ES2330544T3 - Mutantes de la proteasa activadora del factor vii y procedimientos de deteccion con anticuerpos especificos. - Google Patents
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Abstract
Linaje celular de hibridoma DSM ACC2453.
Description
Mutantes de la proteasa activadora del factor
VII y procedimientos de detección con anticuerpos específicos.
El invento se refiere a procedimientos para la
detección proteasa activadora del factor VII de coagulación de la
sangre, y de sus mutantes en el plano de las proteínas o en una
muestra de tejido, así como a unos anticuerpos que son específicos
para estos procedimientos de detección.
A partir de la solicitud de patente alemana
199.03.693.4 ya se conoce una proteasa aislada a partir del plasma
sanguíneo, que puede activar al factor VII (FVII) de coagulación.
Basándose en este primer hallazgo, ella fue denominada como
proteasa activadora del factor VII (con el acrónimo FSAP). Unas
investigaciones detalladas mostraron, que la FSAP es también una
potente activadora de ciertos activadores del plasminógeno
monocatenarios, tales como la prourocinasa o el activador del
plasminógeno tisular monocatenario (sct-PA). A causa
de estas propiedades, se describieron ciertas posibilidades de
utilización del FSAP, por ejemplo, su utilización como un agente
favorecedor de la coagulación que está basado en la aceleración de
la coagulación, apoyada por la activación del FVII. Por sí sola, o
en combinación con activadores del plasminógeno, la FSAP puede
encontrar utilización también para la fibrinolisis, por ejemplo en
el caso de complicaciones trombóticas.
Como se ha descrito en las solicitudes de
patentes alemanas 199.03.693.4 y 199.26.531.3, se desarrollaron
unos ensayos para la detección de la proteasa, que hacen posible la
cuantificación tanto de la FSAP como también de su actividad, por
ejemplo en el plasma. La determinación de antígenos se lleva a cabo
en este caso de manera preferida mediante un ensayo ELISA. La
actividad de la FSAP -tal y como se describe en la solicitud de
patente alemana 199.26.531.3- se puede determinar mediante una
cuantificación de la activación de la prourocinasa para formar la
urocinasa, y de su reacción con un substrato cromógeno, con una
subsiguiente medición de la diferencia de las extinciones. Un
sorprendente hallazgo en el caso de la realización de este ensayo de
actividad fue que la proenzima de FSAP, que se había aislado, por
ejemplo, a partir de un plasma, fue activada en las condiciones
escogidas de incubación, y de esta manera hacía posible la
activación de la prourocinasa. Unas investigaciones más recientes
han puesto de manifiesto que la FSAP es transformada en la forma
activada por medio de una activación propia, y de esta manera puede
activar, por ejemplo, a la prourocinasa o al FVII. Este hallazgo es
apoyado además por las condiciones de incubación antes mencionadas,
es decir por un valor del pH desde neutro hasta alcalino, por iones
de calcio y por heparina. Además, unos resultados muy recientes
apuntan a que la prourocinasa/urocinasa (o un t-PA
de una sola cadena (monocatenario) o de dos cadenas (bicatenario))
pueden provocar o apoyar por sí mismas una activación de la FSAP
monocatenaria.
Mediando utilización de ambos sistemas de ensayo
antes mencionados, a saber el ensayo ELISA y el ensayo de
activación de la prourocinasa, se investigaron más de 180 plasmas de
donantes sanos de sangre. En este caso, se mostró que un 5 a 10% de
todas las muestras, frente a una agrupación de plasmas (a partir de
más que 100 donantes sanos) o frente al promedio de todo el
colectivo de ensayo, tenían una potencia manifiestamente reducida de
la activación de la prourocinasa producida por la FSAP.
Por el contrario, en la mayoría de estos
donantes (con una actividad disminuida) se midieron unos valores
promedios de antígenos de la FSAP. Por lo tanto, se supone que en
las muestras investigadas de sangre podrían estar contenidas una o
varias modificaciones de la FSAP, que tendrían como consecuencia
unas actividades restringidas o ausentes. Este hecho podría estar
basado en unos polimorfismos en la población, es decir en una o
varias mutaciones en las estructuras de la FSAP, que se muestran en
una modificación de la secuencia de aminoácidos de la FSAP, tal
como ya se supuso en la solicitud de patente alemana 199.26.531.3.
Las actividades disminuidas por regla general en un 50 hasta 70%
frente al valor promedio de todos los donantes investigados, apuntan
a la existencia de una mutación heterocigótica. Este hecho podría
expresarse fenotípicamente en el plasma a través de una presencia
probablemente paritaria de ambas FSAPs, es decir, la FSAP del tipo
salvaje y la variante mutante. Suponiendo que la variante mutada
hubiese perdido (casi) totalmente la propiedad de activar a la
prourocinasa, entonces en promedio se mediría una actividad dividida
aproximadamente por la mitad. Además de esto, ya se han descrito,
sin embargo, también ciertas manifestaciones pseudohomocigóticas de
mutaciones heterocigóticas de otras proteínas, en las que solamente
era detectable la proteína mutada, la cual, sin embargo, había
perdido como tal solamente una parte de la propiedad biológica
correspondientemente detectada.
Para poder excluir el hecho de que la falta o la
disminución de unos cofactores potenciales desconocidos sea
responsable de la pérdida comprobada de la actividad de la FSAP, se
purificaron unas muestras de FSAP procedentes de tres donantes, que
habían mostrado en el caso de repetidas donaciones una actividad
significativamente disminuida. Las proteínas altamente purificadas
mostraron, con respecto a la FSAP purificada a partir de la
agrupación de plasmas, asimismo una actividad manifiestamente
disminuida. Esto reduce la probabilidad de una influencia de un
cofactor y aumenta la de una modificación de la proteína en el
sentido antes mencionado. Fue sorprendente el hallazgo de que la
potencia para la activación del factor VII no parece estar
restringida. Por este motivo, tales mutantes son especialmente
adecuadas para la utilización antes mencionada como agente
favorecedor de la coagulación -tal como se describe en la solicitud
de patente alemana 199.03.693.4-, puesto que su potencial
fibrinolítico está manifiestamente limitado. Estas mutantes se
pueden producir de una manera recombinante o transgénica, basándose
en los reconocimientos, descritos a continuación, de las
modificaciones de la secuencia de nucleótidos. No obstante, ellas
se pueden aislar directamente también al igual que la
correspondiente proteína FSAP (la FSAP monocatenaria o bicatenaria)
a partir de unas fuentes naturales tales como un plasma sanguíneo.
En las solicitudes de patentes alemanas 199.03.693.4, 199.37.219.5 y
199.37.218.7 ya se describieron unos procedimientos que permiten la
producción de la FSAP, de manera preferida con ayuda de la
inmunoabsorción, tal como se ilustra en particular en la solicitud
de patente alemana 100.36.641.4. Los anticuerpos monoclonales
utilizados hasta ahora no diferencian, sin embargo, por lo que se
sabe, entre el tipo salvaje y las mutantes de la FSAP.
Correspondientemente, para la producción de las mutantes sólo se
pueden utilizar unas anticuerpos monoclonales, que reaccionan
específicamente con las mutantes. En este caso, los anticuerpos se
pueden obtener mediante inmunización con la mutante. Además, se
pueden utilizar unos péptidos con unas regiones proteínicas, que
corresponden a los aminoácidos 389 hasta 397 (...SFRVQKIFK...) y/o
534 hasta 539 (...EKRPGV...) de la SEQ ID No. ID No. 4 del
protocolo de secuencias, según unos métodos conocidos para la
inmunización y la generación de unos anticuerpos correspondientes.
Además, estos anticuerpos encuentran utilización también para la
detección específica de estas mutantes, por ejemplo como reactivos
en procedimientos de detección tales como un ELISA, borrones de
transferencia Western (en inglés Western blots), en la
inmunohistología o en la FACS (acrónimo del inglés "Fluorescence
Assisted Cell Sorting" = clasificación de células activada por
fluorescencia).
Por el contrario, unos anticuerpos, que están
dirigidos específicamente contra el tipo salvaje de la FSAP o
respectivamente contra la correspondiente secuencia de aminoácidos
del tipo salvaje, por ejemplo, contra las secuencias de aminoácidos
398 hasta 397 (...SFRVEKIFK...) y/o contra la secuencia de
aminoácidos 534 hasta 539 (...GKRPGV...), son utilizados sobre todo
en una forma humanizada como agente farmacéutico para la inhibición
profiláctica o terapéutica de la actividad de la FSAP, a fin de, por
ejemplo, contrarrestar las hiperfibrinolisis que constituyen el
fundamento de las hemorragias. Además, estos anticuerpos se pueden
utilizar también para la purificación, la detección y la
diferenciación de la FSAP de tipo salvaje de la manera descrita más
arriba.
La secuencia genómica de la FSAP se identificó
en el banco de genes bajo el número de acceso (Accession No.) AC
006097 mediante una comparación con la conocida secuencia de ADNc
(cromosomal) (Choi-Miura, número de acceso S 83182)
y en este caso se dedujeron las secuencias de intrones y exones. En
total, se desarrollaron 12 pares de cebadores, a fin de poder
amplificar las secuencias codificadoras en reacciones de PCR
(reacciones en cadena de la polimerasa) específicas en común con
una pequeña parte de las respectivas secuencias flanqueadoras de
intrones.
En primer lugar, el ADN genómico fue aislado a
partir de la sangre de 2 voluntarios con una actividad disminuida
de la prourocinasa, y de 4 voluntarios con una actividad normal de
la prourocinasa, fue amplificado con todos los pares de cebadores,
y a continuación, mediando utilización de los cebadores de la PCR,
se determinó la secuencia de ADN. El resultado se representa en la
Tabla 1. En total, 4 posiciones de nucleótidos en la región
codificadora eran polimorfas, es decir que en estos sitios se
detectaron al mismo tiempo dos bases. Por lo tanto, se ha partir
del hecho de que en estos casos se presenta una heterocigosidad, con
un alelo de tipo salvaje y un alelo mutante. Dos de ellos (en las
posiciones 183 y 957) constituyen unos intercambios de terceras
bases, que no conducen a ningún intercambio de aminoácidos. Los
otros dos, que sólo se encontraron en el ADN de los voluntarios que
tienen una actividad disminuida de la prourocinasa, conducen a
intercambios de aminoácidos, tal como se representa en la Tabla
1.
A fin de investigar la correlación de ambas
mutaciones, que tienen una actividad disminuida de la prourocinasa,
se secuenciaron los ADN's de otras personas en estos lugares. El
resultado se ha recopilado en la Tabla 2. Todos los 6 voluntarios
con una actividad disminuida de la prourocinasa eran heterocigóticos
en las posiciones de nucleótidos 1601 (intercambio
Gly-Glu), cuatro de ellos tenían adicionalmente la
heterocigosidad en la posición 1177 (intercambio
Glu-Gln). Ninguno de los en total 11 voluntarios,
que tienen una actividad de la prourocinasa normal o situada en la
zona normal inferior, tenía las heterocigosidades antes mencionadas.
Este resultado permite sacar la conclusión de que por lo menos el
intercambio en la posición de aminoácidos 534 está relacionado
causalmente con la actividad disminuida de la prourocinasa. Todavía
no hay certidumbre de que un intercambio de aminoácidos solamente en
la posición 393 puede dar lugar a una disminución de la actividad de
la prourocinasa.
La secuencia de nucleótidos SEQ ID No. 1 del
protocolo de secuencias adjunto reproduce la secuencia del tipo
salvaje. La secuencia de ADN de la mutante con ambos intercambios en
las posiciones de nucleótidos 1.177 y 1.601 es descrita por medio
de la SEQ ID No. 2 del protocolo de secuencias. La correspondiente
secuencia de aminoácidos del tipo salvaje se puede deducir de la
SEQ ID No. 3 del protocolo de secuencias. La SEQ ID No. 4 muestra
la secuencia de aminoácidos de la mutante con ambos intercambios de
aminoácidos (Glu-Gln 393 y Gly-Glu
534).
Con el descubrimiento de las secuencias de ADN y
de aminoácidos, que se mencionan en el protocolo de secuencias, se
han proporcionado las premisas para el desarrollo de procedimientos
de diagnóstico para el reconocimiento de pacientes con una
expresión hetero- u homocigótica, condicionada genéticamente, de la
FSAP. Las mutaciones se pueden detectar o bien en el ADN genómico o
en el ARNm (mensajero) derivado de este. No obstante, la detección
se consigue también en el plano de las proteínas con anticuerpos
monoclonales o policlonales, que están dirigidos contra la mutante
que tiene la secuencia modificada de aminoácidos o contra el tipo
salvaje.
A partir de esto se establece la necesidad de
producir unos anticuerpos adecuados para esto y de desarrollar con
ellos unos procedimientos de diagnóstico y unos sistemas de ensayo
confiables.
Un objeto del invento son, por consiguiente,
unos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteasa
activadora del factor VII de coagulación de la sangre y sus
mutantes, así como su utilización para la detección y la
determinación de la actividad de la FSAP y de sus mutantes.
En sí, a partir de las solicitudes de patentes
alemanas 199.03.693.4 y 199.26.531.3 ya se conocen unos sistemas de
ensayo, que hacen posible tanto una cuantificación del contenido de
antígenos de la FSAP como también la determinación de su actividad,
tales como los borrones de transferencia Western o un inmunoensayo
enzimático (ELISA).
Estos sistemas de ensayo se basan en que la FSAP
es fijada y/o detectada por medio de anticuerpos monoclonales
específicos. A pesar de que en el caso de la inmunización, por
ejemplo, de ratones, son identificados frecuentemente muchos clones
positivos en lo referente a la expresión de un anticuerpo monoclonal
específico, sin embargo, con bastante frecuencia sólo unos pocos de
ellos son adecuados para los planteamientos precedentemente
mencionados. Por lo tanto se, planteó la misión de descubrir unos
anticuerpos monoclonales específicos que estén dirigidos contra la
proteasa activadora del factor VII de coagulación de la sangre, que
sean empleables efectivamente tanto para su producción en estado
puro, como también para su detección cualitativa y cuantitativa así
como para la determinación de su actividad.
Por fin, se ha encontrado, que satisfacen estos
requisitos en alto grado unos anticuerpos monoclonales dirigidos
contra la proteasa activadora del factor VII de coagulación de la
sangre, los cuales son formados por el linaje celular de hibridoma
DSM ACC2453. Este linaje celular de hibridoma se ha depositado en la
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (Colección alemana de
microorganismos).
Hasta hace poco tiempo, la FSAP se purificaba
predominantemente en su forma activada. Unos métodos convencionales
de preparación, tales como unas técnicas de cromatografía en
columna, favorecen la activación rápida y la subsiguiente
desactivación de la proteasa. Es conforme al invento, por fin, la
producción en estado puro de la proteasa activadora del factor VII
de coagulación de la sangre y sobre todo de su proenzima, con un
alto rendimiento, mediante el recurso de que uno de los anticuerpos
precedentemente mencionados se acopla con un soporte, éste se
equilibra con un líquido que contiene la proteasa o su proenzima, a
continuación se lava y luego se obtiene la proteasa o su proenzima
mediante una elución.
Además de esto, los mencionados anticuerpos se
adecuan también para la detección de la proteasa activadora del
factor VII de coagulación de la sangre o de su proenzima con un
inmunoensayo, en el que
- a)
- una muestra, que debe de contener la proteasa o su proenzima, se incuba con un primer anticuerpo conforme al invento, que está fijado sobre un soporte sólido, y se lava, luego se añade un segundo anticuerpo conforme al invento, que está marcado, y se lava otra vez, y se mide la señal provocada por el segundo anticuerpo o por otros anticuerpos monoclonales o policlonales; o
- b)
- la proteasa o su proenzima, que está contenida en la muestra que se ha de investigar, se fija sobre un soporte, por ejemplo por medio de unos anticuerpos policlonales que están dirigidos contra la proteasa o su proenzima, y ellas se detectan con un anticuerpo conforme al invento, que está marcado, a solas o en mezcla con uno de los anticuerpos conformes al invento, que no está marcado, y con una detección subsiguiente del anticuerpo monoclonal, o
- c)
- un anticuerpo conforme al invento, que está fijado sobre un soporte, se mezcla con una muestra, que se ha de investigar en cuanto a la proteasa o su proenzima, en presencia de una proteasa marcada o de su proenzima, y se mide la señal provocada por la marcación.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra posibilidad para la detección de la
proteasa activadora del factor VII de coagulación de la sangre o de
su proenzima consiste en que la detección se lleva a cabo con la
metodología del borrón de transferencia Western por medio de una
reacción inmunológica con un anticuerpo conforme al invento, que
está marcado, a solas o en mezcla con un anticuerpo conforme al
invento, que no está marcado, y mediante una detección subsiguiente
del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, por medio de una proteína A
o G marcada, o de un anticuerpo monoclonal o policlonal marcado, que
está dirigido contra el anticuerpo monoclonal.
Finalmente, también es posible determinar la
actividad de la proteasa activadora del factor VII de coagulación
de la sangre o de su proenzima en soluciones de proteínas, mediante
el recurso de que la solución de proteínas, que contiene la
proteasa y/o su proenzima, se incuba junto a un soporte sólido, con
el que se había acoplado previamente un anticuerpo monoclonal
conforme al invento, que está dirigido contra la proteasa, y después
de haber lavado el soporte sólido, la proteasa fijada a éste y su
proenzima se incuban con unos reactivos, que permiten la
determinación de su actividad. La actividad de la proteasa o de su
proenzima se puede medir entonces mediante una determinación
fotométrica de la extinción, que aparece en el caso de la actuación
sobre substratos cromógenos.
\newpage
Otras posibilidades para la determinación de la
actividad de la proteasa o de su proenzima consisten en que en unos
ensayos globales de la coagulación se mide
- -
- su efecto desactivador de los factores VIII/VIIIa ó V/Va de coagulación de la sangre, ó
- -
- su efecto acortador de los períodos de tiempo de coagulación de la sangre, o
- -
- su efecto activador de los activadores del plasminógeno o
- -
- su efecto activador del factor VII de coagulación de la sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la utilización en los procedimientos
precedentemente mencionados se adecuan tanto los anticuerpos
monoclonales completos así como también sus fragmentos tales como
los F(ab')_{2} o Fab. Los anticuerpos o sus fragmentos son
empleados, después de una marcación con una sustancia radiactiva o
fluorescente o enzimáticamente activa, como agentes auxiliares
detectores en un inmunoensayo o en un procedimiento de detección con
un borrón de transferencia Western. Los anticuerpos monoclonales no
marcados, o sus fragmentos, se pueden emplear igualmente, pero
entonces la detección o la inmovilización se lleva a cabo, por
ejemplo, mediante un anticuerpo marcado, que está dirigido contra
el anticuerpo de ratón, o mediante su fragmento marcado
(procedimiento en emparedado = en inglés sándwich). Los anticuerpos
monoclonales conformes al invento o sus fragmentos se pueden emplear
a solas o como una mezcla. Esto es especialmente recomendable en el
caso de los borrones de transferencia Western, puesto que las
electroforesis en gel de SDS (dodecil sulfato de sodio) se llevan a
cabo frecuentemente en condiciones reductoras de las muestras.
Puesto que ambas cadenas de polipéptidos de la FSAP están unidas
una con otra tan sólo a través de un puente de disulfuro, la
molécula se descompone, al realizar la reducción, en dos cadenas, a
saber en la cadena pesada y en la cadena ligera, siendo reconocida
la primera de ellas por el anticuerpo monoclonal de la DSM ACC2454,
y la última de ellas por el anticuerpo monoclonal de la DSM ACC2453.
Para la detección de ambas cadenas son necesarios, por lo tanto,
ambos anticuerpos monoclonales conformes al invento, o sus
fragmentos.
Los anticuerpos monoclonales conformes al
invento se produjeron y caracterizaron de la siguiente manera:
Tres ratones Balb/c hembras (con una edad de
aproximadamente 6 semanas) se inmunizaron con la activadora de
FVII. La primera inyección se componía de 0,2 ml del antígeno (10
\mug) mezclados con 0,2 ml del adyuvante de Freund completo. En
las tres siguientes inyecciones de refuerzo (en inglés boost) (con
una separación en cada caso de 2 semanas) se administró el antígeno
(20 \mug en 0,2 ml) sin ningún adyuvante (todas las inyecciones
por vía intraperitoneal = i.p.). La dilución del inmunógeno se
efectuó en PBS (= solución salina tamponada con fosfato). Después
de la última inyección, los títulos de los sueros se determinaron
mediante un ELISA indirecto, siendo revestida una placa de
microtitulación con la activadora de FVII. Para la fusión se escogió
el ratón que tenía el título más alto de los sueros.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente tres semanas después de la
última aplicación se administró el antígeno en tres días
consecutivos (10 \mug en 0,1 ml por vía intravenosa = i.v.). Al
siguiente día (día 4) el ratón fue sacrificado después de una
extracción de sangre, se le extrajo el bazo y se aislaron las
células del bazo. Las células del bazo se fusionaron a continuación
con el linaje celular de mieloma murinas SP2/0-Ag
14. Como reactivo de fusión se utilizó el poli(etilenglicol)
4.000 (de Merck). La fusión se llevó a cabo con una modificación del
método original de Köhler y Milstein. Las células se distribuyeron
en placas de cultivo de 24 pocillos. Como medio para la selección,
se empleó un medio de Eagle modificado por Dulbecco, con un suero
fetal de ternero al 10% y un HAT. Después de aproximadamente dos
semanas, los clones celulares, que habían crecido, se transfirieron
a los pocillos de una placa de 48 pocillos, y se codificaron.
\vskip1.000000\baselineskip
A partir de 1.728 clones que habían crecido, se
sacó el material sobrenadante del cultivo y se ensayó por medio de
un ELISA en cuanto a la presencia de la IgG de ratón. Con ayuda de
la activadora de FVII inmovilizada, unos materiales sobrenadantes
positivos en cuanto a la IgG de ratón se ensayaron (con un ELISA) en
cuanto a su especificidad. Entre los linajes celulares ensayados se
identificaron 108 linajes celulares como específicos para la
activadora de FVII y se conservaron criológicamente (=
crioconservaron).
El linaje celular de hibridoma con la
denominación DSM ACC2453 se escogió para realizar investigaciones
ulteriores. La especificidad de los anticuerpos formados por estos
linajes celulares se confirmó con el BIACORE y se investigó la
cinética de fijación. El anticuerpo monoclonal es del tipo de la
IgG1.
\newpage
Con ayuda de los anticuerpos descritos dirigidos
contra el tipo salvaje de la FSAP y contra sus mutantes, se pueden
llevar a cabo unos procedimientos de diagnóstico para la detección
de las mutantes, de manera tal que
- a)
- una muestra, que podría contener la mutante, se incuba con un primer anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que está fijado sobre un soporte sólido, y después de esto se lava, luego se añade un segundo anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que está marcado, o un anticuerpo marcado, que está dirigido contra el tipo salvaje, y se lava otra vez, y se mide la señal provocada por el segundo anticuerpo, o
- b)
- una muestra, que podría contener la mutante, se incuba con un primer anticuerpo dirigido contra el tipo salvaje, que está fijado sobre un soporte sólido, y después de esto se lava, luego se añade un segundo anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que está marcado, y se lava otra vez, y se mide la señal provocada por el segundo anticuerpo, o
- c)
- se fija sobre un soporte la muestra que se ha de investigar en cuanto a la presencia de la mutante, y ésta se detecta con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que está marcado, a solas o en mezcla con un anticuerpo no marcado, y a continuación se lleva a cabo la detección del anticuerpo marcado, o
- d)
- un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que está fijado sobre un soporte, se mezcla con una muestra que se ha de investigar en cuanto a la presencia de la mutante, en presencia de una mutante marcada, y se mide la señal provocada por la marcación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prefiere un procedimiento de diagnóstico, en
el que se mide la actividad de la FSAP, incubando la muestra, que
contiene la proteasa, junto a un soporte sólido, con el que se había
acoplado previamente un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
2, que está dirigido contra la proteasa, y después de haber lavado
el soporte sólido, la proteasa fijada se incuba con unos reactivos,
que permiten la determinación de su actividad.
En este caso, la actividad de la proteasa se
puede medir mediante una determinación fotométrica de la extinción
que aparece en el caso de la actuación sobre substratos
cromógenos.
No obstante, también es posible determinar la
actividad de la proteasa mediante una medición
- -
- de su acción desactivadora de los factores VIII/VIIIa y V/Va de coagulación de la sangre, o
- -
- de su acción acortadora de las períodos de tiempo de coagulación en unos ensayos globales de la coagulación, o
- -
- de su acción activadora de los activadores del plasminógeno, o
- -
- de su acción activadora del factor VII de coagulación de la sangre.
\vskip1.000000\baselineskip
Finalmente, están a disposición también unos
procedimientos, en los que se mide la acción activadora de los
activadores del plasminógeno, mediante la activación de
- -
- la urocinasa monocatenaria (scuPA, del inglés "single chain urokinase plasminogen activator" = urocinasa monocatenaria activadora del plasminógeno) o del
- -
- tPA monocatenario (sctPA, del inglés "single chain tissue plasminogen activator" = activador del plasminógeno tisular, monocatenario).
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de las mutaciones, que son
responsables de la disminución de la actividad de la prourocinasa,
en el plano de los ADN's y de los ARN's se pueden emplear unos
procedimientos, tales como los que se utilizan también para la
detección de polimorfismos de un solo nucleótido (en inglés
"single nucleotid polymorphisms"), por ejemplo,
- -
- la amplificación del ARN con un ADNc (cromosomal) o la amplificación del ADN genómico y su subsiguiente secuenciación;
- -
- la detección de la mutación en el plano de los ADNc's o de los ADN's genómicos o de su amplificación mediante
- -
- la hibridación con sondas específicas para una secuencia, que pueden llevar también unas marcaciones para la detección, tales como unas enzimas, una fosfatasa alcalina, HRP (peroxidasa de rábano) y sus substratos, colorantes fluorescentes, también unos pares a base de reporteros y extintores (tales como, por ejemplo, los denominados Scorpions (= escorpiones), Molecular Beacons (balizas moleculares), sondas TaqMan), átomos radiactivos, cromóforos, marcaciones por quimio- o electroquimio-luminiscencia) o
- -
- mediante unos procedimientos tales como la acilación selectiva de una amina en posición 2', la oxidación electroquímica de ácidos nucleicos, por medio de unos conjugados de oligonucleótidos que se fijan a surcos menores (en inglés "minor groove binder") o mediante la HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento).
Sobre la base de los resultados de la
investigación, que se habían obtenido mediante los ensayos de
antígenos y de la actividad, que antes se han mencionado, se
pudieron investigar tres conjuntos de donantes sanos en lo que
respecta a unas mutaciones potenciales en el plano genómico. Para
ello, se extrajo sangre de los donantes, y las células sanguíneas
se separaron del plasma mediante una centrifugación. Los plasmas se
utilizaron entonces para la cuantificación del nivel de los
antígenos y de la actividad de la FSAP, y correspondientemente al
último se subdividieron en tres conjuntos, a saber, en los de
"alto/promedio", "promedio/disminuido" y
"significativamente disminuido". Las células sanguíneas
obtenidas se utilizaron entonces para la extracción de ADN y ARN, y
a partir de esto se determinaron los hallazgos expuestos en la
página 7 y en la Tabla 1.
Basándose en los precedentes resultados, es
posible ahora la detección rápida de una o de ambas mutaciones
descritas, indistintamente de si se trata del genotipo hetero- u
homocigótico, en el plano de la correspondiente secuencia de
nucleótidos de la FSAP. Mientras que los ensayos precedentemente
mencionados de los antígenos y de la actividad en el estado sano de
un donante, reflejan en efecto el genotipo, esto puede ser difícil
o imposible en el caso de presentarse unas influencias sobre los
niveles en plasma de la FSAP. Así, ciertos parámetros, tales como
las fluctuaciones hormonales, el estilo de vida, etc., pero en
particular los estados patológicos, pueden influir más o menos
intensamente sobre el nivel de los antígenos y/o de la actividad.
Tal como se describe en la solicitud de patente alemana
199.26.531.3, en el caso de un infarto cardiaco, la actividad
medible de la FSAP puede subir manifiestamente frente al valor
normal, con un contenido de antígenos apenas aumentado, por lo que
unos donantes, que en el estado sano presentan una actividad
disminuida de la FSAP, aparecen por fin como "promedios".
Por ejemplo, unas investigaciones, acerca de si
unos pacientes con una mutación de la FSAP tienen un riesgo
aumentado de padecer unas complicaciones trombóticas tales como
infartos cardiacos, son solamente difíciles de realizar debido a
las limitaciones antes mencionadas. Al contrario, por ejemplo, unas
insuficiencias hepáticas pueden conducir a unos niveles en plasma
disminuidos, lo que puede conducir asimismo a unas interpretaciones
erróneas de la predisposición genética "verdadera". Un ensayo
acerca de una mutación de la FSAP en el plano de los ADN's o ARN's
es, por el contrario, independiente de sucesos provisionales. La
combinación de todos los ensayos mencionados hace posible una
imagen completa del donante/paciente, es decir, la evaluación de
una mutación potencial y del estado agudo en lo que respecta a una
influencia sobre la relación entre el antígeno y la actividad. A
partir de esto pueden resultar unas medidas profilácticas y
terapéuticas.
Tal como se ha descrito precedentemente, hasta
ahora se encontraron exclusivamente unos donantes de sangre
heterocigóticos, cuyo plasma sanguíneo contiene la FSAP normal en
aproximadamente un 50% y la mutante de FSAP en aproximadamente un
50%. De esto resulta un nivel disminuido en aproximadamente un 50%
de la actividad de los plasmas, en los que se presentan ambos tipos
de moléculas de FSAP. Unas agrupaciones de plasmas, que se han
obtenido a partir de la sangre de 100 y más donantes, contienen
también, conforme a ello, según sea la populación, de 5 a 10% de
las mutantes de FSAP. De esto resulta, en el caso de las
transfusiones de sangre, una correspondiente probabilidad de
recibir un plasma sanguíneo de un donante, que contiene la mutante
de FSAP. Si se administra una sangre, que contiene esta mutante, a
un receptor, que no forma esta mutante, entonces ésta puede ser
reconocida como ajena por él, y se pueden formar unos
correspondientes anticuerpos. En el caso de una posterior
aplicación consiguiente con la mutante de FSAP, se puede llegar a
unas reacciones inmunológicas del receptor, con los efectos
secundarios que son familiares para un experto en la
especialidad.
A la inversa, en el caso de un receptor
homocigótico de sangre, que sólo forma la mutante de FSAP, pero no
la FSAP normal, ésta es reconocida como "ajena" y se forman los
correspondientes anticuerpos contra ella.
La FSAP influye sobre la hemostasis y sobre los
procesos celulares, que están vinculados con ella. Mediante su
implicación en la coagulación de la sangre y/o en la fibrinolisis,
ella también influye sobre la reacción de cicatrización. Además, la
FSAP, por medio de su propiedad de poseer una alta afinidad para
glicosaminoglicanos, puede ser fijada a células o a otras matrices,
con lo cual ella participa posiblemente de una manera fisiológica y
patofisiológica en la migración celular y en procesos celulares
proteolíticos.
Unos anticuerpos dirigidos contra la FSAP pueden
influir, por consiguiente, sobre todas las actividades mediadas por
la FSAP. Para el caso de que se presenten unos
auto-anticuerpos dirigidos contra la FSAP, junto a
un perjuicio de las funciones fisiológicas, puede agregarse el
hecho de que unos complejos inmunológicos (FSAP + anticuerpos)
contribuyen a efectos secundarios de enfermedades autoinmunológicas
conocidas. Esto puede conducir, por ejemplo, a unas vasculitis
localizadas junto al endotelio. La neutralización de la actividad de
la FSAP como agente profibrinolítico podría contribuir además a un
estado favorecedor de las trombosis.
Otro objeto del invento es un procedimiento de
diagnóstico para la detección inmunohistoquímica de la proteasa
activadora del factor VII de coagulación de la sangre, de su
proenzima o de sus mutantes o de sus fragmentos de disociación, en
el que se hace actuar sobre una muestra de un tejido a un anticuerpo
mono- o policlonal, marcado, que está dirigido contra la proteasa,
o a uno de sus fragmentos, el anticuerpo no fijado o sus fragmentos
se lava(n), y se determina la señal emitida por el anticuerpo
fijado o por uno de sus fragmentos.
El procedimiento se puede realizar también de
tal manera que se hace actuar sobre la muestra de un tejido un
anticuerpo mono- o policlonal, no marcado, que está dirigido contra
la proteasa, su proenzima o sus mutantes o sus fragmentos de
disociación, o uno de sus fragmentos, se lava(n) el
anticuerpo no fijado o sus fragmentos, a continuación, se hace
actuar a un anti-anticuerpo marcado sobre el tejido,
y, después de haber lavado el anti-anticuerpo
marcado, que no está fijado, se determina la señal emitida por el
anti-anticuerpo fijado o por sus fragmentos.
Además, se encontró que unos anticuerpos mono- o
policlonales dirigidos contra la FSAP, cuando ellos están marcados
con grupos cromóforos o luminiscentes, se adecuan sobresalientemente
para la detección de la FSAP en cortes de tejidos de origen humano.
Para esta detección se adecuan unos anticuerpos policlonales
dirigidos contra la FSAP, que son obtenidos mediante una
inmunización de conejos, ovejas, cabras u otros mamíferos, al igual
que unos anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales de
los linajes celulares de hibridoma DSM ACC 2453 y DSM ACC 2454 se
adecuan especialmente bien para la detección histológica específica
de la FSAP, que se puede presentar tanto en la forma activada, como
también en la forma de la proenzima, o como un fragmento de
disociación. También se pueden detectar de esta manera unos
complejos de la FSAP activada con unos inhibidores tales como
antiplasmina. Para ello se adecuan todos los procedimientos de
detección histológicos habituales tales como la microscopía óptica,
de fluorescencia o electrónica.
Para la detección de la FSAP en los
procedimientos precedentemente mencionados se adecuan tanto los
anticuerpos policlonales y monoclonales completos como también sus
fragmentos tales como F(ab')_{2} o Fab, siempre y cuando
que éstos estén marcados con un grupo detectable. En este caso, los
anticuerpos precedentemente mencionados o sus fragmentos, se pueden
utilizar a solas o como una mezcla. Esto es especialmente
recomendable en el caso de que uno de los epítopos reconocidos está
oculto. Por ejemplo, un determinado dominio proteínico puede no ser
accesible para un anticuerpo por medio de asociación de células,
pero es fijado por otro anticuerpo, que tiene la especificidad para
otra región de la FSAP. También unos anticuerpos, que están
dirigidos contra la FSAP humana, contra su tipo salvaje y/o contra
sus mutantes, y que se han descrito más detalladamente en la
solicitud de patente alemana 100.52.319.6, se pueden emplear para la
detección de la FSAP en cortes de tejidos de origen humano.
Los reconocimientos obtenidos hasta ahora acerca
de la detección inmunohistoquímica de la FSAP se pueden recopilar de
la siguiente manera:
- -
- la FSAP es detectada en casi todos los tejidos humanos que se han investigado hasta ahora;
- -
- las células endocrinamente activas, tales como las células intersticiales de Leydig o las células endocrinamente activas de los islotes de Langerhans del páncreas, se pueden teñir intra-citoplasmáticamente de una manera muy intensa con unos anticuerpos, que llevan grupos cromóforos;
- -
- los epitelios y endotelios muestran, de manera correspondiente a su localización, una reacción inmunológica intra-citoplasmática más o menos intensa con anticuerpos dirigidos contra la FSAP;
- -
- las células ganglionares y las dendritas de la corteza cerebral muestran una alta concentración de FSAP, lo que es detectado por medio de una fuerte reacción cromática inmunohistológica con anticuerpos cromóforos;
- -
- las células plasmáticas muestran una intensa coloración intra-citoplasmática con anticuerpos cromóforos;
- -
- las células mesenquimales del estroma no muestran en tejidos complejos ninguna reacción cromática, o sólo una débil reacción cromática, para la FSAP.
La FSAP es, por consiguiente, una proteína que
se ha de considerar como un componente normal de las células. Hasta
ahora se encontró a la FSAP localizada tanto intra- como también
extra-celularmente, siendo el primer compartimiento
teñible de manera manifiestamente más intensa. Mediante la detección
conforme al invento de la FSAP con los mencionados anticuerpos o
con sus fragmentos se pueden reconocer los siguientes procesos
patológicos:
- -
- tumores endocrinamente activos y tumores neuro-endocrinos;
- -
- endotelios angiogénicos y endotelios del endotelio capilar; así como
- -
- tumores angiogénicamente activos tales como gliomas y glioblastomas, pero también, por ejemplo, tumores vasculares tales como el hemangio-endotelioma o -pericitoma y el angiosarcoma;
- -
- reacciones de cicatrización, tejidos de granulación y colagenosis;
- -
- zonas arterioscleróticas, (micro)trombosadas y que se necrotizan.
- -
- enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson pero también las encefalitis espongiformes, por ejemplo, las provocadas por proteínas priónicas;
- -
- gamopatías y mielomas.
\vskip1.000000\baselineskip
Para la detección de la FSAP se utilizan de
manera preferida unos anticuerpos monoclonales del linaje celular de
hibridoma DSM ACC 2453.
El procedimiento de diagnóstico conforme al
invento es ilustrado más detalladamente mediante el siguiente
Ejemplo.
Para la investigación de la reactividad
inmunohistoquímica de los anticuerpos monoclonales, que son
específicos para la FSAP, del linaje celular de hibridoma DSM ACC
2453, a partir de un tejido humano adulto y de tumores urológicos
malignos, se produjeron unos cortes en parafina, que tienen un
espesor de 10 \mum, con una subsiguiente desparafinación, los
cuales se trataron en un horno de microondas en el tampón de citrato
3 veces durante 5 minutos. Sobre estos cortes se hizo actuar
primeramente, durante 30 minutos, a un anticuerpo no marcado de los
linajes celulares de hibridoma antes mencionados. Después de haber
lavado el corte del tejido se hizo actuar sobre el tejido a un
anticuerpo de detección anti-ratón, marcado,
asimismo durante 30 minutos, y luego se hizo visible el anticuerpo
dirigido contra la FSAP, fijado, mediante formación del complejo
APAAP (complejo entre la fosfatasa alcalina y el anticuerpo
anti-fosfatasa alcalina) y mediante tinción con un
cromógeno y una tinción antagonista con alumbre hematológico.
Como testigo negativo, en cada tejido se llevó a
cabo por separado una incubación con el anticuerpo de detección -sin
ninguna incubación precedente con el anticuerpo dirigido contra la
FSAP-, a fin de hacer visibles unas potenciales reacciones
inespecíficas del detector. Además, como testigo positivo se utilizó
conjuntamente un anticuerpo dirigido contra
\alpha-queratina.
Los resultados de la investigación
inmunohistoquímica de un tejido humano normal se recopilan en la
Tabla 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Anticuerpos dirigidos contra la
FSAP y DSMZ ACC
2453
Tejido normal
humano
En el caso de células endocrinas tales como los
islotes de Langerhans del páncreas, las células intersticiales de
Leydig del espacio intersticial testicular, en el caso de las
células deciduales de la placenta y del cuerpo glandular, que
contiene un recubrimiento, del cardias del estómago, así como del
epitelio altamente cilíndrico del conducto cístico se pone de
manifiesto una fuerte reacción, en parte finamente granular. Se
observaron unas reacciones fuertemente positivas en células
plasmáticas situadas en texturas tisulares, en células ganglionares
y en las neuronas (células nerviosas) de la corteza cerebral.
También las células deciduales, el epitelio amniótico, y los
fibroplastos de las membranas ovulares mostraron una tingibilidad
inmunohistológica muy fuerte, así como también el epitelio
envolvente de las vesículas seminales y los enterocitos del
intestino delgado.
Ciertas investigaciones en un material tumoral
embebido en parafina, fijado con formalina, procedente de tumores
urológicos, mostraron una reacción intracitoplasmática, desde débil
hasta moderadamente fuerte, de adenocarcinomas diversamente
diferenciados de la próstata. Las células tumorales de tumores
testiculares seminomatosos mostraron solamente una débil reacción
intra-citoplasmática, mientras que unos tumores no
seminomatosos (carcinomas embrionarios y carcinomas coriónicos)
tenían una tingibilidad manifiestamente reforzada de las células
tumorales, que apuntaban a la existencia de unas concentraciones
aumentadas de la FSAP.
El procedimiento de diagnóstico conforme al
invento permite, por consiguiente, una detección inmunohistoquímica
de procesos patológicos en los órganos más diversos.
<110> ZLB Behring GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Mutantes de la proteasa activadora
del factor VII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 2000/A008-A7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> DE 10036641.4
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-07-26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (15)
1. Linaje celular de hibridoma DSM ACC2453.
2. Anticuerpo monoclonal dirigido contra la
proteasa activadora del factor VII de coagulación de la sangre
(FSAP), caracterizado porque él es formado por el linaje
celular de hibridoma de acuerdo con la reivindicación 1.
3. Procedimiento in vitro para la
detección de la FSAP o de su proenzima con un inmunoensayo
caracterizado porque se utiliza un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la reivindicación 2 o unos fragmentos de este anticuerpo
que fijan antígenos, de manera preferida los fragmentos Fab o
F(ab')_{2}.
4. Procedimiento in vitro para la
detección de la FSAP o de su proenzima de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que una muestra, que debe de contener la
proteasa o su proenzima, se incuba con un primer anticuerpo, que
está fijado sobre un soporte sólido, y se lava, a continuación se
añade un segundo anticuerpo marcado y se lava otra vez, y se mide la
señal provocada por el segundo anticuerpo.
5. Procedimiento in vitro para la
detección de la FSAP o de su proenzima de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que se fija sobre un soporte a la FSAP o a
su proenzima, que está contenida en la muestra que se ha de
investigar, y se la detecta con un anticuerpo de acuerdo con la
reivindicación 2, que está marcado, y mediante una subsiguiente
detección del anticuerpo monoclonal.
6. Procedimiento in vitro para la
detección de la FSAP o de su proenzima de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que un anticuerpo, que está fijado sobre un
soporte, se reúne con una mezcla que se ha de investigar en cuanto a
la FSAP o a su proenzima, en presencia de una proteasa marcada o de
su proenzima, y se mide la señal emitida por la marcación.
7. Procedimiento in vitro para la
detección de la FSAP o de su proenzima en un procedimiento de borrón
de transferencia Western, caracterizado porque se utiliza un
anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 o unos
fragmentos del anticuerpo que fijan antígenos, de manera preferida
los fragmentos Fab o F(ab')_{2}.
8. Procedimiento in vitro para la
detección inmunohistoquímica de la FSAP, de su proenzima, o de sus
fragmentos de disociación, caracterizado porque se utiliza un
anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2 o unos
fragmentos del anticuerpo que fijan antígenos, de manera preferida
los fragmentos Fab o F(ab')_{2}.
9. Procedimiento in vitro de acuerdo con
la reivindicación 8 para la detección inmunohistoquímica de la FSAP,
de su proenzima, de sus mutantes o de sus fragmentos de disociación
en muestras de tejidos, en particular en cortes de tejidos de origen
humano.
10. Procedimiento in vitro para la
detección de la FSAP, de su proenzima o de sus fragmentos de
disociación de acuerdo con las reivindicaciones 3 a 9,
caracterizado porque se utiliza un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la reivindicación 2 o unos fragmentos del anticuerpo que
fijan antígenos, estando marcados los anticuerpos o sus fragmentos
que fijan antígenos con una sustancia radiactiva o fluorescente o
activa enzimáticamente.
11. Procedimiento in vitro para la
determinación de la actividad de la FSAP o de su proenzima,
caracterizado porque se utiliza un anticuerpo monoclonal de
acuerdo con la reivindicación 2 o unos fragmentos del anticuerpo que
fijan antígenos, de manera preferida unos fragmentos Fab o
F(ab')_{2}.
12. Procedimiento in vitro para la
determinación de la actividad de la FSAP o de su proenzima de
acuerdo con la reivindicación 11, en el que la muestra, que contiene
la FSAP, se incuba junto a un soporte sólido, con el que se había
acoplado previamente un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación
2 o unos fragmentos de este anticuerpo que fijan antígenos, y
después de haber lavado el soporte sólido, la FSAP fijada a éste se
incuba con unos reactivos, que permiten la determinación de su
actividad.
13. Utilización de un anticuerpo de acuerdo con
la reivindicación 2 para la detección y la determinación de la
actividad de la FSAP y de sus mutantes in vitro.
14. Procedimiento in vitro para la
detección de unos anticuerpos dirigidos contra la FSAP o contra su
proenzima, o contra un mutante de FSAP, que se produjo mediante el
intercambio de uno o varios aminoácidos, haciéndose actuar a una
muestra, que podría contener los anticuerpos, sobre la FSAP y/o la
mutante de FSAP, que está fijada a un soporte sólido, luego se lava
y se detectan los anticuerpos, que están fijados a la proteasa,
caracterizado porque el soporte sólido está revestido con un
anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, que está cargado con
la FSAP y/o con su mutante.
15. Procedimiento para la producción en estado
puro de la FSAP o de su proenzima, caracterizado porque se
acopla un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la reivindicación 2
con un soporte, éste se equilibra con un líquido que contiene la
proteasa o la proenzima de ésta, a continuación se lava, y
seguidamente se obtiene la proteasa o su proenzima.
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