JP2001242170A - 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 - Google Patents
血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法Info
- Publication number
- JP2001242170A JP2001242170A JP2000400334A JP2000400334A JP2001242170A JP 2001242170 A JP2001242170 A JP 2001242170A JP 2000400334 A JP2000400334 A JP 2000400334A JP 2000400334 A JP2000400334 A JP 2000400334A JP 2001242170 A JP2001242170 A JP 2001242170A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- factor
- apc
- protein
- mutation
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】血栓症、及び／または活性タンパク質Ｃ（ＡＰ
Ｃ）に対する弱い抗凝血応答に関連する遺伝的欠陥の存
在をスクリーニングする。 【解決手段】核酸レベルもしくはタンパク質レベル、ま
たは両レベルにおいて第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因
子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因
子の１個以上のＡＰＣ開裂及び／または結合部位に生じ
た一つ以上の突然変異を抗体を用いて検出する。
Ｃ）に対する弱い抗凝血応答に関連する遺伝的欠陥の存
在をスクリーニングする。 【解決手段】核酸レベルもしくはタンパク質レベル、ま
たは両レベルにおいて第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因
子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因
子の１個以上のＡＰＣ開裂及び／または結合部位に生じ
た一つ以上の突然変異を抗体を用いて検出する。
Description
【０００１】本発明はうっ血分野に関するものであり、
特に血栓症に係わる。より具体的には、本発明は、血栓
発現傾向、特に遺伝性の血栓発現傾向のスクリーニング
及び診断方法に関する。従って、本発明の方法は、個体
が血栓症にかかる危険を調べるために使用できる。
特に血栓症に係わる。より具体的には、本発明は、血栓
発現傾向、特に遺伝性の血栓発現傾向のスクリーニング
及び診断方法に関する。従って、本発明の方法は、個体
が血栓症にかかる危険を調べるために使用できる。
【０００２】発明の背景 深静脈血栓症は一般的な病気である。確定されている危
険因子としては、手術して間もない状態、悪性疾患、妊
娠及び分娩、長期の不動化、並びに凝固系の主要阻害物
質のうちの一つの欠乏が挙げられる（Ｒｅｆ．１）。主
要阻害物質は、プロテインＣ、プロテインＳ及びアンチ
トロンビンであることが知られている。多くの患者の深
静脈血栓症の原因はまだ解明されていない。しかしなが
ら、遺伝的に静脈血栓症の傾向がある幾つかの家族に、
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する抗凝血応答の弱
さが見られることが最近確認された（Ｒｅｆ．２）。
険因子としては、手術して間もない状態、悪性疾患、妊
娠及び分娩、長期の不動化、並びに凝固系の主要阻害物
質のうちの一つの欠乏が挙げられる（Ｒｅｆ．１）。主
要阻害物質は、プロテインＣ、プロテインＳ及びアンチ
トロンビンであることが知られている。多くの患者の深
静脈血栓症の原因はまだ解明されていない。しかしなが
ら、遺伝的に静脈血栓症の傾向がある幾つかの家族に、
活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する抗凝血応答の弱
さが見られることが最近確認された（Ｒｅｆ．２）。
【０００３】ＡＰＣの抗凝血特性は、タンパク質限定分
解によって活性化補因子Ｖａ及びＶＩＩＩａを不活化す
る能力にある（Ｒｅｆ．３）。このような補因子Ｖａ及
びＶＩＩＩａの不活化は、重要な凝固酵素であるトロン
ビンの生成率を低下させる。この作用はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで、正常血漿にＡＰＣを加え、その効果を凝固検査、
例えばＡＰＴＴ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ
ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）を測定す
る検査で調べることにより、視覚化できる。プロテイン
Ｃの活性化は、トロンビン−トロンボモジュリン複合体
を介して内皮細胞の表面で起こる（Ｒｅｆ．２７）。ト
ロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）
は、トロンビンに結合することができる膜糖タンパク質
である。この結合によってトロンビンは、フィブリノー
ゲンをフィブリンに変換する能力と、血小板を活性化す
る能力とを失う。即ち、トロンビンは凝血特性を失い、
プロテインＣの活性化によってそれ自体の生成も低下す
る（いわゆる負のフィードバック）。Ｉｎ ｖｉｖｏ
（カルシウムの存在下）では、プロテインＣの活性化
は、内皮上のトロンボモジュリンの存在にほぼ全面的に
依存する。ＡＰＣはその後、ＡＰＣ阻害物質（ＰＣＩ）
及びα１アンチトリプシンとの複合体の形成によって中
和される。これは、正常な状態では、ＡＰＣが循環系中
に短時間しか存在せず、抗凝血作用が通常は局所的に発
現される状態を維持することを意味する。
解によって活性化補因子Ｖａ及びＶＩＩＩａを不活化す
る能力にある（Ｒｅｆ．３）。このような補因子Ｖａ及
びＶＩＩＩａの不活化は、重要な凝固酵素であるトロン
ビンの生成率を低下させる。この作用はｉｎ ｖｉｔｒ
ｏで、正常血漿にＡＰＣを加え、その効果を凝固検査、
例えばＡＰＴＴ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ
ｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）を測定す
る検査で調べることにより、視覚化できる。プロテイン
Ｃの活性化は、トロンビン−トロンボモジュリン複合体
を介して内皮細胞の表面で起こる（Ｒｅｆ．２７）。ト
ロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ）
は、トロンビンに結合することができる膜糖タンパク質
である。この結合によってトロンビンは、フィブリノー
ゲンをフィブリンに変換する能力と、血小板を活性化す
る能力とを失う。即ち、トロンビンは凝血特性を失い、
プロテインＣの活性化によってそれ自体の生成も低下す
る（いわゆる負のフィードバック）。Ｉｎ ｖｉｖｏ
（カルシウムの存在下）では、プロテインＣの活性化
は、内皮上のトロンボモジュリンの存在にほぼ全面的に
依存する。ＡＰＣはその後、ＡＰＣ阻害物質（ＰＣＩ）
及びα１アンチトリプシンとの複合体の形成によって中
和される。これは、正常な状態では、ＡＰＣが循環系中
に短時間しか存在せず、抗凝血作用が通常は局所的に発
現される状態を維持することを意味する。
【０００４】ＡＰＣによる補因子Ｖａ及びＶＩＩＩａの
不活化が、Ｃａ２＋、リン脂質及びＡＰＣ補因子プロテ
インＳの存在下で最適に進行することは、一般的に認め
られていた（Ｒｅｆ．４、２８、２９）。しかしなが
ら、この見解はその後、精製タンパク質系ではプロテイ
ンＳはＡＰＣに対して補因子活性をほとんど示さないと
いう発見により、正当性が問われることになった（Ｒｅ
ｆ．５、Ｒｅｆ．６）。ｉｎ ｖｉｖｏの観察事項（遺
伝性プロテインＳ欠乏の場合の血栓症の傾向）とｉｎ
ｖｉｔｒｏの観察事項（精製タンパク質系におけるプロ
テインＳのＡＰＣ補因子活性の弱さ）との間のこのよう
な明らかな矛盾は、Ｄａｈｌｂａｃｋらの発見（Ｒｅ
ｆ．２）によって解決され得る。Ｄａｈｌｂａｃｋら
は、アンチトロンビン活性が正常値であり、プロテイン
Ｃ及びプロテインＳも（免疫学的及び機能的に）正常値
であり、異常プラスミノーゲン、異常フィブリノーゲン
又は抗凝血性狼瘡（ｌｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌ
ａｎｔ）の徴候を示さないが、活性化プロテインＣに対
する抗凝血応答が弱い患者について報告している。前記
応答は、精製ヒトＡＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏ添加した後
の血漿の応答（凝固時間、ＡＰＴＴ）を調べるためにＤ
ａｈｌｂａｃｋが開発した新しいテスト（Ｒｅｆ．２）
で発見された。これらの血栓症患者の血漿に活性化プロ
テインＣを加えても、ＡＰＴＴは予想に反して延長され
なかった。この現象に関して多数のメカニズムを想定し
た結果、ＡＰＣに対する弱い抗凝血応答を誘起すると見
なされるものが一つだけあった。即ち、前記患者に欠乏
している、これまで未知のＡＰＣ補因子の存在である。
不活化が、Ｃａ２＋、リン脂質及びＡＰＣ補因子プロテ
インＳの存在下で最適に進行することは、一般的に認め
られていた（Ｒｅｆ．４、２８、２９）。しかしなが
ら、この見解はその後、精製タンパク質系ではプロテイ
ンＳはＡＰＣに対して補因子活性をほとんど示さないと
いう発見により、正当性が問われることになった（Ｒｅ
ｆ．５、Ｒｅｆ．６）。ｉｎ ｖｉｖｏの観察事項（遺
伝性プロテインＳ欠乏の場合の血栓症の傾向）とｉｎ
ｖｉｔｒｏの観察事項（精製タンパク質系におけるプロ
テインＳのＡＰＣ補因子活性の弱さ）との間のこのよう
な明らかな矛盾は、Ｄａｈｌｂａｃｋらの発見（Ｒｅ
ｆ．２）によって解決され得る。Ｄａｈｌｂａｃｋら
は、アンチトロンビン活性が正常値であり、プロテイン
Ｃ及びプロテインＳも（免疫学的及び機能的に）正常値
であり、異常プラスミノーゲン、異常フィブリノーゲン
又は抗凝血性狼瘡（ｌｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌ
ａｎｔ）の徴候を示さないが、活性化プロテインＣに対
する抗凝血応答が弱い患者について報告している。前記
応答は、精製ヒトＡＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏ添加した後
の血漿の応答（凝固時間、ＡＰＴＴ）を調べるためにＤ
ａｈｌｂａｃｋが開発した新しいテスト（Ｒｅｆ．２）
で発見された。これらの血栓症患者の血漿に活性化プロ
テインＣを加えても、ＡＰＴＴは予想に反して延長され
なかった。この現象に関して多数のメカニズムを想定し
た結果、ＡＰＣに対する弱い抗凝血応答を誘起すると見
なされるものが一つだけあった。即ち、前記患者に欠乏
している、これまで未知のＡＰＣ補因子の存在である。
【０００５】下記のメカニズムは従来、ＡＰＣに対する
弱い抗凝血応答の原因として認められていなかった： １． ＡＰＣに対する自己抗体の存在、 ２． ＡＰＣと反応する即時型作用性プロテアーゼ阻害
物質、 ３． 機能性プロテインＳの欠乏、 ４． 第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子遺伝子の突然変異。
弱い抗凝血応答の原因として認められていなかった： １． ＡＰＣに対する自己抗体の存在、 ２． ＡＰＣと反応する即時型作用性プロテアーゼ阻害
物質、 ３． 機能性プロテインＳの欠乏、 ４． 第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子遺伝子の突然変異。
【０００６】Ｄａｈｌｂａｃｋ（Ｒｅｆ．２，７）は、
検査した家族では、プロテインＳと無関係に作用すると
されているこれまで知られていないＡＰＣ補因子の遺伝
的な欠乏が、ＡＰＣ耐性の原因であると想定した。Ｄａ
ｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．２）はまた国際特許出願第Ｗ
Ｏ９３／１０２６１号で、凝固因子を含む患者試料に活
性化プロテインＣを加え、該ＡＰＣ添加によって左右さ
れる酵素活性を測定することにより、血栓塞栓障害を診
断する検査方法を開示した。Ｄａｈｌｂａｃｋらの出願
明細書には、記載の実験結果は、当該障害が、これまで
未知の１種類以上の凝固因子、又は既知の因子の未知の
相互作用に関係していることを示すものであると記述さ
れている。未知の因子は、ＡＰＣによる分解に対して耐
性を示す第Ｖａ又は第ＶＩＩＩａ因子ではなく、ＡＰＣ
に対する免疫グロブリン型阻害物質でもない。また、プ
ロテインＳの欠乏にも関係がない。Ｄａｈｌｂａｃｋら
（Ｒｅｆ．２）は、彼らの発明が、遺伝性又は非遺伝性
の血栓発現傾向のような血栓塞栓疾患の更に進んだ診
断、並びに妊娠、避妊ピルの使用、手術等に関連した血
栓症の危険の決定に特に有用な方法であると述べてい
る。彼らはその方法が、試料中の凝固系をそれ自体公知
のように完全に又は部分的に活性化し、活性化プロテイ
ンＣと共にインキュベートし、次いで発色性基質の凝固
又は変換のような基質変換反応速度を測定することを特
徴とすると記述している。測定した変換速度は、正常血
漿試料に関して得られた値と比較される。この速度が大
きければ、試料の由来源である個体が凝固疾患にかかっ
ている可能性がある。この疾患は、プロテインＳの欠
乏、又はＡＰＣによる分解、もしくはＡＰＣに対する免
疫グロブリン型阻害物質による分解に対して耐性の第Ｖ
ａ因子もしくは第ＶＩＩＩａ因子の産生によって発現さ
れない。前記国際特許出願でＤａｈｌｂａｃｋらは更
に、該出願明細書に記載のデータは、当該患者が欠陥第
ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子を有し得ないことを示すもの
であると記述している。これは、彼らがそれより先にＴ
ｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．６５，アブストラク
ト３９，６５８（１９９１）で述べたこと、即ち患者の
血漿試料への活性化プロテインＣの添加、及び生じた作
用の検査によって、活性化プロテインＣにより分解され
ない欠陥第ＶＩＩＩａ因子分子が明らかにされたという
主張に反するものである。前記国際特許出願では更に、
ＡＰＣによる第Ｖａ及び第ＶＩＩＩａ因子の阻害を直接
測定するためにアッセイが使用されている。前記国際特
許出願に記載の第Ｘａ因子ベースの凝固アッセイを使用
すると、ＡＰＣによる患者第Ｖａ因子の阻害が正常であ
ることが判明した。これは、患者血漿試料中の第Ｖａ因
子が、外部から添加したＡＰＣにより正常に分解される
ことを示唆するものである。
検査した家族では、プロテインＳと無関係に作用すると
されているこれまで知られていないＡＰＣ補因子の遺伝
的な欠乏が、ＡＰＣ耐性の原因であると想定した。Ｄａ
ｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．２）はまた国際特許出願第Ｗ
Ｏ９３／１０２６１号で、凝固因子を含む患者試料に活
性化プロテインＣを加え、該ＡＰＣ添加によって左右さ
れる酵素活性を測定することにより、血栓塞栓障害を診
断する検査方法を開示した。Ｄａｈｌｂａｃｋらの出願
明細書には、記載の実験結果は、当該障害が、これまで
未知の１種類以上の凝固因子、又は既知の因子の未知の
相互作用に関係していることを示すものであると記述さ
れている。未知の因子は、ＡＰＣによる分解に対して耐
性を示す第Ｖａ又は第ＶＩＩＩａ因子ではなく、ＡＰＣ
に対する免疫グロブリン型阻害物質でもない。また、プ
ロテインＳの欠乏にも関係がない。Ｄａｈｌｂａｃｋら
（Ｒｅｆ．２）は、彼らの発明が、遺伝性又は非遺伝性
の血栓発現傾向のような血栓塞栓疾患の更に進んだ診
断、並びに妊娠、避妊ピルの使用、手術等に関連した血
栓症の危険の決定に特に有用な方法であると述べてい
る。彼らはその方法が、試料中の凝固系をそれ自体公知
のように完全に又は部分的に活性化し、活性化プロテイ
ンＣと共にインキュベートし、次いで発色性基質の凝固
又は変換のような基質変換反応速度を測定することを特
徴とすると記述している。測定した変換速度は、正常血
漿試料に関して得られた値と比較される。この速度が大
きければ、試料の由来源である個体が凝固疾患にかかっ
ている可能性がある。この疾患は、プロテインＳの欠
乏、又はＡＰＣによる分解、もしくはＡＰＣに対する免
疫グロブリン型阻害物質による分解に対して耐性の第Ｖ
ａ因子もしくは第ＶＩＩＩａ因子の産生によって発現さ
れない。前記国際特許出願でＤａｈｌｂａｃｋらは更
に、該出願明細書に記載のデータは、当該患者が欠陥第
ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子を有し得ないことを示すもの
であると記述している。これは、彼らがそれより先にＴ
ｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．６５，アブストラク
ト３９，６５８（１９９１）で述べたこと、即ち患者の
血漿試料への活性化プロテインＣの添加、及び生じた作
用の検査によって、活性化プロテインＣにより分解され
ない欠陥第ＶＩＩＩａ因子分子が明らかにされたという
主張に反するものである。前記国際特許出願では更に、
ＡＰＣによる第Ｖａ及び第ＶＩＩＩａ因子の阻害を直接
測定するためにアッセイが使用されている。前記国際特
許出願に記載の第Ｘａ因子ベースの凝固アッセイを使用
すると、ＡＰＣによる患者第Ｖａ因子の阻害が正常であ
ることが判明した。これは、患者血漿試料中の第Ｖａ因
子が、外部から添加したＡＰＣにより正常に分解される
ことを示唆するものである。
【０００７】Ｄａｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．２）の報告
に続いて、別のグループがこの分野での研究を開始し
た。Ｇｒｉｆｆｉｎらは、Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８２，
ｎｒ．７，１９９３，１９８９−１９９３ページに、確
認可能な血液凝固異常がない２５人の静脈血栓患者、及
び予め異型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）プロテインＣ
又はプロテインＳ欠乏を有すると確認された２２人の患
者について実施したＡＰＣ耐性検査の結果を記述してい
る。これらの患者に関するＡＰＴＴのＡＰＣ誘発延長
（ＡＰＣ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏ
ｎ）アッセイが、３５の正常被験者に関する結果と比較
された。結果は、このようなＡＰＣへの抗凝血応答の新
しい欠陥が、驚いたことに、２５人の患者の５２〜６４
％、即ち予め血栓発現傾向を有すると診断されなかった
患者の大半に存在することを示した。この欠陥は、２２
人の異型プロテインＣ又はプロテインＳ欠乏患者のうち
２０人の患者には見られなかった。これは、新しい因子
が、プロテインＣ又はプロテインＳの欠乏に関係のない
危険因子であることを示唆するものであった。正常血漿
と２種類の著しい欠陥のある血漿（ＡＰＴＴのＡＰＣ誘
発延長＜２０秒）の各々とを混合し、ＡＰＴＴアッセイ
を行って、正常血漿が欠陥血漿の弱い応答を修正する能
力を評価した。結果は、Ｄａｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．
２）の結果と類似していた。これも、正常血漿が、欠陥
のある患者血漿に欠失している因子を含むことを示唆す
るものであった。前記文献には、ＡＰＣ存在下のＡＰＴ
Ｔ値からＡＰＣ不在下のＡＰＴＴ値を差し引いた値とし
て単純に定義された正味のＡＰＴＴ延長時間計算値が記
載されている。前記文献はまた、ＡＰＣ存在下のＡＰＴ
Ｔ対ＡＰＣ不在下のＡＰＴＴの比と、このパラメーター
をＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長の値と比較したという事実も
記述している。この比較は、異常患者の指標である極め
て小さいＡＰＴＴ比の値と、正常被験者に関するこれら
のパラメーターとの間の優れた相関を明らかにした。従
って、ＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長のパラメーター、あるい
はＡＰＣ存在下対ＡＰＣ不在下のＡＰＴＴ値の比のパラ
メーター、又はこれら二つのパラメーターを診断パラメ
ーターとして使用できると結論された。これらのパラメ
ーターの中には、この目的に関して、前記文献の別のパ
ラメーターより有用と思われるものはない。前記文献に
は更に、使用したＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長アッセイが、
Ｐｏｔｚｓｃｈら（Ｒｅｆ．１９）によりＢｌｏｏｄ
８０：２６７ａ １９９２（アブストラクト）に報告さ
れている抗凝血性狼瘡患者の血漿中の内在性第ＶＩＩＩ
因子のＡＰＣ誘発不活化を用いるアッセイを連想させる
と記載されている。この後者のアッセイに基づいて、Ｇ
ｒｉｆｆｉｎらの文献には、血栓症を有する抗凝血性狼
瘡患者に由来する血漿はＡＰＣに対する応答が弱く、従
って血栓症を有する患者を血栓症のない患者から区別す
ることができると報告されている。Ｇｒｉｆｆｉｎら
は、新しい仮想のＡＰＣ補因子に対する自己抗体が、抗
凝血性狼瘡患者の血栓症の危険性に関与し得ると推測し
た。彼らは更に、新しいＡＰＣ補因子の後天的欠乏が、
血栓症の後天的危険性と関係があり得ると推測すること
に興味を引かれると述べている。
に続いて、別のグループがこの分野での研究を開始し
た。Ｇｒｉｆｆｉｎらは、Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８２，
ｎｒ．７，１９９３，１９８９−１９９３ページに、確
認可能な血液凝固異常がない２５人の静脈血栓患者、及
び予め異型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）プロテインＣ
又はプロテインＳ欠乏を有すると確認された２２人の患
者について実施したＡＰＣ耐性検査の結果を記述してい
る。これらの患者に関するＡＰＴＴのＡＰＣ誘発延長
（ＡＰＣ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏ
ｎ）アッセイが、３５の正常被験者に関する結果と比較
された。結果は、このようなＡＰＣへの抗凝血応答の新
しい欠陥が、驚いたことに、２５人の患者の５２〜６４
％、即ち予め血栓発現傾向を有すると診断されなかった
患者の大半に存在することを示した。この欠陥は、２２
人の異型プロテインＣ又はプロテインＳ欠乏患者のうち
２０人の患者には見られなかった。これは、新しい因子
が、プロテインＣ又はプロテインＳの欠乏に関係のない
危険因子であることを示唆するものであった。正常血漿
と２種類の著しい欠陥のある血漿（ＡＰＴＴのＡＰＣ誘
発延長＜２０秒）の各々とを混合し、ＡＰＴＴアッセイ
を行って、正常血漿が欠陥血漿の弱い応答を修正する能
力を評価した。結果は、Ｄａｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．
２）の結果と類似していた。これも、正常血漿が、欠陥
のある患者血漿に欠失している因子を含むことを示唆す
るものであった。前記文献には、ＡＰＣ存在下のＡＰＴ
Ｔ値からＡＰＣ不在下のＡＰＴＴ値を差し引いた値とし
て単純に定義された正味のＡＰＴＴ延長時間計算値が記
載されている。前記文献はまた、ＡＰＣ存在下のＡＰＴ
Ｔ対ＡＰＣ不在下のＡＰＴＴの比と、このパラメーター
をＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長の値と比較したという事実も
記述している。この比較は、異常患者の指標である極め
て小さいＡＰＴＴ比の値と、正常被験者に関するこれら
のパラメーターとの間の優れた相関を明らかにした。従
って、ＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長のパラメーター、あるい
はＡＰＣ存在下対ＡＰＣ不在下のＡＰＴＴ値の比のパラ
メーター、又はこれら二つのパラメーターを診断パラメ
ーターとして使用できると結論された。これらのパラメ
ーターの中には、この目的に関して、前記文献の別のパ
ラメーターより有用と思われるものはない。前記文献に
は更に、使用したＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長アッセイが、
Ｐｏｔｚｓｃｈら（Ｒｅｆ．１９）によりＢｌｏｏｄ
８０：２６７ａ １９９２（アブストラクト）に報告さ
れている抗凝血性狼瘡患者の血漿中の内在性第ＶＩＩＩ
因子のＡＰＣ誘発不活化を用いるアッセイを連想させる
と記載されている。この後者のアッセイに基づいて、Ｇ
ｒｉｆｆｉｎらの文献には、血栓症を有する抗凝血性狼
瘡患者に由来する血漿はＡＰＣに対する応答が弱く、従
って血栓症を有する患者を血栓症のない患者から区別す
ることができると報告されている。Ｇｒｉｆｆｉｎら
は、新しい仮想のＡＰＣ補因子に対する自己抗体が、抗
凝血性狼瘡患者の血栓症の危険性に関与し得ると推測し
た。彼らは更に、新しいＡＰＣ補因子の後天的欠乏が、
血栓症の後天的危険性と関係があり得ると推測すること
に興味を引かれると述べている。
【０００８】Ｋｏｓｔｅｒらは、Ｌａｎｃｅｔ，１９９
３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１５０３−１５０
６ページで、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する抗
凝血応答の弱さを特徴とする凝固系の異常の臨床的重要
性を調べるために、集団ベース症例対照テストをいかに
して実施したかを記述することによって、ＡＰＣ耐性と
血栓症との関係を更に深く検討している。家族内の研究
に基づけば、ＡＰＣに対するこのような弱い応答は、常
染色体優性形質として遺伝すると思われる（Ｒｅｆ．
２、７及び４７）。原因不明の血栓症のために凝固ユニ
ット（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）と称されて
いる患者の間で前記異常は約４０％の罹患率を示し、血
栓発現傾向の主因であった（Ｒｅｆ．８及び９）。Ｋｏ
ｓｔｅｒがＬａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖ
ｏｌ．３４２，１５０３−１５０６ページに記述してい
る研究では、ＡＰＣに対する弱い応答の臨床的重要性
が、最初の客観的に確認された深静脈血栓症の経験がな
く、内在する悪影響（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｍａｌｉ
ｇｎａｎｃｙ）もない、任意に選択した７０歳以下の一
連の患者について調べられている。ＡＰＣに対するこれ
らの患者の血漿の感度が、対応する健康対照の感度と比
較された。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する血漿
ＡＰＴＴの感度は、プロテインＳ活性アッセイのために
先に開発された試薬及び反応条件を用いて（Ｒｅｆ．１
１）、本質的にＤａｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．２）が記
述しているように測定された。結果は、ＡＰＴＴ（＋Ａ
ＰＣ）／ＡＰＴＴ（−ＡＰＣ）の値として定義されるＡ
ＰＣ感度比（ＡＰＣ−ＳＲ）として示されている。Ｋｏ
ｓｔｅｒらの論文には（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２
月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１５０３−１５０６ペー
ジ）、プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の低い濃度
（＜０．５ｕ／ｍｌ）が、ＡＰＣ−ＳＲを増加させると
記述されている。そのため、経口抗凝血剤で治療してい
る患者の血漿の評価に該検査を使用することはできな
い。９８個の一連の試料では、Ｋｏｓｔｅｒらのテスト
（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３
４２，１５０３−１５０６ページ）で得られたＡＰＣ−
ＳＲと、ＷＯ９３／１０２６１号に記載のようにＣｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｉｘによって開発されたテストで得られた
ＡＰＣ−ＳＲとの間に良好な相関が見出された。健康対
照被験者に基づいてＡＰＣ感度比の基準範囲が算出され
た。データの対数変換及び平均値の三つの標準偏差（Ｓ
Ｄ）外の値を有する１０人の被験者の除外後の正常の下
限値は、２．１７（平均値−１．９６ ＳＤ）であっ
た。血栓症にかかる危険と応答の度合いとの間に反比例
関係が発見された。血栓症患者の弱いＡＰＣ応答の罹患
率が２１％であり、且つ血栓症の確率比（ｏｄｄｓ ｒ
ａｔｉｏ）が６．６であるという理由から、弱いＡＰＣ
応答は深静脈血栓症の一般的な強力危険因子とみなし得
ると結論された。さらには、ＡＰＣ感度比が約１．１０
の被験者は同型（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）又は二重異型
（ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）であり
得、ＡＰＣ感度比が約１．５０の被験者は異常に対して
異型であり得るとさえ推論された。健康対照被験者の前
記異常の罹患率は５％であった。ＡＰＣ−ＳＲの分布は
明らかに双峰であるため、Ｋｏｓｔｅｒらは、被験者が
正常範囲内で低すぎる値を有するのではなく、実際に異
常なＡＰＣ応答を有すると考えた。従って、血栓症にか
かる危険とＡＰＣ応答との間の関係は、単純な単一遺伝
子欠陥のモデルに従うものではないと思われた。前記異
常は健康被験者の間に広く発見されたため、Ｋｏｓｔｅ
ｒらは、プロテインＣ欠乏についても同様であるよう
に、欠陥自体が血栓症を起こすのに十分であるとは思え
ないと考えた（Ｒｅｆ．１５、Ｒｅｆ．１６）。特定の
患者における血栓症の発生には、別の原因となる因子が
必要と思われる。これは後天的因子であり得、まだ知ら
れていない遺伝子欠陥もしくは変異でもあり得る。しか
しながら、別の原因となる因子が存在すれば、弱いＡＰ
Ｃ応答は、相対的危険性の６〜７倍の増加によって証明
されるように、血栓症を発生させる危険が高い。前記論
文には、弱いＡＰＣ応答の潜在的欠陥は、活性化プロテ
インＣに対する補因子の常染色体優性遺伝性欠乏が仮想
されたとしても（Ｒｅｆ．７）、依然として解明されな
いままであると記述されている。弱いＡＰＣ応答は、プ
ロテインＣ、プロテインＳ又は抗トロンビンの欠乏の５
〜１０倍の頻度を有すると思われる一方で、ほぼ類似の
相対的血栓症危険率を与える（Ｒｅｆ．１７及び１
８）。これは、Ｋｏｓｔｅｒらによれば、前記異常に関
する総ての静脈血栓症患者の検査を価値あるものにし得
るデータである。
３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１５０３−１５０
６ページで、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する抗
凝血応答の弱さを特徴とする凝固系の異常の臨床的重要
性を調べるために、集団ベース症例対照テストをいかに
して実施したかを記述することによって、ＡＰＣ耐性と
血栓症との関係を更に深く検討している。家族内の研究
に基づけば、ＡＰＣに対するこのような弱い応答は、常
染色体優性形質として遺伝すると思われる（Ｒｅｆ．
２、７及び４７）。原因不明の血栓症のために凝固ユニ
ット（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）と称されて
いる患者の間で前記異常は約４０％の罹患率を示し、血
栓発現傾向の主因であった（Ｒｅｆ．８及び９）。Ｋｏ
ｓｔｅｒがＬａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖ
ｏｌ．３４２，１５０３−１５０６ページに記述してい
る研究では、ＡＰＣに対する弱い応答の臨床的重要性
が、最初の客観的に確認された深静脈血栓症の経験がな
く、内在する悪影響（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｍａｌｉ
ｇｎａｎｃｙ）もない、任意に選択した７０歳以下の一
連の患者について調べられている。ＡＰＣに対するこれ
らの患者の血漿の感度が、対応する健康対照の感度と比
較された。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する血漿
ＡＰＴＴの感度は、プロテインＳ活性アッセイのために
先に開発された試薬及び反応条件を用いて（Ｒｅｆ．１
１）、本質的にＤａｈｌｂａｃｋら（Ｒｅｆ．２）が記
述しているように測定された。結果は、ＡＰＴＴ（＋Ａ
ＰＣ）／ＡＰＴＴ（−ＡＰＣ）の値として定義されるＡ
ＰＣ感度比（ＡＰＣ−ＳＲ）として示されている。Ｋｏ
ｓｔｅｒらの論文には（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２
月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１５０３−１５０６ペー
ジ）、プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の低い濃度
（＜０．５ｕ／ｍｌ）が、ＡＰＣ−ＳＲを増加させると
記述されている。そのため、経口抗凝血剤で治療してい
る患者の血漿の評価に該検査を使用することはできな
い。９８個の一連の試料では、Ｋｏｓｔｅｒらのテスト
（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３
４２，１５０３−１５０６ページ）で得られたＡＰＣ−
ＳＲと、ＷＯ９３／１０２６１号に記載のようにＣｈｒ
ｏｍｏｇｅｎｉｘによって開発されたテストで得られた
ＡＰＣ−ＳＲとの間に良好な相関が見出された。健康対
照被験者に基づいてＡＰＣ感度比の基準範囲が算出され
た。データの対数変換及び平均値の三つの標準偏差（Ｓ
Ｄ）外の値を有する１０人の被験者の除外後の正常の下
限値は、２．１７（平均値−１．９６ ＳＤ）であっ
た。血栓症にかかる危険と応答の度合いとの間に反比例
関係が発見された。血栓症患者の弱いＡＰＣ応答の罹患
率が２１％であり、且つ血栓症の確率比（ｏｄｄｓ ｒ
ａｔｉｏ）が６．６であるという理由から、弱いＡＰＣ
応答は深静脈血栓症の一般的な強力危険因子とみなし得
ると結論された。さらには、ＡＰＣ感度比が約１．１０
の被験者は同型（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）又は二重異型
（ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）であり
得、ＡＰＣ感度比が約１．５０の被験者は異常に対して
異型であり得るとさえ推論された。健康対照被験者の前
記異常の罹患率は５％であった。ＡＰＣ−ＳＲの分布は
明らかに双峰であるため、Ｋｏｓｔｅｒらは、被験者が
正常範囲内で低すぎる値を有するのではなく、実際に異
常なＡＰＣ応答を有すると考えた。従って、血栓症にか
かる危険とＡＰＣ応答との間の関係は、単純な単一遺伝
子欠陥のモデルに従うものではないと思われた。前記異
常は健康被験者の間に広く発見されたため、Ｋｏｓｔｅ
ｒらは、プロテインＣ欠乏についても同様であるよう
に、欠陥自体が血栓症を起こすのに十分であるとは思え
ないと考えた（Ｒｅｆ．１５、Ｒｅｆ．１６）。特定の
患者における血栓症の発生には、別の原因となる因子が
必要と思われる。これは後天的因子であり得、まだ知ら
れていない遺伝子欠陥もしくは変異でもあり得る。しか
しながら、別の原因となる因子が存在すれば、弱いＡＰ
Ｃ応答は、相対的危険性の６〜７倍の増加によって証明
されるように、血栓症を発生させる危険が高い。前記論
文には、弱いＡＰＣ応答の潜在的欠陥は、活性化プロテ
インＣに対する補因子の常染色体優性遺伝性欠乏が仮想
されたとしても（Ｒｅｆ．７）、依然として解明されな
いままであると記述されている。弱いＡＰＣ応答は、プ
ロテインＣ、プロテインＳ又は抗トロンビンの欠乏の５
〜１０倍の頻度を有すると思われる一方で、ほぼ類似の
相対的血栓症危険率を与える（Ｒｅｆ．１７及び１
８）。これは、Ｋｏｓｔｅｒらによれば、前記異常に関
する総ての静脈血栓症患者の検査を価値あるものにし得
るデータである。
【０００９】要約すれば、当業界では、プロテインＣ抗
凝血経路の欠陥が、比較的高い血栓症発生危険率に関係
していることが確認された。活性化プロテインＣに対す
る弱い抗凝血応答は細部にわたって研究されてきたが、
活性化プロテインＣに対する弱い抗凝血応答の原因はま
だ解明されていない。多くの仮説がたてられたが、唯一
受け入れられたのは、活性化プロテインＣに対して弱い
抗凝血応答を示す患者に明らかに欠乏している未知のＡ
ＰＣ補因子の存在である。仮想のＡＰＣ補因子のアイデ
ンティティは不明である。また、ＡＰＣに対する応答の
変化を検出するために現在使用されている検査は、既に
抗凝血剤を使用している被験者には使用できない。
凝血経路の欠陥が、比較的高い血栓症発生危険率に関係
していることが確認された。活性化プロテインＣに対す
る弱い抗凝血応答は細部にわたって研究されてきたが、
活性化プロテインＣに対する弱い抗凝血応答の原因はま
だ解明されていない。多くの仮説がたてられたが、唯一
受け入れられたのは、活性化プロテインＣに対して弱い
抗凝血応答を示す患者に明らかに欠乏している未知のＡ
ＰＣ補因子の存在である。仮想のＡＰＣ補因子のアイデ
ンティティは不明である。また、ＡＰＣに対する応答の
変化を検出するために現在使用されている検査は、既に
抗凝血剤を使用している被験者には使用できない。
【００１０】発明の説明 驚くべきことに、弱い抗凝血プロテインＣ応答の原因で
ある同定されていない補因子のアイデンティティが判明
した。前述の認められていなかったメカニズムのうちの
一つが、実際に、血栓発現傾向のある患者の大半におけ
るプロテインＣ抗凝血経路の欠陥に関与していることが
判明したのである。この欠陥の原因は、発現後に、第Ｖ
因子及び／又は第Ｖａ因子（前記第Ｖ因子の活性化産
物）、又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子
（前記第ＶＩＩＩ因子の活性化産物）のＡＰＣによる不
活化の度合いの低下に関与する、第Ｖ因子又は第ＶＩＩ
Ｉ因子をコードする核酸物質中の突然変異の存在に結び
付けられた。従って前記欠陥は、まだ同定されていない
ＡＰＣ補因子の突然変異の結果ではなく、実際には、第
Ｖ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子の欠乏、又はより特定的
にはこれら因子の活性化産物の欠陥に起因する。
ある同定されていない補因子のアイデンティティが判明
した。前述の認められていなかったメカニズムのうちの
一つが、実際に、血栓発現傾向のある患者の大半におけ
るプロテインＣ抗凝血経路の欠陥に関与していることが
判明したのである。この欠陥の原因は、発現後に、第Ｖ
因子及び／又は第Ｖａ因子（前記第Ｖ因子の活性化産
物）、又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子
（前記第ＶＩＩＩ因子の活性化産物）のＡＰＣによる不
活化の度合いの低下に関与する、第Ｖ因子又は第ＶＩＩ
Ｉ因子をコードする核酸物質中の突然変異の存在に結び
付けられた。従って前記欠陥は、まだ同定されていない
ＡＰＣ補因子の突然変異の結果ではなく、実際には、第
Ｖ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子の欠乏、又はより特定的
にはこれら因子の活性化産物の欠陥に起因する。
【００１１】当業界で公知のように、血栓症が発生する
危険とＡＰＣ耐性の存在との間の関係は既に確認されて
おり、この種の欠陥のスクリーニングは実際に、血栓症
を起こす危険が高い患者の診断に極めて有用と思われ
る。現在では、どの因子が関係のある遺伝子欠陥を有し
ているかが分かっているため、ＡＰＣ耐性を調べるため
のＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテスト以外の方法で集団を実
際にスクリーニングすることが可能となった。
危険とＡＰＣ耐性の存在との間の関係は既に確認されて
おり、この種の欠陥のスクリーニングは実際に、血栓症
を起こす危険が高い患者の診断に極めて有用と思われ
る。現在では、どの因子が関係のある遺伝子欠陥を有し
ているかが分かっているため、ＡＰＣ耐性を調べるため
のＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテスト以外の方法で集団を実
際にスクリーニングすることが可能となった。
【００１２】ＡＰＣ耐性に関連した変異を受けた第Ｖ因
子又は第ＶＩＩＩ因子についてスクリーニングする時
に、突然変異タンパク質の存在を調べるためにＤＮＡ技
術を使用するか又は抗体を使用することが可能になっ
た。本発明は、血栓症及び／又は活性化プロテインＣ
（ＡＰＣ）に対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠
陥の存在をスクリーニングする方法に関する。前記遺伝
性欠陥は、患者の血栓症発生の危険が高いことを示す
か、又は実際に血栓症を生起させるようなものである。
該方法は、それ自体公知の方法で第Ｖ因子又は第ＶＩＩ
Ｉ因子をコードする核酸物質の突然変異の存在を測定す
ることからなり、但し核酸物質発現時の前記突然変異
は、ＡＰＣによる前記第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子
（前記第Ｖ因子の活性化産物）、あるいは前記第ＶＩＩ
Ｉ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子（前記第ＶＩＩＩ因
子の活性化産物）の不活化の度合いの低下に関係してお
り、及び／又は、該方法は、タンパク質第Ｖ因子及び／
又は第Ｖａ因子中に存在する突然変異、及び／又はタン
パク質第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子中に
存在する突然変異を、それ自体公知の方法で、前記第Ｖ
因子及び／又は第Ｖａ因子あるいは第ＶＩＩＩ因子及び
／又は第ＶＩＩＩａ因子の分析、又は前記第Ｖ因子及び
／又は前記第Ｖａ因子、及び／又は第ＶＩＩＩ因子及び
／又は第ＶＩＩＩａ因子のタンパク分解フラグメントの
分析により調べることからなり、但し前記突然変異はＡ
ＰＣによる前記第Ｖ因子及び／又は前記第Ｖａ因子及び
／又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の不
活化の度合いの低下に相関するものである。本発明は特
に、第Ｖ因子及び／又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核
酸配列における突然変異が、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子
及び／又は第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子上の
ＡＰＣの結合部位又は開裂部位をコードする核酸配列部
分内に存在し、該突然変異が、ＡＰＣによって弱く不活
化された第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子及び／又は第Ｖ
ＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子を生成させる場
合の方法に関する。第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｖａ
因子及び第ＶＩＩＩａ因子中のＡＰＣの結合及び開裂部
位は多数存在することが知られている（表１、Ｒｅｆ．
３４、３５、３６、４８、４９、５２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６２，１１２３３−１１２３８（１９８
７）に記載のＯｄｅｇａａｒｄ Ｂ及びＭａｎｎ Ｋ．
Ｇ．の論文、並びにＢｌｏｏｄ ８２，Ｓｕｐｐｌ．
１，ｐ．５８ａ，１９９３に記載のＫａｌａｆａｔｉｓ
Ｍ．，Ｈａｌｅｙ Ｐ．Ｅ．及びＭａｎｎ Ｋ．Ｇ．
のアブストラクト参照）。
子又は第ＶＩＩＩ因子についてスクリーニングする時
に、突然変異タンパク質の存在を調べるためにＤＮＡ技
術を使用するか又は抗体を使用することが可能になっ
た。本発明は、血栓症及び／又は活性化プロテインＣ
（ＡＰＣ）に対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠
陥の存在をスクリーニングする方法に関する。前記遺伝
性欠陥は、患者の血栓症発生の危険が高いことを示す
か、又は実際に血栓症を生起させるようなものである。
該方法は、それ自体公知の方法で第Ｖ因子又は第ＶＩＩ
Ｉ因子をコードする核酸物質の突然変異の存在を測定す
ることからなり、但し核酸物質発現時の前記突然変異
は、ＡＰＣによる前記第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子
（前記第Ｖ因子の活性化産物）、あるいは前記第ＶＩＩ
Ｉ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子（前記第ＶＩＩＩ因
子の活性化産物）の不活化の度合いの低下に関係してお
り、及び／又は、該方法は、タンパク質第Ｖ因子及び／
又は第Ｖａ因子中に存在する突然変異、及び／又はタン
パク質第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子中に
存在する突然変異を、それ自体公知の方法で、前記第Ｖ
因子及び／又は第Ｖａ因子あるいは第ＶＩＩＩ因子及び
／又は第ＶＩＩＩａ因子の分析、又は前記第Ｖ因子及び
／又は前記第Ｖａ因子、及び／又は第ＶＩＩＩ因子及び
／又は第ＶＩＩＩａ因子のタンパク分解フラグメントの
分析により調べることからなり、但し前記突然変異はＡ
ＰＣによる前記第Ｖ因子及び／又は前記第Ｖａ因子及び
／又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の不
活化の度合いの低下に相関するものである。本発明は特
に、第Ｖ因子及び／又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核
酸配列における突然変異が、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子
及び／又は第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子上の
ＡＰＣの結合部位又は開裂部位をコードする核酸配列部
分内に存在し、該突然変異が、ＡＰＣによって弱く不活
化された第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子及び／又は第Ｖ
ＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子を生成させる場
合の方法に関する。第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｖａ
因子及び第ＶＩＩＩａ因子中のＡＰＣの結合及び開裂部
位は多数存在することが知られている（表１、Ｒｅｆ．
３４、３５、３６、４８、４９、５２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．２６２，１１２３３−１１２３８（１９８
７）に記載のＯｄｅｇａａｒｄ Ｂ及びＭａｎｎ Ｋ．
Ｇ．の論文、並びにＢｌｏｏｄ ８２，Ｓｕｐｐｌ．
１，ｐ．５８ａ，１９９３に記載のＫａｌａｆａｔｉｓ
Ｍ．，Ｈａｌｅｙ Ｐ．Ｅ．及びＭａｎｎ Ｋ．Ｇ．
のアブストラクト参照）。
【００１３】
【表１】
【００１４】結合部位は必ずしも開裂部位ではない。し
かしながら、この種の因子へのＡＰＣの結合を弱めるあ
らゆる効果がこの種の因子のＡＰＣ耐性にも作用するこ
とはかなり明白である。なぜなら、一般的に、該因子は
ＡＰＣと結合した後でなければＡＰＣによって開裂する
ことができないからである。結合及び／又は開裂部位に
作用する突然変異は、結合部位に位置するアミノ酸の一
次アミノ酸配列中に存在し得、又はＡＰＣ結合及び／又
は開裂に対する親和性が小さい三次構造を形成させる分
子中の別の場所の突然変異に起因し得る。多数のＡＰＣ
結合及び／又は開裂部位が明らかにされているため、分
子全体ではなく、これらの位置の突然変異についてスク
リーニングを行うのが最も簡単であることは明白であ
る。多くのＡＰＣ開裂部位が第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ
及び第ＶＩＩＩａ因子のＨ鎖上に存在することが知られ
ているため、検出すべき突然変異は、Ｈ鎖上のＡＰＣ開
裂部位をコードする核酸配列部分内の位置に存在するの
が好ましい。
かしながら、この種の因子へのＡＰＣの結合を弱めるあ
らゆる効果がこの種の因子のＡＰＣ耐性にも作用するこ
とはかなり明白である。なぜなら、一般的に、該因子は
ＡＰＣと結合した後でなければＡＰＣによって開裂する
ことができないからである。結合及び／又は開裂部位に
作用する突然変異は、結合部位に位置するアミノ酸の一
次アミノ酸配列中に存在し得、又はＡＰＣ結合及び／又
は開裂に対する親和性が小さい三次構造を形成させる分
子中の別の場所の突然変異に起因し得る。多数のＡＰＣ
結合及び／又は開裂部位が明らかにされているため、分
子全体ではなく、これらの位置の突然変異についてスク
リーニングを行うのが最も簡単であることは明白であ
る。多くのＡＰＣ開裂部位が第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ
及び第ＶＩＩＩａ因子のＨ鎖上に存在することが知られ
ているため、検出すべき突然変異は、Ｈ鎖上のＡＰＣ開
裂部位をコードする核酸配列部分内の位置に存在するの
が好ましい。
【００１５】第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の活性化はトロン
ビン因子Ｘａによって生起し得、第Ｖ因子の場合はある
種のヘビ毒によっても生起し得る。当業者は、「特定因
子によって（で）活性化された（した）」という表現
を、「特定因子を介して活性化された（した）」と解釈
することもできる。その結果得られる活性化因子は、そ
れぞれの活性化方法に起因して少しだけ異なる。従っ
て、トロビンで活性化した第Ｖａ因子のＡＰＣによる結
合及び／又は開裂を低下させる突然変異が、Ｘａで活性
化した第Ｖａ因子のＡＰＣによる結合及び／又は開裂を
低下させないことは可能であり、その逆も可能である。
第Ｖ因子は次のドメイン構造Ａ１Ａ２／ＢＡ３Ｃ１Ｃ２
を有し、Ｘａで活性化した第Ｖａ因子は構造Ａ１Ａ２／
Ｂ’Ａ３Ｃ１Ｃ２を有し、トロビンで活性化した第Ｖａ
因子は構造Ａ１Ａ２／Ａ３Ｃ１Ｃ２を有する。三次構造
の相違はおそらく、異なる方法で活性化された時に生じ
るこれら因子のＬ鎖の構造変化に起因する。本明細書に
記載の実施例では、活性化がＸａを介して開始され、ト
ロビンを介して活性化された第Ｖａ因子のＡＰＣ不活化
に作用しなかった時には、説明されている特定の突然変
異が実際に、第Ｖａ因子のＡＰＣ不活化のみを抑制した
ことが明らかにされている。この特定の突然変異は、第
Ｖ因子のＨ鎖上に存在していたため、トロビンを介して
活性化した第Ｖａ因子及びＸａを介して活性化した第Ｖ
ａ因子の両方に存在するが、おそらくは、二つの形態の
活性化因子Ｖの三次構造の相違のためにこれら二つの形
態の活性化因子内で同じ作用を発揮することはない。
ビン因子Ｘａによって生起し得、第Ｖ因子の場合はある
種のヘビ毒によっても生起し得る。当業者は、「特定因
子によって（で）活性化された（した）」という表現
を、「特定因子を介して活性化された（した）」と解釈
することもできる。その結果得られる活性化因子は、そ
れぞれの活性化方法に起因して少しだけ異なる。従っ
て、トロビンで活性化した第Ｖａ因子のＡＰＣによる結
合及び／又は開裂を低下させる突然変異が、Ｘａで活性
化した第Ｖａ因子のＡＰＣによる結合及び／又は開裂を
低下させないことは可能であり、その逆も可能である。
第Ｖ因子は次のドメイン構造Ａ１Ａ２／ＢＡ３Ｃ１Ｃ２
を有し、Ｘａで活性化した第Ｖａ因子は構造Ａ１Ａ２／
Ｂ’Ａ３Ｃ１Ｃ２を有し、トロビンで活性化した第Ｖａ
因子は構造Ａ１Ａ２／Ａ３Ｃ１Ｃ２を有する。三次構造
の相違はおそらく、異なる方法で活性化された時に生じ
るこれら因子のＬ鎖の構造変化に起因する。本明細書に
記載の実施例では、活性化がＸａを介して開始され、ト
ロビンを介して活性化された第Ｖａ因子のＡＰＣ不活化
に作用しなかった時には、説明されている特定の突然変
異が実際に、第Ｖａ因子のＡＰＣ不活化のみを抑制した
ことが明らかにされている。この特定の突然変異は、第
Ｖ因子のＨ鎖上に存在していたため、トロビンを介して
活性化した第Ｖａ因子及びＸａを介して活性化した第Ｖ
ａ因子の両方に存在するが、おそらくは、二つの形態の
活性化因子Ｖの三次構造の相違のためにこれら二つの形
態の活性化因子内で同じ作用を発揮することはない。
【００１６】通常は、ＡＰＣによる不活化は活性化第Ｖ
因子又は活性化第ＶＩＩＩ因子上で生起するため、本発
明の方法は、好ましくは、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ
因子上のＡＰＣに対する結合親和性の低下及び／又はＡ
ＰＣによる開裂の低下を引き起こす突然変異の検出に適
用される。一般的には、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因
子に存在する突然変異は、これらの活性化産物の由来源
である第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子上にも存在する。従
って、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配
列を分析すれば、活性化因子Ｖａ又はＶＩＩＩａにも存
在し得る突然変異が検出されることになる。従って、本
発明の方法による分析は、第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の核
酸レベル、例えばＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡレベル、並
びに第Ｖａ、第ＶＩＩＩａ、第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の
うちのいずれか、又はこれらの因子に由来するフラグメ
ント上のタンパク質レベルで実施することができる。
因子又は活性化第ＶＩＩＩ因子上で生起するため、本発
明の方法は、好ましくは、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ
因子上のＡＰＣに対する結合親和性の低下及び／又はＡ
ＰＣによる開裂の低下を引き起こす突然変異の検出に適
用される。一般的には、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因
子に存在する突然変異は、これらの活性化産物の由来源
である第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子上にも存在する。従
って、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配
列を分析すれば、活性化因子Ｖａ又はＶＩＩＩａにも存
在し得る突然変異が検出されることになる。従って、本
発明の方法による分析は、第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の核
酸レベル、例えばＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡレベル、並
びに第Ｖａ、第ＶＩＩＩａ、第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の
うちのいずれか、又はこれらの因子に由来するフラグメ
ント上のタンパク質レベルで実施することができる。
【００１７】第Ｖａ因子ＤＮＡは、ＨｅｐＧ２細胞（Ｒ
ｅｆ．２０）及びヒト胎児肝臓（Ｒｅｆ．２１及び２
２）からクローニングされた。第Ｖ因子の完全アミノ酸
配列は既知であり（Ｒｅｆ．２０、２３）、第Ｖ因子遺
伝子の構造も解明されている（Ｒｅｆ．２３）。Ｓｈｅ
ｎらは（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，２９９２−３００１，Ｎ
ｏ．７，１９９３年４月１日）、どのようにしてヒト第
Ｖ因子の細胞供給源を発見したかを記述している。彼ら
は、逆転写とそれに次ぐポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−
ＰＣＲ）とを用いて、ヒトリンパ球内の第Ｖ因子ｍＲＮ
Ａを同定した。ＰＣＲで得られた結果は、Ｔ細胞 ｃＤ
ＮＡライブラリーからの第Ｖ因子ｃＤＮＡの独立クロー
ニングによって確認された。第Ｖ因子ｃＤＮＡの配列
は、肝臓第Ｖ因子ｍＲＮＡとほぼ同じであった。第Ｖ因
子タンパク質の連結領域の一部をコードする限定された
長さのｍＲＮＡが、６個のヌクレオチド置換に基づくヌ
クレオチド多形性を有することが判明した。Ｓｈｅｎら
は、増幅後に誘導された１４個の独立クローン内に存在
する増幅Ｆ７／Ｆ８第Ｖ因子ｃＤＮＡフラグメントが、
６個のヌクレオチドベース置換を有すると記述してい
る。２個の置換は、それぞれ位置２２０９及び２２３６
でのチミンからシトシン及びシトシンからチミンへの置
換であり、これらはサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変
異であった。４個の置換は、位置２３０２でやはりサイ
レント突然変異を生起させるグアニンからアデニンベー
スの置換、並びに位置２５７３でのアルギニンからリシ
ンへのアミノ酸変化、位置２５９５でのアルギニンから
ヒスチジンへのアミノ酸変化、位置２７７３でのグルタ
ミン酸からリシンへのアミノ酸変化であった。これらの
推定上のアミノ酸変化は、前記論文で、第Ｖ因子機能に
重大に作用しない保存的置換であると記述されている。
クローンのうちの半分（１４個のうち７個）は更に、位
置２２９０でアデニンからグアニンへの置換を示した。
これは、ＥｃｏＲＩ部位を消滅させる別のサイレント置
換であった。これらの突然変異の中には、ＡＰＣ結合又
は開裂に対する親和性の低下に関与しているものはなか
った。
ｅｆ．２０）及びヒト胎児肝臓（Ｒｅｆ．２１及び２
２）からクローニングされた。第Ｖ因子の完全アミノ酸
配列は既知であり（Ｒｅｆ．２０、２３）、第Ｖ因子遺
伝子の構造も解明されている（Ｒｅｆ．２３）。Ｓｈｅ
ｎらは（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏ
ｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，２９９２−３００１，Ｎ
ｏ．７，１９９３年４月１日）、どのようにしてヒト第
Ｖ因子の細胞供給源を発見したかを記述している。彼ら
は、逆転写とそれに次ぐポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−
ＰＣＲ）とを用いて、ヒトリンパ球内の第Ｖ因子ｍＲＮ
Ａを同定した。ＰＣＲで得られた結果は、Ｔ細胞 ｃＤ
ＮＡライブラリーからの第Ｖ因子ｃＤＮＡの独立クロー
ニングによって確認された。第Ｖ因子ｃＤＮＡの配列
は、肝臓第Ｖ因子ｍＲＮＡとほぼ同じであった。第Ｖ因
子タンパク質の連結領域の一部をコードする限定された
長さのｍＲＮＡが、６個のヌクレオチド置換に基づくヌ
クレオチド多形性を有することが判明した。Ｓｈｅｎら
は、増幅後に誘導された１４個の独立クローン内に存在
する増幅Ｆ７／Ｆ８第Ｖ因子ｃＤＮＡフラグメントが、
６個のヌクレオチドベース置換を有すると記述してい
る。２個の置換は、それぞれ位置２２０９及び２２３６
でのチミンからシトシン及びシトシンからチミンへの置
換であり、これらはサイレント（ｓｉｌｅｎｔ）突然変
異であった。４個の置換は、位置２３０２でやはりサイ
レント突然変異を生起させるグアニンからアデニンベー
スの置換、並びに位置２５７３でのアルギニンからリシ
ンへのアミノ酸変化、位置２５９５でのアルギニンから
ヒスチジンへのアミノ酸変化、位置２７７３でのグルタ
ミン酸からリシンへのアミノ酸変化であった。これらの
推定上のアミノ酸変化は、前記論文で、第Ｖ因子機能に
重大に作用しない保存的置換であると記述されている。
クローンのうちの半分（１４個のうち７個）は更に、位
置２２９０でアデニンからグアニンへの置換を示した。
これは、ＥｃｏＲＩ部位を消滅させる別のサイレント置
換であった。これらの突然変異の中には、ＡＰＣ結合又
は開裂に対する親和性の低下に関与しているものはなか
った。
【００１８】Ｓｈｅｎらの論文には、第Ｖ因子ｍＲＮＡ
を、例えばポリメラーゼ連鎖反応を生起させるのに十分
な量で、ヒトリンパ球から回収できると記述されてい
る。この情報に基づいて、当業者は、本発明の方法を実
施するのに十分な量の核酸をヒトから容易に回収でき
る。Ｓｈｅｎらの論文には、ヒト第Ｖ因子核酸の核酸増
幅に使用できるオリゴヌクレオチドが多数紹介されてい
る。
を、例えばポリメラーゼ連鎖反応を生起させるのに十分
な量で、ヒトリンパ球から回収できると記述されてい
る。この情報に基づいて、当業者は、本発明の方法を実
施するのに十分な量の核酸をヒトから容易に回収でき
る。Ｓｈｅｎらの論文には、ヒト第Ｖ因子核酸の核酸増
幅に使用できるオリゴヌクレオチドが多数紹介されてい
る。
【００１９】Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎ
ｎは（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２
３，１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２
３８）、第Ｖ及び第Ｖａ因子の両方について、トロンビ
ンによる第Ｖ因子の開裂が、Ｍｒ＝９４，０００のＨ鎖
（Ｄ鎖）及びＭｒ＝７４，０００のＬ鎖（Ｅ鎖）を形成
させると記述している。各鎖自体は、活性化プロテイン
Ｃ及び第Ｘａ因子によるタンパク質分解を受け易い。活
性化プロテインＣ又は第Ｘａ因子によるＥ鎖の開裂は、
二つの主要フラグメント、Ｍｒ＝３０，０００及びＭｒ
＝４８，０００を与える。彼らはまた、活性化プロテイ
ンＣ及び第Ｘａ因子がＥ鎖を同じ位置で開裂すると記述
している。Ｄ鎖の活性化プロテインＣ開裂では、二つの
産生物Ｍｒ＝７０，０００及びＭ ｒ＝２４，０００が得
られる。Ｍｒ＝７０，０００フラグメントは、無傷Ｄ鎖
と同じＮＨ２末端配列を有するが、Ｍｒ＝２４，０００
フラグメントはそうではない。彼らは、活性化プロテイ
ンＣによるＤ鎖の開裂が第Ｖａ因子の部分的不活化の原
因であることを明らかにした。Ｌ鎖の開裂はより遅いた
め、第Ｖａ因子の不活化がそのＨ鎖の開裂に関係がある
という証拠は、Ｒｅｆ．１０、１２、１３、１４及び４
８にも示されている。
ｎは（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２
３，１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２
３８）、第Ｖ及び第Ｖａ因子の両方について、トロンビ
ンによる第Ｖ因子の開裂が、Ｍｒ＝９４，０００のＨ鎖
（Ｄ鎖）及びＭｒ＝７４，０００のＬ鎖（Ｅ鎖）を形成
させると記述している。各鎖自体は、活性化プロテイン
Ｃ及び第Ｘａ因子によるタンパク質分解を受け易い。活
性化プロテインＣ又は第Ｘａ因子によるＥ鎖の開裂は、
二つの主要フラグメント、Ｍｒ＝３０，０００及びＭｒ
＝４８，０００を与える。彼らはまた、活性化プロテイ
ンＣ及び第Ｘａ因子がＥ鎖を同じ位置で開裂すると記述
している。Ｄ鎖の活性化プロテインＣ開裂では、二つの
産生物Ｍｒ＝７０，０００及びＭ ｒ＝２４，０００が得
られる。Ｍｒ＝７０，０００フラグメントは、無傷Ｄ鎖
と同じＮＨ２末端配列を有するが、Ｍｒ＝２４，０００
フラグメントはそうではない。彼らは、活性化プロテイ
ンＣによるＤ鎖の開裂が第Ｖａ因子の部分的不活化の原
因であることを明らかにした。Ｌ鎖の開裂はより遅いた
め、第Ｖａ因子の不活化がそのＨ鎖の開裂に関係がある
という証拠は、Ｒｅｆ．１０、１２、１３、１４及び４
８にも示されている。
【００２０】Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎｎは、第Ｖａ
因子と第ＶＩＩＩａ因子との間に大きな類似性があるこ
とも明らかにした。第ＶＩＩＩａ因子は、タンパ分解に
よって活性が調節される凝固カスケード（ｃｌｏｔｔｉ
ｎｇ ｃａｓｃａｄｅ）の別の補因子である。第ＶＩＩ
Ｉａ及び第Ｖａ因子は多くの類似した構造的及び機能的
特性を有する。どちらもトロンビン又は第Ｘａ因子によ
る開裂を介して大きなプロコファクターから産生され、
どちらもほぼ同じ大きさを有し、Ｈ鎖とＬ鎖とからな
る。どちらももタンパク分解複合体の活性に大きく寄与
する一方で、それ自体はタンパク分解活性を発揮しな
い。また、どちらもも活性化プロテインＣにより不活化
される。この共通の特徴の根底には、一次構造の明らか
な相同もある（Ｒｅｆ．２４，２５及び２６）。Ｏｄｅ
ｇａａｒｄらはまた、第Ｖ因子と第ＶＩＩＩ因子との間
の更に大きな配列相同を同定した。彼らは特に、開裂が
生起する第Ｖ因子分子内の位置に十分妥当に対応する第
ＶＩＩＩ因子分子内の位置で、ウシ第Ｖ因子とヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子との間に配列相同セグメントが明らかに存在
すると記述している。ヒト第Ｖ因子について（実施例１
で）我々が明らかにした作用は、特定の面における第Ｖ
因子と第ＶＩＩＩ因子との同等性に起因して、第ＶＩＩ
Ｉ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子についても付随的に期待
できる。Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎｎは更に、ＡＰＣ
による第Ｖａ因子の開裂後にＨ鎖が残らない場合でも、
残留補因子活性が残ると記述している。これは、第Ｖａ
因子の不活化が、単一結合の単なる開裂より複雑な事象
であることを意味する。これは、第Ｖ因子分子のＡＰＣ
結合及び／又は開裂部位の突然変異が、実際にＡＰＣに
よる不活化に対する親和性を低下させるのに十分である
という本明細書の実施例の説明を更に驚くべきものとす
るものである。第ＶＩＩＩ因子の場合は、ＡＰＣ開裂部
位はＡｒｇ ５６２、Ａｒｇ ３３６及びＡｒｇ ７４
０にあると想定され（Ｒｅｆ．４９）、ＡＰＣ結合部位
は残基２００９−２０１８上でＡ３ドメイン内に存在す
ると想定された（Ｒｅｆ．３５、３６）（表１も参照の
こと）。
因子と第ＶＩＩＩａ因子との間に大きな類似性があるこ
とも明らかにした。第ＶＩＩＩａ因子は、タンパ分解に
よって活性が調節される凝固カスケード（ｃｌｏｔｔｉ
ｎｇ ｃａｓｃａｄｅ）の別の補因子である。第ＶＩＩ
Ｉａ及び第Ｖａ因子は多くの類似した構造的及び機能的
特性を有する。どちらもトロンビン又は第Ｘａ因子によ
る開裂を介して大きなプロコファクターから産生され、
どちらもほぼ同じ大きさを有し、Ｈ鎖とＬ鎖とからな
る。どちらももタンパク分解複合体の活性に大きく寄与
する一方で、それ自体はタンパク分解活性を発揮しな
い。また、どちらもも活性化プロテインＣにより不活化
される。この共通の特徴の根底には、一次構造の明らか
な相同もある（Ｒｅｆ．２４，２５及び２６）。Ｏｄｅ
ｇａａｒｄらはまた、第Ｖ因子と第ＶＩＩＩ因子との間
の更に大きな配列相同を同定した。彼らは特に、開裂が
生起する第Ｖ因子分子内の位置に十分妥当に対応する第
ＶＩＩＩ因子分子内の位置で、ウシ第Ｖ因子とヒト第Ｖ
ＩＩＩ因子との間に配列相同セグメントが明らかに存在
すると記述している。ヒト第Ｖ因子について（実施例１
で）我々が明らかにした作用は、特定の面における第Ｖ
因子と第ＶＩＩＩ因子との同等性に起因して、第ＶＩＩ
Ｉ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子についても付随的に期待
できる。Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎｎは更に、ＡＰＣ
による第Ｖａ因子の開裂後にＨ鎖が残らない場合でも、
残留補因子活性が残ると記述している。これは、第Ｖａ
因子の不活化が、単一結合の単なる開裂より複雑な事象
であることを意味する。これは、第Ｖ因子分子のＡＰＣ
結合及び／又は開裂部位の突然変異が、実際にＡＰＣに
よる不活化に対する親和性を低下させるのに十分である
という本明細書の実施例の説明を更に驚くべきものとす
るものである。第ＶＩＩＩ因子の場合は、ＡＰＣ開裂部
位はＡｒｇ ５６２、Ａｒｇ ３３６及びＡｒｇ ７４
０にあると想定され（Ｒｅｆ．４９）、ＡＰＣ結合部位
は残基２００９−２０１８上でＡ３ドメイン内に存在す
ると想定された（Ｒｅｆ．３５、３６）（表１も参照の
こと）。
【００２１】本発明の方法は、第Ｖ因子及び／又は第Ｖ
ａ因子又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子
のＡＰＣ開裂及び／又は結合部位のうちの一つ以上にお
いて、核酸もしくはタンパク質のいずれかのレベル又は
両方のレベルで、一つ以上の突然変異を検出するために
適用される。特に、タンパク質のＨ鎖上、又はＨ鎖をコ
ードする核酸上に位置するＡＰＣ結合及び／又は開裂部
位が関連部位とみなされる。 Ｋａｌａｆａｔｉｓらは
（Ｂｌｏｏｄ ８２，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐ．５８Ａ，１
９９３）、膜結合ヒト第Ｖａ因子が、Ａｒｇ ５０６及
びＡｒｇ ３０６でのＨ鎖の開裂後に、活性化プロテイ
ンＣによって不活化されることを明らかにした。彼ら
は、ヒト第Ｖａ因子のＨ鎖の開裂パターンが、ＰＣＰＳ
小胞の存在又は不在に依存すると記述している。膜表面
の不在下、又はＰＣのみからなるリン脂質小胞の存在下
では、開裂の結果として、残基１−５０６からなるフラ
グメントと残基５０７で始まるフラグメントとが得ら
れ、後者のフラグメントはＣＯＯＨ末端でＡＰＣにより
更に開裂される。これと対照的に、ＰＣＰＳ小胞の存在
下では、活性の完全な喪失は、Ｍｒ＝７５，０００フラ
グメントの開裂、並びにＭｒ＝４０，０００及びＭｒ＝
３０，０００フラグメントの出現に関係している。Ｍｒ
＝３０，０００フラグメントは残基３０７〜５０６に対
応する。これは、Ａｒｇ ３０６でのＡＰＣによる開裂
を示すものである。ＡＰＣと共にインキュベートした後
は、ＰＣＰＳ小胞の存在下でも不在下でも、補因子のＬ
鎖の開裂は観察されない。このようにして、補因子がＰ
ＣＰＳに結合した時に特定のＡＰＣ開裂部位が明らかに
される。膜の存在は、ＡＰＣによるヒト第Ｖａ因子の完
全不活化にとって必須であり、Ａｒｇ ５０６での開裂
は補因子を部分的に不活化するだけであり、Ａｒｇ ３
０６での開裂はアニオン脂質依存性であって、ヒト第Ｖ
ａ因子の完全不活化に必要とされる。ＡＰＣによるウシ
第Ｖａ因子の不活化に関しても類似のデータが最近発表
された（Ｒｅｆ．４８）。このように、当業界の現状か
ら、ヒト第Ｖａ因子にはＡＰＣによる潜在的開裂部位が
少なくとも二つ存在することが明らかである。Ｋａｌａ
ｆａｔｉｓらは更に、ヒト第Ｖ因子のリシン９９４に別
のＡＰＣ開裂部位を検出した（Ｒｅｆ．５２）。従っ
て、本発明の方法は、核酸もしくはタンパク質のレベル
で、又はこれら両方のレベルで、第Ｖ及び／又は第Ｖａ
因子内のこれらのＡＰＣ開裂部位のうちの一つ以上にお
ける突然変異を検出するために適用される。ＡＰＣ開裂
部位は、Ｈ鎖上のＡｒｇ ５０６及びＡｒｇ ３０６に
位置する。アミノ酸Ａｒｇ ６７９及びＬｙｓ ９９４
にも別の部位が存在することが判明した。
ａ因子又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子
のＡＰＣ開裂及び／又は結合部位のうちの一つ以上にお
いて、核酸もしくはタンパク質のいずれかのレベル又は
両方のレベルで、一つ以上の突然変異を検出するために
適用される。特に、タンパク質のＨ鎖上、又はＨ鎖をコ
ードする核酸上に位置するＡＰＣ結合及び／又は開裂部
位が関連部位とみなされる。 Ｋａｌａｆａｔｉｓらは
（Ｂｌｏｏｄ ８２，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐ．５８Ａ，１
９９３）、膜結合ヒト第Ｖａ因子が、Ａｒｇ ５０６及
びＡｒｇ ３０６でのＨ鎖の開裂後に、活性化プロテイ
ンＣによって不活化されることを明らかにした。彼ら
は、ヒト第Ｖａ因子のＨ鎖の開裂パターンが、ＰＣＰＳ
小胞の存在又は不在に依存すると記述している。膜表面
の不在下、又はＰＣのみからなるリン脂質小胞の存在下
では、開裂の結果として、残基１−５０６からなるフラ
グメントと残基５０７で始まるフラグメントとが得ら
れ、後者のフラグメントはＣＯＯＨ末端でＡＰＣにより
更に開裂される。これと対照的に、ＰＣＰＳ小胞の存在
下では、活性の完全な喪失は、Ｍｒ＝７５，０００フラ
グメントの開裂、並びにＭｒ＝４０，０００及びＭｒ＝
３０，０００フラグメントの出現に関係している。Ｍｒ
＝３０，０００フラグメントは残基３０７〜５０６に対
応する。これは、Ａｒｇ ３０６でのＡＰＣによる開裂
を示すものである。ＡＰＣと共にインキュベートした後
は、ＰＣＰＳ小胞の存在下でも不在下でも、補因子のＬ
鎖の開裂は観察されない。このようにして、補因子がＰ
ＣＰＳに結合した時に特定のＡＰＣ開裂部位が明らかに
される。膜の存在は、ＡＰＣによるヒト第Ｖａ因子の完
全不活化にとって必須であり、Ａｒｇ ５０６での開裂
は補因子を部分的に不活化するだけであり、Ａｒｇ ３
０６での開裂はアニオン脂質依存性であって、ヒト第Ｖ
ａ因子の完全不活化に必要とされる。ＡＰＣによるウシ
第Ｖａ因子の不活化に関しても類似のデータが最近発表
された（Ｒｅｆ．４８）。このように、当業界の現状か
ら、ヒト第Ｖａ因子にはＡＰＣによる潜在的開裂部位が
少なくとも二つ存在することが明らかである。Ｋａｌａ
ｆａｔｉｓらは更に、ヒト第Ｖ因子のリシン９９４に別
のＡＰＣ開裂部位を検出した（Ｒｅｆ．５２）。従っ
て、本発明の方法は、核酸もしくはタンパク質のレベル
で、又はこれら両方のレベルで、第Ｖ及び／又は第Ｖａ
因子内のこれらのＡＰＣ開裂部位のうちの一つ以上にお
ける突然変異を検出するために適用される。ＡＰＣ開裂
部位は、Ｈ鎖上のＡｒｇ ５０６及びＡｒｇ ３０６に
位置する。アミノ酸Ａｒｇ ６７９及びＬｙｓ ９９４
にも別の部位が存在することが判明した。
【００２２】以上の説明に鑑みて、本発明の方法、即ち
血栓症及び／又は活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対す
る弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥、即ち患者の血
栓症発生の危険が高いことを示すか又は実際に血栓症を
発生させる遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法
であって、それ自体公知の方法で、第Ｖ因子をコードす
る核酸物質の突然変異、即ち核酸物質の発現時に前記第
Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のＡＰＣによる不活化の度
合いの低下に関与する突然変異の存在を調べることから
なる本発明の方法は、第Ｖ因子がＸａで活性化した第Ｖ
因子に由来するものである場合に特に有利である。
血栓症及び／又は活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対す
る弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥、即ち患者の血
栓症発生の危険が高いことを示すか又は実際に血栓症を
発生させる遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法
であって、それ自体公知の方法で、第Ｖ因子をコードす
る核酸物質の突然変異、即ち核酸物質の発現時に前記第
Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のＡＰＣによる不活化の度
合いの低下に関与する突然変異の存在を調べることから
なる本発明の方法は、第Ｖ因子がＸａで活性化した第Ｖ
因子に由来するものである場合に特に有利である。
【００２３】本発明の方法は特に、血漿因子Ｖの配列の
アミノ酸５０６に対応する位置に変化したアミノ酸を含
む突然変異アミノ酸配列を有するヒト第Ｖ又は第Ｖａ因
子をコードする核酸配列内の突然変異を検出するために
適用される（Ｒｅｆ．２１）。特に、前記突然変異が、
アミノ酸アルギニンを血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５０
６でアミノ酸グルタミンにより置換させた突然変異であ
る場合に適用される。特に、アミノ酸５０６に対応する
アミノ酸のコドンの第二ヌクレオチド、ヌクレオチドＧ
が突然変異を起こした場合がこれに相当する。ヌクレオ
チドＧが、血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５０６に対応す
るアミノ酸のコドンの第二ヌクレオチドに対応する位置
でＡに突然変異した場合が特にそうである。
アミノ酸５０６に対応する位置に変化したアミノ酸を含
む突然変異アミノ酸配列を有するヒト第Ｖ又は第Ｖａ因
子をコードする核酸配列内の突然変異を検出するために
適用される（Ｒｅｆ．２１）。特に、前記突然変異が、
アミノ酸アルギニンを血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５０
６でアミノ酸グルタミンにより置換させた突然変異であ
る場合に適用される。特に、アミノ酸５０６に対応する
アミノ酸のコドンの第二ヌクレオチド、ヌクレオチドＧ
が突然変異を起こした場合がこれに相当する。ヌクレオ
チドＧが、血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５０６に対応す
るアミノ酸のコドンの第二ヌクレオチドに対応する位置
でＡに突然変異した場合が特にそうである。
【００２４】実施例で明らかにされるように、本発明
は、被験者が第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子又は第ＶＩ
ＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子における突然変異
に対して同型であるか又は異型であるかを調べる方法に
も関する。この方法は、ＡＰＣに対する抗凝血応答に欠
陥が存在するかどうかを調べるそれ自体公知の方法を実
施し、次いで、欠陥の診断に有用であることが知られて
いるパラメーターの値、例えば（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）／
（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）の値を算出し、得られた値を、正
常な個体又は同型もしくは異型であることがわかってい
る個体に由来する試料について同じ方法で得た値と比較
し、それによって被験者がＡＰＣに対する抗凝血応答の
欠陥に関して同型であるか又は異型であるかを確認する
ことからなり、特に実施例１に記載の具体例、並びに、
最も特定的にはＡＰＣ結合及び／開裂部位の突然変異に
起因してＡＰＣに対する抗凝血応答を変化させる第Ｖ、
第Ｖａ、第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の別の
突然変異に関する任意の同等の具体例では、第Ｖ因子及
び／又は第Ｖａ因子、又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第
ＶＩＩＩａ因子における突然変異の存在及び任意にその
種類を決定するための任意の公知の方法と組合わせて使
用される。
は、被験者が第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子又は第ＶＩ
ＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子における突然変異
に対して同型であるか又は異型であるかを調べる方法に
も関する。この方法は、ＡＰＣに対する抗凝血応答に欠
陥が存在するかどうかを調べるそれ自体公知の方法を実
施し、次いで、欠陥の診断に有用であることが知られて
いるパラメーターの値、例えば（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）／
（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）の値を算出し、得られた値を、正
常な個体又は同型もしくは異型であることがわかってい
る個体に由来する試料について同じ方法で得た値と比較
し、それによって被験者がＡＰＣに対する抗凝血応答の
欠陥に関して同型であるか又は異型であるかを確認する
ことからなり、特に実施例１に記載の具体例、並びに、
最も特定的にはＡＰＣ結合及び／開裂部位の突然変異に
起因してＡＰＣに対する抗凝血応答を変化させる第Ｖ、
第Ｖａ、第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の別の
突然変異に関する任意の同等の具体例では、第Ｖ因子及
び／又は第Ｖａ因子、又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第
ＶＩＩＩａ因子における突然変異の存在及び任意にその
種類を決定するための任意の公知の方法と組合わせて使
用される。
【００２５】本発明の方法は、核酸標的増幅反応の実施
により突然変異を検出することによって達成できる。こ
のような標的増幅反応は当業者によく知られている。突
然変異が存在し得る特定長さの核酸の５’及び３’末端
に隣接する種々の長さの核酸を認識しこれにハイブリダ
イズする特異的プライマーを一つ以上使用する必要があ
る。前記ハイブリダイゼーションは、突然変異が存在し
得る特定長さの核酸の増幅に十分な程度まで実施され
る。要求されるハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシーも、核酸標的増幅の当業者にはよく知られてい
る。当業界で一般的に行われている標的増幅反応は多数
あり、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑ
ｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、
核酸配列ベースの増幅）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）及びＰＣＲ（Ｒｅｐ
ａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、修復連鎖反
応）が挙げられる。ＰＣＲ標的増幅方法の場合は、市販
のＡｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）反応キットを使用し得
る。突然変異が存在し得る特定長さの核酸を認識しこれ
にハイブリダイズするのに十分な特異性を有するプライ
マーを使用することも可能である。別の増幅方法は、Ｃ
ｈｉｒｏｎによって商業的に開発されたような分枝鎖増
幅からなり、この場合は標的ではなくプローブが増幅さ
れる。
により突然変異を検出することによって達成できる。こ
のような標的増幅反応は当業者によく知られている。突
然変異が存在し得る特定長さの核酸の５’及び３’末端
に隣接する種々の長さの核酸を認識しこれにハイブリダ
イズする特異的プライマーを一つ以上使用する必要があ
る。前記ハイブリダイゼーションは、突然変異が存在し
得る特定長さの核酸の増幅に十分な程度まで実施され
る。要求されるハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシーも、核酸標的増幅の当業者にはよく知られてい
る。当業界で一般的に行われている標的増幅反応は多数
あり、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑ
ｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、
核酸配列ベースの増幅）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反
応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）及びＰＣＲ（Ｒｅｐ
ａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、修復連鎖反
応）が挙げられる。ＰＣＲ標的増幅方法の場合は、市販
のＡｍｐｌｉｃｏｒ（登録商標）反応キットを使用し得
る。突然変異が存在し得る特定長さの核酸を認識しこれ
にハイブリダイズするのに十分な特異性を有するプライ
マーを使用することも可能である。別の増幅方法は、Ｃ
ｈｉｒｏｎによって商業的に開発されたような分枝鎖増
幅からなり、この場合は標的ではなくプローブが増幅さ
れる。
【００２６】核酸の増幅後は、突然変異の存在及び任意
に種類を検出するためのそれ自体公知の方法による増幅
核酸分析を本発明の方法で実施する。
に種類を検出するためのそれ自体公知の方法による増幅
核酸分析を本発明の方法で実施する。
【００２７】核酸物質を増幅せずに突然変異を決定する
ことも可能である。核酸上の突然変異の存在を調べるた
めに標的増幅反応が開発される前に使用されていた当業
者に公知の方法は多数存在し、これらの方法は総て本発
明の方法の種々の具体例で使用できる。例えば、正常〜
ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件、例え
ばブロッティング方法を使用し、次いで単離した核酸の
分析をそれ自体公知の方法で実施して突然変異の存在及
び任意に種類を検出する場合には、分析すべき因子をコ
ードする核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズ
するのに十分な特異性を有する少なくとも一つの核酸配
列に対するハイブリダイゼーション反応によって、決定
すべき突然変異を検出することができる。
ことも可能である。核酸上の突然変異の存在を調べるた
めに標的増幅反応が開発される前に使用されていた当業
者に公知の方法は多数存在し、これらの方法は総て本発
明の方法の種々の具体例で使用できる。例えば、正常〜
ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件、例え
ばブロッティング方法を使用し、次いで単離した核酸の
分析をそれ自体公知の方法で実施して突然変異の存在及
び任意に種類を検出する場合には、分析すべき因子をコ
ードする核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズ
するのに十分な特異性を有する少なくとも一つの核酸配
列に対するハイブリダイゼーション反応によって、決定
すべき突然変異を検出することができる。
【００２８】突然変異の存在及び任意に種類の検出は、
このようにして単離した核酸を例えばサンガー配列反応
を用いて配列分析にかけ、それによって核酸配列を確認
し、次いでこの配列決定の結果を非突然変異因子の既知
の配列と比較することにより実施できる。単離した核酸
配列を更に別のハイブリダイゼーション検査にかけるこ
とも可能である。この別のハイブリダイゼーション検査
は、突然変異の存在及び任意に種類を検出するために、
突然変異を含む核酸物質のフラグメントに少なくともハ
イブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を有する対
応する相補配列を含む、適当な長さの核酸配列を用いて
実施する。最初のハイブリダイゼーションステップは、
因子が突然変異を起こしているか否かに関係なく、因子
をコードする核酸を単離するだけであり、第二のハイブ
リダイゼーションステップは、単離核酸物質上の突然変
異の存在の有無を決定するために、確認したいと思う実
際の突然変異核酸配列の相補配列に、単離した配列を実
際にハイブリダイズさせることからなる。この後者のハ
イブリダイゼーション反応は、信頼できる結果を得るた
めにストリンジェント条件下で実施する必要があり、そ
の他のハイブリダイゼーションステップは、正常〜スト
リンジェント条件下で実施し得る。以上、特定核酸上の
突然変異の存在を調べるための従来の方法を二つ説明し
たが、当業者には明らかなように、多くの公知の方法が
使用可能である。分子生物学に関する種々の標準的文献
には、この種の方法が広く記述されている。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）参照。
このようにして単離した核酸を例えばサンガー配列反応
を用いて配列分析にかけ、それによって核酸配列を確認
し、次いでこの配列決定の結果を非突然変異因子の既知
の配列と比較することにより実施できる。単離した核酸
配列を更に別のハイブリダイゼーション検査にかけるこ
とも可能である。この別のハイブリダイゼーション検査
は、突然変異の存在及び任意に種類を検出するために、
突然変異を含む核酸物質のフラグメントに少なくともハ
イブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を有する対
応する相補配列を含む、適当な長さの核酸配列を用いて
実施する。最初のハイブリダイゼーションステップは、
因子が突然変異を起こしているか否かに関係なく、因子
をコードする核酸を単離するだけであり、第二のハイブ
リダイゼーションステップは、単離核酸物質上の突然変
異の存在の有無を決定するために、確認したいと思う実
際の突然変異核酸配列の相補配列に、単離した配列を実
際にハイブリダイズさせることからなる。この後者のハ
イブリダイゼーション反応は、信頼できる結果を得るた
めにストリンジェント条件下で実施する必要があり、そ
の他のハイブリダイゼーションステップは、正常〜スト
リンジェント条件下で実施し得る。以上、特定核酸上の
突然変異の存在を調べるための従来の方法を二つ説明し
たが、当業者には明らかなように、多くの公知の方法が
使用可能である。分子生物学に関する種々の標準的文献
には、この種の方法が広く記述されている。例えば、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ
ｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）参照。
【００２９】本発明のスクリーニング方法で得た増幅核
酸物質は、その後、配列決定反応を用いるか、又は増幅
反応にかけられなかった単離核酸物質の分析について前
述したように、突然変異の存在及び任意に種類を検出す
るために突然変異を含む核酸物質のフラグメントに少な
くともハイブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を
有する対応する相補配列へのハイブリダイゼーションを
用いる分析検査を使用することによって分析することも
可能である。
酸物質は、その後、配列決定反応を用いるか、又は増幅
反応にかけられなかった単離核酸物質の分析について前
述したように、突然変異の存在及び任意に種類を検出す
るために突然変異を含む核酸物質のフラグメントに少な
くともハイブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を
有する対応する相補配列へのハイブリダイゼーションを
用いる分析検査を使用することによって分析することも
可能である。
【００３０】特に、第Ｖ因子の突然変異の存在を分析す
る場合は、単離した及び／又は増幅した核酸物質を、配
列表の配列番号１２及び１３の配列から選択した適当な
長さの核酸物質に対するハイブリダイゼーション検査に
かけ得る。例えば、ハイブリダイゼーションに極めて適
しているプライマー又は核酸配列は、ヒト第Ｖ因子をコ
ードする核酸配列のイントロン１０の少なくとも一部
分、又はストリンジェント条件下でイントロン１０の前
記部分にハイブリダイズすることができる誘導体を含
む。このような誘導体は、イントロン１０の対応する部
分に対して９０％以上の相同を有するのが好ましい。ヒ
ト第Ｖ因子の核酸配列は既知であり、ヒト第Ｖ因子をコ
ードする核酸配列は配列表の配列番号１に示されてい
る。該配列はＲｅｆ．２１から誘導される。イントロン
１０の少なくとも一部分を含むハイブリダイゼーション
用核酸配列を使用すれば、第Ｖ因子をコードする核酸内
に存在する突然変異、特にＡＰＣ結合及び／又は開裂部
位をコードする核酸の突然変異を単離し及び／又は増幅
し及び／又はその後検出することがかなり簡単になる。
これは、Ｈ鎖上に位置する突然変異を検出するのに特に
適している（配列番号１０、１４参照）。また、ハイブ
リダイゼーション及び／又は増幅用の核酸配列のプライ
マーは、配列表の配列番号２〜１１の配列から選択でき
る。前述のように、当業界では他の多くのオリゴヌクレ
オチドプライマーが知られている。これらのプライマー
は、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子をコードする核酸を単離
するために、増幅の目的又はハイブリダイゼーション反
応に使用することも可能である。正常因子をコードする
配列は突然変異因子の配列と同様に既知であるため、当
業者は、本発明の方法でスクリーニングする突然変異の
単離及び／又は増幅及び／又は存在及び種類の決定に最
も適したオリゴヌクレオチド配列を選択することができ
る。
る場合は、単離した及び／又は増幅した核酸物質を、配
列表の配列番号１２及び１３の配列から選択した適当な
長さの核酸物質に対するハイブリダイゼーション検査に
かけ得る。例えば、ハイブリダイゼーションに極めて適
しているプライマー又は核酸配列は、ヒト第Ｖ因子をコ
ードする核酸配列のイントロン１０の少なくとも一部
分、又はストリンジェント条件下でイントロン１０の前
記部分にハイブリダイズすることができる誘導体を含
む。このような誘導体は、イントロン１０の対応する部
分に対して９０％以上の相同を有するのが好ましい。ヒ
ト第Ｖ因子の核酸配列は既知であり、ヒト第Ｖ因子をコ
ードする核酸配列は配列表の配列番号１に示されてい
る。該配列はＲｅｆ．２１から誘導される。イントロン
１０の少なくとも一部分を含むハイブリダイゼーション
用核酸配列を使用すれば、第Ｖ因子をコードする核酸内
に存在する突然変異、特にＡＰＣ結合及び／又は開裂部
位をコードする核酸の突然変異を単離し及び／又は増幅
し及び／又はその後検出することがかなり簡単になる。
これは、Ｈ鎖上に位置する突然変異を検出するのに特に
適している（配列番号１０、１４参照）。また、ハイブ
リダイゼーション及び／又は増幅用の核酸配列のプライ
マーは、配列表の配列番号２〜１１の配列から選択でき
る。前述のように、当業界では他の多くのオリゴヌクレ
オチドプライマーが知られている。これらのプライマー
は、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子をコードする核酸を単離
するために、増幅の目的又はハイブリダイゼーション反
応に使用することも可能である。正常因子をコードする
配列は突然変異因子の配列と同様に既知であるため、当
業者は、本発明の方法でスクリーニングする突然変異の
単離及び／又は増幅及び／又は存在及び種類の決定に最
も適したオリゴヌクレオチド配列を選択することができ
る。
【００３１】本発明の方法では、特に分析すべき核酸を
標的増幅にかけた場合には、単離した及び／又は増幅し
た及び／又はハイブリダイズした核酸物質を配列分析に
かけ、次いで配列を対応する非突然変異因子の核酸配列
と比較する。増幅又は単離した及び／又はハイブリダイ
ズした核酸物質を、制限フラグメント分析によって分析
することも可能である。特に、突然変異を起こした第Ｖ
因子に関する実施例で説明する突然変異の場合には、使
用できる酵素はＭｎｌ Ｉである。制限フラグメント分
析に使用できる制限酵素は当然、検出すべき突然変異の
種類とその位置とに依存する。当業者は、別の新しいス
テップを用いずに、過度の負担がかからないルーチンの
実験だけで、前記酵素を選択できる。
標的増幅にかけた場合には、単離した及び／又は増幅し
た及び／又はハイブリダイズした核酸物質を配列分析に
かけ、次いで配列を対応する非突然変異因子の核酸配列
と比較する。増幅又は単離した及び／又はハイブリダイ
ズした核酸物質を、制限フラグメント分析によって分析
することも可能である。特に、突然変異を起こした第Ｖ
因子に関する実施例で説明する突然変異の場合には、使
用できる酵素はＭｎｌ Ｉである。制限フラグメント分
析に使用できる制限酵素は当然、検出すべき突然変異の
種類とその位置とに依存する。当業者は、別の新しいス
テップを用いずに、過度の負担がかからないルーチンの
実験だけで、前記酵素を選択できる。
【００３２】前述のように、本発明の方法は、タンパク
質をコードする核酸配列ではなくタンパク質を分析する
ことによって実施することもできる。これは特に、タン
パク質の突然変異が、第Ｖもしくは第Ｖａ因子上にＡＰ
Ｃ結合及び／又は開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内
に存在し、ＡＰＣによってあまり不活化されない第Ｖ因
子及び／又は第Ｖａ因子の形成を引き起こすか、又は第
ＶＩＩＩもしくは第ＶＩＩＩａ因子上にＡＰＣ結合及び
／又は開裂部位を与える核酸配列部分内に存在し、ＡＰ
Ｃによってあまり不活化されない第ＶＩＩＩ因子及び／
又は第ＶＩＩＩａ因子の形成を引き起こす場合の、本発
明の有用な具体例である。
質をコードする核酸配列ではなくタンパク質を分析する
ことによって実施することもできる。これは特に、タン
パク質の突然変異が、第Ｖもしくは第Ｖａ因子上にＡＰ
Ｃ結合及び／又は開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内
に存在し、ＡＰＣによってあまり不活化されない第Ｖ因
子及び／又は第Ｖａ因子の形成を引き起こすか、又は第
ＶＩＩＩもしくは第ＶＩＩＩａ因子上にＡＰＣ結合及び
／又は開裂部位を与える核酸配列部分内に存在し、ＡＰ
Ｃによってあまり不活化されない第ＶＩＩＩ因子及び／
又は第ＶＩＩＩａ因子の形成を引き起こす場合の、本発
明の有用な具体例である。
【００３３】前述のように、第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ
又は第ＶＩＩＩａ因子上にＡＰＣ開裂部位を与えるアミ
ノ酸配列部分内の突然変異の存在は、ＡＰＣによる不活
化に対する突然変異因子の耐性を明らかに変える突然変
異であり、従ってこのような突然変異の検出は本発明の
方法の好ましい具体例である。当業界で既に明らかにさ
れているように、第Ｖａ又は第ＶＩＩＩａ因子の不活化
は通常、ＡＰＣが因子のＨ鎖を開裂した時にその結果と
して生起する。従って、突然変異因子の開裂度を変える
ことになるような開裂部位における突然変異の検出は、
本発明の好ましい具体例である。タンパク質を突然変異
に関して分析する時は、開裂部位自体の一次アミノ酸配
列が関係するだけでなく、タンパク質の三次構造も、結
合及び／又は開裂部位と直接関係のない一次配列のどこ
かの突然変異に起因して変形し得る。周知のように、タ
ンパク質の実際の結合部位又は開裂部位から遠く離れて
位置する突然変異は、タンパク質の三次構造に大きく作
用し得、それによって、前記タンパク質への結合、この
場合はＡＰＣによる結合を抹消又は低下させ得る。従っ
て、本発明の方法は、ＡＰＣによる開裂及び／又は結合
部位の一次核酸配列における突然変異の検出だけでな
く、ＡＰＣによる因子の結合及び／又は開裂を低下させ
る変化した三次構造を有する突然変異因子の発生を引き
起こす突然変異の検出にも適用される。
又は第ＶＩＩＩａ因子上にＡＰＣ開裂部位を与えるアミ
ノ酸配列部分内の突然変異の存在は、ＡＰＣによる不活
化に対する突然変異因子の耐性を明らかに変える突然変
異であり、従ってこのような突然変異の検出は本発明の
方法の好ましい具体例である。当業界で既に明らかにさ
れているように、第Ｖａ又は第ＶＩＩＩａ因子の不活化
は通常、ＡＰＣが因子のＨ鎖を開裂した時にその結果と
して生起する。従って、突然変異因子の開裂度を変える
ことになるような開裂部位における突然変異の検出は、
本発明の好ましい具体例である。タンパク質を突然変異
に関して分析する時は、開裂部位自体の一次アミノ酸配
列が関係するだけでなく、タンパク質の三次構造も、結
合及び／又は開裂部位と直接関係のない一次配列のどこ
かの突然変異に起因して変形し得る。周知のように、タ
ンパク質の実際の結合部位又は開裂部位から遠く離れて
位置する突然変異は、タンパク質の三次構造に大きく作
用し得、それによって、前記タンパク質への結合、この
場合はＡＰＣによる結合を抹消又は低下させ得る。従っ
て、本発明の方法は、ＡＰＣによる開裂及び／又は結合
部位の一次核酸配列における突然変異の検出だけでな
く、ＡＰＣによる因子の結合及び／又は開裂を低下させ
る変化した三次構造を有する突然変異因子の発生を引き
起こす突然変異の検出にも適用される。
【００３４】第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子は互いに異なるメ
カニズムで活性化でき、その結果得られる因子はどちら
もその由来源である因子とは異なる三次構造を有するこ
とが知られているため、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子の
突然変異が前記分子のＡＰＣ結合及び／又は開裂部位に
は影響し得ず、活性化因子のそれに影響し得ることは明
らかであり、その逆も明らかである。それにもかかわら
ず、活性化第Ｖ又は第ＶＩＩＩ因子の結合及び／又は開
裂の変化に関与する一次アミノ酸配列の突然変異は、第
Ｖ又は第ＶＩＩＩ因子上にも存在する。特異的抗体の使
用によって突然変異タンパク質の検出を行う場合は、突
然変異の存在及び任意に種類を検出するために、突然変
異を含む活性化因子に対して特異的な抗体を使用するこ
とが可能である。あるいは、分析すべきタンパク質をタ
ンパク分解によって開裂し、それによって、第Ｖ及び／
又は第Ｖａ因子又は第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ
因子の一次アミノ酸配列における突然変異に対して特異
的な抗体の使用を可能にする線状又は部分的線状構造を
得ることも可能である。従って、該突然変異検出方法は
活性化因子の分析に限定する必要はなく、実際、まだ活
性化されていない第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子について
も実施できる。
カニズムで活性化でき、その結果得られる因子はどちら
もその由来源である因子とは異なる三次構造を有するこ
とが知られているため、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子の
突然変異が前記分子のＡＰＣ結合及び／又は開裂部位に
は影響し得ず、活性化因子のそれに影響し得ることは明
らかであり、その逆も明らかである。それにもかかわら
ず、活性化第Ｖ又は第ＶＩＩＩ因子の結合及び／又は開
裂の変化に関与する一次アミノ酸配列の突然変異は、第
Ｖ又は第ＶＩＩＩ因子上にも存在する。特異的抗体の使
用によって突然変異タンパク質の検出を行う場合は、突
然変異の存在及び任意に種類を検出するために、突然変
異を含む活性化因子に対して特異的な抗体を使用するこ
とが可能である。あるいは、分析すべきタンパク質をタ
ンパク分解によって開裂し、それによって、第Ｖ及び／
又は第Ｖａ因子又は第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ
因子の一次アミノ酸配列における突然変異に対して特異
的な抗体の使用を可能にする線状又は部分的線状構造を
得ることも可能である。従って、該突然変異検出方法は
活性化因子の分析に限定する必要はなく、実際、まだ活
性化されていない第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子について
も実施できる。
【００３５】突然変異がＡＰＣ結合及び／又は開裂部位
に存在する時は、第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ、第ＶＩＩ
Ｉａ因子をＡＰＣで処理し、次いでフラグメントを公知
の方法で分析すれば、因子が正常な場合とは異なるフラ
グメントが明らかにされる筈である。
に存在する時は、第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ、第ＶＩＩ
Ｉａ因子をＡＰＣで処理し、次いでフラグメントを公知
の方法で分析すれば、因子が正常な場合とは異なるフラ
グメントが明らかにされる筈である。
【００３６】例えば、第Ｖ因子の場合は、アミノ酸５０
６の突然変異がその位置でのＡＰＣの開裂及び／又は結
合を阻止する。従って、活性化ＡＰＣでの処理の結果、
部位３０６、６７９及び９９４で開裂が生起し、一つの
フラグメントａａ３０７−ａａ６７９と、配列１−３０
６、６８０−９９４及び９９５−末端を含む三つの別の
フラグメントとが得られる。所期のフラグメントは３０
７−６７９である。正常第Ｖ因子はこのフラグメントを
含まず、ａａ５０６の活性開裂部位に起因して、別の二
つのフラグメント、即ちａａ３０７−５０６及びａａ５
０７−６７９を含む。従って、ａａ３０７−ａａ６７９
の検出は、アミノ酸５０６における突然変異ＡＰＣ部位
の存在を示す。
６の突然変異がその位置でのＡＰＣの開裂及び／又は結
合を阻止する。従って、活性化ＡＰＣでの処理の結果、
部位３０６、６７９及び９９４で開裂が生起し、一つの
フラグメントａａ３０７−ａａ６７９と、配列１−３０
６、６８０−９９４及び９９５−末端を含む三つの別の
フラグメントとが得られる。所期のフラグメントは３０
７−６７９である。正常第Ｖ因子はこのフラグメントを
含まず、ａａ５０６の活性開裂部位に起因して、別の二
つのフラグメント、即ちａａ３０７−５０６及びａａ５
０７−６７９を含む。従って、ａａ３０７−ａａ６７９
の検出は、アミノ酸５０６における突然変異ＡＰＣ部位
の存在を示す。
【００３７】極めてエレガントな検査は、第Ｖ因子をＡ
ＰＣ処理後に二つの抗体の存在にかける操作を含み得
る。このようなＡＰＣ処理は血清の調製中に自然に生起
する。この検査では一方の抗体がアミノ酸５０６の上流
のタンパク質の部位に対して特異的であり、前記部位
が、ａａ５０６の上流の最も隣接した開裂部位、ａａ３
０６の下流に位置する。もう一方の抗体は、アミノ酸５
０６の下流のタンパク質の部位に対して特異的であり、
前記部位は、ａａ５０６の下流の最も隣接したＡＰＣ開
裂部位、ａａ６７９の上流に位置する。該検査は、両方
の抗体によって検出されるフラグメントの検出を含む。
この種の検査はサンドイッチ・イムノアッセイであり得
る。好ましくは、一方の抗体を固定するか又は固定し
得、他方の抗体に、イムノアッセイの当業者に公知の方
法で検出可能マーカーを具備する。この種の検査におけ
る、フラグメント３０７−５０６の一部分を特異的に認
識する抗体の使用は、本発明の範囲内に含まれる。フラ
グメント５０７−６７９の一部分を特異的に認識する抗
体自体、及び前述のような検査における該抗体の使用
も、本発明の範囲に含まれる。抗体はモノクローナル抗
体が好ましい。一方の抗体がフラグメント１−３０６の
一部分に対して特異的であり、他方の抗体がフラグメン
ト３０７−５０６の一部分に対して特異的である二つの
抗体を用いて、類似の方法で、Ａｒｇ３０６に位置する
ＡＰＣ開裂部位の突然変異を検出するために適当な検査
を実施し得る。この種の検査における、フラグメント３
０７−５０６の一部分を特異的に認識する抗体の使用
は、本発明の範囲に含まれる。フラグメント１−３０６
の一部分を特異的に認識する抗体自体、及び前述のよう
な検査における該抗体の使用も本発明の範囲に含まれ
る。アミノ酸６７９に位置するＡＰＣ開裂部位の突然変
異の検出にも、前述と類似の方法で検査を実施し得る。
この突然変異の場合は、フラグメント５０７−６７９の
一部分に対して特異的な抗体が一つ必要とされると共
に、アミノ酸６８０の下流のフラグメントの一部分に対
して特異的な抗体が一つ必要とされる。この種の検査に
おける、フラグメント５０７−６７９の一部分を特異的
に認識する抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フ
ラグメント５０７−５６９の一部分を特異的に認識する
抗体及びフラグメント５７０−９９４の一部分を特異的
に認識する抗体、並びに前記と類似の検査におけるこれ
らの抗体のうちの一つ以上の使用も、本発明の範囲に含
まれる。リシン９９４のＡＰＣ開裂部位における突然変
異を検出するための検査も同様に説明し得る。フラグメ
ント９９４−末端及び６８０−９９４は関連フラグメン
トであり、これらのフラグメントを認識することができ
る抗体も関連がある。
ＰＣ処理後に二つの抗体の存在にかける操作を含み得
る。このようなＡＰＣ処理は血清の調製中に自然に生起
する。この検査では一方の抗体がアミノ酸５０６の上流
のタンパク質の部位に対して特異的であり、前記部位
が、ａａ５０６の上流の最も隣接した開裂部位、ａａ３
０６の下流に位置する。もう一方の抗体は、アミノ酸５
０６の下流のタンパク質の部位に対して特異的であり、
前記部位は、ａａ５０６の下流の最も隣接したＡＰＣ開
裂部位、ａａ６７９の上流に位置する。該検査は、両方
の抗体によって検出されるフラグメントの検出を含む。
この種の検査はサンドイッチ・イムノアッセイであり得
る。好ましくは、一方の抗体を固定するか又は固定し
得、他方の抗体に、イムノアッセイの当業者に公知の方
法で検出可能マーカーを具備する。この種の検査におけ
る、フラグメント３０７−５０６の一部分を特異的に認
識する抗体の使用は、本発明の範囲内に含まれる。フラ
グメント５０７−６７９の一部分を特異的に認識する抗
体自体、及び前述のような検査における該抗体の使用
も、本発明の範囲に含まれる。抗体はモノクローナル抗
体が好ましい。一方の抗体がフラグメント１−３０６の
一部分に対して特異的であり、他方の抗体がフラグメン
ト３０７−５０６の一部分に対して特異的である二つの
抗体を用いて、類似の方法で、Ａｒｇ３０６に位置する
ＡＰＣ開裂部位の突然変異を検出するために適当な検査
を実施し得る。この種の検査における、フラグメント３
０７−５０６の一部分を特異的に認識する抗体の使用
は、本発明の範囲に含まれる。フラグメント１−３０６
の一部分を特異的に認識する抗体自体、及び前述のよう
な検査における該抗体の使用も本発明の範囲に含まれ
る。アミノ酸６７９に位置するＡＰＣ開裂部位の突然変
異の検出にも、前述と類似の方法で検査を実施し得る。
この突然変異の場合は、フラグメント５０７−６７９の
一部分に対して特異的な抗体が一つ必要とされると共
に、アミノ酸６８０の下流のフラグメントの一部分に対
して特異的な抗体が一つ必要とされる。この種の検査に
おける、フラグメント５０７−６７９の一部分を特異的
に認識する抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フ
ラグメント５０７−５６９の一部分を特異的に認識する
抗体及びフラグメント５７０−９９４の一部分を特異的
に認識する抗体、並びに前記と類似の検査におけるこれ
らの抗体のうちの一つ以上の使用も、本発明の範囲に含
まれる。リシン９９４のＡＰＣ開裂部位における突然変
異を検出するための検査も同様に説明し得る。フラグメ
ント９９４−末端及び６８０−９９４は関連フラグメン
トであり、これらのフラグメントを認識することができ
る抗体も関連がある。
【００３８】一般的には、第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ又
は第ＶＩＩＩａ因子の突然変異に関する検査は、それ自
体公知の方法によるイムノアッセイで二つの抗体を使用
して、特定のＡＰＣ開裂部位でのＡＰＣによる開裂を低
下又は阻止する突然変異の存在又は不在を検出すること
からなり得る。この場合、一方の抗体は前記ＡＰＣ開裂
部位の上流のフラグメントを認識し、もう一方の抗体は
前記ＡＰＣ開裂部位の下流のフラグメントを認識し、い
ずれかの抗体が認識する因子の部分と、突然変異の存在
又は不在の決定が行われるべき特定のＡＰＣ開裂部位と
の間に別のＡＰＣ開裂部位は存在しない。この突然変異
検出原理に基づく種々の具体例は、イムノアッセイの当
業者には明らかであろう。例えば、更に別の一つ以上の
プロテアーゼをＡＰＣと組合わせて使用し得ることは明
らかであろう。前記ＡＰＣは、使用する試料の種類に応
じて、試料に加えるべきもの、又は試料中に既に存在し
ているものである。前述の更に別の一つ以上のプロテア
ーゼは、因子上の検出すべき活性ＡＰＣ開裂部位が存在
しない場合には、不活性ＡＰＣ開裂部位を含むタンパク
分解フラグメントに両抗体が結合することになり、検出
すべき活性ＡＰＣ開裂部位が存在する場合には、どちら
の抗体もタンパク分解フラグメントに結合できないよう
にタンパク分解フラグメントが形成されることになる。
これは、分析すべきＡＰＣ開裂部位の上流及び下流で因
子の開裂を引き起こす一つ以上のプロテアーゼを選択す
ることにより最も簡単に達成できる。二つの抗体のうち
の一方は、決定すべきＡＰＣ開裂部位の上流、且つＡＰ
Ｃ開裂部位の上流でプロテアーゼが開裂する位置の下流
のフラグメントの一部分を認識し、二つの抗体のうちの
もう一方は、決定すべきＡＰＣ開裂部位の下流、且つＡ
ＰＣ開裂部位の下流でプロテアーゼが開裂する位置の上
流のフラグメントの一部分を認識し、前記一つ以上のプ
ロテアーゼは、その開裂部位が、決定すべきＡＰＣ開裂
部位と、非突然変異因子上に存在するような隣接ＡＰＣ
開裂部位との間に位置するように、因子を開裂する。更
に別の具体例では、突然変異ＡＰＣ開裂部位の開裂を行
うことはできるが非突然変異ＡＰＣ開裂部位の開裂を行
うことはできない、又はその逆のプロテアーゼを、ＡＰ
Ｃの代わりに使用し得る。決定すべき突然変異の種類が
確認されれば、当業者は、適当なプロテアーゼに関し
て、プロテアーゼについて知られている認識部位をスク
リーニングするためのルーチンの実験を行いさえすれば
よい。
は第ＶＩＩＩａ因子の突然変異に関する検査は、それ自
体公知の方法によるイムノアッセイで二つの抗体を使用
して、特定のＡＰＣ開裂部位でのＡＰＣによる開裂を低
下又は阻止する突然変異の存在又は不在を検出すること
からなり得る。この場合、一方の抗体は前記ＡＰＣ開裂
部位の上流のフラグメントを認識し、もう一方の抗体は
前記ＡＰＣ開裂部位の下流のフラグメントを認識し、い
ずれかの抗体が認識する因子の部分と、突然変異の存在
又は不在の決定が行われるべき特定のＡＰＣ開裂部位と
の間に別のＡＰＣ開裂部位は存在しない。この突然変異
検出原理に基づく種々の具体例は、イムノアッセイの当
業者には明らかであろう。例えば、更に別の一つ以上の
プロテアーゼをＡＰＣと組合わせて使用し得ることは明
らかであろう。前記ＡＰＣは、使用する試料の種類に応
じて、試料に加えるべきもの、又は試料中に既に存在し
ているものである。前述の更に別の一つ以上のプロテア
ーゼは、因子上の検出すべき活性ＡＰＣ開裂部位が存在
しない場合には、不活性ＡＰＣ開裂部位を含むタンパク
分解フラグメントに両抗体が結合することになり、検出
すべき活性ＡＰＣ開裂部位が存在する場合には、どちら
の抗体もタンパク分解フラグメントに結合できないよう
にタンパク分解フラグメントが形成されることになる。
これは、分析すべきＡＰＣ開裂部位の上流及び下流で因
子の開裂を引き起こす一つ以上のプロテアーゼを選択す
ることにより最も簡単に達成できる。二つの抗体のうち
の一方は、決定すべきＡＰＣ開裂部位の上流、且つＡＰ
Ｃ開裂部位の上流でプロテアーゼが開裂する位置の下流
のフラグメントの一部分を認識し、二つの抗体のうちの
もう一方は、決定すべきＡＰＣ開裂部位の下流、且つＡ
ＰＣ開裂部位の下流でプロテアーゼが開裂する位置の上
流のフラグメントの一部分を認識し、前記一つ以上のプ
ロテアーゼは、その開裂部位が、決定すべきＡＰＣ開裂
部位と、非突然変異因子上に存在するような隣接ＡＰＣ
開裂部位との間に位置するように、因子を開裂する。更
に別の具体例では、突然変異ＡＰＣ開裂部位の開裂を行
うことはできるが非突然変異ＡＰＣ開裂部位の開裂を行
うことはできない、又はその逆のプロテアーゼを、ＡＰ
Ｃの代わりに使用し得る。決定すべき突然変異の種類が
確認されれば、当業者は、適当なプロテアーゼに関し
て、プロテアーゼについて知られている認識部位をスク
リーニングするためのルーチンの実験を行いさえすれば
よい。
【００３９】突然変異の検出の別の可能性は、もっと以
前から使用されているアミノ酸配列分析技術にある。非
突然変異因子のアミノ酸配列がわかれば、分析すべき因
子のアミノ酸配列を決定して、その配列を対応する非突
然変異因子の既知の配列と比較することは比較的簡単で
ある。しかしながら、突然変異の存在についてタンパク
質を分析するための簡単で効果的な方法は、抗体の使
用、例えばＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ、又は当業者に公
知の他の種々の免疫学的検査の使用である。
前から使用されているアミノ酸配列分析技術にある。非
突然変異因子のアミノ酸配列がわかれば、分析すべき因
子のアミノ酸配列を決定して、その配列を対応する非突
然変異因子の既知の配列と比較することは比較的簡単で
ある。しかしながら、突然変異の存在についてタンパク
質を分析するための簡単で効果的な方法は、抗体の使
用、例えばＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡ、又は当業者に公
知の他の種々の免疫学的検査の使用である。
【００４０】第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子の活性化形態
が、ある特定のメカニズムによって活性化されたもので
ある場合には、ＡＰＣ結合及び／又は開裂の低下のみを
示すことも可能である。これは、第Ｖ因子に関して実施
例１で明らかにする。実施例１では、トロンビンを用い
て活性化した活性化形態がＡＰＣの結合及び／又は開裂
能力の変化を示さないのに対し、第Ｘａ因子で活性化し
た活性化形態はＡＰＣによる結合及び／又は開裂の低下
を示す。しかしながら、前述のように、突然変異の影響
が活性化形態のうちの一つで生起するだけであるかどう
かに関係なく、第Ｖ因子、トロンビンで活性化した第Ｖ
ａ因子、又はＸａで活性化した第Ｖａ因子のいずれかに
突然変異の存在を検出することは、もちろん可能であ
る。
が、ある特定のメカニズムによって活性化されたもので
ある場合には、ＡＰＣ結合及び／又は開裂の低下のみを
示すことも可能である。これは、第Ｖ因子に関して実施
例１で明らかにする。実施例１では、トロンビンを用い
て活性化した活性化形態がＡＰＣの結合及び／又は開裂
能力の変化を示さないのに対し、第Ｘａ因子で活性化し
た活性化形態はＡＰＣによる結合及び／又は開裂の低下
を示す。しかしながら、前述のように、突然変異の影響
が活性化形態のうちの一つで生起するだけであるかどう
かに関係なく、第Ｖ因子、トロンビンで活性化した第Ｖ
ａ因子、又はＸａで活性化した第Ｖａ因子のいずれかに
突然変異の存在を検出することは、もちろん可能であ
る。
【００４１】実施例１で説明するように、原因不明の血
栓発現傾向を示す患者の大部分に代表的に見られる、第
Ｖ因子の特異的突然変異が検出された。これは、血漿因
子Ｖのアミノ酸配列のアミノ酸５０６に対応する位置の
アミノ酸の突然変異であった（Ｒｅｆ．２１に開示）。
従って、アミノ酸５０６の突然変異を決定することがで
きる方法は、本発明の好ましい具体例を構成する。一般
的に、検出すべき突然変異が、特に第Ｖ（ａ）因子及び
／又は第ＶＩＩＩ（ａ）因子のＨ鎖上で、ＡＰＣ開裂部
位に位置するアルギニンアミノ酸の変化を含む場合の方
法は、適切に実施し得る本発明の方法の具体例である。
栓発現傾向を示す患者の大部分に代表的に見られる、第
Ｖ因子の特異的突然変異が検出された。これは、血漿因
子Ｖのアミノ酸配列のアミノ酸５０６に対応する位置の
アミノ酸の突然変異であった（Ｒｅｆ．２１に開示）。
従って、アミノ酸５０６の突然変異を決定することがで
きる方法は、本発明の好ましい具体例を構成する。一般
的に、検出すべき突然変異が、特に第Ｖ（ａ）因子及び
／又は第ＶＩＩＩ（ａ）因子のＨ鎖上で、ＡＰＣ開裂部
位に位置するアルギニンアミノ酸の変化を含む場合の方
法は、適切に実施し得る本発明の方法の具体例である。
【００４２】突然変異を検出するためには、突然変異タ
ンパク質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子に結合すること
ができるか、又は突然変異タンパク質第Ｖ因子及び／又
は第Ｖａ因子の線状タンパク分解フラグメントに結合す
ることができる特異的抗体を使用し得る。前記抗体は、
非突然変異タンパク質又は非突然変異タンパク質の対応
するタンパク分解フラグメントに対する結合親和性が低
い。抗体を用いて行う方法は、タンパク質第ＶＩＩＩ及
び／又は第ＶＩＩＩａ因子、並びに前記突然変異タンパ
ク質第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の線状タン
パク分解フラグメントにも使用し得る。
ンパク質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子に結合すること
ができるか、又は突然変異タンパク質第Ｖ因子及び／又
は第Ｖａ因子の線状タンパク分解フラグメントに結合す
ることができる特異的抗体を使用し得る。前記抗体は、
非突然変異タンパク質又は非突然変異タンパク質の対応
するタンパク分解フラグメントに対する結合親和性が低
い。抗体を用いて行う方法は、タンパク質第ＶＩＩＩ及
び／又は第ＶＩＩＩａ因子、並びに前記突然変異タンパ
ク質第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の線状タン
パク分解フラグメントにも使用し得る。
【００４３】別の方法として、タンパク質第Ｖ及び／又
は第Ｖａ因子、又はタンパク質の第ＶＩＩＩ及び／又は
第ＶＩＩＩａ因子に結合することができる抗体を使用す
ることも可能である。前記タンパク質はＡＰＣによる不
活化の度合いの低下を示さず、前記抗体は、ＡＰＣによ
る不活化の度合いの低下を示す突然変異タンパク質を産
生させる突然変異を含む、対応する因子及び／又は該因
子のタンパク分解フラグメントに対する結合親和性が低
い。この場合は、単離タンパク質又はタンパク分解フラ
グメントに対する抗体の非結合が突然変異の存在を示す
ことになるようなテストを開発し得る。本発明は、前述
のような抗体を使用して実施する方法に関するだけでな
く、抗体自体にも関する。
は第Ｖａ因子、又はタンパク質の第ＶＩＩＩ及び／又は
第ＶＩＩＩａ因子に結合することができる抗体を使用す
ることも可能である。前記タンパク質はＡＰＣによる不
活化の度合いの低下を示さず、前記抗体は、ＡＰＣによ
る不活化の度合いの低下を示す突然変異タンパク質を産
生させる突然変異を含む、対応する因子及び／又は該因
子のタンパク分解フラグメントに対する結合親和性が低
い。この場合は、単離タンパク質又はタンパク分解フラ
グメントに対する抗体の非結合が突然変異の存在を示す
ことになるようなテストを開発し得る。本発明は、前述
のような抗体を使用して実施する方法に関するだけでな
く、抗体自体にも関する。
【００４４】本発明の方法では、最初に、正常血漿標準
と比較したＡＰＣ添加時の凝固時間の変化について試料
をスクリーニングし、次いで、試料が示すＡＰＣ耐性が
標準と比べて変化していると診断された場合には、第Ｖ
因子又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列の分析、
及び／又は第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩもしくは第ＶＩＩ
Ｉａ因子のアミノ酸配列の分析、及び／又は第Ｖ、第Ｖ
ａ、第ＶＩＩＩもしくは第ＶＩＩＩａ因子自体の分析を
行う。試料を、特異的突然変異の存在に関する分析、例
えば後述の実施例で説明する第Ｖ因子の突然変異に関す
る分析に直接かけることも可能である。使用する方法
は、事例の状況と、検査の対象とに依存する。例えば、
大きな集団をスクリーニングする場合は、コストが最も
低い方法を使用するのが好ましい。検出すべき突然変異
が抗体を用いて決定するのが困難な時もあり、その場合
は好ましくは核酸配列又は制限フラグメント分析を使用
し得る。また、制限フラグメント検査に使用すべき酵素
が廉価であればこのような検査の実施は極めて簡単であ
り、実施コストが低く、明らかに適したものと言える。
従って本発明は、試料が、正常第Ｖ因子及び／又は第Ｖ
ＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子及び／又は第Ｖ
ａ因子を含む試料と比べて、ＡＰＣによる結合及び／又
は開裂の変化を示すかどうかを決定し、次いで前述の方
法で前記変化を引き起こす突然変異を更に分析する検査
の使用にも関する。
と比較したＡＰＣ添加時の凝固時間の変化について試料
をスクリーニングし、次いで、試料が示すＡＰＣ耐性が
標準と比べて変化していると診断された場合には、第Ｖ
因子又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列の分析、
及び／又は第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩもしくは第ＶＩＩ
Ｉａ因子のアミノ酸配列の分析、及び／又は第Ｖ、第Ｖ
ａ、第ＶＩＩＩもしくは第ＶＩＩＩａ因子自体の分析を
行う。試料を、特異的突然変異の存在に関する分析、例
えば後述の実施例で説明する第Ｖ因子の突然変異に関す
る分析に直接かけることも可能である。使用する方法
は、事例の状況と、検査の対象とに依存する。例えば、
大きな集団をスクリーニングする場合は、コストが最も
低い方法を使用するのが好ましい。検出すべき突然変異
が抗体を用いて決定するのが困難な時もあり、その場合
は好ましくは核酸配列又は制限フラグメント分析を使用
し得る。また、制限フラグメント検査に使用すべき酵素
が廉価であればこのような検査の実施は極めて簡単であ
り、実施コストが低く、明らかに適したものと言える。
従って本発明は、試料が、正常第Ｖ因子及び／又は第Ｖ
ＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子及び／又は第Ｖ
ａ因子を含む試料と比べて、ＡＰＣによる結合及び／又
は開裂の変化を示すかどうかを決定し、次いで前述の方
法で前記変化を引き起こす突然変異を更に分析する検査
の使用にも関する。
【００４５】本発明の別の目的は、被験者の同型又は異
型である第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ又は第ＶＩＩＩａ因
子の突然変異を検出することにある。これは、Ｋｏｓｔ
ｅｒらによりＬａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，
Ｖｏｌ．３４に記述されているような、被験者がＡＰＣ
耐性を示すかどうかを調べるための検査プロトコルを用
いて実施し得る。基本的には、Ｋｏｓｔｅｒは、３３ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２と２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と５０
ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％オボアルブミンとを含む試
薬（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）５０μｌ、又は２．０μｇ／ｍ
ｌのヒトＡＰＣ及び０．６％グリセロールも含む前記試
薬（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）５０μｌで凝血塊の形成を開始
させる前に、５０μｌのＡＰＴＴ試薬（Ｃｅｐｈｏｔｅ
ｓｔ（登録商標）、バッチ１０３０２９）と共に３７℃
で３６０秒間インキュベートした５０μｌの非希釈血漿
の使用について記述している。彼はその結果を、ＡＰＴ
Ｔ（＋ＡＰＣ）及びＡＰＴＴ（−ＡＰＣ）の比であると
定義されるＡＰＣ感度比（ＡＰＣ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉ
ｔｙ ｒａｔｉｏ）（ＡＰＣ−ＳＲ）として表した。こ
れらの条件下では、正常血漿のＡＰＣ−ＳＲが示され
る。プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の濃度が減少す
ると（＜０．５Ｕ／ｍｌ）、ＡＰＣ−ＳＲは増加する。
従ってこの方法は、経口抗凝血剤で治療している患者の
評価には使用できない。Ｋｏｓｔｅｒは更に、このテス
トによって、彼が得た結果と、前文で述べたＣｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｘアッセイを使用して得られた結果との間
に、良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数０．５４）が
存在することが判明したと記述している。驚くべきこと
に、我々は、Ｋｏｓｔｅｒテストが、被験者が第Ｖ因子
の突然変異について同型であるか又は異型であるかを調
べるために適用した場合には、異型のほぼ半分を検出で
きないＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストより遥かに良く異
常を検出することを発見した。第１４図はＫｏｓｔｅｒ
テスト、第１１図はＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストを示
している。我々は、Ｋｏｓｔｅｒの方法及び市販のＣｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストを用いて、１６９１ ＧＧ
（正常）又は１６９１ ＡＧ（異型）であると遺伝子型
決定された（ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）個体の無作為抽出試
料の検査を２回実施した。Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテス
トでは、正常被験者及び異型被験者で得られた感度比の
間に大きな重複が存在しており、そのため異型の５０％
以上がＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストではＡＰＣ耐性で
あると同定できなかった。そこで我々は、被験者が、Ａ
ＰＣ耐性を引き起こす第Ｖ因子突然変異に関して異常で
あるか又は正常であるかを決定するのに適した別のテス
トを発見した。Ｋｏｓｔｅｒテストは従来、被験者がＡ
ＰＣ耐性一般について正常であるか又は異常であるかを
決定するのに有用であると見なされていただけである
が、我々は、該テストが実際には、ＡＰＣ耐性につなが
る第Ｖ因子突然変異を検出し、それもＣｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｘテストより遥かに大きい信頼度で検出することを
発見した。われわれのテストでは０．８４以下の値が異
常であり、正常被験者と同型被験者との間に重複は生じ
ない。これは、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストと比べて
大きな改善である。我々はこの改善が、Ｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｉｘテストの場合と異なる活性化剤の使用、そして
より重要なことに、異なるカルシウム濃度の使用に起因
すると考える。この改善されたテストでは、２５ｍＭＣ
ａＣｌ２以上の試料中カルシウム濃度を適用する。好ま
しくは、４５ｍＭ以下、より好ましくは３０〜４０ｍ
Ｍ、特に３１〜３５ｍＭとする。このより高い濃度はお
そらく、試料中のクエン酸塩をＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ
配合の場合より十分に中和する。別の改良点は、Ｃｅｐ
ｈｏｔｅｓｔ試薬を活性化剤として使用することにあ
る。この方法はまたＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストと類
似しており、該テストをかなり改善したものとみなすべ
きものである。ＡＰＣ感度比について得られた値を正規
化した場合は（実施例１参照）、特に第Ｖ因子突然変異
に関して、０．８４未満の値がＡＰＣ耐性に関して異常
であることを表し、０．８４を超える値がＡＰＣ耐性に
関して正常であることを表す。同型決定の場合は、０．
５０未満の値が記録されなければならない。異型は０．
５０〜０．７０の値を示す。しかしながら、この改善さ
れた方法は、抗凝血剤で治療した患者には適用できな
い。
型である第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ又は第ＶＩＩＩａ因
子の突然変異を検出することにある。これは、Ｋｏｓｔ
ｅｒらによりＬａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，
Ｖｏｌ．３４に記述されているような、被験者がＡＰＣ
耐性を示すかどうかを調べるための検査プロトコルを用
いて実施し得る。基本的には、Ｋｏｓｔｅｒは、３３ｍ
Ｍ ＣａＣｌ２と２５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と５０
ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％オボアルブミンとを含む試
薬（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）５０μｌ、又は２．０μｇ／ｍ
ｌのヒトＡＰＣ及び０．６％グリセロールも含む前記試
薬（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）５０μｌで凝血塊の形成を開始
させる前に、５０μｌのＡＰＴＴ試薬（Ｃｅｐｈｏｔｅ
ｓｔ（登録商標）、バッチ１０３０２９）と共に３７℃
で３６０秒間インキュベートした５０μｌの非希釈血漿
の使用について記述している。彼はその結果を、ＡＰＴ
Ｔ（＋ＡＰＣ）及びＡＰＴＴ（−ＡＰＣ）の比であると
定義されるＡＰＣ感度比（ＡＰＣ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉ
ｔｙ ｒａｔｉｏ）（ＡＰＣ−ＳＲ）として表した。こ
れらの条件下では、正常血漿のＡＰＣ−ＳＲが示され
る。プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の濃度が減少す
ると（＜０．５Ｕ／ｍｌ）、ＡＰＣ−ＳＲは増加する。
従ってこの方法は、経口抗凝血剤で治療している患者の
評価には使用できない。Ｋｏｓｔｅｒは更に、このテス
トによって、彼が得た結果と、前文で述べたＣｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｘアッセイを使用して得られた結果との間
に、良好な相関（Ｐｅａｒｓｏｎ相関係数０．５４）が
存在することが判明したと記述している。驚くべきこと
に、我々は、Ｋｏｓｔｅｒテストが、被験者が第Ｖ因子
の突然変異について同型であるか又は異型であるかを調
べるために適用した場合には、異型のほぼ半分を検出で
きないＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストより遥かに良く異
常を検出することを発見した。第１４図はＫｏｓｔｅｒ
テスト、第１１図はＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストを示
している。我々は、Ｋｏｓｔｅｒの方法及び市販のＣｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストを用いて、１６９１ ＧＧ
（正常）又は１６９１ ＡＧ（異型）であると遺伝子型
決定された（ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）個体の無作為抽出試
料の検査を２回実施した。Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテス
トでは、正常被験者及び異型被験者で得られた感度比の
間に大きな重複が存在しており、そのため異型の５０％
以上がＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストではＡＰＣ耐性で
あると同定できなかった。そこで我々は、被験者が、Ａ
ＰＣ耐性を引き起こす第Ｖ因子突然変異に関して異常で
あるか又は正常であるかを決定するのに適した別のテス
トを発見した。Ｋｏｓｔｅｒテストは従来、被験者がＡ
ＰＣ耐性一般について正常であるか又は異常であるかを
決定するのに有用であると見なされていただけである
が、我々は、該テストが実際には、ＡＰＣ耐性につなが
る第Ｖ因子突然変異を検出し、それもＣｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｘテストより遥かに大きい信頼度で検出することを
発見した。われわれのテストでは０．８４以下の値が異
常であり、正常被験者と同型被験者との間に重複は生じ
ない。これは、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストと比べて
大きな改善である。我々はこの改善が、Ｃｈｒｏｍｏｇ
ｅｎｉｘテストの場合と異なる活性化剤の使用、そして
より重要なことに、異なるカルシウム濃度の使用に起因
すると考える。この改善されたテストでは、２５ｍＭＣ
ａＣｌ２以上の試料中カルシウム濃度を適用する。好ま
しくは、４５ｍＭ以下、より好ましくは３０〜４０ｍ
Ｍ、特に３１〜３５ｍＭとする。このより高い濃度はお
そらく、試料中のクエン酸塩をＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ
配合の場合より十分に中和する。別の改良点は、Ｃｅｐ
ｈｏｔｅｓｔ試薬を活性化剤として使用することにあ
る。この方法はまたＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストと類
似しており、該テストをかなり改善したものとみなすべ
きものである。ＡＰＣ感度比について得られた値を正規
化した場合は（実施例１参照）、特に第Ｖ因子突然変異
に関して、０．８４未満の値がＡＰＣ耐性に関して異常
であることを表し、０．８４を超える値がＡＰＣ耐性に
関して正常であることを表す。同型決定の場合は、０．
５０未満の値が記録されなければならない。異型は０．
５０〜０．７０の値を示す。しかしながら、この改善さ
れた方法は、抗凝血剤で治療した患者には適用できな
い。
【００４６】この実施例では、検出された突然変異が、
第Ｖ因子のアミノ酸５０６のコドンにおけるＧ→Ａ突然
変異であった。突然変異の発生頻度及びこれに関連した
血栓症発生の危険度の高さは、被験者が同型であるか又
は異型であるかの決定が、親から子孫への突然変異因子
の遺伝に関する危険性を評価する時に大きな問題となる
ことを意味する。実施例２で、我々は、第Ｖ因子におけ
る突然変異の存在、特にＧ→Ａ突然変異が、実際に、血
栓症を発生させる危険因子であることを説明する。ま
た、初めて心筋梗塞にかかった患者の６％が１６９１
Ｇ−Ａ突然変異のキャリヤーであるという先に観察され
た事実は、この突然変異が動脈血栓症の弱い危険因子
（相対危険度１．５〜２．０）であることを意味し得
る。心臓発作の危険の増加が適時に検出されれば、被験
者は生活様式を調整し、このような発作を防ぐように注
意することができる。静脈血栓症に関して重要なこと
は、前文で既に説明した。
第Ｖ因子のアミノ酸５０６のコドンにおけるＧ→Ａ突然
変異であった。突然変異の発生頻度及びこれに関連した
血栓症発生の危険度の高さは、被験者が同型であるか又
は異型であるかの決定が、親から子孫への突然変異因子
の遺伝に関する危険性を評価する時に大きな問題となる
ことを意味する。実施例２で、我々は、第Ｖ因子におけ
る突然変異の存在、特にＧ→Ａ突然変異が、実際に、血
栓症を発生させる危険因子であることを説明する。ま
た、初めて心筋梗塞にかかった患者の６％が１６９１
Ｇ−Ａ突然変異のキャリヤーであるという先に観察され
た事実は、この突然変異が動脈血栓症の弱い危険因子
（相対危険度１．５〜２．０）であることを意味し得
る。心臓発作の危険の増加が適時に検出されれば、被験
者は生活様式を調整し、このような発作を防ぐように注
意することができる。静脈血栓症に関して重要なこと
は、前文で既に説明した。
【００４７】本発明は、ここで説明する全ての具体例で
本発明の方法を実施するのに必要な要素を含むキットに
も関する。これには例えば、前述の特異的抗体のうちの
一つ以上、特にＡＰＣ開裂及び／又は結合部位を認識す
る前述の抗体対を含み、及び／又は前述のような標的増
幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応のための
一つ以上のプローブ又はプライマーもしくはプライマー
対を含む検査キットが含まれる。本発明は特定的には、
第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ酸５０６をコー
ドする核酸配列の突然変異を含む核酸配列を増幅するた
めの一つ以上のプライマーを含むキットに関する。この
キットは、一つの特定の突然変異又は複数の突然変異を
検出するためのプライマー及び／又は抗体を含み得る。
該キットは、好ましくは、特定集団に多く見られるＡＰ
Ｃによる結合及び／又は開裂の低下及び／又は抹消を引
き起こす主要突然変異の検出に必要な構成要素を含む。
本発明の方法を実施するのに必要な要素を含むキットに
も関する。これには例えば、前述の特異的抗体のうちの
一つ以上、特にＡＰＣ開裂及び／又は結合部位を認識す
る前述の抗体対を含み、及び／又は前述のような標的増
幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応のための
一つ以上のプローブ又はプライマーもしくはプライマー
対を含む検査キットが含まれる。本発明は特定的には、
第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ酸５０６をコー
ドする核酸配列の突然変異を含む核酸配列を増幅するた
めの一つ以上のプライマーを含むキットに関する。この
キットは、一つの特定の突然変異又は複数の突然変異を
検出するためのプライマー及び／又は抗体を含み得る。
該キットは、好ましくは、特定集団に多く見られるＡＰ
Ｃによる結合及び／又は開裂の低下及び／又は抹消を引
き起こす主要突然変異の検出に必要な構成要素を含む。
【００４８】
【実施例】実施例１ 血栓症を有する無作為抽出した一連の患者の２１％（Ｌ
ａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４
２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｋｏｓｔｅｒら）、及
び個人的に又は家族に血栓症の病歴がある選択した患者
の約５０％（Ｒｅｆ．８及びＢｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８
２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１日）：ｐｐ．１９８
９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇｒｉｆｆｉｎら）の血漿中
で、ＡＰＣに対する弱い抗凝血結応答（「ＡＰＣ耐性」
（Ｒｅｆ．２））が最近発見された。我々はこの実施例
で、ＡＰＣ耐性の表現型が、ＡＰＣによる不活化に対し
て耐性である第Ｖ因子分子−ＦＶ（Ｑ５０６）又はＦＶ
Ｌｅｉｄｅｎ−の合成を予告する第Ｖ因子遺伝子の単
一点突然変異（１６９１，Ｇ→Ａ）に関する異型性又は
同型性に関連していることを明らかにする。オランダ集
団における突然変異の対立遺伝子頻度は約２％であり、
血栓症の全ての既知の遺伝性危険因子（プロテインＣ−
（ｒｅｆ．１７）、プロテインＳ−（Ｒｅｆ．３０）、
アンチトロンビンＩＩＩ（Ｒｅｆ．３１）欠失）の頻度
の合計の１０倍以上に達する（Ｒｅｆ．３２）。
ａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４
２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｋｏｓｔｅｒら）、及
び個人的に又は家族に血栓症の病歴がある選択した患者
の約５０％（Ｒｅｆ．８及びＢｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８
２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１日）：ｐｐ．１９８
９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇｒｉｆｆｉｎら）の血漿中
で、ＡＰＣに対する弱い抗凝血結応答（「ＡＰＣ耐性」
（Ｒｅｆ．２））が最近発見された。我々はこの実施例
で、ＡＰＣ耐性の表現型が、ＡＰＣによる不活化に対し
て耐性である第Ｖ因子分子−ＦＶ（Ｑ５０６）又はＦＶ
Ｌｅｉｄｅｎ−の合成を予告する第Ｖ因子遺伝子の単
一点突然変異（１６９１，Ｇ→Ａ）に関する異型性又は
同型性に関連していることを明らかにする。オランダ集
団における突然変異の対立遺伝子頻度は約２％であり、
血栓症の全ての既知の遺伝性危険因子（プロテインＣ−
（ｒｅｆ．１７）、プロテインＳ−（Ｒｅｆ．３０）、
アンチトロンビンＩＩＩ（Ｒｅｆ．３１）欠失）の頻度
の合計の１０倍以上に達する（Ｒｅｆ．３２）。
【００４９】明らかに健康な個体の５％がＡＰＣに対し
て弱い抗凝血応答を示し、このＡＰＣ耐性が深静脈血栓
症発生危険度の７倍の増加（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年
１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，ｐｐ．１５０３−１５
０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）に関係しているという我々
の発見に促されて、我々はこの表現型の分子的基礎を調
べた。
て弱い抗凝血応答を示し、このＡＰＣ耐性が深静脈血栓
症発生危険度の７倍の増加（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年
１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，ｐｐ．１５０３−１５
０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）に関係しているという我々
の発見に促されて、我々はこの表現型の分子的基礎を調
べた。
【００５０】ＡＰＣに対する血漿の応答度は、二つのＡ
ＰＴＴ、即ちＡＰＣの存在下で測定したＡＰＴＴ、及び
ＡＰＣの不在下で測定したＡＰＴＴの比として測定され
る（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．
３４２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒ
ら、Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７（１９９３年
１０月１日）；ｐｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇ
ｒｉｆｆｉｎら、及びＲｅｆ．２）。標準化のために、
前記比（ＡＰＣ感度比又はＡＰＣ−ＳＲ）を、基準血漿
について得られた比（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ）に合わせて正
規化する。ＡＰＣ耐性はｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４
（外れ値を除外した後の健康対照１００の平均ｎ−ＡＰ
Ｃ−ＳＲから１．９６ＳＤを差し引いた値）によって定
義される。
ＰＴＴ、即ちＡＰＣの存在下で測定したＡＰＴＴ、及び
ＡＰＣの不在下で測定したＡＰＴＴの比として測定され
る（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．
３４２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒ
ら、Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７（１９９３年
１０月１日）；ｐｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇ
ｒｉｆｆｉｎら、及びＲｅｆ．２）。標準化のために、
前記比（ＡＰＣ感度比又はＡＰＣ−ＳＲ）を、基準血漿
について得られた比（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ）に合わせて正
規化する。ＡＰＣ耐性はｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４
（外れ値を除外した後の健康対照１００の平均ｎ−ＡＰ
Ｃ−ＳＲから１．９６ＳＤを差し引いた値）によって定
義される。
【００５１】１４人の関係の無いＡＰＣ耐性患者の親の
分析の結果、同型及び異型をｎ−ＡＰＣ−ＳＲに基づい
て同定できるＡＰＣ耐性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠失
（Ｒｅｆ．２））の家族的形態の概念が得られた（図１
の説明文参照）。混合実験により、この概念の別の裏付
けが得られた（図１）。即ち、１倍容の正常血漿を、同
型ＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．３
８）であると分類された患者の血漿１倍容に加えると、
ｎ−ＡＰＣ−ＳＲが０．５７になった。これは、前記欠
失に関して異型であると分類された患者の血漿中で発見
された比（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５８）と同じで
ある。同型ＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（平均ｎ−ＡＰＣ−Ｓ
Ｒ ０．４０）であると分類された４人の関係の無い患
者の血漿を混合しても前記比は修正されなかった。これ
は、４人の患者全員が同じ血漿タンパク質を欠失又は欠
乏していることを意味する（Ｒｅｆ．２及びＢｌｏｏ
ｄ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１
日）：ｐｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇｒｉｆｆ
ｉｎら参照）。
分析の結果、同型及び異型をｎ−ＡＰＣ−ＳＲに基づい
て同定できるＡＰＣ耐性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠失
（Ｒｅｆ．２））の家族的形態の概念が得られた（図１
の説明文参照）。混合実験により、この概念の別の裏付
けが得られた（図１）。即ち、１倍容の正常血漿を、同
型ＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．３
８）であると分類された患者の血漿１倍容に加えると、
ｎ−ＡＰＣ−ＳＲが０．５７になった。これは、前記欠
失に関して異型であると分類された患者の血漿中で発見
された比（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５８）と同じで
ある。同型ＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（平均ｎ−ＡＰＣ−Ｓ
Ｒ ０．４０）であると分類された４人の関係の無い患
者の血漿を混合しても前記比は修正されなかった。これ
は、４人の患者全員が同じ血漿タンパク質を欠失又は欠
乏していることを意味する（Ｒｅｆ．２及びＢｌｏｏ
ｄ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１
日）：ｐｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇｒｉｆｆ
ｉｎら参照）。
【００５２】ＡＰＣ補因子ＩＩ活性が既知の凝血タンパ
ク質のうちの一つの機能的特徴である可能性を調べるた
めに、ＡＰＣ補因子ＩＩレベルを、単一タンパク質が欠
乏している一連の血漿中で測定した（図２）。これらの
血漿はいずれも、第Ｖ因子欠乏血漿（＜５％）を除い
て、正常なＡＰＣ補因子ＩＩレベル（６０〜１５５％）
を有していた。第Ｖ因子欠乏血漿に種々の量の単離ヒト
第Ｖ因子を加えると、第Ｖ因子凝血活性及びＡＰＣ補因
子ＩＩ活性の両方が導入された。
ク質のうちの一つの機能的特徴である可能性を調べるた
めに、ＡＰＣ補因子ＩＩレベルを、単一タンパク質が欠
乏している一連の血漿中で測定した（図２）。これらの
血漿はいずれも、第Ｖ因子欠乏血漿（＜５％）を除い
て、正常なＡＰＣ補因子ＩＩレベル（６０〜１５５％）
を有していた。第Ｖ因子欠乏血漿に種々の量の単離ヒト
第Ｖ因子を加えると、第Ｖ因子凝血活性及びＡＰＣ補因
子ＩＩ活性の両方が導入された。
【００５３】第Ｖ因子がＡＰＣ補因子ＩＩの候補である
ことの独立した裏付けが、ＡＰＣ耐性を有する大家族の
連鎖研究から得られた（図３）。
ことの独立した裏付けが、ＡＰＣ耐性を有する大家族の
連鎖研究から得られた（図３）。
【００５４】第Ｖ因子遺伝子（Ｆ５）のヒト遺伝子座を
染色体１（１ｑ２１−２５）についてマッピングした
（Ｒｅｆ．３３）。便利な（ＰＣＲ可能な）多形性Ｆ５
マーカーについての報告は存在しない。しかしながら、
公表されている第Ｖ因子ｃＤＮＡ及びゲノム配列の多様
性（Ｒｅｆ．２０−２３及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，２９９２
−３００１，Ｎｏ．７，１９９３年４月１日，Ｎ．Ｌ．
Ｌ．Ｓｈｅｎら）は、我々が第Ｖ因子遺伝子の二つの新
しい多形性を同定する助けになった。残念ながら、前記
ＡＰＣ耐性家族では、これらの多形性のどちらも情報を
与えるものではなかった。そこで我々は、この家族の１
ｑ２１−２５領域（図４参照）の幾つかの遺伝子座に関
するマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔ
ｅ）・マーカーの分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を検
査した。図５の表は、これらのマーカーとＡＰＣ耐性の
表現型との間の関係に関する二つ組ロドスコア（ｐａｉ
ｒｗｉｓｅ ｌｏｄｓｃｏｒｅ）を示している。かなり
肯定的な結果は、Ｆ５遺伝子座から４ｃＭ以内に位置す
る遺伝子座Ｄ１Ｓ６１（θ＝０．００でＺｍａｘ ７．
２７）に関してだけ得られた。
染色体１（１ｑ２１−２５）についてマッピングした
（Ｒｅｆ．３３）。便利な（ＰＣＲ可能な）多形性Ｆ５
マーカーについての報告は存在しない。しかしながら、
公表されている第Ｖ因子ｃＤＮＡ及びゲノム配列の多様
性（Ｒｅｆ．２０−２３及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌｏ
ｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，２９９２
−３００１，Ｎｏ．７，１９９３年４月１日，Ｎ．Ｌ．
Ｌ．Ｓｈｅｎら）は、我々が第Ｖ因子遺伝子の二つの新
しい多形性を同定する助けになった。残念ながら、前記
ＡＰＣ耐性家族では、これらの多形性のどちらも情報を
与えるものではなかった。そこで我々は、この家族の１
ｑ２１−２５領域（図４参照）の幾つかの遺伝子座に関
するマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔ
ｅ）・マーカーの分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を検
査した。図５の表は、これらのマーカーとＡＰＣ耐性の
表現型との間の関係に関する二つ組ロドスコア（ｐａｉ
ｒｗｉｓｅ ｌｏｄｓｃｏｒｅ）を示している。かなり
肯定的な結果は、Ｆ５遺伝子座から４ｃＭ以内に位置す
る遺伝子座Ｄ１Ｓ６１（θ＝０．００でＺｍａｘ ７．
２７）に関してだけ得られた。
【００５５】この時点で我々は、ＡＰＣ耐性が第Ｖ因子
遺伝子の欠陥に関係があるという証拠が、関連突然変異
の調査を開始するのに十分なだけそろっていると考え
た。我々は調査の焦点を、推定上のＡＰＣ結合部位（残
基１８６５−１８７４）（Ｒｅｆ．３５、３６）及び推
定上のＡＰＣ開裂部位（Ａｒｇ−５０６）（Ｒｅｆ．２
１及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．
２３，１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１
２３８，Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＫｅｎｎｅ
ｔｈ Ｍａｎｎ）をそれぞれ含む第Ｖ因子の二つの領域
に絞った。
遺伝子の欠陥に関係があるという証拠が、関連突然変異
の調査を開始するのに十分なだけそろっていると考え
た。我々は調査の焦点を、推定上のＡＰＣ結合部位（残
基１８６５−１８７４）（Ｒｅｆ．３５、３６）及び推
定上のＡＰＣ開裂部位（Ａｒｇ−５０６）（Ｒｅｆ．２
１及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉ
ｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．
２３，１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１
２３８，Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＫｅｎｎｅ
ｔｈ Ｍａｎｎ）をそれぞれ含む第Ｖ因子の二つの領域
に絞った。
【００５６】第一のアプローチとして、末梢血液リンパ
球から単離した第Ｖ因子遺伝子の異所転写体（ｅｃｔｏ
ｐｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて第一鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、次いでＡＰＣ結合及び開裂部位をコードす
る二つの領域を増幅した。ＰＣＲフラグメントの直接的
配列決定の結果、ＡＰＣ補因子ＩＩの同型接合欠失とし
て分類された二人の関係の無い患者の両方が、１６９
１，Ｇ→Ａトランジションに対して同型接合であること
が判明した（図６）。この突然変異は、Ｇｌｎ（ＣＡ
Ａ）（ＦＡ（Ｑ５０６）又はＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ）によ
るＡｒｇ−５０６（ＣＧＡ）の置換を予測させるもので
ある。１６９１ Ａを包囲する２２５ｂｐ、及び推定上
のＡＰＣ結合部位をコードする領域を包囲する２７５ｂ
ｐに、別の配列異常は観察されなかった（図７）。
球から単離した第Ｖ因子遺伝子の異所転写体（ｅｃｔｏ
ｐｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて第一鎖ｃＤＮ
Ａを合成し、次いでＡＰＣ結合及び開裂部位をコードす
る二つの領域を増幅した。ＰＣＲフラグメントの直接的
配列決定の結果、ＡＰＣ補因子ＩＩの同型接合欠失とし
て分類された二人の関係の無い患者の両方が、１６９
１，Ｇ→Ａトランジションに対して同型接合であること
が判明した（図６）。この突然変異は、Ｇｌｎ（ＣＡ
Ａ）（ＦＡ（Ｑ５０６）又はＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ）によ
るＡｒｇ−５０６（ＣＧＡ）の置換を予測させるもので
ある。１６９１ Ａを包囲する２２５ｂｐ、及び推定上
のＡＰＣ結合部位をコードする領域を包囲する２７５ｂ
ｐに、別の配列異常は観察されなかった（図７）。
【００５７】Ａｒｇ−５０６の後の開裂がＡＰＣによる
ヒト第Ｖａ因子の不活化のきっかけであれば、位置５０
６へのＧｌｎの導入が抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）
開裂を防止することが予測される。凝固プロセスの間
に、血漿因子Ｖはまず第Ｘａ因子によって活性化され
（１０５／２２０ｋＤａヘテロダイマーの形成（Ｒｅ
ｆ．３７））、次いで更にトロンビンによってプロセス
される（１０５／７４ｋＤａヘテロダイマーの形成（Ｒ
ｅｆ．３８））（Ｒｅｆ．３９）。興味深いことに、我
々はＧｌｎによるＡｒｇ−５０６の置換が、第Ｖ因子の
Ｘａ活性化形態のＡＰＣによる不活化のみを阻止し（図
８）トロンビン活性化形態の不活化は阻止しないことを
発見した（データ示さず）。
ヒト第Ｖａ因子の不活化のきっかけであれば、位置５０
６へのＧｌｎの導入が抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）
開裂を防止することが予測される。凝固プロセスの間
に、血漿因子Ｖはまず第Ｘａ因子によって活性化され
（１０５／２２０ｋＤａヘテロダイマーの形成（Ｒｅ
ｆ．３７））、次いで更にトロンビンによってプロセス
される（１０５／７４ｋＤａヘテロダイマーの形成（Ｒ
ｅｆ．３８））（Ｒｅｆ．３９）。興味深いことに、我
々はＧｌｎによるＡｒｇ−５０６の置換が、第Ｖ因子の
Ｘａ活性化形態のＡＰＣによる不活化のみを阻止し（図
８）トロンビン活性化形態の不活化は阻止しないことを
発見した（データ示さず）。
【００５８】二人の関係の無いＡＰＣ耐性患者が同じ突
然変異に対して同型接合であるという観察事実は、この
変化がＡＰＣ耐性患者の大半に存在することを示唆す
る。この可能性を調べるために、ゲノムＤＮＡを１６９
１ Ｇ→Ａトランジションの存在についてスクリーニン
グするテストを設計した。前記突然変異は、イントロン
１０の開始点から１１ｎｔ５１のエクソン１０に存在
し、イントロン１０のヌクレオチドは最初の８個のみが
公表されているため（Ｒｅｆ．２３）、半ネスト型（ｈ
ｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）逆ＰＣＲ（Ｒｅｆ．４０）によ
って、より長いイントロン１０配列を形成した（配列１
４も参照）。この情報に基づいて、遺伝子型決定に使用
し得る二つの重複ゲノムフラグメントを増幅するための
プライマーを設計した。
然変異に対して同型接合であるという観察事実は、この
変化がＡＰＣ耐性患者の大半に存在することを示唆す
る。この可能性を調べるために、ゲノムＤＮＡを１６９
１ Ｇ→Ａトランジションの存在についてスクリーニン
グするテストを設計した。前記突然変異は、イントロン
１０の開始点から１１ｎｔ５１のエクソン１０に存在
し、イントロン１０のヌクレオチドは最初の８個のみが
公表されているため（Ｒｅｆ．２３）、半ネスト型（ｈ
ｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）逆ＰＣＲ（Ｒｅｆ．４０）によ
って、より長いイントロン１０配列を形成した（配列１
４も参照）。この情報に基づいて、遺伝子型決定に使用
し得る二つの重複ゲノムフラグメントを増幅するための
プライマーを設計した。
【００５９】ＭｎｌＩでの２６７ｂｐフラグメントの消
化を使用して、正常（１６９１ Ｇ）又は突然変異対立
遺伝子の存在を明らかにし、この正常又は突然変異対立
遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドと２２２ｂ
ｐフラグメントとのハイブリダイゼーションを用いて、
１６９１ Ａを正に同定した。このアプローチを用い
て、我々はまず図３の家系の構成員を総て調べた。この
家系の一部について、図１０に示すように、１６９１，
Ｇ→Ａトランジションに関する異型接合性のＡＰＣ耐性
（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４）を用いた完全な同時分
離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が明らかにされた。
更に、経口抗凝血剤で治療したためにｎ−ＡＰＣ−ＳＲ
が得られない４人の患者（ＩＩ．６、ＩＩ．８、ＩＩ．
１４、ＩＩＩ．２２）は、異型接合性であることが判明
した。
化を使用して、正常（１６９１ Ｇ）又は突然変異対立
遺伝子の存在を明らかにし、この正常又は突然変異対立
遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドと２２２ｂ
ｐフラグメントとのハイブリダイゼーションを用いて、
１６９１ Ａを正に同定した。このアプローチを用い
て、我々はまず図３の家系の構成員を総て調べた。この
家系の一部について、図１０に示すように、１６９１，
Ｇ→Ａトランジションに関する異型接合性のＡＰＣ耐性
（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４）を用いた完全な同時分
離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が明らかにされた。
更に、経口抗凝血剤で治療したためにｎ−ＡＰＣ−ＳＲ
が得られない４人の患者（ＩＩ．６、ＩＩ．８、ＩＩ．
１４、ＩＩＩ．２２）は、異型接合性であることが判明
した。
【００６０】最初の客観的に確認された深静脈血栓を経
験したことがある３０１人の患者と、年齢及び性別が適
合した３０１の集団対照とについて先に行われた検査で
は、６４人のＡＰＣ耐性血栓症患者が同定された（Ｌａ
ｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，
ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）。こ
れら６４の患者と、対応する６４の対照とを、Ｇ→Ａト
ランジションの存在についてスクリーニングした。１２
８の個体のうち７０がｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４を示
した（６４の患者及び６の対照）。そのうち５６の個体
が突然変異を有しており（５３の患者及び３の対照）、
患者のうち６人の突然変異が両方の対立遺伝子にあり
（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．４３；範囲０．４１−
０．４４）、他の５０が一つの対立遺伝子にあった（平
均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５７；範囲０．５０−０．６
７）。残りの１４のＡＰＣ耐性個体は突然変異を有して
おらず、わずかに減少したｎ−ＡＰＣ−ＳＲを有してい
ただけであった（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．７８；範
囲０．７０−０．８３）。５８の非ＡＰＣ耐性個体はい
ずれも突然変異を有していなかった（平均ｎ−ＡＰＣ−
ＳＲ ０．９９；範囲０．８３−１．１９）。また、ｎ
−ＡＰＣ−ＳＲ＞０．８４の１００人の血栓症患者の中
に突然変異のキャリヤーはいなかったが、予想した通
り、対応する１００の適合対照のうち３は突然変異のキ
ャリヤーであった。この３つは（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲがそ
れぞれ０．５７、０．５８及び０．５９）、ｎ−ＡＰＣ
−ＳＲ＜０．８４を有する唯一の対照であった。
験したことがある３０１人の患者と、年齢及び性別が適
合した３０１の集団対照とについて先に行われた検査で
は、６４人のＡＰＣ耐性血栓症患者が同定された（Ｌａ
ｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，
ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）。こ
れら６４の患者と、対応する６４の対照とを、Ｇ→Ａト
ランジションの存在についてスクリーニングした。１２
８の個体のうち７０がｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４を示
した（６４の患者及び６の対照）。そのうち５６の個体
が突然変異を有しており（５３の患者及び３の対照）、
患者のうち６人の突然変異が両方の対立遺伝子にあり
（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．４３；範囲０．４１−
０．４４）、他の５０が一つの対立遺伝子にあった（平
均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５７；範囲０．５０−０．６
７）。残りの１４のＡＰＣ耐性個体は突然変異を有して
おらず、わずかに減少したｎ−ＡＰＣ−ＳＲを有してい
ただけであった（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．７８；範
囲０．７０−０．８３）。５８の非ＡＰＣ耐性個体はい
ずれも突然変異を有していなかった（平均ｎ−ＡＰＣ−
ＳＲ ０．９９；範囲０．８３−１．１９）。また、ｎ
−ＡＰＣ−ＳＲ＞０．８４の１００人の血栓症患者の中
に突然変異のキャリヤーはいなかったが、予想した通
り、対応する１００の適合対照のうち３は突然変異のキ
ャリヤーであった。この３つは（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲがそ
れぞれ０．５７、０．５８及び０．５９）、ｎ−ＡＰＣ
−ＳＲ＜０．８４を有する唯一の対照であった。
【００６１】我々のデータは、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．
８４の個体の８０％、及びｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．７０
の個体の１００％が、１６９１，Ｇ→Ａトランジション
に関して異型又は同型接合であり、また逆にすべての突
然変異キャリヤーがｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．７を有する
ことを示すものである。オランダ集団における突然変異
対立遺伝子の比較的高い頻度（約２％）と、ＡＰＣ耐性
が深静脈血栓症の一般的な強力危険因子であるという我
々の発見（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖ
ｏｌ．３４２，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）とを組合わせるて
考えると、この遺伝性の第Ｖ因子欠乏は現在のところ最
も一般的な遺伝性凝血障害ということになる。
８４の個体の８０％、及びｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．７０
の個体の１００％が、１６９１，Ｇ→Ａトランジション
に関して異型又は同型接合であり、また逆にすべての突
然変異キャリヤーがｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．７を有する
ことを示すものである。オランダ集団における突然変異
対立遺伝子の比較的高い頻度（約２％）と、ＡＰＣ耐性
が深静脈血栓症の一般的な強力危険因子であるという我
々の発見（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖ
ｏｌ．３４２，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）とを組合わせるて
考えると、この遺伝性の第Ｖ因子欠乏は現在のところ最
も一般的な遺伝性凝血障害ということになる。
【００６２】図１及び図２ 血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ濃度の測定 図１． 血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活性のアッセイに関
する検量線 ＡＰＣ補因子ＩＩは、ＡＰＣ耐性を有する個体に欠失又
は欠乏している、ＡＰＣの想定上の新しい補因子である
（Ｒｅｆ．２）。ＡＰＣ補因子ＩＩが欠乏している同型
接合患者の血漿（ＡＰＣ補因子ＩＩ ０％）中の正常血
漿（ＡＰＣ補因子ＩＩ １００％）希釈物中で、ｎ−Ａ
ＰＣ−ＳＲを測定した。図１の曲線は、９回の異なる実
験の結果である。ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏同型又は異型接
合の分類は、ＡＰＣ耐性を有する１４のプロバンド（ｐ
ｒｏｂａｎｄ）（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４）に関す
る親分析の結果に基づく。２個のプロバンド（ｎ−ＡＰ
Ｃ−ＳＲ ０．３８／０／４１）では両親がＡＰＣ耐性
を有しており（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５５）、１
１個のプロバンド（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５７）
では、親の一方がＡＰＣ耐性である（平均ｎ−ＡＰＣ−
ＳＲ ０．５９）のに対し他方がＡＰＣ耐性ではなく
（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．９６）、１個のプロバン
ド（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．７４）では両親ともＡＰＣ
耐性ではなかった（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．９６／０．
９９）。我々は、個体のｎ−ＡＰＣ−ＳＲに基づいて、
個体をＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏に関し同型又は異型接合で
あると分類できると考える（同型：平均０．４０、ｎ＝
２；異型：平均０．５８、範囲０．５１−０．６７、ｎ
＝２６）。
する検量線 ＡＰＣ補因子ＩＩは、ＡＰＣ耐性を有する個体に欠失又
は欠乏している、ＡＰＣの想定上の新しい補因子である
（Ｒｅｆ．２）。ＡＰＣ補因子ＩＩが欠乏している同型
接合患者の血漿（ＡＰＣ補因子ＩＩ ０％）中の正常血
漿（ＡＰＣ補因子ＩＩ １００％）希釈物中で、ｎ−Ａ
ＰＣ−ＳＲを測定した。図１の曲線は、９回の異なる実
験の結果である。ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏同型又は異型接
合の分類は、ＡＰＣ耐性を有する１４のプロバンド（ｐ
ｒｏｂａｎｄ）（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４）に関す
る親分析の結果に基づく。２個のプロバンド（ｎ−ＡＰ
Ｃ−ＳＲ ０．３８／０／４１）では両親がＡＰＣ耐性
を有しており（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５５）、１
１個のプロバンド（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５７）
では、親の一方がＡＰＣ耐性である（平均ｎ−ＡＰＣ−
ＳＲ ０．５９）のに対し他方がＡＰＣ耐性ではなく
（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．９６）、１個のプロバン
ド（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．７４）では両親ともＡＰＣ
耐性ではなかった（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．９６／０．
９９）。我々は、個体のｎ−ＡＰＣ−ＳＲに基づいて、
個体をＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏に関し同型又は異型接合で
あると分類できると考える（同型：平均０．４０、ｎ＝
２；異型：平均０．５８、範囲０．５１−０．６７、ｎ
＝２６）。
【００６３】図２． 単一凝固因子が欠乏している（＜
５％）血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活性レベル 血漿は、先天性欠乏を有する患者に由来するもの（ａ、
ｇ、ｆ、ｍ、ｇ、ｒ、ｓ、ｔ）、又はイムノデプリーシ
ョン（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって製造
したもの（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｊ、ｈ、ｉ、ｋ、ｌ、ｐ）
である。血漿は、第ＩＩ因子欠乏（ａ）、第ＶＩＩ因子
欠乏（ｂ）、第ＩＸ因子欠乏（ｃ）、第Ｘ因子欠乏
（ｄ）、第ＸＩ因子欠乏（ｅ）、第ＸＩＩ因子欠乏
（ｊ）、第ＸＩＩＩ因子欠乏（ｇ）、プロテインＣ欠乏
（ｌ）、プロテインＳ欠乏（ｉ）、β２−糖タンパク質
欠乏（ｊ）、抗トロンビン欠乏（ｋ）、第Ｖ因子欠乏
（ｌ，ｍ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏（ｐ，ｑ）又はｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子欠乏（ｒ、ｓ、ｔ）であっ
た。第Ｖ因子欠乏血漿（ｍ）に精製ヒト第Ｖ因子（Ｓｅ
ｒｂｉｏ，Ｇｅｎｎｅｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｆｒａｎｃ
ｅ）を二つの異なる濃度、５４％（ｎ）及び９０％
（ｏ）で加え、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ２に対して透析し、Ａ
ＰＣ補因子ＩＩ活性について検査した。
５％）血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活性レベル 血漿は、先天性欠乏を有する患者に由来するもの（ａ、
ｇ、ｆ、ｍ、ｇ、ｒ、ｓ、ｔ）、又はイムノデプリーシ
ョン（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）によって製造
したもの（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｊ、ｈ、ｉ、ｋ、ｌ、ｐ）
である。血漿は、第ＩＩ因子欠乏（ａ）、第ＶＩＩ因子
欠乏（ｂ）、第ＩＸ因子欠乏（ｃ）、第Ｘ因子欠乏
（ｄ）、第ＸＩ因子欠乏（ｅ）、第ＸＩＩ因子欠乏
（ｊ）、第ＸＩＩＩ因子欠乏（ｇ）、プロテインＣ欠乏
（ｌ）、プロテインＳ欠乏（ｉ）、β２−糖タンパク質
欠乏（ｊ）、抗トロンビン欠乏（ｋ）、第Ｖ因子欠乏
（ｌ，ｍ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏（ｐ，ｑ）又はｖｏｎ
Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子欠乏（ｒ、ｓ、ｔ）であっ
た。第Ｖ因子欠乏血漿（ｍ）に精製ヒト第Ｖ因子（Ｓｅ
ｒｂｉｏ，Ｇｅｎｎｅｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｆｒａｎｃ
ｅ）を二つの異なる濃度、５４％（ｎ）及び９０％
（ｏ）で加え、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ２に対して透析し、Ａ
ＰＣ補因子ＩＩ活性について検査した。
【００６４】方法：二つのＡＰＴＴ測定、即ちＡＰＣの
存在下での測定及び不在下での測定の結果に基づき、既
述の方法と全く同じ方法（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１
２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）で
ＡＰＣ−ＳＲを計算した。検査試料のＡＰＣ−ＳＲを、
プールしてあった正常血漿のＡＰＣ−ＳＲで割り算し
て、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲを計算した。図１に示すような検
量線で、ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏血漿中の検査血漿の二つ
の異なる希釈物（１：１、３：４）のｎ−ＡＰＣ−ＳＲ
を読み取ることにより、ＡＰＣ補因子ＩＩ活性を測定し
た。
存在下での測定及び不在下での測定の結果に基づき、既
述の方法と全く同じ方法（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１
２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）で
ＡＰＣ−ＳＲを計算した。検査試料のＡＰＣ−ＳＲを、
プールしてあった正常血漿のＡＰＣ−ＳＲで割り算し
て、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲを計算した。図１に示すような検
量線で、ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏血漿中の検査血漿の二つ
の異なる希釈物（１：１、３：４）のｎ−ＡＰＣ−ＳＲ
を読み取ることにより、ＡＰＣ補因子ＩＩ活性を測定し
た。
【００６５】図３〜図５． ＡＰＣ耐性を有する家族の
連鎖分析 図３． ＡＰＣ耐性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏）を有
する家族の家系
連鎖分析 図３． ＡＰＣ耐性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏）を有
する家族の家系
【００６６】
【化１】 図４． 染色体ｌのｑ２１−２５領域の統合的遺伝連鎖
地図 遺伝子座ＡＰＯＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ６１、ＡＴ
３、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂの相対位置を、ＮＩＨ／ＣＥ
ＰＨ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｍａｐｐｉｎｇ
Ｇｒｏｕｐ連鎖地図（Ｒｅｆ．４１）から誘導した。隣
接遺伝子座間の遺伝距離はｃＭで示す。Ｆ５及びＤ１Ｓ
６１遺伝子座のマーカーの情報を提供する三つのＣＥＰ
Ｈ家族におけるこれら２個のマーカーの分離を調べたと
ころ、Ｆ５遺伝子座は、この地図上で、Ｄ１Ｓ６１遺伝
子座から４ｃＭ以内に位置していた（５５の減数分裂
で、これら二つの遺伝子座の間に組換えは観察されなか
った：θ＝０．００でＺｍａｘ１６．６）。
地図 遺伝子座ＡＰＯＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ６１、ＡＴ
３、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂの相対位置を、ＮＩＨ／ＣＥ
ＰＨ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｍａｐｐｉｎｇ
Ｇｒｏｕｐ連鎖地図（Ｒｅｆ．４１）から誘導した。隣
接遺伝子座間の遺伝距離はｃＭで示す。Ｆ５及びＤ１Ｓ
６１遺伝子座のマーカーの情報を提供する三つのＣＥＰ
Ｈ家族におけるこれら２個のマーカーの分離を調べたと
ころ、Ｆ５遺伝子座は、この地図上で、Ｄ１Ｓ６１遺伝
子座から４ｃＭ以内に位置していた（５５の減数分裂
で、これら二つの遺伝子座の間に組換えは観察されなか
った：θ＝０．００でＺｍａｘ１６．６）。
【００６７】図５． 染色体１マーカーでのＡＰＣ耐性
の二つ組ロドスコア 図３の家系の検査できる個体総てを分析した。遺伝子座
ＡｐｏＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ６１、ＬＡＭＢ及び
Ｆ１３Ｂのマーカーのオリゴヌクレオチド配列はゲノム
データバンクから入手できる。プライマーはオランダプ
ライマーベースから得た。ＡＴ３遺伝子座の三つの異な
る多形性マーカーは、この家族の情報を提供するもので
はなかった。Ｄｒ．Ｊ．Ｏｔｔから入手したＬＩＮＫＡ
ＧＥパッケージバージョン５．３からのＭＬＩＮＫプロ
グラムを用いて、２点連鎖分析（ｔｗｏ ｐｏｉｎｔ
ｌｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。性別平
均ロドスコアを示す。
の二つ組ロドスコア 図３の家系の検査できる個体総てを分析した。遺伝子座
ＡｐｏＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ６１、ＬＡＭＢ及び
Ｆ１３Ｂのマーカーのオリゴヌクレオチド配列はゲノム
データバンクから入手できる。プライマーはオランダプ
ライマーベースから得た。ＡＴ３遺伝子座の三つの異な
る多形性マーカーは、この家族の情報を提供するもので
はなかった。Ｄｒ．Ｊ．Ｏｔｔから入手したＬＩＮＫＡ
ＧＥパッケージバージョン５．３からのＭＬＩＮＫプロ
グラムを用いて、２点連鎖分析（ｔｗｏ ｐｏｉｎｔ
ｌｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ）を実施した。性別平
均ロドスコアを示す。
【００６８】方法：ＡｐｏＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ
６１、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂのマイクロサテライト・マ
ーカーをＰＣＲで増幅した。条件：５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．６）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＧＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、２０μＭ ｄＣＴＰ、０．
７μＣｉ α３２Ｐ ｄＣＴＰ、０．４３Ｕ Ｔａｑポ
リメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）、５０ｎｇの各プライマー及び３０ｎｇの
ゲノムＤＮＡ。最終延伸（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステ
ップを１０分間にして、９４℃（１’）、５５℃
（２’）、７２℃（１’）で２７サイクル実施した。Ｐ
ＣＲ生成物を６％変性用ポリアクリルアミド配列ゲル上
で分離し、その後ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露し
た。
６１、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂのマイクロサテライト・マ
ーカーをＰＣＲで増幅した。条件：５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．６）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．０１％ＢＳＡ、２００μＭ ｄＧＴ
Ｐ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、２０μＭ ｄＣＴＰ、０．
７μＣｉ α３２Ｐ ｄＣＴＰ、０．４３Ｕ Ｔａｑポ
リメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，Ｃ
Ａ，ＵＳＡ）、５０ｎｇの各プライマー及び３０ｎｇの
ゲノムＤＮＡ。最終延伸（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステ
ップを１０分間にして、９４℃（１’）、５５℃
（２’）、７２℃（１’）で２７サイクル実施した。Ｐ
ＣＲ生成物を６％変性用ポリアクリルアミド配列ゲル上
で分離し、その後ゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに暴露し
た。
【００６９】Ｆ５多形性：第Ｖ因子遺伝子のエクソン１
３からの６３６ｂｐフラグメント（Ｒｅｆ．２３）を、
配列表のプライマー番号２（ＰＲ−７６６、ｎｔ２２５
３−２２７２（Ｒｅｆ．２１））及び番号３（ＰＲ−７
６８、ｎｔ２８７０−２８９９（Ｒｅｆ．２１））を用
いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件については図１０及
び第１１図の説明文を参照されたい。Ｈｉｎｆ Ｉで制
限すると、ｎｔ ２２９８のＣ／Ｔ二形性（Ｃ：０．６
８；Ｔ：０．３２）と、ｎｔ２４１１の稀なＡ／Ｇ二形
性（Ａ：０．９８；Ｇ：０．０２）とが検出される。こ
れらのマーカーのうち、図３の家系で情報提供するもの
はない。
３からの６３６ｂｐフラグメント（Ｒｅｆ．２３）を、
配列表のプライマー番号２（ＰＲ−７６６、ｎｔ２２５
３−２２７２（Ｒｅｆ．２１））及び番号３（ＰＲ−７
６８、ｎｔ２８７０−２８９９（Ｒｅｆ．２１））を用
いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件については図１０及
び第１１図の説明文を参照されたい。Ｈｉｎｆ Ｉで制
限すると、ｎｔ ２２９８のＣ／Ｔ二形性（Ｃ：０．６
８；Ｔ：０．３２）と、ｎｔ２４１１の稀なＡ／Ｇ二形
性（Ａ：０．９８；Ｇ：０．０２）とが検出される。こ
れらのマーカーのうち、図３の家系で情報提供するもの
はない。
【００７０】図６〜図８． ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏同型
接合患者の第Ｖ因子遺伝子突然変異の同定 図６． ＡＰＣ補因子ＩＩ同型接合欠乏として分類され
た患者のヌクレオチド置換を示すオートラジオグラム ｃＤＮＡ ＰＣＲフラグメント（ヒト第Ｖ因子のアミノ
酸４１７〜５７２をコードする（Ｒｅｆ．２１））の非
コード鎖のヌクレオチド配列の一部を、一人の患者
（Ｐ）及び一人の非ＡＰＣ耐性対照（Ｃ）に関して示
す。矢印は、ＧｌｎによるＡｒｇ ５０６の置換を予告
する１６９１，Ｇ→Ａトランジションの位置を示す。
接合患者の第Ｖ因子遺伝子突然変異の同定 図６． ＡＰＣ補因子ＩＩ同型接合欠乏として分類され
た患者のヌクレオチド置換を示すオートラジオグラム ｃＤＮＡ ＰＣＲフラグメント（ヒト第Ｖ因子のアミノ
酸４１７〜５７２をコードする（Ｒｅｆ．２１））の非
コード鎖のヌクレオチド配列の一部を、一人の患者
（Ｐ）及び一人の非ＡＰＣ耐性対照（Ｃ）に関して示
す。矢印は、ＧｌｎによるＡｒｇ ５０６の置換を予告
する１６９１，Ｇ→Ａトランジションの位置を示す。
【００７１】図７． 第Ｖ因子分子の簡単な説明図 ヒト第Ｖ因子は、数種類の内部反復を含む３３０ｋＤａ
糖タンパク質である（Ｒｅｆ．２１）。第Ｘａ因子での
活性化は、１０５／２２０ｋＤａヘテロダイマー（Ａ１
Ａ２／Ｂ’Ａ３Ｃ１Ｃ２）（Ｒｅｆ．３８）の形成につ
ながり、トロンビンでの活性化は１０５／７４ｋＤａヘ
テロダイマー（Ａ１Ａ２／Ａ３Ｃ１Ｃ２）（Ｒｅｆ．３
７）の形成につながる。ＡＰＣは第Ｖａ因子のＡ３領域
に結合し（Ｒｅｆ．３５、３６）、Ａｒｇ−５０５後の
Ａ２領域内での開裂によってウシ第Ｖａ因子を阻害する
（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２３，
１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２３
８，Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＫｅｎｎｅｔｈ
Ｍａｎｎ）。
糖タンパク質である（Ｒｅｆ．２１）。第Ｘａ因子での
活性化は、１０５／２２０ｋＤａヘテロダイマー（Ａ１
Ａ２／Ｂ’Ａ３Ｃ１Ｃ２）（Ｒｅｆ．３８）の形成につ
ながり、トロンビンでの活性化は１０５／７４ｋＤａヘ
テロダイマー（Ａ１Ａ２／Ａ３Ｃ１Ｃ２）（Ｒｅｆ．３
７）の形成につながる。ＡＰＣは第Ｖａ因子のＡ３領域
に結合し（Ｒｅｆ．３５、３６）、Ａｒｇ−５０５後の
Ａ２領域内での開裂によってウシ第Ｖａ因子を阻害する
（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２３，
１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２３
８，Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＫｅｎｎｅｔｈ
Ｍａｎｎ）。
【００７２】ヒト（Ａｒｇ−５０６）及びウシ（Ａｒｇ
−５０５）第Ｖａ因子の推定上の（Ｒｅｆ．４３）ＡＰ
Ｃ開裂部位を包囲するアミノ酸配列を示す。ＡＰＣ耐性
患者では、Ａｒｇ−５０６がＧｌｎで置換されている。
−５０５）第Ｖａ因子の推定上の（Ｒｅｆ．４３）ＡＰ
Ｃ開裂部位を包囲するアミノ酸配列を示す。ＡＰＣ耐性
患者では、Ａｒｇ−５０６がＧｌｎで置換されている。
【００７３】図８． ＡＰＣによる不活化に対する第Ｘ
ａ因子活性化第Ｖ因子（Ｑ５０６）の耐性 第Ｖ因子（Ｒ５０６）又は第Ｖ因子（Ｑ５０６）を含
む、Ａｌ（ＯＨ）３吸着しフィブリノーゲン欠失した血
漿（２時間、３７℃；０．３Ｕ／ｍｌ−１アーブン）
を、２０ｍＭＣａＣｌ２及び２０μＭ ＰＳ／ＰＣ（２
５／７５）の存在下で、第Ｘａ因子（２ ｎＭ）で処理
した。８分後、第Ｖ因子の活性化が終了した時点で、
１．９ｎＭのＡＰＣ又は緩衝液を加えた。様々な時間間
隔で、１０μｌの試料をストップ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１８０ｍＭＮａＣｌ、０．５
ｍｇ／ｍｌ−１ＯＶＡ、５ｍＭ ＣａＣｌ２）中で１／
１００に希釈し、Ｐｉｅｔｅｒｓらの方法（Ｒｅｆ．４
４）を用いて、第Ｖａ因子活性について直接アッセイし
た。０．７０Ｕ／ｍｌ−１ＦＶ（Ｒ５０６）（０．６４
μＭトロンビン分−１）又は０．４９Ｕ／ｍｌ−１ＦＶ
（Ｑ５０６）（０．２０μＭトロンビン分−１）の完全
な活性化後に測定した第Ｖａ因子活性は、任意に１００
％とみなされる； ○，−ＡＰＣ； ●，＋ＡＰＣ。
ａ因子活性化第Ｖ因子（Ｑ５０６）の耐性 第Ｖ因子（Ｒ５０６）又は第Ｖ因子（Ｑ５０６）を含
む、Ａｌ（ＯＨ）３吸着しフィブリノーゲン欠失した血
漿（２時間、３７℃；０．３Ｕ／ｍｌ−１アーブン）
を、２０ｍＭＣａＣｌ２及び２０μＭ ＰＳ／ＰＣ（２
５／７５）の存在下で、第Ｘａ因子（２ ｎＭ）で処理
した。８分後、第Ｖ因子の活性化が終了した時点で、
１．９ｎＭのＡＰＣ又は緩衝液を加えた。様々な時間間
隔で、１０μｌの試料をストップ緩衝液（５０ｍＭトリ
ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１８０ｍＭＮａＣｌ、０．５
ｍｇ／ｍｌ−１ＯＶＡ、５ｍＭ ＣａＣｌ２）中で１／
１００に希釈し、Ｐｉｅｔｅｒｓらの方法（Ｒｅｆ．４
４）を用いて、第Ｖａ因子活性について直接アッセイし
た。０．７０Ｕ／ｍｌ−１ＦＶ（Ｒ５０６）（０．６４
μＭトロンビン分−１）又は０．４９Ｕ／ｍｌ−１ＦＶ
（Ｑ５０６）（０．２０μＭトロンビン分−１）の完全
な活性化後に測定した第Ｖａ因子活性は、任意に１００
％とみなされる； ○，−ＡＰＣ； ●，＋ＡＰＣ。
【００７４】方法： ｃＤＮＡ合成：同意した患者及び非ＡＰＣ耐性対照のク
エン酸含有血液１０ｍｌのリンパ球フラクションからＲ
ＮＡを単離した（Ｒｅｆ．４５）。１μｇのＲＮＡを鋳
型として使用し、スーパースクリプト・キット（ＢＲ
Ｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用い
て、混合ランダムヘキサマーの存在下で第一鎖ｃＤＮＡ
を合成した。ｃＤＮＡフラグメントの増幅。プライマー
配列４（ＰＲ−７６４，ｎｔ １４２１−１４４０（Ｒ
ｅｆ．２１））及び配列５（ＰＲ−８５６，ｎｔ １８
６７−１８９１（Ｒｅｆ．２１））は、推定上のＡＰＣ
開裂部位を含む残基４１７〜５７２をコードする領域を
増幅し、プライマー配列６（ＰＲ−８４９ ｎｔ ５６
０８−５６２７（Ｒｅｆ．２１））及び配列７（ＰＲ−
８４８，ｎｔ ６０４０−６０６３（Ｒｅｆ．２１））
は、ＡＰＣ結合領域を含むアミノ酸残基１８１２〜１９
６３をコードする領域を増幅する。ＰＣＲ条件は、図９
及び図１０の説明文に記載の通りである。ＰＣＲフラグ
メントをゲル化温度が極めて低いアガロース上で精製
し、ＰＣＲ反応と同じプライマーを用いて前述のように
直接配列決定した（Ｒｅｆ．４２）。ＡＰＣ結合領域の
配列決定を補助するために、更にもう一つのプライマー
を合成した：配列８（ＰＲ−８４７，ｎｔ ５９０５−
５９２７（Ｒｅｆ．２１））。
エン酸含有血液１０ｍｌのリンパ球フラクションからＲ
ＮＡを単離した（Ｒｅｆ．４５）。１μｇのＲＮＡを鋳
型として使用し、スーパースクリプト・キット（ＢＲ
Ｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用い
て、混合ランダムヘキサマーの存在下で第一鎖ｃＤＮＡ
を合成した。ｃＤＮＡフラグメントの増幅。プライマー
配列４（ＰＲ−７６４，ｎｔ １４２１−１４４０（Ｒ
ｅｆ．２１））及び配列５（ＰＲ−８５６，ｎｔ １８
６７−１８９１（Ｒｅｆ．２１））は、推定上のＡＰＣ
開裂部位を含む残基４１７〜５７２をコードする領域を
増幅し、プライマー配列６（ＰＲ−８４９ ｎｔ ５６
０８−５６２７（Ｒｅｆ．２１））及び配列７（ＰＲ−
８４８，ｎｔ ６０４０−６０６３（Ｒｅｆ．２１））
は、ＡＰＣ結合領域を含むアミノ酸残基１８１２〜１９
６３をコードする領域を増幅する。ＰＣＲ条件は、図９
及び図１０の説明文に記載の通りである。ＰＣＲフラグ
メントをゲル化温度が極めて低いアガロース上で精製
し、ＰＣＲ反応と同じプライマーを用いて前述のように
直接配列決定した（Ｒｅｆ．４２）。ＡＰＣ結合領域の
配列決定を補助するために、更にもう一つのプライマー
を合成した：配列８（ＰＲ−８４７，ｎｔ ５９０５−
５９２７（Ｒｅｆ．２１））。
【００７５】図９及び図１０． ＡＰＣ耐性と第Ｖ因子
の１６９１Ａ対立遺伝子の存在との関係 図９． １６９１ＡのＡＰＣ耐性による同時分離 上部は家系（図３）における個体の位置を示し、可能で
あればｎ−ＡＰＣ−ＳＲも示す（ＩＩ６は経口抗凝血剤
治療に関する）。中間部は、２６７ｂｐ ＰＣＲフラグ
メントのＭｎｌ Ｉ消化の結果を示す。下部は、２２２
ｂｐフラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １
００５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドと
のドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示
す。 図１０． ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４の６４人の血栓
症患者及び対応する６４の対照の２２２ｂｐ ＰＣＲフ
ラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １００
５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドとのド
ットブロットハイブリダイゼーション。
の１６９１Ａ対立遺伝子の存在との関係 図９． １６９１ＡのＡＰＣ耐性による同時分離 上部は家系（図３）における個体の位置を示し、可能で
あればｎ−ＡＰＣ−ＳＲも示す（ＩＩ６は経口抗凝血剤
治療に関する）。中間部は、２６７ｂｐ ＰＣＲフラグ
メントのＭｎｌ Ｉ消化の結果を示す。下部は、２２２
ｂｐフラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １
００５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドと
のドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示
す。 図１０． ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４の６４人の血栓
症患者及び対応する６４の対照の２２２ｂｐ ＰＣＲフ
ラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １００
５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドとのド
ットブロットハイブリダイゼーション。
【００７６】総ての患者（Ｐ）及び対照（Ｃ）は、十分
な説明を受けた上で同意を与えてくれた。スラッシュは
この実験で失敗したＰＣＲ反応の位置を示す。
な説明を受けた上で同意を与えてくれた。スラッシュは
この実験で失敗したＰＣＲ反応の位置を示す。
【００７７】方法：１６９１Ｇ／Ａを含むゲノムフラグ
メントの増幅。Ｍｎｌ−Ｉ消化のために、配列９（ＰＲ
−６９６７；ｎｔ １５８１−１６０２（Ｒｅｆ．２
１））を５’プライマーとして使用し、且つ配列１０
（ＰＲ−９９０；イントロン１０のｎｔ１２７〜−１４
６）を３’プライマーとして使用して、２６７ｂｐフラ
グメントを増幅した。ドットブロットハイブリダイゼー
ションのために、配列１１（ＰＲ−６９６６、ｎｔ１６
２６−１６４７（Ｒｅｆ．２１））を５’プライマーと
して使用し、ＰＲ−９９０（配列１０）を３’プライマ
ーとして使用して、２２２ｂｐフラグメントを増幅し
た。条件：５４ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、
５．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．４μＭ ＥＤＴＡ、１
３．３ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８％ ＤＭＳＯ、８ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール、０．４ｍｇ／ｍｌ−１
ＢＳＡ、０．８ｍＭの各ヌクレオシドトリホスフェー
ト、４００ｎｇの各プライマー、２００〜５００ｎｇ
ＤＮＡ及び２ＵＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍ
ｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む混合物１２５
μｌを、９１℃（４０”）、５５℃（４０”）及び７１
℃（２’）のサイクルに３６回かけた。２６７ｂｐフラ
グメント（７−１０μｌ）を０．４Ｕ Ｍｎｌ Ｉ（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａ，ＵＳＡ）で
消化した。１６９１Ｇフラグメントは６７、３７及び１
６３ｂｐのフラグメントを与え、１６９１Ａフラグメン
トは６７及び２００ｂｐのフラグメントを与える。２２
２ｂｐフラグメント（約１００ｎｇ）を、１６９１Ｇを
検出するためのビオチニル化配列特異的オリゴヌクレオ
チド配列１２（ＰＲ１００６；ｎｔ １６８２−１６９
９（Ｒｅｆ．２１））、及び１６９１Ａを検出するため
の配列１３（ＰＲ１００５）とのドットブロットハイブ
リダイゼーションに使用した。手順は全く前述通りであ
る（Ｒｅｆ．４６）。ハイブリダイゼーション後、スト
リンジェンシー洗浄を、ＰＲ−１００６で５３℃、ＰＲ
−１００５で５２℃で実施した。
メントの増幅。Ｍｎｌ−Ｉ消化のために、配列９（ＰＲ
−６９６７；ｎｔ １５８１−１６０２（Ｒｅｆ．２
１））を５’プライマーとして使用し、且つ配列１０
（ＰＲ−９９０；イントロン１０のｎｔ１２７〜−１４
６）を３’プライマーとして使用して、２６７ｂｐフラ
グメントを増幅した。ドットブロットハイブリダイゼー
ションのために、配列１１（ＰＲ−６９６６、ｎｔ１６
２６−１６４７（Ｒｅｆ．２１））を５’プライマーと
して使用し、ＰＲ−９９０（配列１０）を３’プライマ
ーとして使用して、２２２ｂｐフラグメントを増幅し
た。条件：５４ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、
５．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、５．４μＭ ＥＤＴＡ、１
３．３ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、８％ ＤＭＳＯ、８ｍ
Ｍβ−メルカプトエタノール、０．４ｍｇ／ｍｌ−１
ＢＳＡ、０．８ｍＭの各ヌクレオシドトリホスフェー
ト、４００ｎｇの各プライマー、２００〜５００ｎｇ
ＤＮＡ及び２ＵＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍ
ｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む混合物１２５
μｌを、９１℃（４０”）、５５℃（４０”）及び７１
℃（２’）のサイクルに３６回かけた。２６７ｂｐフラ
グメント（７−１０μｌ）を０．４Ｕ Ｍｎｌ Ｉ（Ｂ
ｉｏｌａｂｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａ，ＵＳＡ）で
消化した。１６９１Ｇフラグメントは６７、３７及び１
６３ｂｐのフラグメントを与え、１６９１Ａフラグメン
トは６７及び２００ｂｐのフラグメントを与える。２２
２ｂｐフラグメント（約１００ｎｇ）を、１６９１Ｇを
検出するためのビオチニル化配列特異的オリゴヌクレオ
チド配列１２（ＰＲ１００６；ｎｔ １６８２−１６９
９（Ｒｅｆ．２１））、及び１６９１Ａを検出するため
の配列１３（ＰＲ１００５）とのドットブロットハイブ
リダイゼーションに使用した。手順は全く前述通りであ
る（Ｒｅｆ．４６）。ハイブリダイゼーション後、スト
リンジェンシー洗浄を、ＰＲ−１００６で５３℃、ＰＲ
−１００５で５２℃で実施した。
【００７８】実施例２ 我々は、凝固因子Ｖ（第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ）異常の突
然変異に関して異型及び同型接合の個体における静脈血
栓症発生の危険度を調べた。我々は、最初の客観的に確
認された深静脈血栓症を有する７０歳以下の４７１人の
患者、及び４７４人の健康な対照の、第Ｖ因子Ｌｅｉｄ
ｅｎ遺伝子型を決定した。我々は、血栓症患者の中に８
５の異型接合個体及び７の同型接合個体を発見し、対照
被験者の中に１４の異型接合個体を発見した。
然変異に関して異型及び同型接合の個体における静脈血
栓症発生の危険度を調べた。我々は、最初の客観的に確
認された深静脈血栓症を有する７０歳以下の４７１人の
患者、及び４７４人の健康な対照の、第Ｖ因子Ｌｅｉｄ
ｅｎ遺伝子型を決定した。我々は、血栓症患者の中に８
５の異型接合個体及び７の同型接合個体を発見し、対照
被験者の中に１４の異型接合個体を発見した。
【００７９】異型接合個体の場合は相対危険度が７倍増
加したのに対し、同型接合個体の場合は８０倍増加し
た。これらの個体は遥かに若い年齢で（３２歳対４４
歳）血栓症を経験していた。同型接合個体は主に女性で
あり、殆どが血液型Ａであった。
加したのに対し、同型接合個体の場合は８０倍増加し
た。これらの個体は遥かに若い年齢で（３２歳対４４
歳）血栓症を経験していた。同型接合個体は主に女性で
あり、殆どが血液型Ａであった。
【００８０】血栓症発生の危険は年齢と共に増加するた
め、絶対危険度差は、異型接合個体及び同型接合個体の
両方について、年齢のより高い患者で極めて顕著であ
る。同型接合個体の場合は、絶対危険度が数％／年にな
る。これは、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関して同型接合の
個体の大半が、一生のうち少なくとも一回は血栓症を経
験することを意味する。
め、絶対危険度差は、異型接合個体及び同型接合個体の
両方について、年齢のより高い患者で極めて顕著であ
る。同型接合個体の場合は、絶対危険度が数％／年にな
る。これは、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関して同型接合の
個体の大半が、一生のうち少なくとも一回は血栓症を経
験することを意味する。
【００８１】突然変異第Ｖ因子遺伝子は対立遺伝子の頻
度が高いため、同型接合キャリヤーは、別の種類の遺伝
性血栓発現傾向の場合のように極端に稀ではない。同型
接合状態が異型接合状態より大きい危険度を与えるかど
うかはこれまで知られていなかった。我々は、血栓症発
生危険度と、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関して同型接合で
ある患者の臨床的特徴とを調べた。これらは、深静脈血
栓症に関する大規模症例対照検査（ｌａｒｇｅ ｃａｓ
ｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ）で確認された（Ｔｈ
ｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔ
ｕｄｙ：ＬＥＴＳ）（ＫｏｓｔｅｒＴ．ら，Ｖｅｎｏｕ
ｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｐｏｏｒ
ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ：Ｌｅｉｄ
ｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ．Ｌａ
ｎｃｅｔ １９９３；３４２：１５０３−１５０６）。
度が高いため、同型接合キャリヤーは、別の種類の遺伝
性血栓発現傾向の場合のように極端に稀ではない。同型
接合状態が異型接合状態より大きい危険度を与えるかど
うかはこれまで知られていなかった。我々は、血栓症発
生危険度と、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関して同型接合で
ある患者の臨床的特徴とを調べた。これらは、深静脈血
栓症に関する大規模症例対照検査（ｌａｒｇｅ ｃａｓ
ｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ）で確認された（Ｔｈ
ｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔ
ｕｄｙ：ＬＥＴＳ）（ＫｏｓｔｅｒＴ．ら，Ｖｅｎｏｕ
ｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｐｏｏｒ
ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ：Ｌｅｉｄ
ｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ．Ｌａ
ｎｃｅｔ １９９３；３４２：１５０３−１５０６）。
【００８２】方法 試験計画 ＬＥＴＳの計画の詳細については以前に開示されている
（Ｔ． Ｋｏｓｔｅｒ等， “Ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｐｏｏｒ ａｎｔｉｃｏ
ａｇｕｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｒ ｔｏ ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ： Ｌｅｉｄｅｎ Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ，” Ｌａｎｃ
ｅｔ ３４２， ｐｐ．１５０３−１５０６， １９９
３）。本発明者は７０歳未満の続発患者を考慮下に置
き、既知の悪性障害の不在下に客観的に確認された最初
の深静脈血栓症のエピソード後に前記患者をライデン、
アムステルダム及びロッテルダムのＡｎｔｉｃｏａｇｕ
ｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃに、抗凝血治療の外来監視
のために委託した。患者は急性血栓症事象後少なくとも
６ヵ月（６〜１９ヵ月）診療した。適格患者の９０％が
試験への参加を希望した。４７４人の血栓症患者に加え
て、本発明者は４７４人の対照被験者も用意し、これら
の被験者は静脈性血栓塞栓症の履歴を有せず、既知の悪
性障害に罹患しておらず、性別が同じであり、かつ年齢
もほぼ同じ（±５歳）であった。
（Ｔ． Ｋｏｓｔｅｒ等， “Ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｐｏｏｒ ａｎｔｉｃｏ
ａｇｕｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｒ ｔｏ ａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ： Ｌｅｉｄｅｎ Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ，” Ｌａｎｃ
ｅｔ ３４２， ｐｐ．１５０３−１５０６， １９９
３）。本発明者は７０歳未満の続発患者を考慮下に置
き、既知の悪性障害の不在下に客観的に確認された最初
の深静脈血栓症のエピソード後に前記患者をライデン、
アムステルダム及びロッテルダムのＡｎｔｉｃｏａｇｕ
ｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃに、抗凝血治療の外来監視
のために委託した。患者は急性血栓症事象後少なくとも
６ヵ月（６〜１９ヵ月）診療した。適格患者の９０％が
試験への参加を希望した。４７４人の血栓症患者に加え
て、本発明者は４７４人の対照被験者も用意し、これら
の被験者は静脈性血栓塞栓症の履歴を有せず、既知の悪
性障害に罹患しておらず、性別が同じであり、かつ年齢
もほぼ同じ（±５歳）であった。
【００８３】データ収集及び研究室分析 全被験者に、指標日付、即ち血栓症事象の日付以前の特
定期間内に限定した過去における後天性危険状況の存在
についての質問を含む標準的な質問票に回答させた。本
発明者が“後天性危険状況”と看做したのは、いずれも
指標日付の前年に有った手術、手術を行なわない入院、
または自宅での長期不動化（２週間以上）、及び指標日
付時点での妊娠である。
定期間内に限定した過去における後天性危険状況の存在
についての質問を含む標準的な質問票に回答させた。本
発明者が“後天性危険状況”と看做したのは、いずれも
指標日付の前年に有った手術、手術を行なわない入院、
または自宅での長期不動化（２週間以上）、及び指標日
付時点での妊娠である。
【００８４】前腕前部静脈から血液を、０．１０６ｍｍ
ｏｌ／ｌのクエン酸三ナトリウムを収容したＳａｒｓｔ
ｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）管内に採取し
た。白血球から高分子ＤＮＡを単離し、４℃で貯蔵し
た。突然変異体第Ｖ因子−ライデン遺伝子（１６９１；
Ｇ→Ａトランジション）の存在を既述のように確認し
た。この方法によって本発明者は、各患者に関し、当該
患者がホモ接合性正常（ＧＧ）であるか、第Ｖ因子ライ
デン突然変異に関してヘテロ接合性（ＡＧ）であるか、
それとも前記異常のホモ接合性保有者（ＡＡ）であるか
を確定した。技術者には常に、試料の立場、即ち試料が
患者と対照被験者とのいずれに由来するかを知らせなか
った。ＤＮＡ分析用の細胞は４７１人の患者及び４７４
人の対照から入手可能であった。
ｏｌ／ｌのクエン酸三ナトリウムを収容したＳａｒｓｔ
ｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）管内に採取し
た。白血球から高分子ＤＮＡを単離し、４℃で貯蔵し
た。突然変異体第Ｖ因子−ライデン遺伝子（１６９１；
Ｇ→Ａトランジション）の存在を既述のように確認し
た。この方法によって本発明者は、各患者に関し、当該
患者がホモ接合性正常（ＧＧ）であるか、第Ｖ因子ライ
デン突然変異に関してヘテロ接合性（ＡＧ）であるか、
それとも前記異常のホモ接合性保有者（ＡＡ）であるか
を確定した。技術者には常に、試料の立場、即ち試料が
患者と対照被験者とのいずれに由来するかを知らせなか
った。ＤＮＡ分析用の細胞は４７１人の患者及び４７４
人の対照から入手可能であった。
【００８５】分析及び統計処理 患者（ｃａｓｅｓ）及び対照における第Ｖ因子ライデン
突然変異のヘテロ接合性及びホモ接合性保有者の頻度
を、単純な交叉作表によって比較した。ヘテロ接合状態
に関連する危険の分析では性別及び年齢は、常染色体遺
伝異常に肯定的に作用すると予測されないので交絡（ｃ
ｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ）変数であるとは考えられなかっ
たため、ヘテロ接合状態に関する相対的危険度の推定値
は非整合暴露オッズ比の計算によって求めた。９５％信
頼区間をＷｏｏｌｆに従って設定した（Ｂ． Ｗｏｏｌ
ｆ， “Ｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌ
ａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ
ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ａｎｎ． Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅｔ． １９， ｐｐ．２５１−２５３， １９
５５）。
突然変異のヘテロ接合性及びホモ接合性保有者の頻度
を、単純な交叉作表によって比較した。ヘテロ接合状態
に関連する危険の分析では性別及び年齢は、常染色体遺
伝異常に肯定的に作用すると予測されないので交絡（ｃ
ｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ）変数であるとは考えられなかっ
たため、ヘテロ接合状態に関する相対的危険度の推定値
は非整合暴露オッズ比の計算によって求めた。９５％信
頼区間をＷｏｏｌｆに従って設定した（Ｂ． Ｗｏｏｌ
ｆ， “Ｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌ
ａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ
ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，” Ａｎｎ． Ｈｕｍ．
Ｇｅｎｅｔ． １９， ｐｐ．２５１−２５３， １９
５５）。
【００８６】ホモ接合状態に関連する危険度は上述の標
準的な方式では推定できなかったが、これは対照中にホ
モ接合性個体が見出されなかったからである。従って、
（対照における）Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の
仮定下に対照母集団内のホモ接合性個体の予測数を計算
し、その後オッズ比を標準的な方式で推定した。ホモ接
合状態に関する（ｌｏｇ）オッズ比の分散を、Ｗｏｏｌ
ｆの方法を改良した方法によって推定した。欄の内容
ａ、ｂ、ｃ及びｄを有する２行２列の表の各欄をＰｏｉ
ｓｓｏｎ分布の実現と看做せば、ｌｏｇ（ＯＲ）の分散
は１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄとなる（Ｂ． Ｗｏ
ｏｌｆ， “Ｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｔｈｅ ｒｅ
ｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐ
ａｎｄｄｉｓｅａｓｅ，” Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇ
ｅｎｅｔ． １９， ｐｐ．２５１−２５３，１９５
５）。遺伝子型ＧＧ及びＡＡを有する個体数を患者では
計数し、対照に関してはＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
平衡から算出し、必要な二次変換を行なうと、ｌｏｇ
（ＯＲ）の分散は１／ＡＡ（患者）＋１／ＧＧ（患者）
＋４／Ａ（対照）＋４／Ａ（対照）＋４／Ｇ（対照）と
なり、その際ＡＡ及びＧＧは遺伝子型（個体）の数であ
り、Ａ及びＧは対立遺伝子の数である。
準的な方式では推定できなかったが、これは対照中にホ
モ接合性個体が見出されなかったからである。従って、
（対照における）Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の
仮定下に対照母集団内のホモ接合性個体の予測数を計算
し、その後オッズ比を標準的な方式で推定した。ホモ接
合状態に関する（ｌｏｇ）オッズ比の分散を、Ｗｏｏｌ
ｆの方法を改良した方法によって推定した。欄の内容
ａ、ｂ、ｃ及びｄを有する２行２列の表の各欄をＰｏｉ
ｓｓｏｎ分布の実現と看做せば、ｌｏｇ（ＯＲ）の分散
は１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄとなる（Ｂ． Ｗｏ
ｏｌｆ， “Ｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｔｈｅ ｒｅ
ｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄｇｒｏｕｐ
ａｎｄｄｉｓｅａｓｅ，” Ａｎｎ． Ｈｕｍ． Ｇ
ｅｎｅｔ． １９， ｐｐ．２５１−２５３，１９５
５）。遺伝子型ＧＧ及びＡＡを有する個体数を患者では
計数し、対照に関してはＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ
平衡から算出し、必要な二次変換を行なうと、ｌｏｇ
（ＯＲ）の分散は１／ＡＡ（患者）＋１／ＧＧ（患者）
＋４／Ａ（対照）＋４／Ａ（対照）＋４／Ｇ（対照）と
なり、その際ＡＡ及びＧＧは遺伝子型（個体）の数であ
り、Ａ及びＧは対立遺伝子の数である。
【００８７】様々な遺伝子型及び年齢における血栓症の
絶対的危険度を、まずＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平
衡の仮定下に（自治体当局提供の情報から得た）原母集
団の人年数を分割することによって計算した。分割した
人年によって患者を各サブグループ（遺伝子型、年齢）
に分け、それによって絶対的危険度の推定値を得た。そ
の後、これらの粗い出現率データを対数変換後に、三つ
の年齢群（０〜２９歳の２５歳群、３０〜４９歳の４０
歳群及び５０〜６９歳の６０歳群）と、各層の患者数に
関して加重したヘテロ接合状態（０，１）及びホモ接合
状態（０，１）に関する指示変数とを有する加重最小２
乗回帰モデルへとモデル化した。層特定的な出現率をま
ず推定し、その後加重最小２乗回帰によって平滑化する
［“最終平滑化”（Ｓ． Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ， “Ｍ
ｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｉｄｅ
ｎｃｅ ｆｒｏｍ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕ
ｄｉｅｓ，” Ｊ． Ｃｈｒｏｎ． Ｄｉｓ．３４，
ｐｐ．４４５−４５３， １９８１）］この方法はＧｒ
ｉｚｚｌｅ等が開示している（Ｊ． Ｅ． Ｇｒｉｚｚ
ｌｅ， Ｃ． Ｆ．Ｓｔａｒｍｅｒ及びＧ． Ｇ．Ｋｏ
ｃｈ， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｔｅｇｏｒｉ
ｃａｌ ｄａｔａ ｂｙ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ
ｓ，” Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ２５， ｐｐ．４８９
−５０４， １９６９）。Ｐｏｉｓｓｏｎ分布では患者
数の分散は患者数に等しいので、この方法はＰｏｉｓｓ
ｏｎ回帰モデルを作成するのとほとんど同じである。Ｐ
ｏｉｓｓｏｎ回帰モデルは、ホモ接合状態（及びヘテロ
接合状態）に関する出現率比が当該対数（出現率）に関
して年齢層間で一定であるという仮定の下に、特にホモ
接合状態に関してより安定な推定値をもたらす。このモ
デルは ｌｏｇ（Ｉ）＝α＋β１＊年齢＋β２＊ＡＧ（０，１）
＋β３＊ＡＡ（０，１） と表記でき、この式は後に、（係数の真数として）絶対
的危険度及び相対的危険度の推定値の計算に用い得る。
絶対的危険度を、まずＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平
衡の仮定下に（自治体当局提供の情報から得た）原母集
団の人年数を分割することによって計算した。分割した
人年によって患者を各サブグループ（遺伝子型、年齢）
に分け、それによって絶対的危険度の推定値を得た。そ
の後、これらの粗い出現率データを対数変換後に、三つ
の年齢群（０〜２９歳の２５歳群、３０〜４９歳の４０
歳群及び５０〜６９歳の６０歳群）と、各層の患者数に
関して加重したヘテロ接合状態（０，１）及びホモ接合
状態（０，１）に関する指示変数とを有する加重最小２
乗回帰モデルへとモデル化した。層特定的な出現率をま
ず推定し、その後加重最小２乗回帰によって平滑化する
［“最終平滑化”（Ｓ． Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ， “Ｍ
ｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｘｐｏｓｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｉｄｅ
ｎｃｅ ｆｒｏｍ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕ
ｄｉｅｓ，” Ｊ． Ｃｈｒｏｎ． Ｄｉｓ．３４，
ｐｐ．４４５−４５３， １９８１）］この方法はＧｒ
ｉｚｚｌｅ等が開示している（Ｊ． Ｅ． Ｇｒｉｚｚ
ｌｅ， Ｃ． Ｆ．Ｓｔａｒｍｅｒ及びＧ． Ｇ．Ｋｏ
ｃｈ， “Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｔｅｇｏｒｉ
ｃａｌ ｄａｔａ ｂｙ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌ
ｓ，” Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ２５， ｐｐ．４８９
−５０４， １９６９）。Ｐｏｉｓｓｏｎ分布では患者
数の分散は患者数に等しいので、この方法はＰｏｉｓｓ
ｏｎ回帰モデルを作成するのとほとんど同じである。Ｐ
ｏｉｓｓｏｎ回帰モデルは、ホモ接合状態（及びヘテロ
接合状態）に関する出現率比が当該対数（出現率）に関
して年齢層間で一定であるという仮定の下に、特にホモ
接合状態に関してより安定な推定値をもたらす。このモ
デルは ｌｏｇ（Ｉ）＝α＋β１＊年齢＋β２＊ＡＧ（０，１）
＋β３＊ＡＡ（０，１） と表記でき、この式は後に、（係数の真数として）絶対
的危険度及び相対的危険度の推定値の計算に用い得る。
【００８８】結果 ４７１人の患者のうち、欠陥に関してヘテロ接合性であ
ったのは８５人（１８％）、ホモ接合性であったのは７
人（１．５％）であり、その他の３７９人（８０％）は
第Ｖ因子ライデン突然変異を有しなかった。対照では４
７４人のうちの１４人（２．９％）がヘテロ接合性で、
他の４６０人は総て正常であった。対照中にホモ接合性
個体は存在しなかった。
ったのは８５人（１８％）、ホモ接合性であったのは７
人（１．５％）であり、その他の３７９人（８０％）は
第Ｖ因子ライデン突然変異を有しなかった。対照では４
７４人のうちの１４人（２．９％）がヘテロ接合性で、
他の４６０人は総て正常であった。対照中にホモ接合性
個体は存在しなかった。
【００８９】ホモ接合性個体は他の患者より甚だしく若
年で血栓症に罹患し、その血栓症罹患平均年齢はヘテロ
接合性患者の４４歳、及び突然変異を有しない患者の４
６歳に対して３２歳であった（表２）。
年で血栓症に罹患し、その血栓症罹患平均年齢はヘテロ
接合性患者の４４歳、及び突然変異を有しない患者の４
６歳に対して３２歳であった（表２）。
【００９０】ホモ接合性患者における深静脈血栓症の臨
床経過は平凡であった。全員が脚の深静脈血栓症に罹患
した。４人はヘパリン化のために短期間入院し、３人は
外来患者としてクマリン誘導体のみでの治療を受けた。
７人の患者のうちで顕性動脈疾患（心筋梗塞、卒中また
は末梢動脈疾患）の履歴を有するものは皆無であった
（表３）。
床経過は平凡であった。全員が脚の深静脈血栓症に罹患
した。４人はヘパリン化のために短期間入院し、３人は
外来患者としてクマリン誘導体のみでの治療を受けた。
７人の患者のうちで顕性動脈疾患（心筋梗塞、卒中また
は末梢動脈疾患）の履歴を有するものは皆無であった
（表３）。
【００９１】７人のホモ接合性患者のうち６人（８６
％）は女性であり、これに対してヘテロ接合性個体では
４６人（５４％）、突然変異を有しない個体では２１７
人（５７％）が女性であった。また、上記７人の患者の
うちの６人は血液型がＡ型であったが、他の４６４人の
患者のうちでＡ型は２４９人（５４％）であった。４５
歳以下である５人のホモ接合性女性患者のうち、３人は
血栓症事象の時点で経口避妊薬を用いており、このこと
はいずれにせよ現在通常の使用に類似していた。非Ｏ型
の血液型、及び経口避妊薬の使用はそれ自体が静脈血栓
症の危険因子であるので、上記の数字はこれらの危険因
子とホモ接合性第Ｖ因子ライデンとの、複合的な性質を
有する相互作用を示唆している。
％）は女性であり、これに対してヘテロ接合性個体では
４６人（５４％）、突然変異を有しない個体では２１７
人（５７％）が女性であった。また、上記７人の患者の
うちの６人は血液型がＡ型であったが、他の４６４人の
患者のうちでＡ型は２４９人（５４％）であった。４５
歳以下である５人のホモ接合性女性患者のうち、３人は
血栓症事象の時点で経口避妊薬を用いており、このこと
はいずれにせよ現在通常の使用に類似していた。非Ｏ型
の血液型、及び経口避妊薬の使用はそれ自体が静脈血栓
症の危険因子であるので、上記の数字はこれらの危険因
子とホモ接合性第Ｖ因子ライデンとの、複合的な性質を
有する相互作用を示唆している。
【００９２】７人のホモ接合性患者のうちの２人（２９
％）には、事象の前年に血栓症の素因は存在しなかった
（１人は血栓症となる４５日前に股関節部の手術を受
け、１人は血栓症事象の６０日前に出産後一晩入院し
た）。８５人のヘテロ接合性個体のうちの２５人（２９
％）の患者、及び３７９人の正常な患者のうちの１３１
人（３５％）に後天性危険因子が存在した。
％）には、事象の前年に血栓症の素因は存在しなかった
（１人は血栓症となる４５日前に股関節部の手術を受
け、１人は血栓症事象の６０日前に出産後一晩入院し
た）。８５人のヘテロ接合性個体のうちの２５人（２９
％）の患者、及び３７９人の正常な患者のうちの１３１
人（３５％）に後天性危険因子が存在した。
【００９３】過去の危険状況（手術、妊娠、入院）が血
栓症を招かなかった例は、第Ｖ因子ライデン突然変異に
関してホモ接合性である患者ではその他の患者における
ほど頻繁に生起しなかった。それでも、７人のホモ接合
性患者のうち５人は過去に、後に血栓症をもたらさない
危険状況に遭遇していた（２人が手術を受け、４人が５
人の子供を出産）。
栓症を招かなかった例は、第Ｖ因子ライデン突然変異に
関してホモ接合性である患者ではその他の患者における
ほど頻繁に生起しなかった。それでも、７人のホモ接合
性患者のうち５人は過去に、後に血栓症をもたらさない
危険状況に遭遇していた（２人が手術を受け、４人が５
人の子供を出産）。
【００９４】上記７人の患者を、最初の血栓症事象後長
期経口避妊を行なわせずに平均２年間追跡した。１人の
患者は再発性血栓症に罹患した（１回／１３．４年；
年率７．４％）。両親１４人のうちの３人が静脈血栓症
の履歴を有したが、これは予測の約５倍である。
期経口避妊を行なわせずに平均２年間追跡した。１人の
患者は再発性血栓症に罹患した（１回／１３．４年；
年率７．４％）。両親１４人のうちの３人が静脈血栓症
の履歴を有したが、これは予測の約５倍である。
【００９５】Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡下に正
常個体：ヘテロ接合性個体：ホモ接合性個体の相対的頻
度はｐ２：２ｐｇ：ｑ２となり、その際ｐは正常遺伝子
の、またｑは異常遺伝子の対立遺伝子頻度である。ｐ
２：２ｐｇが４６０／４７４：１４／４７４であったの
で、第Ｖ因子ライデンの対立遺伝子頻度（ｑ）は０．０
１５となる。ｐ＝０．９８５及びｑ＝０．０１５という
対立遺伝子頻度は、非選択個体４７４人中での４５９．
９人（ＧＧ）、１４．０人（ＡＧ）及び０．１０７人
（ＡＡ）という分布に合致する。
常個体：ヘテロ接合性個体：ホモ接合性個体の相対的頻
度はｐ２：２ｐｇ：ｑ２となり、その際ｐは正常遺伝子
の、またｑは異常遺伝子の対立遺伝子頻度である。ｐ
２：２ｐｇが４６０／４７４：１４／４７４であったの
で、第Ｖ因子ライデンの対立遺伝子頻度（ｑ）は０．０
１５となる。ｐ＝０．９８５及びｑ＝０．０１５という
対立遺伝子頻度は、非選択個体４７４人中での４５９．
９人（ＧＧ）、１４．０人（ＡＧ）及び０．１０７人
（ＡＡ）という分布に合致する。
【００９６】対照４７４人中のホモ接合性個体の予測数
（ｑ２）が０．１０７人であることから、ホモ接合性状
態に関するオッズ比は（７／３７９）／（０．１０７／
４６０）＝７９となる。即ち、ホモ接合性個体にとって
の血栓症の危険度は正常個体の約８０倍である（ＣＩ９
５： ２２〜２８９）。
（ｑ２）が０．１０７人であることから、ホモ接合性状
態に関するオッズ比は（７／３７９）／（０．１０７／
４６０）＝７９となる。即ち、ホモ接合性個体にとって
の血栓症の危険度は正常個体の約８０倍である（ＣＩ９
５： ２２〜２８９）。
【００９７】表４に三つの年齢群に関して、０．０１５
の対立遺伝子頻度を用いて各年齢群におけるホモ接合性
対照の予測数を計算した場合のオッズ比を示す。ホモ接
合性個体における高い血栓症の相対的危険度は年齢と共
に低下することが明らかである。このことは、ヘテロ接
合性個体の相対的危険度が年齢を越えて多かれ少なかれ
一定であることと対照的である。
の対立遺伝子頻度を用いて各年齢群におけるホモ接合性
対照の予測数を計算した場合のオッズ比を示す。ホモ接
合性個体における高い血栓症の相対的危険度は年齢と共
に低下することが明らかである。このことは、ヘテロ接
合性個体の相対的危険度が年齢を越えて多かれ少なかれ
一定であることと対照的である。
【００９８】続いて、異なる年齢群及び遺伝子型におけ
る絶対的危険度（出現率）を、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇ平衡の仮定下での原母集団における年齢分布に関
するデータを用いて計算した。表４に示したように、出
現率は遺伝子型ＧＧを有する最低年齢群での毎年１０，
０００人当たり僅か０．５５人という値から、より高い
年齢群のヘテロ接合性個体に関する毎年１０，０００人
当たり１６．３人という値まで上昇する。総ての年齢群
においてホモ接合性個体に関する危険度の方がヘテロ接
合性個体に関する危険度よりはるかに高いことも、表４
に示した数値から明らかである（毎年１０，０００人当
たり７８〜１７６人）。しかし、これらの出現率推定値
は三つの年齢群に分けた僅か７人の個体に基づくもので
あるので不安定であり、かつ最高年齢群では意外にも低
下している。本発明者が用いた回帰モデルはこれらの推
定値を平滑化し、なぜなら該モデルは相対的危険度が年
齢群を越えて一定であると仮定するからである。図１２
に示したように、このモデルは正常個体及びヘテロ接合
性個体には良く適合する（係数： 定数 −１０．０
６； 年齢 ０．０２９３； ＡＧ １．９６； ＡＡ
４．５２）。ホモ接合性個体に関する平滑化された出
現率推定値は今や、３０歳未満での１０，０００人年当
たり８２人から５０〜６９歳での１０，０００患者年当
たり２２７人へと上昇する（図１３）。これらの推定値
は、ほとんどのホモ接合性患者がその人生において少な
くとも一つの血栓症事象を経験することを意味する。
る絶対的危険度（出現率）を、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂ
ｅｒｇ平衡の仮定下での原母集団における年齢分布に関
するデータを用いて計算した。表４に示したように、出
現率は遺伝子型ＧＧを有する最低年齢群での毎年１０，
０００人当たり僅か０．５５人という値から、より高い
年齢群のヘテロ接合性個体に関する毎年１０，０００人
当たり１６．３人という値まで上昇する。総ての年齢群
においてホモ接合性個体に関する危険度の方がヘテロ接
合性個体に関する危険度よりはるかに高いことも、表４
に示した数値から明らかである（毎年１０，０００人当
たり７８〜１７６人）。しかし、これらの出現率推定値
は三つの年齢群に分けた僅か７人の個体に基づくもので
あるので不安定であり、かつ最高年齢群では意外にも低
下している。本発明者が用いた回帰モデルはこれらの推
定値を平滑化し、なぜなら該モデルは相対的危険度が年
齢群を越えて一定であると仮定するからである。図１２
に示したように、このモデルは正常個体及びヘテロ接合
性個体には良く適合する（係数： 定数 −１０．０
６； 年齢 ０．０２９３； ＡＧ １．９６； ＡＡ
４．５２）。ホモ接合性個体に関する平滑化された出
現率推定値は今や、３０歳未満での１０，０００人年当
たり８２人から５０〜６９歳での１０，０００患者年当
たり２２７人へと上昇する（図１３）。これらの推定値
は、ほとんどのホモ接合性患者がその人生において少な
くとも一つの血栓症事象を経験することを意味する。
【００９９】検討 抗ＡＰＣ性は、突然変異体第Ｖ因子遺伝子に関する対立
遺伝子頻度が約１．５％である一般的な異常である。こ
のことは、母集団の３％がヘテロ接合性であり、ホモ接
合性個体は出生１０，０００人当たり約２人と予測可能
であることを意味する。
遺伝子頻度が約１．５％である一般的な異常である。こ
のことは、母集団の３％がヘテロ接合性であり、ホモ接
合性個体は出生１０，０００人当たり約２人と予測可能
であることを意味する。
【０１００】この試験において本発明者は、ホモ接合性
個体の血栓症の危険度が高く、しかもヘテロ接合性個体
の危険度を甚だしく上回ることを示す。この結論は、ホ
モ接合性個体がその最初の血栓症事象を若年時に経験し
ていることによって支持される。
個体の血栓症の危険度が高く、しかもヘテロ接合性個体
の危険度を甚だしく上回ることを示す。この結論は、ホ
モ接合性個体がその最初の血栓症事象を若年時に経験し
ていることによって支持される。
【０１０１】ホモ接合性第Ｖ因子ライデンがもたらす血
栓症の危険度がホモ接合性タンパク質Ｃまたはタンパク
質Ｓ欠乏がもたらす血栓症の危険度に全く近似しないこ
とは明らかであり、これらの異常は新生児電撃性紫斑病
を誘発する（Ｈ． Ｅ．Ｂｒａｎｓｏｎ等， “Ｉｎｈ
ｅｒｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ ａｎｄ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖ
ｅ ｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｐｕｒｐｕｒ
ａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ ｉｎａ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉ
ｎｆａｎｔ，” Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ， ｐ．１１６
５， １９８３； Ｃ． Ｍａｈａｓａｄａｎａ等，
“Ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｕｒｐｕｒａｆｕｌｍｉｎａｎ
ｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｚｙｇ
ｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，”
Ｌａｎｃｅｔ ３３５，ｐｐ．６１−６２， １９９
０）。ホモ接合性第Ｖ因子ライデンを有する個体は全員
最初の血栓症事象前に成人に達しており、１人は中年後
期にすら達していた。ほとんどのホモ接合性個体は過去
に、血栓症をもたらさない危険状況を経験しており、そ
のような危険状況（妊娠、産褥）のほとんどに関して抗
凝血性予防法は示されていない。このことは、抗ＡＰＣ
性をホモ接合性タンパク質Ｃ欠乏におけるような定性的
欠陥（タンパク質Ｃ活性の不在）ではなく、定量的欠陥
（第Ｖａ因子の不活性化速度の低下）と看做すべきであ
ることを示している。
栓症の危険度がホモ接合性タンパク質Ｃまたはタンパク
質Ｓ欠乏がもたらす血栓症の危険度に全く近似しないこ
とは明らかであり、これらの異常は新生児電撃性紫斑病
を誘発する（Ｈ． Ｅ．Ｂｒａｎｓｏｎ等， “Ｉｎｈ
ｅｒｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎ
ｃｙ ａｎｄ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖ
ｅ ｃｈｒｏｎｉｃｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｐｕｒｐｕｒ
ａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ ｉｎａ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉ
ｎｆａｎｔ，” Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ， ｐ．１１６
５， １９８３； Ｃ． Ｍａｈａｓａｄａｎａ等，
“Ｎｅｏｎａｔａｌ ｐｕｒｐｕｒａｆｕｌｍｉｎａｎ
ｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｚｙｇ
ｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，”
Ｌａｎｃｅｔ ３３５，ｐｐ．６１−６２， １９９
０）。ホモ接合性第Ｖ因子ライデンを有する個体は全員
最初の血栓症事象前に成人に達しており、１人は中年後
期にすら達していた。ほとんどのホモ接合性個体は過去
に、血栓症をもたらさない危険状況を経験しており、そ
のような危険状況（妊娠、産褥）のほとんどに関して抗
凝血性予防法は示されていない。このことは、抗ＡＰＣ
性をホモ接合性タンパク質Ｃ欠乏におけるような定性的
欠陥（タンパク質Ｃ活性の不在）ではなく、定量的欠陥
（第Ｖａ因子の不活性化速度の低下）と看做すべきであ
ることを示している。
【０１０２】この試験で目立った発見は、ホモ接合性患
者において女性が優勢であることであった。それらの女
性の間では経口避妊薬が他の患者間でと同様に頻繁に用
いられていたので、経口避妊薬の使用が抗ＡＰＣ性との
相乗作用によって一定の役割を果たしたと考えられる。
ピルの使用及び抗ＡＰＣ性はいずれも一般的であるの
で、特にヘテロ接合性保有者（全女性の３％）に関して
は上記の関連性を更に別の試験によって調べるべきであ
る。
者において女性が優勢であることであった。それらの女
性の間では経口避妊薬が他の患者間でと同様に頻繁に用
いられていたので、経口避妊薬の使用が抗ＡＰＣ性との
相乗作用によって一定の役割を果たしたと考えられる。
ピルの使用及び抗ＡＰＣ性はいずれも一般的であるの
で、特にヘテロ接合性保有者（全女性の３％）に関して
は上記の関連性を更に別の試験によって調べるべきであ
る。
【０１０３】ヘテロ接合性個体に関する相対的危険度
は、異なる年齢群同士の間で一定であると考えられる。
このような観察は、年齢と共に上昇する背景出現率に照
らして理解しければならない。上記の事態は、図１２及
び図１３に示したように、血栓症の絶対的危険度、また
は抗ＡＰＣ性によって助長される絶対的危険度がより高
齢のヘテロ接合性個体にとってより重大となることを意
味する。
は、異なる年齢群同士の間で一定であると考えられる。
このような観察は、年齢と共に上昇する背景出現率に照
らして理解しければならない。上記の事態は、図１２及
び図１３に示したように、血栓症の絶対的危険度、また
は抗ＡＰＣ性によって助長される絶対的危険度がより高
齢のヘテロ接合性個体にとってより重大となることを意
味する。
【０１０４】毎年１０，０００人当たり約２人という、
本発明者の得た総合的な出現率推定値は、１，０００人
年当たり約０．５〜１人の通常の推定値より小さいとい
うことが留意され得る（Ｈ． Ｅ． Ｂｒａｎｓｏｎ
等， “Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｒｅｓ
ｐｏｎｓｉｖｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ
ｐｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ ｉｎ ａ ｎ
ｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔ，” Ｌａｎｃｅｔ ｉ
ｉ， ｐ．１１６５， １９８３；Ｔ． Ｋｏｓｔｅ
ｒ， “Ｍｏｒｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｄｉａｇｎｏｓｅ
ｓ ｏｆ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉ
ｓｍ，” Ｎｅｔｈ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３８， ｐ
ｐ．２４６−２４８， １９９１）。このことは、本発
明者の試験での年齢制限（７０歳未満）、確認済みの血
栓症への限定、悪性障害に罹患した患者の除外、及び最
初の血栓症事象への限定によりきわめて容易に説明され
る。
本発明者の得た総合的な出現率推定値は、１，０００人
年当たり約０．５〜１人の通常の推定値より小さいとい
うことが留意され得る（Ｈ． Ｅ． Ｂｒａｎｓｏｎ
等， “Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ ｄｅ
ｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｒｅｓ
ｐｏｎｓｉｖｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ
ｐｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ ｉｎ ａ ｎ
ｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔ，” Ｌａｎｃｅｔ ｉ
ｉ， ｐ．１１６５， １９８３；Ｔ． Ｋｏｓｔｅ
ｒ， “Ｍｏｒｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｄｉａｇｎｏｓｅ
ｓ ｏｆ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉ
ｓｍ，” Ｎｅｔｈ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３８， ｐ
ｐ．２４６−２４８， １９９１）。このことは、本発
明者の試験での年齢制限（７０歳未満）、確認済みの血
栓症への限定、悪性障害に罹患した患者の除外、及び最
初の血栓症事象への限定によりきわめて容易に説明され
る。
【０１０５】ホモ接合性患者は８０倍大きい血栓症の危
険度を有し、その結果総合的な出現率は毎年約１％とな
る。より高い年齢群において観察された出現率低下は、
最初の血栓症事象を未だ経験していない当該年代の個体
が母集団内にほとんど存在しないことによって説明でき
る。この出現率低下はまた、ホモ接合性患者が少数（即
ち、最高年齢群には１人のみ）であることの結果でもあ
った。いずれの場合も、加重回帰モデルから再算出した
出現率値が最良の危険度推定値であると考えられ、この
値は５０歳以上の患者では毎年２％より高くなる。
険度を有し、その結果総合的な出現率は毎年約１％とな
る。より高い年齢群において観察された出現率低下は、
最初の血栓症事象を未だ経験していない当該年代の個体
が母集団内にほとんど存在しないことによって説明でき
る。この出現率低下はまた、ホモ接合性患者が少数（即
ち、最高年齢群には１人のみ）であることの結果でもあ
った。いずれの場合も、加重回帰モデルから再算出した
出現率値が最良の危険度推定値であると考えられ、この
値は５０歳以上の患者では毎年２％より高くなる。
【０１０６】本発明者は、ホモ接合性第Ｖ因子ライデン
によって惹起される抗ＡＰＣ性が深静脈血栓症の危険度
を高めると結論付ける。深静脈血栓症は成人期前には出
現しないと考えられ、更には妊娠及び産褥などの危険状
況において必ず出現するともかぎらない。とはいえ本発
明者は、ホモ接合性患者は危険状況下では、抗凝血剤を
用いる短期予防を受けるべきであると確信する。しか
し、第Ｖ因子ライデン突然変異に関してホモ接合性であ
る個体において持続的な予防を行なうことはかならずし
も必要でない。
によって惹起される抗ＡＰＣ性が深静脈血栓症の危険度
を高めると結論付ける。深静脈血栓症は成人期前には出
現しないと考えられ、更には妊娠及び産褥などの危険状
況において必ず出現するともかぎらない。とはいえ本発
明者は、ホモ接合性患者は危険状況下では、抗凝血剤を
用いる短期予防を受けるべきであると確信する。しか
し、第Ｖ因子ライデン突然変異に関してホモ接合性であ
る個体において持続的な予防を行なうことはかならずし
も必要でない。
【０１０７】
【表２】
【０１０８】
【表３】
【０１０９】
【表４】
【０１１０】図１２及び図１３ 年齢に基づき求めた、第Ｖ因子ライデン遺伝子型に関す
る粗な（図１２）、及び平滑化した（図１３）出現率推
定値。
る粗な（図１２）、及び平滑化した（図１３）出現率推
定値。
【０１１１】（図中）最下方の線は遺伝子型ＧＧに関す
る推定値を示し、上方の線は遺伝子型ＡＧに関する推定
値を示す。図１３には遺伝子型ＡＡ（ホモ接合性の第Ｖ
因子ライデン）に関する推定値も示す。粗な出現率は記
号＋で示し、平滑化した出現率は記号□で示す。１０，
０００人年当たりの平滑化した出現率は、ＧＧに関して
は０．９（０〜２０歳）、１．４（３０〜４９歳）及び
２．５（５０〜６９歳）； ＡＧに関しては６．３（０
〜２９歳）、９．８（３０〜４９歳）及び１７．６（５
０〜６９歳）； ＡＡに関しては８１．５（０〜２９
歳）、１２６．５（３０〜４９歳）及び２２７．３（５
０〜６９歳）であった。
る推定値を示し、上方の線は遺伝子型ＡＧに関する推定
値を示す。図１３には遺伝子型ＡＡ（ホモ接合性の第Ｖ
因子ライデン）に関する推定値も示す。粗な出現率は記
号＋で示し、平滑化した出現率は記号□で示す。１０，
０００人年当たりの平滑化した出現率は、ＧＧに関して
は０．９（０〜２０歳）、１．４（３０〜４９歳）及び
２．５（５０〜６９歳）； ＡＧに関しては６．３（０
〜２９歳）、９．８（３０〜４９歳）及び１７．６（５
０〜６９歳）； ＡＡに関しては８１．５（０〜２９
歳）、１２６．５（３０〜４９歳）及び２２７．３（５
０〜６９歳）であった。
【０１１２】実施例３ プラスミド及びｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ １人の健康なヒト（ホモ接合性野生型）並びに２人の患
者ＩＤ９０及びＩＤ１３７（いずれもホモ接合性突然変
異体）のＰＢＭＣから単離したＲＮＡを、オランダ国ラ
イデンの鬱血及び血栓症研究センター（Ｈｅｍｏｓｔａ
ｔｉｓａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｒｅ）から入手した。５０６位のアミノ酸に
存在する突然変異を包含する２９７ｎｔの断片を、制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｓｐ４５１を用いてベクターｐＧ
３０中でクローニングした。得られたプラスミドを、野
生型クローンはｐＧ３０／ＦＶｗｔ、突然変異体クロー
ンはｐＧ３０／ＦＶｍｕｔとそれぞれ名付けた。
者ＩＤ９０及びＩＤ１３７（いずれもホモ接合性突然変
異体）のＰＢＭＣから単離したＲＮＡを、オランダ国ラ
イデンの鬱血及び血栓症研究センター（Ｈｅｍｏｓｔａ
ｔｉｓａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｃｅｎｔｒｅ）から入手した。５０６位のアミノ酸に
存在する突然変異を包含する２９７ｎｔの断片を、制限
酵素ＥｃｏＲＩ及びＣｓｐ４５１を用いてベクターｐＧ
３０中でクローニングした。得られたプラスミドを、野
生型クローンはｐＧ３０／ＦＶｗｔ、突然変異体クロー
ンはｐＧ３０／ＦＶｍｕｔとそれぞれ名付けた。
【０１１３】適正配列のクローニングを配列分析によっ
て確認し、その後プラスミドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒ
ＮＡ合成のためにＣｓＣｌ濃度勾配によって精製した。
ソースとしてプラスミドｐＧ３０／ＦＶｗｔを用いて系
制御プラスミド（ｐＧ３０／ＦＶ Ｅ２）を、プローブ
配列（２１ｎｔ）の欠失及びＥ２配列（１４４ｎｔ）の
挿入によって構築した。上記３種のプラスミドを、標準
的なプロトコルにおいてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用
いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写に用いた。プラスミ
ドをＢａｍＨ１で直線状とし、Ｔ７ ＲＮＡＰでの転写
後にこれらのプラスミドから、２９７ｎｔのｗｔ及びｍ
ｕｔクローン並びに４２０ｎｔの系制御クローンとそれ
ぞれに続く７００ｎｔのベクター配列とから成るＲＮＡ
が得られ、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡの全長は約
１ｋｂであった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後、ＲＮＡをＤ
ＮアーゼＩで処理し、Ｔｉｐ １００カラム（Ｑｉａｇ
ｅｎ）プロトコルを用いて精製し、分光光度計で定量し
た。適当な連続稀釈を水で行ない、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＲＮＡを−７０℃で貯蔵した。
て確認し、その後プラスミドを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｒ
ＮＡ合成のためにＣｓＣｌ濃度勾配によって精製した。
ソースとしてプラスミドｐＧ３０／ＦＶｗｔを用いて系
制御プラスミド（ｐＧ３０／ＦＶ Ｅ２）を、プローブ
配列（２１ｎｔ）の欠失及びＥ２配列（１４４ｎｔ）の
挿入によって構築した。上記３種のプラスミドを、標準
的なプロトコルにおいてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用
いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写に用いた。プラスミ
ドをＢａｍＨ１で直線状とし、Ｔ７ ＲＮＡＰでの転写
後にこれらのプラスミドから、２９７ｎｔのｗｔ及びｍ
ｕｔクローン並びに４２０ｎｔの系制御クローンとそれ
ぞれに続く７００ｎｔのベクター配列とから成るＲＮＡ
が得られ、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡの全長は約
１ｋｂであった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後、ＲＮＡをＤ
ＮアーゼＩで処理し、Ｔｉｐ １００カラム（Ｑｉａｇ
ｅｎ）プロトコルを用いて精製し、分光光度計で定量し
た。適当な連続稀釈を水で行ない、ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ＲＮＡを−７０℃で貯蔵した。
【０１１４】プライマー及びプローブ ＮＡＳＢＡ増幅プライマー、及びＥＬＧＡ及びＥＣＬ検
出用の検出プローブの配列を表５に示す。
出用の検出プローブの配列を表５に示す。
【０１１５】
【表５】
【０１１６】Ｐ１は第Ｖ因子コーディング配列のエキソ
ン１０に位置し、Ｐ２配列はエキソン１１に位置する。
その結果、このプライマーセットは、スプライシングに
よりイントロン１０配列が取り出されるｍＲＮＡ配列し
か増幅し得ない。ＥＬＧＡまたはＥＣＬにおいてより良
く機能することから、２種の一般的（ｇｅｎｅｒｉｃ）
プローブが用いられる。しかし、ＥＬＧＡとＥＣＬとの
両方のために一方の一般的プローブを選択することが可
能であるべきである。増幅プライマーは２０％アクリル
アミド、７Ｍ尿素スラブゲル上で精製した。溶離及びＥ
ｔＯＨからの析出後、プライマーを５００μｌのＨ２Ｏ
に溶解させ、濃度を分光光度計（ＯＤ２６０）によって
測定した。
ン１０に位置し、Ｐ２配列はエキソン１１に位置する。
その結果、このプライマーセットは、スプライシングに
よりイントロン１０配列が取り出されるｍＲＮＡ配列し
か増幅し得ない。ＥＬＧＡまたはＥＣＬにおいてより良
く機能することから、２種の一般的（ｇｅｎｅｒｉｃ）
プローブが用いられる。しかし、ＥＬＧＡとＥＣＬとの
両方のために一方の一般的プローブを選択することが可
能であるべきである。増幅プライマーは２０％アクリル
アミド、７Ｍ尿素スラブゲル上で精製した。溶離及びＥ
ｔＯＨからの析出後、プライマーを５００μｌのＨ２Ｏ
に溶解させ、濃度を分光光度計（ＯＤ２６０）によって
測定した。
【０１１７】ビオチンオリゴを合成機で製造し、これを
ＥｔＯＨから析出させ、かつＨ２Ｏに溶解させて用い
た。ＮＨ２−オリゴへのＨＲＰラベルの結合を標準的な
プロトコルに従って実現し、プローブは更に精製するこ
となく用い（一般的ＥＬＧＡプローブ）、またはスラブ
ゲル上で精製した（野生型及び突然変異体特異的ＥＬＧ
Ａプローブ）。ＥＣＬオリゴを合成し、更に精製するこ
となく用いた。
ＥｔＯＨから析出させ、かつＨ２Ｏに溶解させて用い
た。ＮＨ２−オリゴへのＨＲＰラベルの結合を標準的な
プロトコルに従って実現し、プローブは更に精製するこ
となく用い（一般的ＥＬＧＡプローブ）、またはスラブ
ゲル上で精製した（野生型及び突然変異体特異的ＥＬＧ
Ａプローブ）。ＥＣＬオリゴを合成し、更に精製するこ
となく用いた。
【０１１８】核酸の単離 核酸の単離は総て、Ｂｏｏｍ等が述べている方法（Ｊ．
Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８， ｐｐ．
４９５−５０３， １９９０）を用いて行なった。１０
０μｌの全血から核酸を抽出し（臨床試料参照）、溶離
を１００μｌのＨ２Ｏで行ない、典型的には５μｌの溶
出液をＮＡＳＢＡ増幅のためのインプットとして用い
た。残りの溶出液は−７０℃で貯蔵した。
Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８， ｐｐ．
４９５−５０３， １９９０）を用いて行なった。１０
０μｌの全血から核酸を抽出し（臨床試料参照）、溶離
を１００μｌのＨ２Ｏで行ない、典型的には５μｌの溶
出液をＮＡＳＢＡ増幅のためのインプットとして用い
た。残りの溶出液は−７０℃で貯蔵した。
【０１１９】ＮＡＳＢＡ増幅 ＮＡＳＢＡ増幅を次のように行なった。５μｌのＲＮＡ
に、１０μｌの２．５倍ＮＲＧ緩衝液（１倍緩衝液中で
の最終濃度： ｐＨ８．５のトリス ４０ｍＭ； ＫＣ
ｌ ７０ｍＭ； 各ｄＮＴＰ １ｍＭ； ＡＴＰ／ＣＴ
Ｐ／ＵＴＰ ２ｍＭ； ＧＴＰ １．５ｍＭ； ＩＴＰ
０．５ｍＭ； ＭｇＣｌ２ １２ｍＭ）と、６．２５
μｌの４倍プライマー混合物（１倍緩衝液中での最終濃
度： ＤＭＳＯ １５％ ｖ／ｖ； Ｐ１ ０．２μ
Ｍ； Ｐ２ ０．２μＭ）と、１．７５μｌのＨ２Ｏと
から成る１８μｌのプレミックス溶液を添加した。試料
を６５℃で５分間インキュベートし、続いて４１℃で５
分間インキュベートした。４１℃において可能なかぎり
多くを管から取り出し、２μｌの酵素混合物（８単位の
ＡＭＶ−ＲＴ、４０単位のＴ７ＲＮＡＰ、０．１単位の
大腸菌ＲＮアーゼＨ、２．６μｇのＢＳＡ、１．５Ｍの
ソルビトール）を添加し、その後穏やかに混合し（即ち
タッピングし）、４１℃で９０分間インキュベートし
た。
に、１０μｌの２．５倍ＮＲＧ緩衝液（１倍緩衝液中で
の最終濃度： ｐＨ８．５のトリス ４０ｍＭ； ＫＣ
ｌ ７０ｍＭ； 各ｄＮＴＰ １ｍＭ； ＡＴＰ／ＣＴ
Ｐ／ＵＴＰ ２ｍＭ； ＧＴＰ １．５ｍＭ； ＩＴＰ
０．５ｍＭ； ＭｇＣｌ２ １２ｍＭ）と、６．２５
μｌの４倍プライマー混合物（１倍緩衝液中での最終濃
度： ＤＭＳＯ １５％ ｖ／ｖ； Ｐ１ ０．２μ
Ｍ； Ｐ２ ０．２μＭ）と、１．７５μｌのＨ２Ｏと
から成る１８μｌのプレミックス溶液を添加した。試料
を６５℃で５分間インキュベートし、続いて４１℃で５
分間インキュベートした。４１℃において可能なかぎり
多くを管から取り出し、２μｌの酵素混合物（８単位の
ＡＭＶ−ＲＴ、４０単位のＴ７ＲＮＡＰ、０．１単位の
大腸菌ＲＮアーゼＨ、２．６μｇのＢＳＡ、１．５Ｍの
ソルビトール）を添加し、その後穏やかに混合し（即ち
タッピングし）、４１℃で９０分間インキュベートし
た。
【０１２０】ＥＬＧＡ検出 ＥＬＧＡ検出のために、一般的プローブ、野生型プロー
ブ及び突然変異体プローブをそれぞれ含有する３種のプ
ローブ溶液を用いた。野生型及び突然変異体ＨＲＰ標識
プローブの特異性を高めるべく、これらの標識プローブ
を該プローブと対を成す非標識プローブと混合した（表
６参照）。
ブ及び突然変異体プローブをそれぞれ含有する３種のプ
ローブ溶液を用いた。野生型及び突然変異体ＨＲＰ標識
プローブの特異性を高めるべく、これらの標識プローブ
を該プローブと対を成す非標識プローブと混合した（表
６参照）。
【０１２１】
【表６】
【０１２２】増幅後、１μｌの増幅物を４μｌの適当な
プローブ混合物［５μｌ中の最終濃度： ＳＳＣ、ＢＦ
Ｂ、ＸＣＦＦ １倍； グリセロール及び適当なプロー
ブ（表５参照） ５％ ｖ／ｖ］に添加し、混合し、４
５℃で１５分間インキュベートした。その後、アクリル
アミドゲル（５％アクリル／ビスアクリル、０．０４％
デキストラン硫酸、ＮＡＳＢＡ ｅｌｆｏ緩衝液＝２５
ｍＭトリス、２５ｍＭホウ酸、５００μＭ ＥＤＴＡ；
ｐＨ８．３）上で２．５μｌの試料を、０．５倍ＮＡ
ＳＢＡ ｅｌｆｏ緩衝液に加え１５０Ｖで泳動させて分
析した。電気泳動後、標準的なＴＭＢ／ＵＰ基質溶液
（比１：１で混合）を用いてゲルを約６分間染色した。
普通、ゲルを５０％メタノール（Ｏ／Ｎ）中で固定し、
２枚の透明な箔の間で空気乾燥させた。
プローブ混合物［５μｌ中の最終濃度： ＳＳＣ、ＢＦ
Ｂ、ＸＣＦＦ １倍； グリセロール及び適当なプロー
ブ（表５参照） ５％ ｖ／ｖ］に添加し、混合し、４
５℃で１５分間インキュベートした。その後、アクリル
アミドゲル（５％アクリル／ビスアクリル、０．０４％
デキストラン硫酸、ＮＡＳＢＡ ｅｌｆｏ緩衝液＝２５
ｍＭトリス、２５ｍＭホウ酸、５００μＭ ＥＤＴＡ；
ｐＨ８．３）上で２．５μｌの試料を、０．５倍ＮＡ
ＳＢＡ ｅｌｆｏ緩衝液に加え１５０Ｖで泳動させて分
析した。電気泳動後、標準的なＴＭＢ／ＵＰ基質溶液
（比１：１で混合）を用いてゲルを約６分間染色した。
普通、ゲルを５０％メタノール（Ｏ／Ｎ）中で固定し、
２枚の透明な箔の間で空気乾燥させた。
【０１２３】ＥＣＬ検出 ＥＣＬでも３種のプローブ溶液を用いて増幅物を検出し
た（表７参照）。
た（表７参照）。
【０１２４】
【表７】 ハイブリダイゼーション反応開始のため、１０μｌのＥ
ＣＬ混合物（０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、１２．５倍ＳＳ
Ｃ、２×１０１２分子のＥＣＬ一般的プローブ）と、１
０μｌのビーズ混合物（０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、１
倍ＰＢＳ、２μｌの適当なビーズ溶液及び適当な非標識
プローブ）と、５μｌの（水での）２１倍稀釈増幅物と
を混合し、ストーブにおいて常に振盪しつつ４５℃で３
０分間インキュベートした。その後、３００μｌのＥＣ
Ｌアッセイ緩衝液を添加し、管をＥＣＬシグナル読み取
りのためＥＣＬ装置に設置した。
ＣＬ混合物（０．１％ｗ／ｖ ＢＳＡ、１２．５倍ＳＳ
Ｃ、２×１０１２分子のＥＣＬ一般的プローブ）と、１
０μｌのビーズ混合物（０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、１
倍ＰＢＳ、２μｌの適当なビーズ溶液及び適当な非標識
プローブ）と、５μｌの（水での）２１倍稀釈増幅物と
を混合し、ストーブにおいて常に振盪しつつ４５℃で３
０分間インキュベートした。その後、３００μｌのＥＣ
Ｌアッセイ緩衝液を添加し、管をＥＣＬシグナル読み取
りのためＥＣＬ装置に設置した。
【０１２５】結果 感度 第Ｖ因子ｍＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅に用いたプライマー
は、野生型及び突然変異体配列に関して長さ１８２ｎｔ
の増幅物をもたらした。プライマーを系制御（ＳＣ）ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡの増幅に用いると、長さ３０５
ｎｔの増幅物が得られる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じた野
生型、突然変異体及びＳＣ ＲＮＡの連続稀釈物を用い
て、増幅の感度を調べた（表８）。
は、野生型及び突然変異体配列に関して長さ１８２ｎｔ
の増幅物をもたらした。プライマーを系制御（ＳＣ）ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡの増幅に用いると、長さ３０５
ｎｔの増幅物が得られる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じた野
生型、突然変異体及びＳＣ ＲＮＡの連続稀釈物を用い
て、増幅の感度を調べた（表８）。
【０１２６】
【表８】 ３種のインプットＲＮＡのいずれにおいても、分析感度
は１００分子以上である。１０分子のインプットとの反
応が陽性である場合も有り、このことは感度が実際は１
０分子と１００分子との間であることを示している。
は１００分子以上である。１０分子のインプットとの反
応が陽性である場合も有り、このことは感度が実際は１
０分子と１００分子との間であることを示している。
【０１２７】実施例４ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。核酸
の単離において野生型または突然変異体ＲＮＡが存在す
る場合に当該ＲＮＡと競合しないように添加するべきＳ
Ｃ ＲＮＡの量を決定するべく、幾つかのＳＣ ＲＮＡ
量を分析した。前記量のＳＣ ＲＮＡを、試料を加えず
に、また１００μｌの全血を加えて単離し、かつ対照と
してＳＣ ＲＮＡの連続稀釈物を直接増幅した。増幅後
のＥＬＧＡ分析の結果を表９に示す。明らかに、核酸を
単離する間に何等かの核酸損失が生じる（Ａシリーズの
インプット３の行とＣシリーズのインプット３の行とを
比較されたい）。
の単離において野生型または突然変異体ＲＮＡが存在す
る場合に当該ＲＮＡと競合しないように添加するべきＳ
Ｃ ＲＮＡの量を決定するべく、幾つかのＳＣ ＲＮＡ
量を分析した。前記量のＳＣ ＲＮＡを、試料を加えず
に、また１００μｌの全血を加えて単離し、かつ対照と
してＳＣ ＲＮＡの連続稀釈物を直接増幅した。増幅後
のＥＬＧＡ分析の結果を表９に示す。明らかに、核酸を
単離する間に何等かの核酸損失が生じる（Ａシリーズの
インプット３の行とＣシリーズのインプット３の行とを
比較されたい）。
【０１２８】Ａシリーズ（表９）から、溶解緩衝液に加
えるべきＳＣＲＮＡの最少量は１×１０５分子であると
いう結論を得ることができる。この量のＳＣ ＲＮＡ
は、１００μｌの全血から単離した野生型または突然変
異体ＲＮＡの増幅を抑制しない。実際のところ、ＳＣ
ＲＮＡは上記の１０倍量で用いても、１００μｌの全血
から単離した野生型または突然変異体ＲＮＡに対して抑
制性でない（表９のＢシリーズ）。更に行なった実験で
は、適当であれば常に、核酸単離前に１０５分子のＳＣ
ＲＮＡを溶解緩衝液に添加した。
えるべきＳＣＲＮＡの最少量は１×１０５分子であると
いう結論を得ることができる。この量のＳＣ ＲＮＡ
は、１００μｌの全血から単離した野生型または突然変
異体ＲＮＡの増幅を抑制しない。実際のところ、ＳＣ
ＲＮＡは上記の１０倍量で用いても、１００μｌの全血
から単離した野生型または突然変異体ＲＮＡに対して抑
制性でない（表９のＢシリーズ）。更に行なった実験で
は、適当であれば常に、核酸単離前に１０５分子のＳＣ
ＲＮＡを溶解緩衝液に添加した。
【０１２９】
【表９】
【０１３０】実施例５ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。Ｇか
らＡへの単一塩基突然変異という、第Ｖ因子ｍＲＮＡの
突然変異の性格に起因して、野生型プローブは突然変異
体増幅物に関して甚だしいバックグラウンドシグナルを
発生し、かつこの逆も成り立つということが予測され
る。このことはＥＬＧＡ検出とＥＣＬ検出との両方に該
当する。複雑なハイブリダイゼーションプロトコルを回
避するためには、標識したプローブを該プローブと対を
成す非標識プローブと混合して、非相同増幅物に関する
バックグラウンドハイブリダイゼーションを抑制する。
表１０に、ＥＬＧＡ検出によって調べた、プローブ混合
物での野生型及び突然変異体増幅物の特異的検出の結果
を示す。
らＡへの単一塩基突然変異という、第Ｖ因子ｍＲＮＡの
突然変異の性格に起因して、野生型プローブは突然変異
体増幅物に関して甚だしいバックグラウンドシグナルを
発生し、かつこの逆も成り立つということが予測され
る。このことはＥＬＧＡ検出とＥＣＬ検出との両方に該
当する。複雑なハイブリダイゼーションプロトコルを回
避するためには、標識したプローブを該プローブと対を
成す非標識プローブと混合して、非相同増幅物に関する
バックグラウンドハイブリダイゼーションを抑制する。
表１０に、ＥＬＧＡ検出によって調べた、プローブ混合
物での野生型及び突然変異体増幅物の特異的検出の結果
を示す。
【０１３１】
【表１０】
【０１３２】ＨＲＰ標識野生型プローブの場合、バック
グラウンドを十分低下させるには２５０倍過剰な非標識
突然変異体プローブを添加するべきであることは明らか
である。ＨＲＰ標識突然変異体プローブを用いる場合は
１００倍過剰な非標識野生型プローブを添加すれば、バ
ックグラウンドを許容可能なレベルまで低下させるのに
十分である。ＥＣＬ検出を用いて、多かれ少なかれ同様
の実験を行なった。ＥＣＬ法では非標識プローブは、磁
性ビーズ上の特異的ビオチニル化捕捉プローブと競合す
るはずである。異なる過剰倍率の非標識プローブ比率を
用いて行なったＥＣＬ検出の結果を表１１に示す。
グラウンドを十分低下させるには２５０倍過剰な非標識
突然変異体プローブを添加するべきであることは明らか
である。ＨＲＰ標識突然変異体プローブを用いる場合は
１００倍過剰な非標識野生型プローブを添加すれば、バ
ックグラウンドを許容可能なレベルまで低下させるのに
十分である。ＥＣＬ検出を用いて、多かれ少なかれ同様
の実験を行なった。ＥＣＬ法では非標識プローブは、磁
性ビーズ上の特異的ビオチニル化捕捉プローブと競合す
るはずである。異なる過剰倍率の非標識プローブ比率を
用いて行なったＥＣＬ検出の結果を表１１に示す。
【０１３３】
【表１１】
【０１３４】後でＥＣＬ検出を行なうためには、ビーズ
上のビオチニル化プローブが野生型プローブである場合
は１０倍過剰な非標識突然変異体プローブを、またビー
ズ上のビオチニル化プローブが突然変異体プローブであ
る場合は４倍過剰な非標識野生型プローブを共に用いる
べきであることが判明した。ＥＬＧＡ及びＥＣＬ検出を
行なう場合に添加しなければならない非標識プローブ量
同士の相違はハイブリダイゼーション方式に関連するに
違いない。ＥＣＬ方式では特異的プローブを磁性ビーズ
に結合させ、従って該プローブのハイブリダイゼーショ
ン反応は液中プローブに比べて遅い。その結果、標識し
ない液中プローブは比較的僅かに過剰な量で添加しなけ
ればならない。ＥＬＧＡでは２種の液中プローブ間で競
合が起こり、それによって比較的多量の非標識プローブ
を添加しなければならなくなる。
上のビオチニル化プローブが野生型プローブである場合
は１０倍過剰な非標識突然変異体プローブを、またビー
ズ上のビオチニル化プローブが突然変異体プローブであ
る場合は４倍過剰な非標識野生型プローブを共に用いる
べきであることが判明した。ＥＬＧＡ及びＥＣＬ検出を
行なう場合に添加しなければならない非標識プローブ量
同士の相違はハイブリダイゼーション方式に関連するに
違いない。ＥＣＬ方式では特異的プローブを磁性ビーズ
に結合させ、従って該プローブのハイブリダイゼーショ
ン反応は液中プローブに比べて遅い。その結果、標識し
ない液中プローブは比較的僅かに過剰な量で添加しなけ
ればならない。ＥＬＧＡでは２種の液中プローブ間で競
合が起こり、それによって比較的多量の非標識プローブ
を添加しなければならなくなる。
【０１３５】
【配列表】
【図１】血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ濃度の測定であり、
血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活性のアッセイに関する検量
線を示す。
血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活性のアッセイに関する検量
線を示す。
【図２】血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ濃度の測定であり、
単一凝固因子が欠乏している（＜５％）血漿中のＡＰＣ
補因子ＩＩ活性レベルを示す。
単一凝固因子が欠乏している（＜５％）血漿中のＡＰＣ
補因子ＩＩ活性レベルを示す。
【図３】ＡＰＣ耐性を有する家族の連鎖分析のＡＰＣ耐
性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏）を有する家族の家系を
示す。
性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏）を有する家族の家系を
示す。
【図４】ＡＰＣ耐性を有する家族の連鎖分析の染色体ｌ
のｑ２１−２５領域の統合的遺伝連鎖地図を示す。
のｑ２１−２５領域の統合的遺伝連鎖地図を示す。
【図５】ＡＰＣ耐性を有する家族の連鎖分析の染色体１
マーカーでのＡＰＣ耐性の二つ組ロドスコアを示す。
マーカーでのＡＰＣ耐性の二つ組ロドスコアを示す。
【図６】ＡＰＣ補因子ＩＩ同型接合欠乏として分類され
た患者のヌクレオチド置換を示すオートラジオグラムで
ある。
た患者のヌクレオチド置換を示すオートラジオグラムで
ある。
【図７】第Ｖ因子分子の簡単な説明図である。
【図８】ＡＰＣによる不活化に対する第Ｘａ因子活性化
第Ｖ因子（Ｑ５０６）の耐性を示す。
第Ｖ因子（Ｑ５０６）の耐性を示す。
【図９】１６９１ＡのＡＰＣ耐性による同時分離を示
す。
す。
【図１０】ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４の６４人の血栓
症患者及び対応する６４の対照の２２２ｂｐ ＰＣＲフ
ラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １００
５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドとのド
ットブロットハイブリダイゼーション。
症患者及び対応する６４の対照の２２２ｂｐ ＰＣＲフ
ラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １００
５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドとのド
ットブロットハイブリダイゼーション。
【図１１】１６９１ＧＧと１６９１ＧＡの関係を示す。
【図１２】年齢に基づき求めた第Ｖ因子ライデン遺伝子
型に関する粗な出現率推定値を示す。
型に関する粗な出現率推定値を示す。
【図１３】年齢に基づき求めた第Ｖ因子ライデン遺伝子
型に関する平滑化した出現率推定値を示す。
型に関する平滑化した出現率推定値を示す。
【図１４】１６９１ＧＧと１６９１ＧＡの関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｘ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＺＮＡＡ
Claims (11)
- 【請求項１】 血栓症の高危険率を示唆し、又は実際に
患者において血栓症を誘発することを特徴とする、血栓
症及び活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する低抗凝血
応答性に関する遺伝的欠陥の存在をスクリーニングする
方法であり、蛋白質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子中に
存在する突然変異の存在を検出することを含み、該突然
変異がアミノ酸配列の５０６位のアミノ酸アルギニンが
グルタミンに変異している突然変異を含むことを特徴と
する前記方法。 - 【請求項２】 突然変異蛋白質第Ｖ因子及び／若しくは
第Ｖａ因子又はその蛋白分解断片に結合し得る一方、非
突然変異蛋白質又はその断片に対してはより低い親和性
を有する抗体を用いること、又は、非突然変異蛋白質第
Ｖ因子及び／若しくは第Ｖａ因子又はそれらの蛋白分解
断片に結合し得る一方、突然変異蛋白質又はその蛋白分
解断片に対してはより低い親和性を有する抗体を用いる
ことにより、前記突然変異を検出することを特徴とする
請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 試験するサンプルをＡＰＣ単独で又は１
以上のプロテアーゼと組合わせて処理し、このことによ
りサンプル中に存在する第Ｖ因子又は第Ｖａ因子のいず
れをも、突然変異が存在しない場合には３０６、５０６
及び６７９位で確実に切断し、突然変異が存在する場合
には３０６及び６７９位で切断し、得られたサンプルを
第Ｖ因子又は第Ｖａ因子のアミノ酸第３０６〜５０６位
断片上の部位を特異的に認識し得る一の抗体と第Ｖ因子
又は第Ｖａ因子のアミノ酸第５０７〜６７９位断片上の
部位を特異的に認識し得る他の抗体から成る２つの抗体
と接触させることを特徴とし、更に、サンプル中の蛋白
分解断片への両抗体の結合をイムノアッセイで確認し、
突然変異の指標である該結合を検出することを含む請求
項１に記載の方法。 - 【請求項４】 試験するサンプルをプロテアーゼの処理
にかけ、突然変異の指標である抗体の結合を検出する請
求項３に記載の方法であり、該プロテアーゼが５０６位
の突然変異したＡＰＣ切断部位を切断し得ず、一方、該
プロテアーゼが５０６位の非突然変異ＡＰＣ切断部位を
切断し得ることを特徴とする前記方法。 - 【請求項５】 試験するサンプルをプロテアーゼの処理
にかけ、正常第Ｖ因子の指標である抗体の結合を検出す
る請求項３に記載の方法であり、該プロテアーゼが５０
６位の突然変異したＡＰＣ切断部位を切断し得、一方、
該プロテアーゼが５０６位の非突然変異ＡＰＣ切断部位
を切断し得ないことを特徴とし、非突然変異ＡＰＣ切断
部位を切断し得るプロテアーゼを含まないサンプルにの
み適用され得る前記方法。 - 【請求項６】 ５０６位のアミノ酸アルギニンがグルタ
ミンに突然変異しており、非突然変異第Ｖ因子及び／又
は第Ｖａ因子に比較し、ＡＰＣによる不活性化程度の減
弱を示すことを特徴とする突然変異蛋白質第Ｖ因子及び
／又は第Ｖａ因子に結合し得る抗体、又は該突然変異を
含む突然変異蛋白質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子の蛋
白分解断片に結合し得る抗体であって、該突然変異蛋白
質又はその対応する蛋白分解断片に比較し、非突然変異
蛋白質又は非突然変異蛋白質の対応する蛋白分解断片に
対してより低い親和性を有することを特徴とする前記抗
体。 - 【請求項７】 蛋白質第Ｖ因子及び／若しくは第Ｖａ因
子並びに／又は該蛋白質の蛋白分解断片のいずれかに結
合し得る抗体であり、該蛋白質がＡＰＣによる不活性化
程度の減弱を示さず、該抗体が、突然変異が第５０６位
のアミノ酸アルギニンのグルタミンへの変換を含む突然
変異蛋白質第Ｖ因子及び／若しくは第Ｖａ因子、並びに
／又は該突然変異を含むそれらの蛋白分解断片に対しよ
り低い親和性を有し、該突然変異によりＡＰＣによる不
活性化程度が減弱されることを特徴とする前記抗体。 - 【請求項８】 第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ
酸第３０６〜５０６位断片上の部位を特異的に認識し得
る請求項３に記載の方法において使用するための抗体。 - 【請求項９】 第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ
酸第５０７〜６７９位断片上の部位を特異的に認識し得
る請求項３に記載の方法において使用するための抗体。 - 【請求項１０】 ‐第５０６位のアミノ酸アルギニンが
グルタミンに突然変異している蛋白質第Ｖ因子及び／又
は第Ｖａ因子に結合し得る１以上の抗体であって、非突
然変異蛋白質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子に対しより
低い結合親和性を有する抗体、又は非突然変異蛋白質第
Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子に結合し得る１以上の抗体
であって、突然変異蛋白質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因
子に対しより低い結合親和性を有する抗体、及び ‐抗体の結合反応を検出するためのその他の試薬を含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法において使用す
るためのキット。 - 【請求項１１】 ‐非突然変異ＡＰＣ切断部位を切断し
得るが、突然変異ＡＰＣ切断部位を切断し得ない１以上
のプロテアーゼ、又は突然変異ＡＰＣ切断部位を切断し
得るが、非突然変異ＡＰＣ切断部位を切断し得ない１以
上のプロテアーゼ、 ‐第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ酸第３０６〜
５０６位断片上の部位を特異的に認識し得る抗体、及び ‐第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ酸第５０７〜
６７９位断片上の部位を特異的に認識し得る抗体を含む
ことを特徴とする請求項３乃至５のいずれかに記載の方
法において使用するためのキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP94200377.3 | 1994-02-14 | ||
| EP94200377 | 1994-02-14 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52098395A Division JP3163105B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001242170A true JP2001242170A (ja) | 2001-09-07 |
| JP3439458B2 JP3439458B2 (ja) | 2003-08-25 |
Family
ID=8216642
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52098395A Expired - Lifetime JP3163105B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
| JP2000400334A Expired - Lifetime JP3439458B2 (ja) | 1994-02-14 | 2000-12-28 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52098395A Expired - Lifetime JP3163105B2 (ja) | 1994-02-14 | 1995-02-14 | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6518016B1 (ja) |
| EP (2) | EP0696325B1 (ja) |
| JP (2) | JP3163105B2 (ja) |
| KR (1) | KR100384251B1 (ja) |
| AT (2) | ATE166110T1 (ja) |
| AU (1) | AU690644B2 (ja) |
| CA (1) | CA2159907C (ja) |
| DE (3) | DE696325T1 (ja) |
| DK (2) | DK0807691T3 (ja) |
| ES (2) | ES2166948T3 (ja) |
| FI (1) | FI117977B (ja) |
| GR (2) | GR960300034T1 (ja) |
| PT (1) | PT807691E (ja) |
| WO (1) | WO1995021938A1 (ja) |
Families Citing this family (50)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5935522A (en) * | 1990-06-04 | 1999-08-10 | University Of Utah Research Foundation | On-line DNA analysis system with rapid thermal cycling |
| EP0815262A4 (en) * | 1995-03-24 | 2000-08-23 | Scripps Research Inst | METHODS OF IDENTIFYING A MUTATION OF V FACTOR GENES |
| DE69636367T2 (de) * | 1995-08-21 | 2007-07-19 | bioMérieux B.V. | T-pa polymorphismus und dessen verwendung zur risikodiagnose von thrombus assoziierten krankheiten |
| US20030143759A1 (en) * | 1995-10-20 | 2003-07-31 | Bjorn Dahlback | Assays for determining anticoagulant cofactor activity |
| US5766869A (en) * | 1995-11-30 | 1998-06-16 | Ahs Hospital Corp. | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism |
| GB9604267D0 (en) * | 1996-02-29 | 1996-05-01 | Royal Infirmary Of Edinburgh N | Mutation assay |
| US6379975B1 (en) | 1996-11-27 | 2002-04-30 | T.A.C. Thrombosis And Coagulation Aktiebolag | Methods and reagents for determining protein S |
| AT404993B (de) * | 1997-01-13 | 1999-04-26 | Immuno Ag | Verfahren zur bestimmung eines proteins mit einer mutation |
| US6451526B1 (en) * | 1998-01-20 | 2002-09-17 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Simplified mutation detection |
| DE19802377A1 (de) | 1998-01-22 | 1999-08-19 | Max Planck Gesellschaft | Verwendung von Inhibitoren für die Behandlung von RTK-Überfunktions-bedingten Störungen, insbesondere von Krebs |
| US6268146B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-07-31 | Promega Corporation | Analytical methods and materials for nucleic acid detection |
| US6270974B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Exogenous nucleic acid detection |
| US6312902B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-11-06 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6335162B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-01-01 | Promega Corporation | Nucleic acid detection |
| US6235480B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-05-22 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6391551B1 (en) | 1998-03-13 | 2002-05-21 | Promega Corporation | Detection of nucleic acid hybrids |
| US6270973B1 (en) | 1998-03-13 | 2001-08-07 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US6703211B1 (en) | 1998-03-13 | 2004-03-09 | Promega Corporation | Cellular detection by providing high energy phosphate donor other than ADP to produce ATP |
| US7090975B2 (en) | 1998-03-13 | 2006-08-15 | Promega Corporation | Pyrophosphorolysis and incorporation of nucleotide method for nucleic acid detection |
| DE19840897A1 (de) * | 1998-09-08 | 2000-03-09 | Dirk Happich | Faktor V-Leiden-Test |
| US6703228B1 (en) * | 1998-09-25 | 2004-03-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and products related to genotyping and DNA analysis |
| EP1001037A3 (en) * | 1998-09-28 | 2003-10-01 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms |
| DE19848665A1 (de) * | 1998-10-22 | 2000-04-27 | Bayer Ag | Ein automatisierbarer Schnelltest zum direkten Nachweis der APC Resistenz Mutation mit spezifischen Primern und Probes |
| EP1155150A1 (en) * | 1999-02-18 | 2001-11-21 | Promega Corporation | Multiplex method for nucleic acid detection |
| US6238868B1 (en) * | 1999-04-12 | 2001-05-29 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences using ligation-dependant strand displacement amplification and bioelectronic chip technology |
| WO2000062036A1 (en) * | 1999-04-12 | 2000-10-19 | Nanogen/Becton Dickinson Partnership | Amplification and separation of nucleic acid sequences using strand displacement amplification and bioelectronic microchip technology |
| US6582920B2 (en) * | 2000-09-01 | 2003-06-24 | Gen-Probe Incorporated | Amplification of HIV-1 RT sequences for detection of sequences associated with drug-resistance mutations |
| EP1330549A2 (en) * | 2000-10-27 | 2003-07-30 | Abbott Laboratories | Genotyping using partially-complementary probes |
| US6855509B2 (en) | 2000-12-19 | 2005-02-15 | Instrumentation Laboratory Company | Protein S functional assay and kit therefor |
| WO2003076869A1 (en) * | 2002-03-13 | 2003-09-18 | Borealis Technology Oy | Apparatus for inspecting deformation of pipes |
| US20030177850A1 (en) * | 2002-03-19 | 2003-09-25 | The Washington Post Company | System and method for verifying the roll roundness of rolls of paper used for newspapers |
| US20050026168A1 (en) * | 2002-12-13 | 2005-02-03 | Genesis Group Inc. | Method for the detection of risk factors associated with myocardial infarction |
| US20050032066A1 (en) * | 2003-08-04 | 2005-02-10 | Heng Chew Kiat | Method for assessing risk of diseases with multiple contributing factors |
| FR2866349B1 (fr) * | 2004-02-12 | 2008-05-16 | Biomerieux Sa | Procede de diagnostic/pronostic d'une thrombose |
| US20090004175A1 (en) * | 2004-07-16 | 2009-01-01 | Novo Nordick Health Care A/G | Methods for Optimizing Forming Vlla-Based Hemostatic Treatment |
| EP1623996A1 (en) * | 2004-08-06 | 2006-02-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts | Improved method of selecting a desired protein from a library |
| WO2006027111A1 (en) * | 2004-09-06 | 2006-03-16 | Zlb Behring Gmbh | Modified coagulation factor viii with enhanced stability |
| KR100655658B1 (ko) * | 2005-07-26 | 2006-12-08 | 삼성전자주식회사 | 게이트 전극 구조물과 그 제조 방법 및 이를 갖는 반도체트랜지스터와 그 제조 방법 |
| US20110027184A1 (en) * | 2006-01-12 | 2011-02-03 | Russell James A | Protein c pathway associated polymorphisms as response predictors to activated protein c or protein c-like compound administration |
| US20070207188A1 (en) * | 2006-02-16 | 2007-09-06 | Miller Debra L | Cocoa products and methods of treating cardiovascular conditions with sugar-free cocoa |
| WO2008020090A1 (es) * | 2006-08-18 | 2008-02-21 | Laboratorios Indas, S.A. | Método y kit para diagnosticar el riesgo de desarrollar una enfermedad trombótica venosa |
| US9717896B2 (en) | 2007-12-18 | 2017-08-01 | Gearbox, Llc | Treatment indications informed by a priori implant information |
| US20090163856A1 (en) * | 2007-12-19 | 2009-06-25 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Treatment indications informed by a prior implant information |
| US20090292214A1 (en) * | 2008-05-22 | 2009-11-26 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| US8636670B2 (en) * | 2008-05-13 | 2014-01-28 | The Invention Science Fund I, Llc | Circulatory monitoring systems and methods |
| US20090292213A1 (en) * | 2008-05-21 | 2009-11-26 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| US20090287120A1 (en) | 2007-12-18 | 2009-11-19 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| US20100036263A1 (en) * | 2008-08-07 | 2010-02-11 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Circulatory monitoring systems and methods |
| ES2547075T3 (es) | 2011-06-16 | 2015-10-01 | Gendiag.Exe, S.L. | SNP asociados a enfermedad tromboembólica |
| WO2016005564A2 (en) * | 2014-07-11 | 2016-01-14 | Novo Nordisk A/S | Antibodies against activated factor v |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5049491A (en) * | 1987-11-19 | 1991-09-17 | The University Of Vermont | Immunologic detection of factor V(VA) fragments in hemorrhagic and thrombotic clinical settings |
| US5051357A (en) * | 1989-07-14 | 1991-09-24 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Method and assay using inactivation of factors Va and VIIIa by activated Protein C to diagnose thrombic disease or assay for Protein C and kit therefor |
| DE608235T1 (de) * | 1991-11-13 | 1994-12-22 | Bjoern Dahlbaeck | Vefahren zur diagnose von störungen der blutgerinnung. |
| SE470274B (sv) * | 1991-11-13 | 1993-12-20 | Bjoern Dahlbaeck | Användning av en in vitro-metod för diagnos av blodkoagulationssjukdomar |
| NZ261190A (en) | 1993-01-29 | 1997-12-19 | Bjorn Dahlback | Assaying for functional activity of a blood coagulation component involved in the protein c anticoagulant system (protein c, activated protein c, protein s or anticoagulant factor v) |
| US5922855A (en) * | 1993-12-17 | 1999-07-13 | Oregon Health Sciences University | Mammalian DNA mismatch repair genes MLH1 and PMS1 |
| WO1995029259A1 (en) | 1994-04-22 | 1995-11-02 | Stichting Centraal Laboratorium Van De Bloedtransfusiedienst Van Het Nederlandse Rode Kruis | Method and means for detecting and treating disorders in the blood coagulation cascade |
| US5639726A (en) * | 1994-09-30 | 1997-06-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Peptide mediated enhancement of thrombolysis methods and compositions |
| ATE198772T1 (de) | 1994-11-10 | 2001-02-15 | Dade Behring Marburg Gmbh | Verfahren zum spezifischen nachweis eines aktivierten gerinnungsfaktors v mit einer erhöhten stabilität gegenüber aktiviertem protein c |
| US5705395A (en) * | 1994-11-14 | 1998-01-06 | The Scripps Research Institute | Method for diagnosis of thrombotic disorders |
| EP0815262A4 (en) | 1995-03-24 | 2000-08-23 | Scripps Research Inst | METHODS OF IDENTIFYING A MUTATION OF V FACTOR GENES |
| US5874256A (en) * | 1995-06-06 | 1999-02-23 | Rijks Universiteit Leiden | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same |
| US5863896A (en) * | 1995-11-09 | 1999-01-26 | Immuno Ag | Evaluation of substances for altering and for increasing APC response |
| US5766869A (en) * | 1995-11-30 | 1998-06-16 | Ahs Hospital Corp. | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism |
-
1995
- 1995-02-14 CA CA002159907A patent/CA2159907C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 DK DK97201766T patent/DK0807691T3/da active
- 1995-02-14 KR KR1019950704470A patent/KR100384251B1/ko active IP Right Grant
- 1995-02-14 DE DE0696325T patent/DE696325T1/de active Pending
- 1995-02-14 EP EP95909724A patent/EP0696325B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 DE DE69523179T patent/DE69523179T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 DK DK95909724T patent/DK0696325T3/da active
- 1995-02-14 EP EP97201766A patent/EP0807691B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 AU AU18091/95A patent/AU690644B2/en not_active Expired
- 1995-02-14 DE DE69502451T patent/DE69502451T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 AT AT95909724T patent/ATE166110T1/de active
- 1995-02-14 PT PT97201766T patent/PT807691E/pt unknown
- 1995-02-14 US US08/454,353 patent/US6518016B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 AT AT97201766T patent/ATE206765T1/de active
- 1995-02-14 ES ES97201766T patent/ES2166948T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 JP JP52098395A patent/JP3163105B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-02-14 WO PCT/EP1995/000553 patent/WO1995021938A1/en active IP Right Grant
- 1995-02-14 ES ES95909724T patent/ES2090001T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-12 FI FI954855A patent/FI117977B/fi not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-06-05 US US08/658,340 patent/US5910576A/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-30 GR GR960300034T patent/GR960300034T1/el unknown
-
1998
- 1998-08-05 GR GR980401765T patent/GR3027579T3/el unknown
- 1998-09-30 US US09/165,019 patent/US6558913B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-12-28 JP JP2000400334A patent/JP3439458B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3439458B2 (ja) | 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 | |
| US20090054256A1 (en) | Method evolved for recognition of thrombophilia (mert) | |
| US5874256A (en) | Method for diagnosing an increased risk for thrombosis or a genetic defect causing thrombosis and kit for use with the same | |
| EP2215256A1 (en) | Disorders of vasoregulation and methods of diagnosing them | |
| US20110118135A1 (en) | Mutations in Contaction Associated Protein 2 (CNTNAP2) are Associated with Increased Risk for Ideopathic Autism | |
| US20220372572A1 (en) | Prediction of pregnancy loss | |
| US7785788B2 (en) | Method for the detection of risk factors associated with myocardial infarction | |
| JP2002527079A (ja) | 心臓血管ステータスを評価するための遺伝子及びその使用のための組成物 | |
| Phasha et al. | Factor XIII-A Val34Leu and Tyr204Phe variants influence clot kinetics in a cohort of South African type 2 diabetes mellitus patients | |
| US6316188B1 (en) | Histamine-N-methyltransferase variants associated with histaminergic disease | |
| EP1881081A1 (en) | Combinations of markers for increased accuracy of diagnosis of rheumatoid arthritis | |
| AU2004247896B2 (en) | Mutations in the SLC40A1 gene associated to impaired iron homeostasis | |
| JP2007530059A (ja) | 血栓性疾患を発症する素因の診断方法およびその使用 | |
| WO2009070764A1 (en) | Variation in the chi3l1 gene influences serum ykl-40 levels, asthma risk, and lung function | |
| JP5111763B2 (ja) | 気管支喘息の遺伝的素因検査方法 | |
| JP4649163B2 (ja) | 気管支喘息の遺伝的素因検査方法 | |
| US20020155466A1 (en) | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of respiratory distress in newborn infants | |
| MXPA06010380A (en) | Method of diagnosis of a predisposition to develop thrombotic disease and its uses |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080613 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090613 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100613 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110613 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110613 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120613 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120613 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130613 Year of fee payment: 10 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |