JPH08509383A - 血栓症及び／又は活性化プロテインｃに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の存在をスクリーニングする方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血栓症、及び／または活性タンパ質Ｃ（ＡＰＣ）に対する弱い抗凝血応答に関連する遺伝的欠陥の存在をスクリーニングする方法。この方法は、核酸レベルもしくはタンパク質レベル、または両レベルにおいて第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子の１個以上のＡＰＣ開裂及び／または結合部位に生じた一つ以上の突然変異を検出するためのものである。

Description

【発明の詳細な説明】 血栓症及び／又は活性化プロテインＣに対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性 欠陥の存在をスクリーニングする方法 本発明はうっ血分野に関するものであり、特に血栓症に係わる。より具体的に は、本発明は、血栓発現傾向、特に遺伝性の血栓発現傾向のスクリーニング及び 診断方法に関する。従って、本発明の方法は、個体が血栓症にかかる危険を調べ るために使用できる。発明の背景 深静脈血栓症は一般的な病気である。確定されている危険因子としては、手術 して間もない状態、悪性疾患、妊娠及び分娩、長期の不動化、並びに凝固系の主 要阻害物質のうちの一つの欠乏が挙げられる（Ｒｅｆ．１）。主要阻害物質は、 プロテインＣ、プロテインＳ及びアンチトロンビンであることが知られている。 多くの患者の深静脈血栓症の原因はまだ解明されていない。しかしながら、遺伝 的に静脈血栓症の傾向がある幾つかの家族に、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に 対する抗凝血応答の弱さが見られること が最近確認された（Ｒｅｆ．２）。 ＡＰＣの抗凝血特性は、タンパク質限定分解によって活性化補因子Ｖａ及びＶ ＩＩＩａを不活化する能力にある（Ｒｅｆ．３）。このような補因子Ｖａ及びＶ ＩＩＩａの不活化は、重要な凝固酵素であるトロンビンの生成率を低下させる。 この作用はｉｎ ｖｉｔｒｏで、正常血漿にＡＰＣを加え、その効果を凝固検査 、例えばＡＰＴＴ（ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｐｌ ａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ）を測定する検査で調べることにより、視覚化できる。プ ロテインＣの活性化は、トロンビン−トロンボモジュリン複合体を介して内皮細 胞の表面で起こる（Ｒｅｆ．２７）。トロンボモジュリン（ｔｈｒｏｍｂｏｍｏ ｄｕｌｉｎ）は、トロンビンに結合することができる膜糖タンパク質である。こ の結合によってトロンビンは、フィブリノーゲンをフィブリンに変換する能力と 、血小板を活性化する能力とを失う。即ち、トロンビンは凝血特性を失い、プロ テインＣの活性化によってそれ自体の生成も低下する（いわゆる負のフィードバ ック）。Ｉｎ ｖｉｖｏ（カルシウムの存在下）では、プロテインＣの活性化は 、内皮上のトロンボモジュリンの存在にほぼ全面的に依存す る。ＡＰＣはその後、ＡＰＣ阻害物質（ＰＣＩ）及びα₁アンチトリプシンとの 複合体の形成によって中和される。これは、正常な状態では、ＡＰＣが循環系中 に短時間しか存在せず、抗凝血作用が通常は局所的に発現される状態を維持する ことを意味する。 ＡＰＣによる補因子Ｖａ及びＶＩＩＩａの不活化が、Ｃａ²⁺、リン脂質及びＡ ＰＣ補因子プロテインＳの存在下で最適に進行することは、一般的に認められて いた（Ｒｅｆ．４、２８、２９）。しかしながら、この見解はその後、精製タン パク質系ではプロテインＳはＡＰＣに対して補因子活性をほとんど示さないとい う発見により、正当性が問われることになった（Ｒｅｆ．５、Ｒｅｆ．６）。ｉ ｎ ｖｉｖｏの観察事項（遺伝性プロテインＳ欠乏の場合の血栓症の傾向）とｉ ｎ ｖｉｔｒｏの観察事項（精製タンパク質系におけるプロテインＳのＡＰＣ補 因子活性の弱さ）と ｃｋらは、アンチトロンビン活性が正常値であり、プロテインＣ及びプロテイン Ｓも（免疫学的及び機能的に）正常値であり、異常プラスミノーゲン、異常フィ ブリノーゲン 又は抗凝血性狼瘡（ｌｕｐｕｓ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ）の徴候を示さな いが、活性化プロテインＣに対する抗凝血応答が弱い患者について報告している 。前記応答は、精製ヒトＡＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏ添加した後の血漿の応答（凝 固時間、ＡＰＴＴ）を調べるためにＤａｈｌｂａｃｋが開発した新しいテスト（ Ｒｅｆ．２）で発見された。これらの血栓症患者の血漿に活性化プロテインＣを 加えても、ＡＰＴＴは予想に反して延長されなかった。この現象に関して多数の メカニズムを想定した結果、ＡＰＣに対する弱い抗凝血応答を誘起すると見なさ れるものが一つだけあった。即ち、前記患者に欠乏している、これまで未知のＡ ＰＣ補因子の存在である。 下記のメカニズムは従来、ＡＰＣに対する弱い抗凝血応答の原因として認めら れていなかった： １． ＡＰＣに対する自己抗体の存在、 ２． ＡＰＣと反応する即時型作用性プロテアーゼ阻害物質、 ３． 機能性プロテインＳの欠乏、 ４． 第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子遺伝子の突然変異。 では、プロテインＳと無関係に作用するとされているこれまで知られていないＡ ＰＣ補因子の遺伝的な欠乏が、ＡＰ ｅｆ．２）はまた国際特許出願第ＷＯ９３／１０２６１号で、凝固因子を含む患 者試料に活性化プロテインＣを加え、該ＡＰＣ添加によって左右される酵素活性 を測定することにより、血栓塞栓障害を診断する検査方法を開示した。Ｄ 当該障害が、これまで未知の１種類以上の凝固因子、又は既知の因子の未知の相 互作用に関係していることを示すものであると記述されている。未知の因子は、 ＡＰＣによる分解に対して耐性を示す第Ｖａ又は第ＶＩＩＩａ因子ではなく、Ａ ＰＣに対する免疫グロブリン型阻害物質でもない。 ｃｋら（Ｒｅｆ．２）は、彼らの発明が、遺伝性又は非遺伝性の血栓発現傾向の ような血栓塞栓疾患の更に進んだ診断、並びに妊娠、避妊ピルの使用、手術等に 関連した血栓症の危険の決定に特に有用な方法であると述べている。彼らはその 方法が、試料中の凝固系をそれ自体公知のように完全に又は部分的に活性化し、 活性化プロテインＣと共に インキュベートし、次いで発色性基質の凝固又は変換のような基質変換反応速度 を測定することを特徴とすると記述している。測定した変換速度は、正常血漿試 料に関して得られた値と比較される。この速度が大きければ、試料の由来源であ る個体が凝固疾患にかかっている可能性がある。この疾患は、プロテインＳの欠 乏、又はＡＰＣによる分解、もしくはＡＰＣに対する免疫グロブリン型阻害物質 による分解に対して耐性の第Ｖａ因子もしくは第ＶＩＩＩａ因子の産生によって 発現されない。前記国際特許出願でＤａｈｌｂａｃｋらは更に、該出願明細書に 記載のデータは、当該患者が欠陥第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子を有し得ないこと を示すものであると記述している。これは、彼らがそれより先にＴｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．６５，アブストラクト３９，６５８（１９９１）で述べた こと、即ち患者の血漿試料への活性化プロテインＣの添加、及び生じた作用の検 査によって、活性化プロテインＣにより分解されない欠陥第ＶＩＩＩａ因子分子 が明らかにされたという主張に反するものである。前記国際特許出願では更に、 ＡＰＣによる第Ｖａ及び第ＶＩＩＩａ因子の阻害を直接測定するためにアッセイ が使用されている。前記国際特許出願 に記載の第Ｘａ因子ベースの凝固アッセイを使用すると、ＡＰＣによる患者第Ｖ ａ因子の阻害が正常であることが判明した。これは、患者血漿試料中の第Ｖａ因 子が、外部から添加したＡＰＣにより正常に分解されることを示唆するものであ る。 のグループがこの分野での研究を開始した。Ｇｒｉｆｆｉｎらは、Ｂｌｏｏｄ， Ｖｏｌ．８２，ｎｒ．７，１９９３，１９８９−１９９３ページに、確認可能な 血液凝固異常がない２５人の静脈血栓患者、及び予め異型（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇ ｏｕｓ）プロテインＣ又はプロテインＳ欠乏を有すると確認された２２人の患者 について実施したＡＰＣ耐性検査の結果を記述している。これらの患者に関する ＡＰＴＴのＡＰＣ誘発延長（ＡＰＣ ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｏｎｇａｔｉｏ ｎ）アッセイが、３５の正常被験者に関する結果と比較された。結果は、このよ うなＡＰＣへの抗凝血応答の新しい欠陥が、驚いたことに、２５人の患者の５２ 〜６４％、即ち予め血栓発現傾向を有すると診断されなかった患者の大半に存在 することを示した。この欠陥は、２２人の異型プロテインＣ又はプロテインＳ欠 乏患者のう ち２０人の患者には見られなかった。これは、新しい因子が、プロテインＣ又は プロテインＳの欠乏に関係のない危険因子であることを示唆するものであった。 正常血漿と２種類の著しい欠陥のある血漿（ＡＰＴＴのＡＰＣ誘発延長＜２０秒 ）の各々とを混合し、ＡＰＴＴアッセイを行って、正常血漿が欠陥血漿の弱い応 答を修正する能力を評価した。 していた。これも、正常血漿が、欠陥のある患者血漿に欠失している因子を含む ことを示唆するものであった。前記文献には、ＡＰＣ存在下のＡＰＴＴ値からＡ ＰＣ不在下のＡＰＴＴ値を差し引いた値として単純に定義された正味のＡＰＴＴ 延長時間計算値が記載されている。前記文献はまた、ＡＰＣ存在下のＡＰＴＴ対 ＡＰＣ不在下のＡＰＴＴの比と、このパラメーターをＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長の 値と比較したという事実も記述している。この比較は、異常患者の指標である極 めて小さいＡＰＴＴ比の値と、正常被験者に関するこれらのパラメーターとの間 の優れた相関を明らかにした。従って、ＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長のパラメーター 、あるいはＡＰＣ存在下対ＡＰＣ不在下のＡＰＴＴ値の比のパラメーター、又は これら二つのパラメーターを診 断パラメーターとして使用できると結論された。これらのパラメーターの中には 、この目的に関して、前記文献の別のパラメーターより有用と思われるものはな い。前記文献には更に、使用したＡＰＣ誘発ＡＰＴＴ延長アッセイが、ｐｏｔｚ ｓｃｈら（Ｒｅｆ．１９）によりＢｌｏｏｄ ８０：２６７ａ １９９２（アブ ストラクト）に報告されている抗凝血性狼瘡患者の血漿中の内在性第ＶＩＩＩ因 子のＡＰＣ誘発不活化を用いるアッセイを連想させると記載されている。この後 者のアッセイに基づいて、Ｇｒｉｆｆｉｎらの文献には、血栓症を有する抗凝血 性狼瘡患者に由来する血漿はＡＰＣに対する応答が弱く、従って血栓症を有する 患者を血栓症のない患者から区別することができると報告されている。Ｇｒｉｆ ｆｉｎらは、新しい仮想のＡＰＣ補因子に対する自己抗体が、抗凝血性狼瘡患者 の血栓症の危険性に関与し得ると推測した。彼らは更に、新しいＡＰＣ補因子の 後天的欠乏が、血栓症の後天的危険性と関係があり得ると推測することに興味を 引かれると述べている。 Ｋｏｓｔｅｒらは、Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２ ，１５０３−１５０６ページで、活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する抗凝血 応答の弱さを 特徴とする凝固系の異常の臨床的重要性を調べるために、集団ベース症例対照テ ストをいかにして実施したかを記述することによって、ＡＰＣ耐性と血栓症との 関係を更に深く検討している。家族内の研究に基づけば、ＡＰＣに対するこのよ うな弱い応答は、常染色体優性形質として遺伝すると思われる（Ｒｅｆ．２、７ 及び４７）。原因不明の血栓症のために凝固ユニット（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｕｎｉｔ）と称されている患者の間で前記異常は約４０％の罹患率を示し、血 栓発現傾向の主因であった（Ｒｅｆ．８及び９）。ＫｏｓｔｅｒがＬａｎｃｅｔ ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１５０３−１５０６ページに記述 している研究では、ＡＰＣに対する弱い応答の臨床的重要性が、最初の客観的に 確認された深静脈血栓症の経験がなく、内在する悪影響（ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ）もない、任意に選択した７０歳以下の一連の患者につ いて調べられている。ＡＰＣに対するこれらの患者の血漿の感度が、対応する健 康対照の感度と比較された。活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する血漿ＡＰＴ Ｔの感度は、プロテインＳ活性アッセイのために先に開発された試薬及び反応条 件を用いて（Ｒｅｆ．１１）、本質 うに測定された。結果は、ＡＰＴＴ（＋ＡＰＣ）／ＡＰＴＴ（−ＡＰＣ）の値と して定義されるＡＰＣ感度比（ＡＰＣ−ＳＲ）として示されている。Ｋｏｓｔｅ ｒらの論文には（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１ ５０３−１５０６ページ）、プロトロンビン及び／又は第Ｘ因子の低い濃度（＜ ０．５ｕ／ｍｌ）が、ＡＰＣ−ＳＲを増加させると記述されている。そのため、 経口抗凝血剤で治療している患者の血漿の評価に該検査を使用することはできな い。９８個の一連の試料では、Ｋｏｓｔｅｒらのテスト（Ｌａｎｃｅｔ，１９９ ３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，１５０３−１５０６ページ）で得られたＡ ＰＣ−ＳＲと、ＷＯ９３／１０２６１号に記載のようにＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ によって開発されたテストで得られたＡＰＣ−ＳＲとの間に良好な相関が見出さ れた。健康対照被験者に基づいてＡＰＣ感度比の基準範囲が算出された。データ の対数変換及び平均値の三つの標準偏差（ＳＤ）外の値を有する１０人の被験者 の除外後の正常の下限値は、２．１７（平均値−１．９６ ＳＤ）であった。血 栓症にかかる危険と応答の度合いとの間に反比例関係が発見され た。血栓症患者の弱いＡＰＣ応答の罹患率が２１％であり、且つ血栓症の確率比 （ｏｄｄｓ ｒａｔｉｏ）が６．６であるという理由から、弱いＡＰＣ応答は深 静脈血栓症の一般的な強力危険因子とみなし得ると結論された。さらには、ＡＰ Ｃ感度比が約１．１０の被験者は同型（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ）又は二重異型（ ｄｏｕｂｌｅ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ）であり得、ＡＰＣ感度比が約１．５ ０の被験者は異常に対して異型であり得るとさえ推論された。健康対照被験者の 前記異常の罹患率は５％であった。ＡＰＣ−ＳＲの分布は明らかに双峰であるた め、Ｋｏｓｔｅｒらは、被験者が正常範囲内で低すぎる値を有するのではなく、 実際に異常なＡＰＣ応答を有すると考えた。従って、血栓症にかかる危険とＡＰ Ｃ応答との間の関係は、単純な単一遺伝子欠陥のモデルに従うものではないと思 われた。前記異常は健康被験者の間に広く発見されたため、Ｋｏｓｔｅｒらは、 プロテインＣ欠乏についても同様であるように、欠陥自体が血栓症を起こすのに 十分であるとは思えないと考えた（Ｒｅｆ．１５、Ｒｅｆ．１６）。特定の患者 における血栓症の発生には、別の原因となる因子が必要と思われる。これは後天 的因子であり得、まだ知られていない遺伝 子欠陥もしくは変異でもあり得る。しかしながら、別の原因となる因子が存在す れば、弱いＡＰＣ応答は、相対的危険性の６〜７倍の増加によって証明されるよ うに、血栓症を発生させる危険が高い。前記論文には、弱いＡＰＣ応答の潜在的 欠陥は、活性化プロテインＣに対する補因子の常染色体優性遺伝性欠乏が仮想さ れたとしても（Ｒｅｆ．７）、依然として解明されないままであると記述されて いる。弱いＡＰＣ応答は、プロテインＣ、プロテインＳ又は抗トロンビンの欠乏 の５〜１０倍の頻度を有すると思われる一方で、ほぼ類似の相対的血栓症危険率 を与える（Ｒｅｆ．１７及び１８）。これは、Ｋｏｓｔｅｒらによれば、前記異 常に関する総ての静脈血栓症患者の検査を価値あるものにし得るデータである。 要約すれば、当業界では、プロテインＣ抗凝血経路の欠陥が、比較的高い血栓 症発生危険率に関係していることが確認された。活性化プロテインＣに対する弱 い抗凝血応答は細部にわたって研究されてきたが、活性化プロテインＣに対する 弱い抗凝血応答の原因はまだ解明されていない。多くの仮説がたてられたが、唯 一受け入れられたのは、活性化プロテインＣに対して弱い抗凝血応答を示す患者 に明 らかに欠乏している未知のＡＰＣ補因子の存在である。仮想のＡＰＣ補因子のア イデンティティは不明である。また、ＡＰＣに対する応答の変化を検出するため に現在使用されている検査は、既に抗凝血剤を使用している被験者には使用でき ない。発明の説明 驚くべきことに、弱い抗凝血プロテインＣ応答の原因である同定されていない 補因子のアイデンティティが判明した。前述の認められていなかったメカニズム のうちの一つが、実際に、血栓発現傾向のある患者の大半におけるプロテインＣ 抗凝血経路の欠陥に関与していることが判明したのである。この欠陥の原因は、 発現後に、第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子（前記第Ｖ因子の活性化産物）、又は 第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子（前記第ＶＩＩＩ因子の活性化産物 ）のＡＰＣによる不活化の度合いの低下に関与する、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因 子をコードする核酸物質中の突然変異の存在に結び付けられた。従って前記欠陥 は、まだ同定されていないＡＰＣ補因子の突然変異の結果ではなく、実際には、 第Ｖ因子もしくは第ＶＩＩＩ因子の欠乏、又はより特定的にはこれら因子の活性 化産物の 欠陥に起因する。 当業界で公知のように、血栓症が発生する危険とＡＰＣ耐性の存在との間の関 係は既に確認されており、この種の欠陥のスクリーニングは実際に、血栓症を起 こす危険が高い患者の診断に極めて有用と思われる。現在では、どの因子が関係 のある遺伝子欠陥を有しているかが分かっているため、ＡＰＣ耐性を調べるため のＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテスト以外の方法で集団を実際にスクリーニングする ことが可能となった。 ＡＰＣ耐性に関連した変異を受けた第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子についてスク リーニングする時に、突然変異タンパク質の存在を調べるためにＤＮＡ技術を使 用するか又は抗体を使用することが可能になった。本発明は、血栓症及び／又は 活性化プロテインＣ（ＡＰＣ）に対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥の 存在をスクリーニングする方法に関する。前記遺伝性欠陥は、患者の血栓症発生 の危険が高いことを示すか、又は実際に血栓症を生起させるようなものである。 該方法は、それ自体公知の方法で第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸 物質の突然変異の存在を測定することからなり、但し核酸物質発現時の前記 突然変異は、ＡＰＣによる前記第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子（前記第Ｖ因子の 活性化産物）、あるいは前記第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子（前記 第ＶＩＩＩ因子の活性化産物）の不活化の度合いの低下に関係しており、及び／ 又は、該方法は、タンパク質第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子中に存在する突然変 異、及び／又はタンパク質第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子中に存在 する突然変異を、それ自体公知の方法で、前記第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子あ るいは第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の分析、又は前記第Ｖ因子及 び／又は前記第Ｖａ因子、及び／又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因 子のタンパク分解フラグメントの分析により調べることからなり、但し前記突然 変異はＡＰＣによる前記第Ｖ因子及び／又は前記第Ｖａ因子及び／又は第ＶＩＩ Ｉ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の不活化の度合いの低下に相関するものであ る。本発明は特に、第Ｖ因子及び／又は第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列に おける突然変異が、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子及び／又は第ＶＩＩＩ及び／又は 第ＶＩＩＩａ因子上のＡＰＣの結合部位又は開裂部位をコードする核酸配列部分 内に存在し、該突然変異が、ＡＰＣに よって弱く不活化された第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子及び／又は第ＶＩＩＩ因 子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子を生成させる場合の方法に関する。第Ｖ因子、第 ＶＩＩＩ因子、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子中のＡＰＣの結合及び開裂部位 は多数存在することが知られている（表１、Ｒｅｆ．３４、３５、３６、４８、 ４９、５２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，１１２３３−１１２３８（１９ ８７）に記載のＯｄｅｇａａｒｄ Ｂ及びＭａｎｎ Ｋ．Ｇ．の論文、並びにＢ ｌｏｏｄ ８２，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐ．５８ａ，１９９３に記載のＫａｌａｆａ ｔｉｓ Ｍ．，Ｈａｌｅｙ Ｐ．Ｅ．及びＭａｎｎ Ｋ．Ｇ．のアブストラクト 参照）。 結合部位は必ずしも開裂部位ではない。しかしながら、この種の因子へのＡＰＣ の結合を弱めるあらゆる効果がこの種の因子のＡＰＣ耐性にも作用することはか なり明白である。なぜなら、一般的に、該因子はＡＰＣと結合した後でなければ ＡＰＣによって開裂することができないからである。結合及び／又は開裂部位に 作用する突然変異は、結合部位に位置するアミノ酸の一次アミノ酸配列中に存在 し得、又はＡＰＣ結合及び／又は開裂に対する親和性が小さい三次構造を形成さ せる分子中の別の場所の突然変異に起因し得る。多数のＡＰＣ結合及び／又は開 裂部位が明らかにされているため、分子全体ではなく、これらの位置の突然変異 についてスクリーニングを行うのが最も簡単であることは明白である。多くのＡ ＰＣ開裂部位が第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ及び第ＶＩＩＩａ因子のＨ鎖上に存在 することが知られているため、検出すべき突然変異は、Ｈ鎖上のＡＰＣ開裂部位 をコードする核酸配列部分内の位置に存在するのが好ましい。 第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子の活性化はトロンビン因子Ｘａによって生起し得、第 Ｖ因子の場合はある種のへビ毒によっても生起し得る。当業者は、「特定因子に よって（で）活 性化された（した）」という表現を、「特定因子を介して活性化された（した） 」と解釈することもできる。その結果得られる活性化因子は、それぞれの活性化 方法に起因して少しだけ異なる。従って、トロビンで活性化した第Ｖａ因子のＡ ＰＣによる結合及び／又は開裂を低下させる突然変異が、Ｘａで活性化した第Ｖ ａ因子のＡＰＣによる結合及び／又は開裂を低下させないことは可能であり、そ の逆も可能である。第Ｖ因子は次のドメイン構造Ａ１Ａ２／ＢＡ３Ｃ１Ｃ２を有 し、Ｘａで活性化した第Ｖａ因子は構造Ａ１Ａ２／Ｂ’Ａ３Ｃ１Ｃ２を有し、ト ロビンで活性化した第Ｖａ因子は構造Ａ１Ａ２／Ａ３Ｃ１Ｃ２を有する。三次構 造の相違はおそらく、異なる方法で活性化された時に生じるこれら因子のＬ鎖の 構造変化に起因する。本明細書に記載の実施例では、活性化がＸａを介して開始 され、トロビンを介して活性化された第Ｖａ因子のＡＰＣ不活化に作用しなかっ た時には、説明されている特定の突然変異が実際に、第Ｖａ因子のＡＰＣ不活化 のみを抑制したことが明らかにされている。この特定の突然変異は、第Ｖ因子の Ｈ鎖上に存在していたため、トロビンを介して活性化した第Ｖａ因子及びＸａを 介して活性化した第Ｖａ因子の両方 に存在するが、おそらくは、二つの形態の活性化因子Ｖの三次構造の相違のため にこれら二つの形態の活性化因子内で同じ作用を発揮することはない。 通常は、ＡＰＣによる不活化は活性化第Ｖ因子又は活性化第ＶＩＩＩ因子上で 生起するため、本発明の方法は、好ましくは、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ因子 上のＡＰＣに対する結合親和性の低下及び／又はＡＰＣによる開裂の低下を引き 起こす突然変異の検出に適用される。一般的には、第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩａ 因子に存在する突然変異は、これらの活性化産物の由来源である第Ｖ因子又は第 ＶＩＩＩ因子上にも存在する。従って、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子をコードす る核酸配列を分析すれば、活性化因子Ｖａ又はＶＩＩＩａにも存在し得る突然変 異が検出されることになる。従って、本発明の方法による分析は、第Ｖ及び第Ｖ ＩＩＩ因子の核酸レベル、例えばＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡレベル、並びに第Ｖ ａ、第ＶＩＩＩａ、第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子のうちのいずれか、又はこれらの因 子に由来するフラグメント上のタンパク質レベルで実施することができる。 第Ｖａ因子ＤＮＡは、ＨｅｐＧ２細胞（Ｒｅｆ．２０） 及びヒト胎児肝臓（Ｒｅｆ．２１及び２２）からクローニングされた。第Ｖ因子 の完全アミノ酸配列は既知であり（Ｒｅｆ．２０、２３）、第Ｖ因子遺伝子の構 造も解明されている（Ｒｅｆ．２３）。Ｓｈｅｎらは（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５０，２９９２−３００１，Ｎｏ． ７，１９９３年４月１日）、どのようにしてヒト第Ｖ因子の細胞供給源を発見し たかを記述している。彼らは、逆転写とそれに次ぐポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ −ＰＣＲ）とを用いて、ヒトリンパ球内の第Ｖ因子ｍＲＮＡを同定した。ＰＣＲ で得られた結果は、Ｔ細胞 ｃＤＮＡライブラリーからの第Ｖ因子ｃＤＮＡの独 立クローニングによって確認された。第Ｖ因子ｃＤＮＡの配列は、肝臓第Ｖ因子 ｍＲＮＡとほぼ同じであった。第Ｖ因子タンパク質の連結領域の一部をコードす る限定された長さのｍＲＮＡが、６個のヌクレオチド置換に基づくヌクレオチド 多形性を有することが判明した。Ｓｈｅｎらは、増幅後に誘導された１４個の独 立クローン内に存在する増幅Ｆ７／Ｆ８第Ｖ因子ｃＤＮＡフラグメントが、６個 のヌクレオチドベース置換を有すると記述している。２個の置換は、それぞれ位 置２２０９及び２２３６でのチミンから シトシン及びシトシンからチミンへの置換であり、これらはサイレント（ｓｉｌ ｅｎｔ）突然変異であった。４個の置換は、位置２３０２でやはりサイレント突 然変異を生起させるグアニンからアデニンベースの置換、並びに位置２５７３で のアルギニンからリシンへのアミノ酸変化、位置２５９５でのアルギニンからヒ スチジンへのアミノ酸変化、位置２７７３でのグルタミン酸からリシンへのアミ ノ酸変化であった。これらの推定上のアミノ酸変化は、前記論文で、第Ｖ因子機 能に重大に作用しない保存的置換であると記述されている。クローンのうちの半 分（１４個のうち７個）は更に、位置２２９０でアデニンからグアニンへの置換 を示した。これは、ＥｃｏＲＩ部位を消滅させる別のサイレント置換であった。 これらの突然変異の中には、ＡＰＣ結合又は開裂に対する親和性の低下に関与し ているものはなかった。 Ｓｈｅｎらの論文には、第Ｖ因子ｍＲＮＡを、例えばポリメラーゼ連鎖反応を 生起させるのに十分な量で、ヒトリンパ球から回収できると記述されている。こ の情報に基づいて、当業者は、本発明の方法を実施するのに十分な量の核酸をヒ トから容易に回収できる。Ｓｈｅｎらの論文には、 ヒト第Ｖ因子核酸の核酸増幅に使用できるオリゴヌクレオチドが多数紹介されて いる。 Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎｎは（ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２３， １９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２３８）、第Ｖ及び第Ｖａ因子 の両方について、トロンビンによる第Ｖ因子の開裂が、Ｍ_r＝９４，０００のＨ 鎖（Ｄ鎖）及びＭ_r＝７４，０００のＬ鎖（Ｅ鎖）を形成させると記述している 。各鎖自体は、活性化プロテインＣ及び第Ｘａ因子によるタンパク質分解を受け 易い。活性化プロテインＣ又は第Ｘａ因子によるＥ鎖の開裂は、二つの主要フラ グメント、Ｍ_r＝３０，０００及びＭ_r＝４８，０００を与える。彼らはまた、活 性化プロテインＣ及び第Ｘａ因子がＥ鎖を同じ位置で開裂すると記述している。 Ｄ鎖の活性化プロテインＣ開裂では、二つの産生物Ｍ_r＝７０，０００及びＭ_r＝ ２４，０００が得られる。Ｍ_r＝７０，０００フラグメントは、無傷Ｄ鎖と同じ ＮＨ₂末端配列を有するが、Ｍ_r＝２４，０００フラグメントはそうではない。彼 らは、活性化プロテインＣによるＤ鎖の開裂が第Ｖａ因子の部分的不活化の原因 で あることを明らかにした。Ｌ鎖の開裂はより遅いため、第Ｖａ因子の不活化がそ のＨ鎖の開裂に関係があるという証拠は、Ｒｅｆ．１０、１２、１３、１４及び ４８にも示されている。 Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎｎは、第Ｖａ因子と第ＶＩＩＩａ因子との間に大 きな類似性があることも明らかにした。第ＶＩＩＩａ因子は、タンパ分解によっ て活性が調節される凝固カスケード（ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｃａｓｃａｄｅ）の別 の補因子である。第ＶＩＩＩａ及び第Ｖａ因子は多くの類似した構造的及び機能 的特性を有する。どちらもトロンビン又は第Ｘａ因子による開裂を介して大きな プロコファクターから産生され、どちらもほぼ同じ大きさを有し、Ｈ鎖とＬ鎖と からなる。どちらももタンパク分解複合体の活性に大きく寄与する一方で、それ 自体はタンパク分解活性を発揮しない。また、どちらもも活性化プロテインＣに より不活化される。この共通の特徴の根底には、一次構造の明らかな相同もある （Ｒｅｆ．２４，２５及び２６）。Ｏｄｅｇａａｒｄらはまた、第Ｖ因子と第Ｖ ＩＩＩ因子との間の更に大きな配列相同を同定した。彼らは特に、開裂が生起す る第Ｖ因子分子内の位置に十分妥当に対応する 第ＶＩＩＩ因子分子内の位置で、ウシ第Ｖ因子とヒト第ＶＩＩＩ因子との間に配 列相同セグメントが明らかに存在すると記述している。ヒト第Ｖ因子について（ 実施例１で）我々が明らかにした作用は、特定の面における第Ｖ因子と第ＶＩＩ Ｉ因子との同等性に起因して、第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子について も付随的に期待できる。Ｏｄｅｇａａｒｄ及びＭａｎｎは更に、ＡＰＣによる第 Ｖａ因子の開裂後にＨ鎖が残らない場合でも、残留補因子活性が残ると記述して いる。これは、第Ｖａ因子の不活化が、単一結合の単なる開裂より複雑な事象で あることを意味する。これは、第Ｖ因子分子のＡＰＣ結合及び／又は開裂部位の 突然変異が、実際にＡＰＣによる不活化に対する親和性を低下させるのに十分で あるという本明細書の実施例の説明を更に驚くべきものとするものである。第Ｖ ＩＩＩ因子の場合は、ＡＰＣ開裂部位はＡｒｇ ５６２、Ａｒｇ３３６及びＡｒ ｇ ７４０にあると想定され（Ｒｅｆ．４９）、ＡＰＣ結合部位は残基２００９ −２０１８上でＡ３ドメイン内に存在すると想定された（Ｒｅｆ．３５、３６） （表１も参照のこと）。 本発明の方法は、第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子又は第 ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子のＡＰＣ開裂及び／又は結合部位のう ちの一つ以上において、核酸もしくはタンパク質のいずれかのレベル又は両方の レベルで、一つ以上の突然変異を検出するために適用される。特に、タンパク質 のＨ鎖上、又はＨ鎖をコードする核酸上に位置するＡＰＣ結合及び／又は開裂部 位が関連部位とみなされる。 Ｋａｌａｆａｔｉｓらは（Ｂｌｏｏｄ ８２，Ｓｕｐｐｌ．１，ｐ．５８Ａ， １９９３）、膜結合ヒト第Ｖａ因子が、Ａｒｇ ５０６及びＡｒｇ ３０６での Ｈ鎖の開裂後に、活性化プロテインＣによって不活化されることを明らかにした 。彼らは、ヒト第Ｖａ因子のＨ鎖の開裂パターンが、ＰＣＰＳ小胞の存在又は不 在に依存すると記述している。膜表面の不在下、又はＰＣのみからなるリン脂質 小胞の存在下では、開裂の結果として、残基１−５０６からなるフラグメントと 残基５０７で始まるフラグメントとが得られ、後者のフラグメントはＣＯＯＨ末 端でＡＰＣにより更に開裂される。これと対照的に、ＰＣＰＳ小胞の存在下では 、活性の完全な喪失は、Ｍ_r＝７５，０００フラグメントの開裂、並びにＭ_r＝４ ０，０００及びＭ_r＝３０，０００フラグメントの出現に関係している。Ｍ_r＝３ ０，０ ００フラグメントは残基３０７〜５０６に対応する。これは、Ａｒｇ ３０６で のＡＰＣによる開裂を示すものである。ＡＰＣと共にインキュベートした後は、 ＰＣＰＳ小胞の存在下でも不在下でも、補因子のＬ鎖の開裂は観察されない。こ のようにして、補因子がＰＣＰＳに結合した時に特定のＡＰＣ開裂部位が明らか にされる。膜の存在は、ＡＰＣによるヒト第Ｖａ因子の完全不活化にとって必須 であり、Ａｒｇ ５０６での開裂は補因子を部分的に不活化するだけであり、Ａ ｒｇ ３０６での開裂はアニオン脂質依存性であって、ヒト第Ｖａ因子の完全不 活化に必要とされる。ＡＰＣによるウシ第Ｖａ因子の不活化に関しても類似のデ ータが最近発表された（Ｒｅｆ．４８）。このように、当業界の現状から、ヒト 第Ｖａ因子にはＡＰＣによる潜在的開裂部位が少なくとも二つ存在することが明 らかである。Ｋａｌａｆａｔｉｓらは更に、ヒト第Ｖ因子のリシン９９４に別の ＡＰＣ開裂部位を検出した（Ｒｅｆ．５２）。従って、本発明の方法は、核酸も しくはタンパク質のレベルで、又はこれら両方のレベルで、第Ｖ及び／又は第Ｖ ａ因子内のこれらのＡＰＣ開裂部位のうちの一つ以上における突然変異を検出す るために適用される。ＡＰＣ開裂部位は、Ｈ 鎖上のＡｒｇ ５０６及びＡｒｇ ３０６に位置する。アミノ酸Ａｒｇ ６７９ 及びＬｙｓ ９９４にも別の部位が存在することが判明した。 以上の説明に鑑みて、本発明の方法、即ち血栓症及び／又は活性化プロテイン Ｃ（ＡＰＣ）に対する弱い抗凝血応答に関連した遺伝性欠陥、即ち患者の血栓症 発生の危険が高いことを示すか又は実際に血栓症を発生させる遺伝性欠陥の存在 をスクリーニングする方法であって、それ自体公知の方法で、第Ｖ因子をコード する核酸物質の突然変異、即ち核酸物質の発現時に前記第Ｖ因子及び／又は第Ｖ ａ因子のＡＰＣによる不活化の度合いの低下に関与する突然変異の存在を調べる ことからなる本発明の方法は、第Ｖ因子がＸａで活性化した第Ｖ因子に由来する ものである場合に特に有利である。 本発明の方法は特に、血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５０６に対応する位置に変 化したアミノ酸を含む突然変異アミノ酸配列を有するヒト第Ｖ又は第Ｖａ因子を コードする核酸配列内の突然変異を検出するために適用される（Ｒｅｆ．２１） 。特に、前記突然変異が、アミノ酸アルギニンを血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５ ０６でアミノ酸グルタミンに より置換させた突然変異である場合に適用される。特に、アミノ酸５０６に対応 するアミノ酸のコドンの第二ヌクレオチド、ヌクレオチドＧが突然変異を起こし た場合がこれに相当する。ヌクレオチドＧが、血漿因子Ｖの配列のアミノ酸５０ ６に対応するアミノ酸のコドンの第二ヌクレオチドに対応する位置でＡに突然変 異した場合が特にそうである。 実施例で明らかにされるように、本発明は、被験者が第Ｖ因子及び／又は第Ｖ ａ因子又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子における突然変異に対し て同型であるか又は異型であるかを調べる方法にも関する。この方法は、ＡＰＣ に対する抗凝血応答に欠陥が存在するかどうかを調べるそれ自体公知の方法を実 施し、次いで、欠陥の診断に有用であることが知られているパラメーターの値、 例えば（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）／（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）の値を算出し、得られた値 を、正常な個体又は同型もしくは異型であることがわかっている個体に由来する 試料について同じ方法で得た値と比較し、それによって被験者がＡＰＣに対する 抗凝血応答の欠陥に関して同型であるか又は異型であるかを確認することからな り、特に実施例１に記載の具体例、 並びに、最も特定的にはＡＰＣ結合及び／開裂部位の突然変異に起因してＡＰＣ に対する抗凝血応答を変化させる第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩ Ｉａ因子の別の突然変異に関する任意の同等の具体例では、第Ｖ因子及び／又は 第Ｖａ因子、又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩａ因子における突然変異 の存在及び任意にその種類を決定するための任意の公知の方法と組合わせて使用 される。 本発明の方法は、核酸標的増幅反応の実施により突然変異を検出することによ って達成できる。このような標的増幅反応は当業者によく知られている。突然変 異が存在し得る特定長さの核酸の５’及び３’末端に隣接する種々の長さの核酸 を認識しこれにハイブリダイズする特異的プライマーを一つ以上使用する必要が ある。前記ハイブリダイゼーションは、突然変異が存在し得る特定長さの核酸の 増幅に十分な程度まで実施される。要求されるハイブリダイゼーションのストリ ンジェンシーも、核酸標的増幅の当業者にはよく知られている。当業界で一般的 に行われている標的増幅反応は多数あり、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ ｄ Ｓｅｑｅｎｃｅ Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃ ａｔｉｏｎ、核酸配列ベースの増幅）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣ Ｒ（リガーゼ連鎖反応）及びＰＣＲ（Ｒｅｐａｉｒ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ ｏｎ）修復連鎖反応）が挙げられる。ＰＣＲ標的増幅方法の場合は、市販のＡｍ ｐｌｉｃｏｒ（登録商標）反応キットを使用し得る。突然変異が存在し得る特定 長さの核酸を認識しこれにハイブリダイズするのに十分な特異性を有するプライ マーを使用することも可能である。別の増幅方法は、Ｃｈｉｒｏｎによって商業 的に開発されたような分枝鎖増幅からなり、この場合は標的ではなくプローブが 増幅される。 核酸の増幅後は、突然変異の存在及び任意に種類を検出するためのそれ自体公 知の方法による増幅核酸分析を本発明の方法で実施する。 核酸物質を増幅せずに突然変異を決定することも可能である。核酸上の突然変 異の存在を調べるために標的増幅反応が開発される前に使用されていた当業者に 公知の方法は多数存在し、これらの方法は総て本発明の方法の種々の具体例で使 用できる。例えば、正常〜ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件、例 えばブロッティング方法を使用し、次いで単離した核酸の分析をそれ自体公知の 方法 で実施して突然変異の存在及び任意に種類を検出する場合には、分析すべき因子 をコードする核酸配列の少なくとも一部分にハイブリダイズするのに十分な特異 性を有する少なくとも一つの核酸配列に対するハイブリダイゼーション反応によ って、決定すべき突然変異を検出することができる。 突然変異の存在及び任意に種類の検出は、このようにして単離した核酸を例え ばサンガー配列反応を用いて配列分析にかけ、それによって核酸配列を確認し、 次いでこの配列決定の結果を非突然変異因子の既知の配列と比較することにより 実施できる。単離した核酸配列を更に別のハイブリダイゼーション検査にかける ことも可能である。この別のハイブリダイゼーション検査は、突然変異の存在及 び任意に種類を検出するために、突然変異を含む核酸物質のフラグメントに少な くともハイブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を有する対応する相補配列 を含む、適当な長さの核酸配列を用いて実施する。最初のハイブリダイゼーショ ンステップは、因子が突然変異を起こしているか否かに関係なく、因子をコード する核酸を単離するだけであり、第二のハイブリダイゼーションステップは、単 離核酸物質 上の突然変異の存在の有無を決定するために、確認したいと思う実際の突然変異 核酸配列の相補配列に、単離した配列を実際にハイブリダイズさせることからな る。この後者のハイブリダイゼーション反応は、信頼できる結果を得るためにス トリンジェント条件下で実施する必要があり、その他のハイブリダイゼーション ステップは、正常〜ストリンジェント条件下で実施し得る。以上、特定核酸上の 突然変異の存在を調べるための従来の方法を二つ説明したが、当業者には明らか なように、多くの公知の方法が使用可能である。分子生物学に関する種々の標準 的文献には、この種の方法が広く記述されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９）参照。 本発明のスクリーニング方法で得た増幅核酸物質は、その後、配列決定反応を 用いるか、又は増幅反応にかけられなかった単離核酸物質の分析について前述し たように、突 然変異の存在及び任意に種類を検出するために突然変異を含む核酸物質のフラグ メントに少なくともハイブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を有する対応 する相補配列へのハイブリダイゼーションを用いる分析検査を使用することによ って分析することも可能である。 特に、第Ｖ因子の突然変異の存在を分析する場合は、単離した及び／又は増幅 した核酸物質を、配列表の配列番号１２及び１３の配列から選択した適当な長さ の核酸物質に対するハイブリダイゼーション検査にかけ得る。例えば、ハイブリ ダイゼーションに極めて適しているプライマー又は核酸配列は、ヒト第Ｖ因子を コードする核酸配列のイントロン１０の少なくとも一部分、又はストリンジェン ト条件下でイントロン１０の前記部分にハイブリダイズすることができる誘導体 を含む。このような誘導体は、イントロン１０の対応する部分に対して９０％以 上の相同を有するのが好ましい。ヒト第Ｖ因子の核酸配列は既知であり、ヒト第 Ｖ因子をコードする核酸配列は配列表の配列番号１に示されている。該配列はＲ ｅｆ．２１から誘導される。イントロン１０の少なくとも一部分を含むハイブリ ダイゼーション用核酸配列を使用すれば、第Ｖ因子をコードする核 酸内に存在する突然変異、特にＡＰＣ結合及び／又は開裂部位をコードする核酸 の突然変異を単離し及び／又は増幅し及び／又はその後検出することがかなり簡 単になる。これは、Ｈ鎖上に位置する突然変異を検出するのに特に適している（ 配列番号１０、１４参照）。また、ハイブリダイゼーション及び／又は増幅用の 核酸配列のプライマーは、配列表の配列番号２〜１１の配列から選択できる。前 述のように、当業界では他の多くのオリゴヌクレオチドプライマーが知られてい る。これらのプライマーは、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子をコードする核酸を単離 するために、増幅の目的又はハイブリダイゼーション反応に使用することも可能 である。正常因子をコードする配列は突然変異因子の配列と同様に既知であるた め、当業者は、本発明の方法でスクリーニングする突然変異の単離及び／又は増 幅及び／又は存在及び種類の決定に最も適したオリゴヌクレオチド配列を選択す ることができる。 本発明の方法では、特に分析すべき核酸を標的増幅にかけた場合には、単離し た及び／又は増幅した及び／又はハイブリダイズした核酸物質を配列分析にかけ 、次いで配列を対応する非突然変異因子の核酸配列と比較する。増幅又 は単離した及び／又はハイブリダイズした核酸物質を、制限フラグメント分析に よって分析することも可能である。特に、突然変異を起こした第Ｖ因子に関する 実施例で説明する突然変異の場合には、使用できる酵素はＭｎｌ Ｉである。制 限フラグメント分析に使用できる制限酵素は当然、検出すべき突然変異の種類と その位置とに依存する。当業者は、別の新しいステップを用いずに、過度の負担 がかからないルーチンの実験だけで、前記酵素を選択できる。 前述のように、本発明の方法は、タンパク質をコードする核酸配列ではなくタ ンパク質を分析することによって実施することもできる。これは特に、タンパク 質の突然変異が、第Ｖもしくは第Ｖａ因子上にＡＰＣ結合及び／又は開裂部位を 与えるアミノ酸配列部分内に存在し、ＡＰＣによってあまり不活化されない第Ｖ 因子及び／又は第Ｖａ因子の形成を引き起こすか、又は第ＶＩＩＩもしくは第Ｖ ＩＩＩａ因子上にＡＰＣ結合及び／又は開裂部位を与える核酸配列部分内に存在 し、ＡＰＣによってあまり不活化されない第ＶＩＩＩ因子及び／又は第ＶＩＩＩ ａ因子の形成を引き起こす場合の、本発明の有用な具体例である。 前述のように、第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ又は第ＶＩＩ Ｉａ因子上にＡＰＣ開裂部位を与えるアミノ酸配列部分内の突然変異の存在は、 ＡＰＣによる不活化に対する突然変異因子の耐性を明らかに変える突然変異であ り、従ってこのような突然変異の検出は本発明の方法の好ましい具体例である。 当業界で既に明らかにされているように、第Ｖａ又は第ＶＩＩＩａ因子の不活化 は通常、ＡＰＣが因子のＨ鎖を開裂した時にその結果として生起する。従って、 突然変異因子の開裂度を変えることになるような開裂部位における突然変異の検 出は、本発明の好ましい具体例である。タンパク質を突然変異に関して分析する 時は、開裂部位自体の一次アミノ酸配列が関係するだけでなく、タンパク質の三 次構造も、結合及び／又は開裂部位と直接関係のない一次配列のどこかの突然変 異に起因して変形し得る。周知のように、タンパク質の実際の結合部位又は開裂 部位から遠く離れて位置する突然変異は、タンパク質の三次構造に大きく作用し 得、それによって、前記タンパク質への結合、この場合はＡＰＣによる結合を抹 消又は低下させ得る。従って、本発明の方法は、ＡＰＣによる開裂及び／又は結 合部位の一次核酸配列における突然変異の検出だけでなく、ＡＰＣによる因子の 結合及び／又は開裂を低下させる変化し た三次構造を有する突然変異因子の発生を引き起こす突然変異の検出にも適用さ れる。 第Ｖ及び第ＶＩＩＩ因子は互いに異なるメカニズムで活性化でき、その結果得 られる因子はどちらもその由来源である因子とは異なる三次構造を有することが 知られているため、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子の突然変異が前記分子のＡＰＣ 結合及び／又は開裂部位には影響し得ず、活性化因子のそれに影響し得ることは 明らかであり、その逆も明らかである。それにもかかわらず、活性化第Ｖ又は第 ＶＩＩＩ因子の結合及び／又は開裂の変化に関与する一次アミノ酸配列の突然変 異は、第Ｖ又は第ＶＩＩＩ因子上にも存在する。特異的抗体の使用によって突然 変異タンパク質の検出を行う場合は、突然変異の存在及び任意に種類を検出する ために、突然変異を含む活性化因子に対して特異的な抗体を使用することが可能 である。あるいは、分析すべきタンパク質をタンパク分解によって開裂し、それ によって、第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子又は第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因 子の一次アミノ酸配列における突然変異に対して特異的な抗体の使用を可能にす る線状又は部分的線状構造を得ることも可能である。従って、該突然変異検出方 法 は活性化因子の分析に限定する必要はなく、実際、まだ活性化されていない第Ｖ 因子又は第ＶＩＩＩ因子についても実施できる。 突然変異がＡＰＣ結合及び／又は開裂部位に存在する時は、第Ｖ、第Ｖａ、第 ＶＩＩＩ、第ＶＩＩＩａ因子をＡＰＣで処理し、次いでフラグメントを公知の方 法で分析すれば、因子が正常な場合とは異なるフラグメントが明らかにされる筈 である。 例えば、第Ｖ因子の場合は、アミノ酸５０６の突然変異がその位置でのＡＰＣ の開裂及び／又は結合を阻止する。従って、活性化ＡＰＣでの処理の結果、部位 ３０６、６７９及び９９４で開裂が生起し、一つのフラグメントａａ３０７−ａ ａ６７９と、配列１−３０６、６８０−９９４及び９９５−末端を含む三つの別 のフラグメントとが得られる。所期のフラグメントは３０７−６７９である。正 常第Ｖ因子はこのフラグメントを含まず、ａａ５０６の活性開裂部位に起因して 、別の二つのフラグメント、即ちａａ３０７−５０６及びａａ５０７−６７９を 含む。従って、ａａ３０７−ａａ６７９の検出は、アミノ酸５０６における突然 変異ＡＰＣ部位の存在を示す。 極めてエレガントな検査は、第Ｖ因子をＡＰＣ処理後に二つの抗体の存在にか ける操作を含み得る。このようなＡＰＣ処理は血清の調製中に自然に生起する。 この検査では一方の抗体がアミノ酸５０６の上流のタンパク質の部位に対して特 異的であり、前記部位が、ａａ５０６の上流の最も隣接した開裂部位、ａａ３０ ６の下流に位置する。もう一方の抗体は、アミノ酸５０６の下流のタンパク質の 部位に対して特異的であり、前記部位は、ａａ５０６の下流の最も隣接したＡＰ Ｃ開裂部位、ａａ６７９の上流に位置する。該検査は、両方の抗体によって検出 されるフラグメントの検出を含む。この種の検査はサンドイッチ・イムノアッセ イであり得る。好ましくは、一方の抗体を固定するか又は固定し得、他方の抗体 に、イムノアッセイの当業者に公知の方法で検出可能マーカーを具備する。この 種の検査における、フラグメント３０７−５０６の一部分を特異的に認識する抗 体の使用は、本発明の範囲内に含まれる。フラグメント５０７−６７９の一部分 を特異的に認識する抗体自体、及び前述のような検査における該抗体の使用も、 本発明の範囲に含まれる。抗体はモノクローナル抗体が好ましい。一方の抗体が フラグメント１−３０６の一部分に対 して特異的であり、他方の抗体がフラグメント３０７−５０６の一部分に対して 特異的である二つの抗体を用いて、類似の方法で、Ａｒｇ３０６に位置するＡＰ Ｃ開裂部位の突然変異を検出するために適当な検査を実施し得る。この種の検査 における、フラグメント３０７−５０６の一部分を特異的に認識する抗体の使用 は、本発明の範囲に含まれる。フラグメント１−３０６の一部分を特異的に認識 する抗体自体、及び前述のような検査における該抗体の使用も本発明の範囲に含 まれる。アミノ酸６７９に位置するＡＰＣ開裂部位の突然変異の検出にも、前述 と類似の方法で検査を実施し得る。この突然変異の場合は、フラグメント５０７ −６７９の一部分に対して特異的な抗体が一つ必要とされると共に、アミノ酸６ ８０の下流のフラグメントの一部分に対して特異的な抗体が一つ必要とされる。 この種の検査における、フラグメント５０７−６７９の一部分を特異的に認識す る抗体の使用は、本発明の範囲に含まれる。フラグメント５０７−５６９の一部 分を特異的に認識する抗体及びフラグメント５７０−９９４の一部分を特異的に 認識する抗体、並びに前記と類似の検査におけるこれらの抗体のうちの一つ以上 の使用も、本発明の範囲に含まれる。 リシン９９４のＡＰＣ開裂部位における突然変異を検出するための検査も同様に 説明し得る。フラグメント９９４−末端及び６８０−９９４は関連フラグメント であり、これらのフラグメントを認識することができる抗体も関連がある。 一般的には、第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ又は第ＶＩＩＩａ因子の突然変異に関 する検査は、それ自体公知の方法によるイムノアッセイで二つの抗体を使用して 、特定のＡＰＣ開裂部位でのＡＰＣによる開裂を低下又は阻止する突然変異の存 在又は不在を検出することからなり得る。この場合、一方の抗体は前記ＡＰＣ開 裂部位の上流のフラグメントを認識し、もう一方の抗体は前記ＡＰＣ開裂部位の 下流のフラグメントを認識し、いずれかの抗体が認識する因子の部分と、突然変 異の存在又は不在の決定が行われるべき特定のＡＰＣ開裂部位との間に別のＡＰ Ｃ開裂部位は存在しない。この突然変異検出原理に基づく種々の具体例は、イム ノアッセイの当業者には明らかであろう。例えば、更に別の一つ以上のプロテア ーゼをＡＰＣと組合わせて使用し得ることは明らかであろう。前記ＡＰＣは、使 用する試料の種類に応じて、試料に加えるべきもの、又は試料中に 既に存在しているものである。前述の更に別の一つ以上のプロテアーゼは、因子 上の検出すべき活性ＡＰＣ開裂部位が存在しない場合には、不活性ＡＰＣ開裂部 位を含むタンパク分解フラグメントに両抗体が結合することになり、検出すべき 活性ＡＰＣ開裂部位が存在する場合には、どちらの抗体もタンパク分解フラグメ ントに結合できないようにタンパク分解フラグメントが形成されることになる。 これは、分析すべきＡＰＣ開裂部位の上流及び下流で因子の開裂を引き起こす一 つ以上のプロテアーゼを選択することにより最も簡単に達成できる。二つの抗体 のうちの一方は、決定すべきＡＰＣ開裂部位の上流、且つＡＰＣ開裂部位の上流 でプロテアーゼが開裂する位置の下流のフラグメントの一部分を認識し、二つの 抗体のうちのもう一方は、決定すべきＡＰＣ開裂部位の下流、且つＡＰＣ開裂部 位の下流でプロテアーゼが開裂する位置の上流のフラグメントの一部分を認識し 、前記一つ以上のプロテアーゼは、その開裂部位が、決定すべきＡＰＣ開裂部位 と、非突然変異因子上に存在するような隣接ＡＰＣ開裂部位との間に位置するよ うに、因子を開裂する。更に別の具体例では、突然変異ＡＰＣ開裂部位の開裂を 行うことはできるが非突然変異ＡＰ Ｃ開裂部位の開裂を行うことはできない、又はその逆のプロテアーゼを、ＡＰＣ の代わりに使用し得る。決定すべき突然変異の種類が確認されれば、当業者は、 適当なプロテアーゼに関して、プロテアーゼについて知られている認識部位をス クリーニングするためのルーチンの実験を行いさえすればよい。 突然変異の検出の別の可能性は、もっと以前から使用されているアミノ酸配列 分析技術にある。非突然変異因子のアミノ酸配列がわかれば、分析すべき因子の アミノ酸配列を決定して、その配列を対応する非突然変異因子の既知の配列と比 較することは比較的簡単である。しかしながら、突然変異の存在についてタンパ ク質を分析するための簡単で効果的な方法は、抗体の使用、例えばＥＬＩＳＡも しくはＲＩＡ、又は当業者に公知の他の種々の免疫学的検査の使用である。 第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子の活性化形態が、ある特定のメカニズムによって 活性化されたものである場合には、ＡＰＣ結合及び／又は開裂の低下のみを示す ことも可能である。これは、第Ｖ因子に関して実施例１で明らかにする。実施例 １では、トロンビンを用いて活性化した活性化形態 がＡＰＣの結合及び／又は開裂能力の変化を示さないのに対し、第Ｘａ因子で活 性化した活性化形態はＡＰＣによる結合及び／又は開裂の低下を示す。しかしな がら、前述のように、突然変異の影響が活性化形態のうちの一つで生起するだけ であるかどうかに関係なく、第Ｖ因子、トロンビンで活性化した第Ｖａ因子、又 はＸａで活性化した第Ｖａ因子のいずれかに突然変異の存在を検出することは、 もちろん可能である。 実施例１で説明するように、原因不明の血栓発現傾向を示す患者の大部分に代 表的に見られる、第Ｖ因子の特異的突然変異が検出された。これは、血漿因子Ｖ のアミノ酸配列のアミノ酸５０６に対応する位置のアミノ酸の突然変異であった （Ｒｅｆ．２１に開示）。従って、アミノ酸５０６の突然変異を決定することが できる方法は、本発明の好ましい具体例を構成する。一般的に、検出すべき突然 変異が、特に第Ｖ（ａ）因子及び／又は第ＶＩＩＩ（ａ）因子のＨ鎖上で、ＡＰ Ｃ開裂部位に位置するアルギニンアミノ酸の変化を含む場合の方法は、適切に実 施し得る本発明の方法の具体例である。 突然変異を検出するためには、突然変異タンパク質第Ｖ 因子及び／又は第Ｖａ因子に結合することができるか、又は突然変異タンパク質 第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子の線状タンパク分解フラグメントに結合すること ができる特異的抗体を使用し得る。前記抗体は、非突然変異タンパク質又は非突 然変異タンパク質の対応するタンパク分解フラグメントに対する結合親和性が低 い。抗体を用いて行う方法は、タンパク質第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因 子、並びに前記突然変異タンパク質第ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子の線 状タンパク分解フラグメントにも使用し得る。 別の方法として、タンパク質第Ｖ及び／又は第Ｖａ因子、又はタンパク質の第 ＶＩＩＩ及び／又は第ＶＩＩＩａ因子に結合することができる抗体を使用するこ とも可能である。前記タンパク質はＡＰＣによる不活化の度合いの低下を示さず 、前記抗体は、ＡＰＣによる不活化の度合いの低下を示す突然変異タンパク質を 産生させる突然変異を含む、対応する因子及び／又は該因子のタンパク分解フラ グメントに対する結合親和性が低い。この場合は、単離タンパク質又はタンパク 分解フラグメントに対する抗体の非結合が突然変異の存在を示すことになるよう なテストを開発し得る。 本発明は、前述のような抗体を使用して実施する方法に関するだけでなく、抗体 自体にも関する。 本発明の方法では、最初に、正常血漿標準と比較したＡＰＣ添加時の凝固時間 の変化について試料をスクリーニングし、次いで、試料が示すＡＰＣ耐性が標準 と比べて変化していると診断された場合には、第Ｖ因子又は第ＶＩＩＩ因子をコ ードする核酸配列の分析、及び／又は第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩもしくは第ＶＩ ＩＩａ因子のアミノ酸配列の分析、及び／又は第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩもしく は第ＶＩＩＩａ因子自体の分析を行う。試料を、特異的突然変異の存在に関する 分析、例えば後述の実施例で説明する第Ｖ因子の突然変異に関する分析に直接か けることも可能である。使用する方法は、事例の状況と、検査の対象とに依存す る。例えば、大きな集団をスクリーニングする場合は、コストが最も低い方法を 使用するのが好ましい。検出すべき突然変異が抗体を用いて決定するのが困難な 時もあり、その場合は好ましくは核酸配列又は制限フラグメント分析を使用し得 る。また、制限フラグメント検査に使用すべき酵素が廉価であればこのような検 査の実施は極めて簡単であり、実施コストが低く、明らかに適したものと言える 。 従って本発明は、試料が、正常第Ｖ因子及び／又は第ＶＩＩＩ因子及び／又は第 ＶＩＩＩａ因子及び／又は第Ｖａ因子を含む試料と比べて、ＡＰＣによる結合及 び／又は開裂の変化を示すかどうかを決定し、次いで前述の方法で前記変化を引 き起こす突然変異を更に分析する検査の使用にも関する。 本発明の別の目的は、被験者の同型又は異型である第Ｖ、第Ｖａ、第ＶＩＩＩ 又は第ＶＩＩＩａ因子の突然変異を検出することにある。これは、Ｋｏｓｔｅｒ らによりＬａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４に記述されてい るような、被験者がＡＰＣ耐性を示すかどうかを調べるための検査プロトコルを 用いて実施し得る。基本的には、Ｋｏｓｔｅｒは、３３ｍＭ ＣａＣｌ₂と２５ ｍＭトリス（ｐＨ７．５）と５０ｍＭ ＮａＣｌと０．０５％オボアルブミンと を含む試薬（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）５０μｌ、又は２．０ｐｇ／ｍｌのヒトＡＰＣ 及び０．６％グリセロールも含む前記試薬（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）５０μｌで凝血 塊の形成を開始させる前に、５０μｌのＡＰＴＴ試薬（Ｃｅｐｈｏｔｅｓｔ（登 録商標）、バッチ１０３０２９）と共に３７℃で３６０秒間インキュベートした ５０μｌの非 希釈血漿の使用について記述している。彼はその結果を、ＡＰＴＴ（＋ＡＰＣ） 及びＡＰＴＴ（−ＡＰＣ）の比であると定義されるＡＰＣ感度比（ＡＰＣ ｓｅ ｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｒａｔｉｏ）（ＡＰＣ−ＳＲ）として表した。これらの条 件下では、正常血漿のＡＰＣ−ＳＲが示される。プロトロンビン及び／又は第Ｘ 因子の濃度が減少すると（＜０．５Ｕ／ｍｌ）、ＡＰＣ−ＳＲは増加する。従っ てこの方法は、経口抗凝血剤で治療している患者の評価には使用できない。Ｋｏ ｓｔｅｒは更に、このテストによって、彼が得た結果と、前文で述べたＣｈｒｏ ｍｏｇｅｎｉｘアッセイを使用して得られた結果との間に、良好な相関（Ｐｅａ ｒｓｏｎ相関係数０．５４）が存在することが判明したと記述している。驚くべ きことに、我々は、Ｋｏｓｔｅｒテストが、被験者が第Ｖ因子の突然変異につい て同型であるか又は異型であるかを調べるために適用した場合には、異型のほぼ 半分を検出できないＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストより遥かに良く異常を検出す ることを発見した。第１４図はＫｏｓｔｅｒテスト、第１１図はＣｈｒｏｍｏｇ ｅｎｉｘテストを示している。我々は、Ｋｏｓｔｅｒの方法及び市販のＣｈｒｏ ｍｏｇｅｎｉｘテストを用いて、１６ ９１ ＧＧ（正常）又は１６９１ ＡＧ（異型）であると遺伝子型決定された（ ｇｅｎｏｔｙｐｅｄ）個体の無作為抽出試料の検査を２回実施した。Ｃｈｒｏｍ ｏｇｅｎｉｘテストでは、正常被験者及び異型被験者で得られた感度比の間に大 きな重複が存在しており、そのため異型の５０％以上がＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ テストではＡＰＣ耐性であると同定できなかった。そこで我々は、被験者が、Ａ ＰＣ耐性を引き起こす第Ｖ因子突然変異に関して異常であるか又は正常であるか を決定するのに適した別のテストを発見した。Ｋｏｓｔｅｒテストは従来、被験 者がＡＰＣ耐性一般について正常であるか又は異常であるかを決定するのに有用 であると見なされていただけであるが、我々は、該テストが実際には、ＡＰＣ耐 性につながる第Ｖ因子突然変異を検出し、それもＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテスト より遥かに大きい信頼度で検出することを発見した。われわれのテストでは０． ８４以下の値が異常であり、正常被験者と同型被験者との間に重複は生じない。 これは、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストと比べて大きな改善である。我々はこの 改善が、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストの場合と異なる活性化剤の使用、そして より重要なことに、異なるカルシウ ム濃度の使用に起因すると考える。この改善されたテストでは、２５ｍＭ Ｃａ Ｃｌ₂以上の試料中カルシウム濃度を適用する。好ましくは、４５ｍＭ以下、よ り好ましくは３０〜４０ｍＭ、特に３１〜３５ｍＭとする。このより高い濃度は おそらく、試料中のクエン酸塩をＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ配合の場合より十分に 中和する。別の改良点は、Ｃｅｐｈｏｔｅｓｔ試薬を活性化剤として使用するこ とにある。この方法はまたＣｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘテストと類似しており、該テ ストをかなり改善したものとみなすべきものである。ＡＰＣ感度比について得ら れた値を正規化した場合は（実施例１参照）、特に第Ｖ因子突然変異に関して、 ０．８４未満の値がＡＰＣ耐性に関して異常であることを表し、０．８４を超え る値がＡＰＣ耐性に関して正常であることを表す。同型決定の場合は、０．５０ 未満の値が記録されなければならない。異型は０．５０〜０．７０の値を示す。 しかしながら、この改善された方法は、抗凝血剤で治療した患者には適用できな い。 この実施例では、検出された突然変異が、第Ｖ因子のアミノ酸５０６のコドン におけるＧ→Ａ突然変異であった。突然変異の発生頻度及びこれに関連した血栓 症発生の危険 度の高さは、被験者が同型であるか又は異型であるかの決定が、親から子孫への 突然変異因子の遺伝に関する危険性を評価する時に大きな問題となることを意味 する。実施例２で、我々は、第Ｖ因子における突然変異の存在、特にＧ→Ａ突然 変異が、実際に、血栓症を発生させる危険因子であることを説明する。また、初 めて心筋梗塞にかかった患者の６％が１６９１ Ｇ−Ａ突然変異のキャリヤーで あるという先に観察された事実は、この突然変異が動脈血栓症の弱い危険因子（ 相対危険度１．５〜２．０）であることを意味し得る。心臓発作の危険の増加が 適時に検出されれば、被験者は生活様式を調整し、このような発作を防ぐように 注意することができる。静脈血栓症に関して重要なことは、前文で既に説明した 。 本発明は、ここで説明する全ての具体例で本発明の方法を実施するのに必要な 要素を含むキットにも関する。これには例えば、前述の特異的抗体のうちの一つ 以上、特にＡＰＣ開裂及び／又は結合部位を認識する前述の抗体対を含み、及び ／又は前述のような標的増幅反応及び／又はハイブリダイゼーション反応のため の一つ以上のプローブ又はプライマーもしくはプライマー対を含む検査キットが 含ま れる。本発明は特定的には、第Ｖ因子及び／又は第Ｖａ因子のアミノ酸５０６を コードする核酸配列の突然変異を含む核酸配列を増幅するための一つ以上のプラ イマーを含むキットに関する。このキットは、一つの特定の突然変異又は複数の 突然変異を検出するためのプライマー及び／又は抗体を含み得る。該キットは、 好ましくは、特定集団に多く見られるＡＰＣによる結合及び／又は開裂の低下及 び／又は抹消を引き起こす主要突然変異の検出に必要な構成要素を含む。実施例１ 血栓症を有する無作為抽出した一連の患者の２１％（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３ 年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｋｏｓｔｅｒら ）、及び個人的に又は家族に血栓症の病歴がある選択した患者の約５０％（Ｒｅ ｆ．８及びＢｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１日）：ｐ ｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇｒｉｆｆｉｎら）の血漿中で、ＡＰＣに対 する弱い抗凝血結応答（「ＡＰＣ耐性」（Ｒｅｆ．２））が最近発見された。我 々はこの実施例で、ＡＰＣ耐性の表現型が、ＡＰＣによる不活化に対して耐性で ある第Ｖ因子分子 −ＦＶ（Ｑ５０６）又はＦＶ Ｌｅｉｄｅｎ−の合成を予告する第Ｖ因子遺伝子 の単一点突然変異（１６９１，Ｇ→Ａ）に関する異型性又は同型性に関連してい ることを明らかにする。オランダ集団における突然変異の対立遺伝子頻度は約２ ％であり、血栓症の全ての既知の遺伝性危険因子（プロテインＣ−（ｒｅｆ．１ ７）、プロテインＳ−（Ｒｅｆ．３０）、アンチトロンビンＩＩＩ（Ｒｅｆ．３ １）欠失）の頻度の合計の１０倍以上に達する（Ｒｅｆ．３２）。 明らかに健康な個体の５％がＡＰＣに対して弱い抗凝血応答を示し、このＡＰ Ｃ耐性が深静脈血栓症発生危険度の７倍の増加（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２ 月１８日，Ｖｏｌ．３４２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら） に関係しているという我々の発見に促されて、我々はこの表現型の分子的基礎を 調べた。 ＡＰＣに対する血漿の応答度は、二つのＡＰＴＴ、即ちＡＰＣの存在下で測定 したＡＰＴＴ、及びＡＰＣの不在下で測定したＡＰＴＴの比として測定される（ Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，ｐｐ．１５０３−１ ５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ． ８２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１日）；ｐｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ ．Ｇｒｉｆｆｉｎら、及びＲｅｆ．２）。標準化のために、前記比（ＡＰＣ感度 比又はＡＰＣ−ＳＲ）を、基準血漿について得られた比（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ）に 合わせて正規化する。ＡＰＣ耐性はｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４（外れ値を除外 した後の健康対照１００の平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲから１．９６ＳＤを差し引いた 値）によって定義される。 １４人の関係の無いＡＰＣ耐性患者の親の分析の結果、同型及び異型をｎ−Ａ ＰＣ−ＳＲに基づいて同定できるＡＰＣ耐性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（Ｒｅ ｆ．２））の家族的形態の概念が得られた（第１図の説明文参照）。混合実験に より、この概念の別の裏付けが得られた（第１図）。即ち、１倍容の正常血漿を 、同型ＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．３８）であると分類され た患者の血漿１倍容に加えると、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲが０．５７になった。これは 、前記欠失に関して異型であると分類された患者の血漿中で発見された比（平均 ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ０．５８）と同じである。同型ＡＰＣ補因子ＩＩ欠失（平均ｎ −ＡＰＣ−ＳＲ ０．４０）であると分類された４人 の関係の無い患者の血漿を混合しても前記比は修正されなかった。これは、４人 の患者全員が同じ血漿タンパク質を欠失又は欠乏していることを意味する（Ｒｅ ｆ．２及びＢｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．８２，Ｎｏ．７（１９９３年１０月１日）：ｐ ｐ．１９８９−１９９３，Ｊ．Ｈ．Ｇｒｉｆｆｉｎら参照）。 ＡＰＣ補因子ＩＩ活性が既知の凝血タンパク質のうちの一つの機能的特徴であ る可能性を調べるために、ＡＰＣ補因子ＩＩレベルを、単一タンパク質が欠乏し ている一連の血漿中で測定した（第２図）。これらの血漿はいずれも、第Ｖ因子 欠乏血漿（＜５％）を除いて、正常なＡＰＣ補因子ＩＩレベル（６０〜１５５％ ）を有していた。第Ｖ因子欠乏血漿に種々の量の単離ヒト第Ｖ因子を加えると、 第Ｖ因子凝血活性及びＡＰＣ補因子ＩＩ活性の両方が導入された。 第Ｖ因子がＡＰＣ補因子ＩＩの候補であることの独立した裏付けが、ＡＰＣ耐 性を有する大家族の連鎖研究から得られた（第３図）。 第Ｖ因子遺伝子（Ｆ５）のヒト遺伝子座を染色体１（１ｑ２１−２５）につい てマッピングした（Ｒｅｆ．３３）。 便利な（ＰＣＲ可能な）多形性Ｆ５マーカーについての報告は存在しない。しか しながら、公表されている第Ｖ因子ｃＤＮＡ及びゲノム配列の多様性（Ｒｅｆ． ２０−２３及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ．１５０，２９９２−３００１，Ｎｏ．７，１９９３年４月１日，Ｎ．Ｌ．Ｌ． Ｓｈｅｎら）は、我々が第Ｖ因子遺伝子の二つの新しい多形性を同定する助けに なった。残念ながら、前記ＡＰＣ耐性家族では、これらの多形性のどちらも情報 を与えるものではなかった。そこで我々は、この家族の１ｑ２１−２５領域（第 ４図参照）の幾つかの遺伝子座に関するマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔ ｅｌｌｉｔｅ）・マーカーの分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を検査した。第５ 図の表は、これらのマーカーとＡＰＣ耐性の表現型との間の関係に関する二つ組 ロドスコア（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｌｏｄｓｃｏｒｅ）を示している。かなり肯定 的な結果は、Ｆ５遺伝子座から４ｃＭ以内に位置する遺伝子座Ｄ１Ｓ６１（θ＝ ０．００でＺｍａｘ ７．２７）に関してだけ得られた。 この時点で我々は、ＡＰＣ耐性が第Ｖ因子遺伝子の欠陥に関係があるという証 拠が、関連突然変異の調査を開始す るのに十分なだけそろっていると考えた。我々は調査の焦点を、推定上のＡＰＣ 結合部位（残基１８６５−１８７４）（Ｒｅｆ．３５、３６）及び推定上のＡＰ Ｃ開裂部位（Ａｒｇ−５０６）（Ｒｅｆ．２１及びＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２３ ，１９８７年８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２３８，Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅ ｇａａｒｄ及びＫｅｎｎｅｔｈ Ｍａｎｎ）をそれぞれ含む第Ｖ因子の二つの領 域に絞った。 第一のアプローチとして、末梢血液リンパ球から単離した第Ｖ因子遺伝子の異 所転写体（ｅｃｔｏｐｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを 合成し、次いでＡＰＣ結合及び開裂部位をコードする二つの領域を増幅した。Ｐ ＣＲフラグメントの直接的配列決定の結果、ＡＰＣ補因子ＩＩの同型接合欠失と して分類された二人の関係の無い患者の両方が、１６９１，Ｇ→Ａトランジショ ンに対して同型接合であることが判明した（第６図）。この突然変異は、Ｇｌｎ （ＣＡＡ）（ＦＡ（Ｑ５０６）又はＦＶＬｅｉｄｅｎ）によるＡｒｇ−５０６（ ＣＧＡ）の置換を予測させるものである。１６９１ Ａを包囲する２２５ｂｐ、 及び推定上のＡＰＣ結合部位をコードする領域を包囲する２７５ｂｐに、別の配 列異常は観察されなかった（第７図）。 Ａｒｇ−５０６の後の開裂がＡＰＣによるヒト第Ｖａ因子の不活化のきっかけ であれば、位置５０６へのＧｌｎの導入が抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）開裂 を防止することが予測される。凝固プロセスの間に、血漿因子Ｖはまず第Ｘａ因 子によって活性化され（１０５／２２０ｋＤａヘテロダイマーの形成（Ｒｅｆ． ３７））、次いで更にトロ ンビンによってプロセスされる（１０５／７４ｋＤａヘテロダイマーの形成（Ｒ ｅｆ．３８））（Ｒｅｆ．３９）。興味深いことに、我々はＧｌｎによるＡｒｇ −５０６の置換が、第Ｖ因子のＸａ活性化形態のＡＰＣによる不活化のみを阻止 し（第８図）トロンビン活性化形態の不活化は阻止しないことを発見した（デー タ示さず）。 二人の関係の無いＡＰＣ耐性患者が同じ突然変異に対して同型接合であるとい う観察事実は、この変化がＡＰＣ耐性患者の大半に存在することを示唆する。こ の可能性を調べるために、ゲノムＤＮＡを１６９１ Ｇ→Ａトランジションの存 在についてスクリーニングするテストを設計した。前記突然変異は、イントロン １０の開始点から１１ｎｔ５１のエクソン１０に存在し、イントロン１０のヌク レオチドは最初の８個のみが公表されているため（Ｒｅｆ．２３）、半ネスト型 （ｈｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）逆ＰＣＲ（Ｒｅｆ．４０）によって、より長いイン トロン１０配列を形成した（配列１４も参照）。この情報に基づいて、遺伝子型 決定に使用し得る二つの重複ゲノムフラグメントを増幅するためのプライマーを 設計した。 ＭｎｌＩでの２６７ｂｐフラグメントの消化を使用して、 正常（１６９１ Ｇ）又は突然変異対立遺伝子の存在を明らかにし、この正常又 は突然変異対立遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドと２２２ｂｐフラグ メントとのハイブリダイゼーションを用いて、１６９１ Ａを正に同定した。こ のアプローチを用いて、我々はまず第３図の家系の構成員を総て調べた。この家 系の一部について、第１０図に示すように、１６９１，Ｇ→Ａトランジションに 関する異型接合性のＡＰＣ耐性（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４）を用いた完全な 同時分離（ｃｏｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が明らかにされた。更に、経口抗凝血 剤で治療したためにｎ−ＡＰＣ−ＳＲが得られない４人の患者（ＩＩ．６、ＩＩ ．８、ＩＩ．１４、ＩＩＩ．２２）は、異型接合性であることが判明した。 最初の客観的に確認された深静脈血栓を経験したことがある３０１人の患者と 、年齢及び性別が適合した３０１の集団対照とについて先に行われた検査では、 ６４人のＡＰＣ耐性血栓症患者が同定された（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月 １８日，Ｖｏｌ．３４２，ｐｐ．１５０３−１５０６，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）。 これら６４の患者と、対応する６４の対照とを、Ｇ→Ａトランジションの存在に つい てスクリーニングした。１２８の個体のうち７０がｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４ を示した（６４の患者及び６の対照）。そのうち５６の個体が突然変異を有して おり（５３の患者及び３の対照）、患者のうち６人の突然変異が両方の対立遺伝 子にあり（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．４３；範囲０．４１−０．４４）、他の ５０が一つの対立遺伝子にあった（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５７；範囲０． ５０−０．６７）。残りの１４のＡＰＣ耐性個体は突然変異を有しておらず、わ ずかに減少したｎ−ＡＰＣ−ＳＲを有していただけであった（平均ｎ−ＡＰＣ− ＳＲ ０．７８；範囲０．７０−０．８３）。５８の非ＡＰＣ耐性個体はいずれ も突然変異を有していなかった（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．９９；範囲０．８ ３−１．１９）。また、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＞０．８４の１００人の血栓症患者の 中に突然変異のキャリヤーはいなかったが、予想した通り、対応する１００の適 合対照のうち３は突然変異のキャリヤーであった。この３つは（ｎ−ＡＰＣ−Ｓ Ｒがそれぞれ０．５７、０．５８及び０．５９）、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４ を有する唯一の対照であった。 我々のデータは、ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４の個体の ８０％、及びｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．７０の個体の１００％が、１６９１，Ｇ→ Ａトランジションに関して異型又は同型接合であり、また逆にすべての突然変異 キャリヤーがｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．７を有することを示すものである。オラン ダ集団における突然変異対立遺伝子の比較的高い頻度（約２％）と、ＡＰＣ耐性 が深静脈血栓症の一般的な強力危険因子であるという我々の発見（Ｌａｎｃｅｔ ，１９９３年１２月１８日，Ｖｏｌ．３４２，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）とを組合わ せるて考えると、この遺伝性の第Ｖ因子欠乏は現在のところ最も一般的な遺伝性 凝血障害ということになる。 第１図及び第２図 血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ濃度の測定 第１図． 血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活性のアッセイに関する検量線 ＡＰＣ補因子ＩＩは、ＡＰＣ耐性を有する個体に欠失又は欠乏している、ＡＰ Ｃの想定上の新しい補因子である（Ｒｅｆ．２）。ＡＰＣ補因子ＩＩが欠乏して いる同型接合患者の血漿（ＡＰＣ補因子ＩＩ ０％）中の正常血漿（ＡＰＣ補因 子ＩＩ １００％）希釈物中で、ｎ−ＡＰＣ −ＳＲを測定した。第１図の曲線は、９回の異なる実験の結果である。ＡＰＣ補 因子ＩＩ欠乏同型又は異型接合の分類は、ＡＰＣ耐性を有する１４のプロバンド （ｐｒｏｂａｎｄ）（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４）に関する親分析の結果に基 づく。２個のプロバンド（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．３８／０／４１）では両親が ＡＰＣ耐性を有しており（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５５）、１１個のプロバ ンド（平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５７）では、親の一方がＡＰＣ耐性である（ 平均ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．５９）のに対し他方がＡＰＣ耐性ではなく（平均ｎ −ＡＰＣ−ＳＲ０．９６）、１個のプロバンド（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．７４） では両親ともＡＰＣ耐性ではなかった（ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ ０．９６／０．９９ ）。我々は、個体のｎ−ＡＰＣ−ＳＲに基づいて、個体をＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏 に関し同型又は異型接合であると分類できると考える（同型：平均０．４０、ｎ ＝２；異型：平均０．５８、範囲０．５１−０．６７、ｎ＝２６）。 第２図． 単一凝固因子が欠乏している（＜５％）血漿中のＡＰＣ補因子ＩＩ活 性レベル 血漿は、先天性欠乏を有する患者に由来するもの（ａ、 ｇ、ｆ、ｍ、ｇ、ｒ、ｓ、ｔ）、又はイムノデプリーション（ｉｍｍｕｎｏｄｅ ｐｌｅｔｉｏｎ）によって製造したもの（ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｊ、ｈ、ｉ、ｋ、ｌ 、ｐ）である。血漿は、第ＩＩ因子欠乏（ａ）、第ＶＩＩ因子欠乏（ｂ）、第Ｉ Ｘ因子欠乏（ｃ）、第Ｘ因子欠乏（ｄ）、第ＸＩ因子欠乏（ｅ）、第ＸＩＩ因子 欠乏（ｊ）、第ＸＩＩＩ因子欠乏（ｇ）、プロテインＣ欠乏（ｌ）、プロテイン Ｓ欠乏（ｉ）、β２−糖タンパク質欠乏（ｊ）、抗トロンビン欠乏（ｋ）、第Ｖ 因子欠乏（ｌ，ｍ）、第ＶＩＩＩ因子欠乏（ｐ，ｑ）又はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂ ｒａｎｄ因子欠乏（ｒ、ｓ、ｔ）であった。第Ｖ因子欠乏血漿（ｍ）に精製ヒト 第Ｖ因子（Ｓｅｒｂｉｏ，Ｇｅｎｎｅｖｉｌｌｉｅｒｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を二つ の異なる濃度、５４％（ｎ）及び９０％（ｏ）で加え、２０ｍＭクエン酸ナトリ ウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＣａＣｌ₂に対して透析し、ＡＰＣ補因 子ＩＩ活性について検査した。方法 ： 二つのＡＰＴＴ測定、即ちＡＰＣの存在下での測定及び不在下での測定の結果 に基づき、既述の方法と全く同じ方法（Ｌａｎｃｅｔ，１９９３年１２月１８日 ，Ｖｏｌ．３ ４２，Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒら）でＡＰＣ−ＳＲを計算した。検査試料のＡＰＣ−Ｓ Ｒを、プールしてあった正常血漿のＡＰＣ−ＳＲで割り算して、ｎ−ＡＰＣ−Ｓ Ｒを計算した。第１図に示すような検量線で、ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏血漿中の検 査血漿の二つの異なる希釈物（１：１、３：４）のｎ−ＡＰＣ−ＳＲを読み取る ことにより、ＡＰＣ補因子ＩＩ活性を測定した。 第３図〜第５図． ＡＰＣ耐性を有する家族の連鎖分析 第３図． ＡＰＣ耐性（又はＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏）を有する家族の家系 ●，■： ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４（平均０．６５；範囲０．５９−０．７ １、ｎ＝１３）の個体； ○，□：ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＞０．８４（平均１．０３ ；範囲０．８ 血剤で治療した患者（これらの患者のｎ−ＡＰＣ−ＳＲ測 第４図． 染色体１のｑ２１−２５領域の統合的遺伝連鎖地図 遺伝子座ＡＰＯＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ６１、ＡＴ ３、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂの相対位置を、ＮＩＨ／ＣＥＰＨ Ｃｏｌｌａｂｏｒ ａｔｉｖｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ連鎖地図（Ｒｅｆ．４１）から誘導し た。隣接遺伝子座間の遺伝距離はｃＭで示す。Ｆ５及びＤ１Ｓ６１遺伝子座のマ ーカーの情報を提供する三つのＣＥＰＨ家族におけるこれら２個のマーカーの分 離を調べたところ、Ｆ５遺伝子座は、この地図上で、Ｄ１Ｓ６１遺伝子座から４ ｃＭ以内に位置していた（５５の減数分裂で、これら二つの遺伝子座の間に組換 えは観察されなかった：θ＝０．００でＺ_max１６・６）。 第５図． 染色体１マーカーでのＡＰＣ耐性の二つ組ロドスコア 第３図の家系の検査できる個体総てを分析した。遺伝子座ＡｐｏＡ２、Ｄ１Ｓ １０４、Ｄ１Ｓ６１、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂのマーカーのオリゴヌクレオチド配 列はゲノムデータバンクから入手できる。プライマーはオランダプライマーベー スから得た。ＡＴ３遺伝子座の三つの異なる多形性マーカーは、この家族の情報 を提供するものではなかった。Ｄｒ．Ｊ．Ｏｔｔから入手したＬＩＮＫＡＧＥパ ッケージバージョン５．３からのＭＬＩＮＫプログラムを用い て、２点連鎖分析（ｔｗｏ ｐｏｉｎｔ ｌｉｎｋａｇｅａｎａｌｙｓｉｓ）を 実施した。性別平均ロドスコアを示す。方法 ： ＡｐｏＡ２、Ｄ１Ｓ１０４、Ｄ１Ｓ６１、ＬＡＭＢ及びＦ１３Ｂのマイクロサ テライト・マーカーをＰＣＲで増幅した。条件：５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．６）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．０１％ＢＳＡ、２ ００ｐＭ ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ、２０μＭ ｄＣＴＰ、０．７μＣ ｉ α³²Ｐ ｄＣＴＰ、０．４３Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅ ｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、５０ｎｇの各プライマー及び３０ｎｇのゲノ ムＤＮＡ。最終延伸（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）ステップを１０分間にして、９４ ℃（１’）、５５℃（２’）、７２℃（１’）で２７サイクル実施した。ＰＣＲ 生成物を６％変性用ポリアクリルアミド配列ゲル上で分離し、その後ゲルを乾燥 し、Ｘ線フィルムに暴露した。 Ｆ５多形性：第Ｖ因子遺伝子のエクソン１３からの６３６ｂｐフラグメント（ Ｒｅｆ．２３）を、配列表のプライマー番号２（ＰＲ−７６６、ｎｔ２２５３− ２２７２（Ｒ ｅｆ．２１））及び番号３（ＰＲ−７６８、ｎｔ２８７０−２８９９（Ｒｅｆ． ２１））を用いてＰＣＲで増幅した。ＰＣＲ条件については第１０図及び第１１ 図の説明文を参照されたい。Ｈｉｎｆ Ｉで制限すると、ｎｔ ２２９８のＣ／ Ｔ二形性（Ｃ：０．６８；Ｔ：０．３２）と、ｎｔ２４１１の稀なＡ／Ｇ二形性 （Ａ：０．９８；Ｇ：０．０２）とが検出される。これらのマーカーのうち、第 ３図の家系で情報提供するものはない。 第６図〜第８図． ＡＰＣ補因子ＩＩ欠乏同型接合患者の第Ｖ因子遺伝子突然変 異の同定 第６図． ＡＰＣ補因子ＩＩ同型接合欠乏として分類された患者のヌクレオチド 置換を示すオートラジオグラム ｃＤＮＡ ＰＣＲフラグメント（ヒト第Ｖ因子のアミノ酸４１７〜５７２をコ ードする（Ｒｅｆ．２１））の非コード鎖のヌクレオチド配列の一部を、一人の 患者（Ｐ）及び一人の非ＡＰＣ耐性対照（Ｃ）に関して示す。矢印は、Ｇｌｎに よるＡｒｇ ５０６の置換を予告する１６９１，Ｇ→Ａトランジションの位置を 示す。 第７図． 第Ｖ因子分子の簡単な説明図 ヒト第Ｖ因子は、数種類の内部反復を含む３３０ｋＤａ 糖タンパク質である（Ｒｅｆ．２１）。第Ｘａ因子での活性化は、１０５／２２ ０ｋＤａヘテロダイマー（Ａ₁Ａ₂／Ｂ’Ａ₃Ｃ₁Ｃ₂）（Ｒｅｆ．３８）の形成に つながり、トロンビンでの活性化は１０５／７４ｋＤａヘテロダイマー（Ａ₁Ａ₂ ／Ａ₃Ｃ₁Ｃ₂）（Ｒｅｆ．３７）の形成につながる。ＡＰＣは第Ｖａ因子のＡ３ 領域に結合し（Ｒｅｆ．３５、３６）、Ａｒｇ−５０５後のＡ２領域内での開裂 によってウシ第Ｖａ因子を阻害する（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２６２，Ｎｏ．２３，１９８７年 ８月１５日，ｐｐ．１１２３３−１１２３８，Ｂｒｕｃｅ Ｏｄｅｇａａｒｄ及 びＫｅｎｎｅｔｈ Ｍａｎｎ）。 ヒト（Ａｒｇ−５０６）及びウシ（Ａｒｇ−５０５）第Ｖａ因子の推定上の（ Ｒｅｆ．４３）ＡＰＣ開裂部位を包囲するアミノ酸配列を示す。ＡＰＣ耐性患者 では、Ａｒｇ−５０６がＧｌｎで置換されている。 第８図． ＡＰＣによる不活化に対する第Ｘａ因子活性化第Ｖ因子（Ｑ５０６） の耐性 第Ｖ因子（Ｒ５０６）又は第Ｖ因子（Ｑ５０６）を含む、Ａｌ（ＯＨ）₃吸着 しフィブリノーゲン欠失した血漿（２ 時間、３７℃；０．３Ｕ／ｍｌ^-1アーブン）を、２０ｍＭＣａＣｌ₂及び２０μ Ｍ ＰＳ／ＰＣ（２５／７５）の存在下で、第Ｘａ因子（２ ｎＭ）で処理した 。８分後、第Ｖ因子の活性化が終了した時点で、１．９ｎＭのＡＰＣ又は緩衝液 を加えた。様々な時間間隔で、１０μｌの試料をストップ緩衝液（５０ｍＭトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１８０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ^-1ＯＶＡ、 ５ｍＭ ＣａＣｌ₂）中で１／１００に希釈し、Ｐｉｅｔｅｒｓらの方法（Ｒｅ ｆ．４４）を用いて、第Ｖａ因子活性について直接アッセイした。０．７０Ｕ／ ｍｌ^-1ＦＶ（Ｒ５０６）（０．６４μＭトロンビン分^-1）又は０．４９Ｕ／ｍｌ^-1 ＦＶ（Ｑ５０６）（０．２０μＭトロンビン分^-1）の完全な活性化後に測定し た第Ｖａ因子活性は、任意に１００％とみなされる； ○，−ＡＰＣ； ●，＋ＡＰＣ。方法 ： ｃＤＮＡ合成：同意した患者及び非ＡＰＣ耐性対照のクエン酸含有血液１０ｍ ｌのリンパ球フラクションからＲＮＡを単離した（Ｒｅｆ．４５）。１μｇのＲ ＮＡを鋳型として使用し、スーパースクリプト・キット（ＢＲＬ，Ｂｅ ｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、混合ランダムヘキサマーの存在 下で第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡフラグメントの増幅。プライマー配列 ４（ＰＲ−７６４，ｎｔ １４２１−１４４０（Ｒｅｆ．２１））及び配列５（ ＰＲ−８５６，ｎｔ １８６７−１８９１（Ｒｅｆ．２１））は、推定上のＡＰ Ｃ開裂部位を含む残基４１７〜５７２をコードする領域を増幅し、プライマー配 列６（ＰＲ−８４９ ｎｔ ５６０８−５６２７（Ｒｅｆ．２１））及び配列７ （ＰＲ−８４８，ｎｔ ６０４０−６０６３（Ｒｅｆ．２１））は、ＡＰＣ結合 領域を含むアミノ酸残基１８１２〜１９６３をコードする領域を増幅する。ＰＣ Ｒ条件は、第９図及び第１０図の説明文に記載の通りである。ＰＣＲフラグメン トをゲル化温度が極めて低いアガロース上で精製し、ＰＣＲ反応と同じプライマ ーを用いて前述のように直接配列決定した（Ｒｅｆ．４２）。ＡＰＣ結合領域の 配列決定を補助するために、更にもう一つのプライマーを合成した：配列８（Ｐ Ｒ−８４７，ｎｔ ５９０５−５９２７（Ｒｅｆ．２１））。 第９図及び第１０図． ＡＰＣ耐性と第Ｖ因子の１６９１Ａ対立遺伝子の存在と の関係 第９図． １６９１ＡのＡＰＣ耐性による同時分離 上部は家系（第３図）における個体の位置を示し、可能であればｎ−ＡＰＣ− ＳＲも示す（ＩＩ６は経口抗凝血剤治療に関する）。中間部は、２６７ｂｐ Ｐ ＣＲフラグメントのＭｎｌ Ｉ消化の結果を示す。下部は、２２２ｂｐフラグメ ントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １００５）に特異的なビオチニル化オリ ゴヌクレオチドとのドットブロットハイブリダイゼーションの結果を示す。 第１０図． ｎ−ＡＰＣ−ＳＲ＜０．８４の６４人の血栓症患者及び対応する６ ４の対照の２２２ｂｐ ＰＣＲフラグメントと、１６９１Ａ対立遺伝子（ＰＲ １００５）に特異的なビオチニル化オリゴヌクレオチドとのドットブロットハイ ブリダイゼーション。 総ての患者（Ｐ）及び対照（Ｃ）は、十分な説明を受けた上で同意を与えてく れた。スラッシュはこの実験で失敗したＰＣＲ反応の位置を示す。方法 ： １６９１Ｇ／Ａを含むゲノムフラグメントの増幅。Ｍｎｌ−Ｉ消化のために、 配列９（ＰＲ−６９６７；ｎｔ １５８１−１６０２（Ｒｅｆ．２１））を５’ プライマーと して使用し、且つ配列１０（ＰＲ−９９０；イントロン１０のｎｔ １２７〜− １４６）を３’プライマーとして使用して、２６７ｂｐフラグメントを増幅した 。ドットブロットハイブリダイゼーションのために、配列１１（ＰＲ−６９６６ 、ｎｔ１６２６−１６４７（Ｒｅｆ．２１））を５’プライマーとして使用し、 ＰＲ−９９０（配列１０）を３’プライマーとして使用して、２２２ｂｐフラグ メントを増幅した。条件：５４ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、５．４ｍ Ｍ ＭｇＣｌ₂、５．４μＭ ＥＤＴＡ、１３．３ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、８％ ＤＭＳＯ、８ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．４ｍｇ／ｍｌ^-1 ＢＳＡ、０ ．８ｍＭの各ヌクレオシドトリホスフェート、４００ｎｇの各プライマー、２０ ０〜５００ｎｇ ＤＮＡ及び２ＵＴａｑポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ，Ｅｍｅｒｙ ｖｉｌｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を含む混合物１２５μｌを、９１℃（４０”）、５ ５℃（４０”）及び７１℃（２’）のサイクルに３６回かけた。２６７ｂｐフラ グメント（７−１０μｌ）を０．４Ｕ Ｍｎｌ Ｉ（Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｃａｍｂ ｒｉｄｇｅ，Ｍａ，ＵＳＡ）で消化した。１６９１Ｇフラグメントは６７、３７ 及び１６３ｂｐのフラグメントを与え、 １６９１Ａフラグメントは６７及び２００ｂｐのフラグメントを与える。２２２ ｂｐフラグメント（約１００ｎｇ）を、１６９１Ｇを検出するためのビオチニル 化配列特異的オリゴヌクレオチド配列１２（ＰＲ１００６；ｎｔ １６８２−１ ６９９（Ｒｅｆ．２１））、及び１６９１Ａを検出するための配列１３（ＰＲ１ ００５）とのドットブロットハイブリダイゼーションに使用した。手順は全く前 述通りである（Ｒｅｆ．４６）。ハイブリダイゼーション後、ストリンジェンシ ー洗浄を、ＰＲ−１００６で５３℃、ＰＲ−１００５で５２℃で実施した。 実施例２ 我々は、凝固因子Ｖ（第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ）異常の突然変異に関して異型及 び同型接合の個体における静脈血栓症発生の危険度を調べた。我々は、最初の客 観的に確認された深静脈血栓症を有する７０歳以下の４７１人の患者、及び４７ ４人の健康な対照の、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ遺伝子型を決定した。我々は、血栓 症患者の中に８５の異型接合個体及び７の同型接合個体を発見し、対照被験者の 中に１４の異型接合個体を発見した。 異型接合個体の場合は相対危険度が７倍増加したのに対 し、同型接合個体の場合は８０倍増加した。これらの個体は遥かに若い年齢で（ ３２歳対４４歳）血栓症を経験していた。同型接合個体は主に女性であり、殆ど が血液型Ａであった。 血栓症発生の危険は年齢と共に増加するため、絶対危険度差は、異型接合個体 及び同型接合個体の両方について、年齢のより高い患者で極めて顕著である。同 型接合個体の場合は、絶対危険度が数％／年になる。これは、第Ｖ因子Ｌｅｉｄ ｅｎに関して同型接合の個体の大半が、一生のうち少なくとも一回は血栓症を経 験することを意味する。 突然変異第Ｖ因子遺伝子は対立遺伝子の頻度が高いため、同型接合キャリヤー は、別の種類の遺伝性血栓発現傾向の場合のように極端に稀ではない。同型接合 状態が異型接合状態より大きい危険度を与えるかどうかはこれまで知られていな かった。我々は、血栓症発生危険度と、第Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎに関して同型接合 である患者の臨床的特徴とを調べた。これらは、深静脈血栓症に関する大規模症 例対照検査（ｌａｒｇｅ ｃａｓｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｙ）で確認され た（Ｔｈｅ Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ：ＬＥＴ Ｓ）（Ｋｏｓｔｅｒ Ｔ．ら，Ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｐｏｏｒ ａｎ ｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒ ｏｔｅｉｎ Ｃ：Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ．Ｌ ａｎｃｅｔ １９９３；３４２：１５０３−１５０６）。方法 試験計画 ＬＥＴＳの計画の詳細については以前に開示されている（Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒ等 ，“Ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ｄｕｅ ｔｏ ｐｏｏｒ ａｎｔｉ ｃｏａｇｕｌａｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅｒ ｔｏ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏ ｔｅｉｎ Ｃ： Ｌｅｉｄｅｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｐｈｉｌｉａ Ｓｔｕｄｙ，”Ｌａｎｃｅｔ ３４２ ，ｐｐ．１５０３−１５０６，１９９３）。本発明者は７ ０歳未満の続発患者を考慮下に置き、既知の悪性障害の不在下に客観的に確認さ れた最初の深静脈血栓症のエピソード後に前記患者をライデン、アムステルダム 及びロッテルダムのＡｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｃｌｉｎｉｃに、抗凝血 治療の外来監視のために委託した。患者は急性血栓症事象後少なくとも６ヵ月（ ６〜１９ヵ月）診療した。適格患者の９０％が試験への参加を希望した。４７４ 人の血栓症患者に加えて、本発明者は４７４人の対照被験者も用意し、これらの 被験者は静脈性血栓塞栓症の履歴を有せず、既知の悪性障害に罹患しておらず、 性別が同じであり、かつ年齢もほぼ同じ（±５歳）であった。データ収集及び研究室分析 全被験者に、指標日付、即ち血栓症事象の日付以前の特定期間内に限定した過 去における後天性危険状況の存在についての質問を含む標準的な質問票に回答さ せた。本発明者が“後天性危険状況”と看做したのは、いずれも指標日付の前年 に有った手術、手術を行なわない入院、または自宅での長期不動化（２週間以上 ）、及び指標日付時点での妊娠である。 前腕前部静脈から血液を、０．１０６ｍｍｏｌ／ｌのクエン酸三ナトリウムを 収容したＳａｒｓｔｅｄｔ Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ（登録商標）管内に採取した。 白血球から高分子ＤＮＡを単離し、４℃で貯蔵した。突然変異体第Ｖ因子−ライ デン遺伝子（１６９１； Ｇ→Ａトランジション）の存在を既述のように確認し た。この方法によって本発明者は、各患者に関し、当該患者がホモ接合性正常（ ＧＧ）であるか、第Ｖ因子ライデン突然変異に関してヘテロ接合性（ＡＧ）であ るか、それとも前記異常のホモ接合性保有者（ＡＡ）であるかを確定した。技術 者には常に、試料の立場、即ち試料が患者と対照被験者とのいずれに由来するか を知らせなかった。ＤＮＡ分析用の細胞は４７１人の患 者及び４７４人の対照から入手可能であった。分析及び統計処理 患者（ｃａｓｅｓ）及び対照における第Ｖ因子ライデン突然変異のヘテロ接合 性及びホモ接合性保有者の頻度を、単純な交叉作表によって比較した。ヘテロ接 合状態に関連する危険の分析では性別及び年齢は、常染色体遺伝異常に肯定的に 作用すると予測されないので交絡（ｃｏｎｆｏｕｎｄｉｎｇ）変数であるとは考 えられなかったため、ヘテロ接合状態に関する相対的危険度の推定値は非整合暴 露オッズ比の計算によって求めた。９５％信頼区間をＷｏｏｌｆに従って設定し た（Ｂ．Ｗｏｏｌｆ，“Ｏｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏ ｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ａ ｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１９ ，ｐｐ．２５１−２５３，１９５５）。 ホモ接合状態に関連する危険度は上述の標準的な方式では推定できなかったが 、これは対照中にホモ接合性個体が見出されなかったからである。従って、（対 照における）Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の仮定下に対照母集団内のホモ 接合性個体の予測数を計算し、その後オッズ比を 標準的な方式で推定した。ホモ接合状態に関する（ｌｏｇ）オッズ比の分散を、 Ｗｏｏｌｆの方法を改良した方法によって推定した。欄の内容ａ、ｂ、ｃ及びｄ を有する２行２列の表の各欄をＰｏｉｓｓｏｎ分布の実現と看做せば、ｌｏｇ（ ＯＲ）の分散は１／ａ＋１／ｂ＋１／ｃ＋１／ｄとなる（Ｂ．Ｗｏｏｌｆ，“Ｏ ｎ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｌｏ ｏｄｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．１ ９ ，ｐｐ．２５１−２５３，１９５５）。遺伝子型ＧＧ及びＡＡを有する個体数 を患者では計数し、対照に関してはＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡から算出 し、必要な二次変換を行なうと、ｌｏｇ（ＯＲ）の分散は１／ＡＡ（患者）＋１ ／ＧＧ（患者）＋４／Ａ（対照）＋４／Ａ（対照）＋４／Ｇ（対照）となり、そ の際ＡＡ及びＧＧは遺伝子型（個体）の数であり、Ａ及びＧは対立遺伝子の数で ある。 様々な遺伝子型及び年齢における血栓症の絶対的危険度を、まずＨａｒｄｙ− Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の仮定下に（自治体当局提供の情報から得た）原母集団の 人年数を分割することによって計算した。分割した人年によって患者 を各サブグループ（遺伝子型、年齢）に分け、それによって絶対的危険度の推定 値を得た。その後、これらの粗い出現率データを対数変換後に、三つの年齢群（ ０〜２９歳の２５歳群、３０〜４９歳の４０歳群及び５０〜６９歳の６０歳群） と、各層の患者数に関して加重したヘテロ接合状態（０，１）及びホモ接合状態 （０，１）に関する指示変数とを有する加重最小２乗回帰モデルへとモデル化し た。層特定的な出現率をまず推定し、その後加重最小２乗回帰によって平滑化す る［“最終平滑化”（Ｓ．Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ，“Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｏｓｕｒｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｃｉ ｄｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｕｄｉｅｓ，”Ｊ．Ｃ ｈｒｏｎ．Ｄｉｓ．３４ ，ｐｐ．４４５−４５３，１９８１）］この方法はＧｒ ｉｚｚｌｅ等が開示している（Ｊ．Ｅ．Ｇｒｉｚｚｌｅ，Ｃ．Ｆ．Ｓｔａｒｍｅ ｒ及びＧ．Ｇ．Ｋｏｃｈ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ ｄａｔａ ｂｙ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｄｅｌｓ，”Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ２ ５ ，ｐｐ．４８９−５０４，１９６９）。Ｐｏｉｓｓｏｎ分布では患者数の分散 は患者数に等しいので、この方法はＰｏｉｓｓｏｎ回帰モデルを作成するのとほ とんど同じである。Ｐｏｉｓｓｏｎ回帰モデルは、ホモ接合状態（及びヘテロ接 合状態）に関する出現率比が当該対数（出現率）に関して年齢層間で一定である という仮定の下に、特にホモ接合状態に関してより安定な推定値をもたらす。こ のモデルは ｌｏｇ（Ｉ）＝α＋β₁＊年齢＋β₂＊ＡＧ（０，１）＋β₃＊ＡＡ（０，１） と表記でき、この式は後に、（係数の真数として）絶対的危険度及び相対的危険 度の推定値の計算に用い得る。結果 ４７１人の患者のうち、欠陥に関してヘテロ接合性であったのは８５人（１８ ％）、ホモ接合性であったのは７人（１．５％）であり、その他の３７９人（８ ０％）は第Ｖ因子ライデン突然変異を有しなかった。対照では４７４人のうちの １４人（２．９％）がヘテロ接合性で、他の４６０人は総て正常であった。対照 中にホモ接合性個体は存在しなかった。 ホモ接合性個体は他の患者より甚だしく若年で血栓症に罹患し、その血栓症罹 患平均年齢はヘテロ接合性患者の４ ４歳、及び突然変異を有しない患者の４６歳に対して３２歳であった（表２）。 ホモ接合性患者における深静脈血栓症の臨床経過は平凡であった。全員が脚の 深静脈血栓症に罹患した。４人はヘパリン化のために短期間入院し、３人は外来 患者としてクマリン誘導体のみでの治療を受けた。７人の患者のうちで顕性動脈 疾患（心筋梗塞、卒中または末梢動脈疾患）の履歴を有するものは皆無であった （表３）。 ７人のホモ接合性患者のうち６人（８６％）は女性であり、これに対してヘテ ロ接合性個体では４６人（５４％）、突然変異を有しない個体では２１７人（５ ７％）が女性であった。また、上記７人の患者のうちの６人は血液型がＡ型であ ったが、他の４６４人の患者のうちでＡ型は２４９人（５４％）であった。４５ 歳以下である５人のホモ接合性女性患者のうち、３人は血栓症事象の時点で経口 避妊薬を用いており、このことはいずれにせよ現在通常の使用に類似していた。 非Ｏ型の血液型、及び経口避妊薬の使用はそれ自体が静脈血栓症の危険因子であ るので、上記の数字はこれらの危険因子とホモ接合性第Ｖ因子ライデンとの、複 合的な性質を有する相互作用を示唆している。 ７人のホモ接合性患者のうちの２人（２９％）には、事象の前年に血栓症の素 因は存在しなかった（１人は血栓症となる４５日前に股関節部の手術を受け、１ 人は血栓症事象の６０日前に出産後一晩入院した）。８５人のヘテロ接合性個体 のうちの２５人（２９％）の患者、及び３７９人の正常な患者のうちの１３１人 （３５％）に後天性危険因子が存在した。 過去の危険状況（手術、妊娠、入院）が血栓症を招かなかった例は、第Ｖ因子 ライデン突然変異に関してホモ接合性である患者ではその他の患者におけるほど 頻繁に生起しなかった。それでも、７人のホモ接合性患者のうち５人は過去に、 後に血栓症をもたらさない危険状況に遭遇していた（２人が手術を受け、４人が ５人の子供を出産）。 上記７人の患者を、最初の血栓症事象後長期経口避妊を行なわせずに平均２年 間追跡した。１人の患者は再発性血栓症に罹患した（１回／１３．４年；年率７ ．４％）。両親１４人のうちの３人が静脈血栓症の履歴を有したが、これは予測 の約５倍である。 Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡下に正常個体：ヘテロ接合性個体：ホモ接 合性個体の相対的頻度はｐ²：２ｐ ｇ：ｑ²となり、その際ｐは正常遺伝子の、またｑは異常遺伝子の対立遺伝子頻 度である。ｐ²：２ｐｇが４６０／４７４：１４／４７４であったので、第Ｖ因 子ライデンの対立遺伝子頻度（ｑ）は０．０１５となる。ｐ＝０．９８５及びｑ ＝０．０１５という対立遺伝子頻度は、非選択個体４７４人中での４５９．９人 （ＧＧ）、１４．０人（ＡＧ）及び０．１０７人（ＡＡ）という分布に合致する 。 対照４７４人中のホモ接合性個体の予測数（ｑ２）が０．１０７人であること から、ホモ接合性状態に関するオッズ比は（７／３７９）／（０．１０７／４６ ０）＝７９となる。即ち、ホモ接合性個体にとっての血栓症の危険度は正常個体 の約８０倍である（ＣＩ₉₅：２２〜２８９）。 表４に三つの年齢群に関して、０．０１５の対立遺伝子頻度を用いて各年齢群 におけるホモ接合性対照の予測数を計算した場合のオッズ比を示す。ホモ接合性 個体における高い血栓症の相対的危険度は年齢と共に低下することが明らかであ る。このことは、ヘテロ接合性個体の相対的危険度が年齢を越えて多かれ少なか れ一定であることと対照的である。 続いて、異なる年齢群及び遺伝子型における絶対的危険 度（出現率）を、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡の仮定下での原母集団にお ける年齢分布に関するデータを用いて計算した。表４に示したように、出現率は 遺伝子型ＧＧを有する最低年齢群での毎年１０，０００人当たり僅か０．５５人 という値から、より高い年齢群のヘテロ接合性個体に関する毎年１０，０００人 当たり１６．３人という値まで上昇する。総ての年齢群においてホモ接合性個体 に関する危険度の方がヘテロ接合性個体に関する危険度よりはるかに高いことも 、表４に示した数値から明らかである（毎年１０，０００人当たり７８〜１７６ 人）。しかし、これらの出現率推定値は三つの年齢群に分けた僅か７人の個体に 基づくものであるので不安定であり、かつ最高年齢群では意外にも低下している 。本発明者が用いた回帰モデルはこれらの推定値を平滑化し、なぜなら該モデル は相対的危険度が年齢群を越えて一定であると仮定するからである。図１２に示 したように、このモデルは正常個体及びヘテロ接合性個体には良く適合する（係 数：定数−１０．０６； 年齢０．０２９３；ＡＧ １．９６； ＡＡ４．５２ ）。ホモ接合性個体に関する平滑化された出現率推定値は今や、３０歳未満での １０，０００人年当たり８ ２人から５０〜６９歳での１０，０００患者年当たり２２７人へと上昇する（図 １３）。これらの推定値は、ほとんどのホモ接合性患者がその人生において少な くとも一つの血栓症事象を経験することを意味する。検討 抗ＡＰＣ性は、突然変異体第Ｖ因子遺伝子に関する対立遺伝子頻度が約１．５ ％である一般的な異常である。このことは、母集団の３％がヘテロ接合性であり 、ホモ接合性個体は出生１０，０００人当たり約２人と予測可能であることを意 味する。 この試験において本発明者は、ホモ接合性個体の血栓症の危険度が高く、しか もヘテロ接合性個体の危険度を甚だしく上回ることを示す。この結論は、ホモ接 合性個体がその最初の血栓症事象を若年時に経験していることによって支持され る。 ホモ接合性第Ｖ因子ライデンがもたらす血栓症の危険度がホモ接合性タンパク 質Ｃまたはタンパク質Ｓ欠乏がもたらす血栓症の危険度に全く近似しないことは 明らかであり、これらの異常は新生児電撃性紫斑病を誘発する（Ｈ．Ｅ．Ｂｒａ ｎｓｏｎ等，“Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｐｒｏｔｅ ｉｎ Ｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｒｅｓｐｏｎｓ ｉｖｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｒｅｌ ａｐｓｉｎｇ ｐｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉ ｎａｎｓ ｉｎａ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔ，”Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ，ｐ ．１１６５，１９８３；Ｃ．Ｍａｈａｓａｄａｎａ等，“Ｎｅｏｎａｔａｌ ｐ ｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｏｍ ｏｚｙｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ，”Ｌａｎｃｅｔ ３３５ ，ｐｐ．６１−６２，１９９０）。ホモ接合性第Ｖ因子ライデンを有す る個体は全員最初の血栓症事象前に成人に達しており、１人は中年後期にすら達 していた。ほとんどのホモ接合性個体は過去に、血栓症をもたらさない危険状況 を経験しており、そのような危険状況（妊娠、産褥）のほとんどに関して抗凝血 性予防法は示されていない。このことは、抗ＡＰＣ性をホモ接合性タンパク質Ｃ 欠乏におけるような定性的欠陥（タンパク質Ｃ活性の不在）ではなく、定量的欠 陥（第Ｖａ因子の不活性化速度の低下）と看做すべきであることを示している。 この試験で目立った発見は、ホモ接合性患者において女 性が優勢であることであった。それらの女性の間では経口避妊薬が他の患者間で と同様に頻繁に用いられていたので、経口避妊薬の使用が抗ＡＰＣ性との相乗作 用によって一定の役割を果たしたと考えられる。ピルの使用及び抗ＡＰＣ性はい ずれも一般的であるので、特にヘテロ接合性保有者（全女性の３％）に関しては 上記の関連性を更に別の試験によって調べるべきである。 ヘテロ接合性個体に関する相対的危険度は、異なる年齢群同士の間で一定であ ると考えられる。このような観察は、年齢と共に上昇する背景出現率に照らして 理解しければならない。上記の事態は、図１２及び図１３に示したように、血栓 症の絶対的危険度、または抗ＡＰＣ性によって助長される絶対的危険度がより高 齢のヘテロ接合性個体にとってより重大となることを意味する。 毎年１０，０００人当たり約２人という、本発明者の得た総合的な出現率推定 値は、１，０００人年当たり約０．５〜１人の通常の推定値より小さいというこ とが留意され得る（Ｈ．Ｅ．Ｂｒａｎｓｏｎ等，“Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｐｒｏ ｔｅｉｎ Ｃ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｏｕｍａｒｉｎ−ｒｅｓｐｏ ｎｓｉｖｅ ｃｈｒ ｏｎｉｃ ｒｅｌａｐｓｉｎｇ ｐｕｒｐｕｒａ ｆｕｌｍｉｎａｎｓ ｉｎ ａ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔ，”Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ，ｐ．１１６５，１ ９８３；Ｔ．Ｋｏｓｔｅｒ，“Ｍｏｒｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓ ｅｓ ｏｆ ｖｅｎｏｕｓ ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ，”Ｎｅｔｈ．Ｊ ．Ｍｅｄ．３８ ，ｐｐ．２４６−２４８，１９９１）。このことは、本発明者の 試験での年齢制限（７０歳未満）、確認済みの血栓症への限定、悪性障害に罹患 した患者の除外、及び最初の血栓症事象への限定によりきわめて容易に説明され る。 ホモ接合性患者は８０倍大きい血栓症の危険度を有し、その結果総合的な出現 率は毎年約１％となる。より高い年齢群において観察された出現率低下は、最初 の血栓症事象を未だ経験していない当該年代の個体が母集団内にほとんど存在し ないことによって説明できる。この出現率低下はまた、ホモ接合性患者が少数（ 即ち、最高年齢群には１人のみ）であることの結果でもあった。いずれの場合も 、加重回帰モデルから再算出した出現率値が最良の危険度推定値であると考えら れ、この値は５０歳以上の患者では毎年 ２％より高くなる。 本発明者は、ホモ接合性第Ｖ因子ライデンによって惹起される抗ＡＰＣ性が深 静脈血栓症の危険度を高めると結論付ける。深静脈血栓症は成人期前には出現し ないと考えられ、更には妊娠及び産褥などの危険状況において必ず出現するとも かぎらない。とはいえ本発明者は、ホモ接合性患者は危険状況下では、抗凝血剤 を用いる短期予防を受けるべきであると確信する。しかし、第Ｖ因子ライデン突 然変異に関してホモ接合性である個体において持続的な予防を行なうことはかな らずしも必要でない。 図１２及び図１３ 年齢に基づき求めた、第Ｖ因子ライデン遺伝子型に関する粗な（図１２）、及 び平滑化した（図１３）出現率推定値。 （図中）最下方の線は遺伝子型ＧＧに関する推定値を示し、上方の線は遺伝子 型ＡＧに関する推定値を示す。図１３には遺伝子型ＡＡ（ホモ接合性の第Ｖ因子 ライデン）に関する推定値も示す。粗な出現率は記号＋で示し、平滑化した出現 率は記号□で示す。１０，０００人年当たりの平滑化した出現率は、ＧＧに関し ては０．９（０〜２０歳）、１．４（３０〜４９歳）及び２．５（５０〜６９歳 ）；ＡＧに関しては６．３（０〜２９歳）、９．８（３０〜４９歳）及び１７． ６（５０〜６９歳）；ＡＡに関しては８１．５（０〜２９歳）、１２６．５（３ ０〜４９歳）及び２２７．３（５０〜６９歳）であった。実施例３ プラスミド及びｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ １人の健康なヒト（ホモ接合性野生型）並びに２人の患者ＩＤ９０及びＩＤ１ ３７（いずれもホモ接合性突然変異体）のＰＢＭＣから単離したＲＮＡを、オラ ンダ国ライデ ンの鬱血及び血栓症研究センター（Ｈｅｍｏｓｔａｔｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍ ｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）から入手した。５０６位のアミ ノ酸に存在する突然変異を包含する２９７ｎｔの断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及 びＣｓｐ４５１を用いてベクターｐＧ３０中でクローニングした。得られたプラ スミドを、野生型クローンはｐＧ３０／ＦＶｗｔ、突然変異体クローンはｐＧ３ ０／ＦＶｍｕｔとそれぞれ名付けた。 適正配列のクローニングを配列分析によって確認し、その後プラスミドを、ｉ ｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ合成のためにＣｓＣｌ濃度勾配によって精製した。ソー スとしてプラスミドｐＧ３０／ＦＶｗｔを用いて系制御プラスミド（ｐＧ３０／ ＦＶ Ｅ２）を、プローブ配列（２１ｎｔ）の欠失及びＥ２配列（１４４ｎｔ） の挿入によって構築した。上記３種のプラスミドを、標準的なプロトコルにおい てＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いるｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡ転写に用いた。 プラスミドをＢａｍＨ１で直線状とし、Ｔ７ ＲＮＡＰでの転写後にこれらのプ ラスミドから、２９７ｎｔのｗｔ及びｍｕｔクローン並びに４２０ｎｔの系制御 クローンとそれぞれに続く７００ｎｔのベクター配列 とから成るＲＮＡが得られ、従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡの全長は約１ｋｂ であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後、ＲＮＡをＤＮアーゼＩで処理し、Ｔｉｐ １００カラム（Ｑｉａｇｅｎ）プロトコルを用いて精製し、分光光度計で定量し た。適当な連続稀釈を水で行ない、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡを−７０℃で貯蔵 した。プライマー及びプローブ ＮＡＳＢＡ増幅プライマー、及びＥＬＧＡ及びＥＣＬ検出用の検出プローブの 配列を表５に示す。 Ｐ１は第Ｖ因子コーディング配列のエキソン１０に位置し、Ｐ２配列はエキソ ン１１に位置する。その結果、このプライマーセットは、スプライシングにより イントロン１０配列が取り出されるｍＲＮＡ配列しか増幅し得ない。Ｅ ＬＧＡまたはＥＣＬにおいてより良く機能することから、２種の一般的（ｇｅｎ ｅｒｉｃ）プローブが用いられる。しかし、ＥＬＧＡとＥＣＬとの両方のために 一方の一般的プローブを選択することが可能であるべきである。増幅プライマー は２０％アクリルアミド、７Ｍ尿素スラブゲル上で精製した。溶離及びＥｔＯＨ からの析出後、プライマーを５００μｌのＨ₂Ｏに溶解させ、濃度を分光光度計 （ＯＤ₂₆₀）によって測定した。 ビオチンオリゴを合成機で製造し、これをＥｔＯＨから析出させ、かつＨ₂Ｏ に溶解させて用いた。ＮＨ₂−オリゴへのＨＲＰラベルの結合を標準的なプロト コルに従って実現し、プローブは更に精製することなく用い（一般的ＥＬＧＡプ ローブ）、またはスラブゲル上で精製した（野生型及び突然変異体特異的ＥＬＧ Ａプローブ）。ＥＣＬオリゴを合成し、更に精製することなく用いた。核酸の単離 核酸の単離は総て、Ｂｏｏｍ等が述べている方法（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ．２８ ，ｐｐ．４９５−５０３，１９９０）を用いて行なった。１００ μｌの全血から核酸を抽出し（臨床試料参照）、溶離を１０ ０μｌのＨ₂Ｏで行ない、典型的には５μｌの溶出液をＮＡＳＢＡ増幅のための インプットとして用いた。残りの溶出液は−７０℃で貯蔵した。ＮＡＳＢＡ増幅 ＮＡＳＢＡ増幅を次のように行なった。５μｌのＲＮＡに、１０μｌの２．５ 倍ＮＲＧ緩衝液（１倍緩衝液中での最終濃度：ｐＨ８．５のトリス ４０ｍＭ； ＫＣｌ ７０ｍＭ；各ｄＮＴＰ １ｍＭ；ＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ ２ｍＭ；Ｇ ＴＰ １．５ｍＭ；ＩＴＰ ０．５ｍＭ；ＭｇＣｌ₂ １２ｍＭ）と、６．２５ μｌの４倍プライマー混合物（１倍緩衝液中での最終濃度：ＤＭＳＯ １５％ ｖ／ｖ；Ｐ１ ０．２μＭ；Ｐ２ ０．２μＭ）と、１．７５μｌのＨ₂Ｏとか ら成る１８μｌのプレミックス溶液を添加した。試料を６５℃で５分間インキュ ベートし、続いて４１℃で５分間インキュベートした。４１℃において可能なか ぎり多くを管から取り出し、２μｌの酵素混合物（８単位のＡＭＶ−ＲＴ、４０ 単位のＴ７ＲＮＡＰ、０．１単位の大腸菌ＲＮアーゼＨ、２．６μｇのＢＳＡ、 １．５Ｍのソルビトール）を添加し、その後穏やかに混合し（即ちタッピングし ）、４１℃で９０分間イ ンキュベートした。ＥＬＧＡ検出 ＥＬＧＡ検出のために、一般的プローブ、野生型プローブ及び突然変異体プロ ーブをそれぞれ含有する３種のプローブ溶液を用いた。野生型及び突然変異体Ｈ ＲＰ標識プローブの特異性を高めるべく、これらの標識プローブを該プローブと 対を成す非標識プローブと混合した（表６参照）。 増幅後、１μｌの増幅物を４μｌの適当なプローブ混合物［５μｌ中の最終濃 度：ＳＳＣ、ＢＦＢ、ＸＣＦＦ１倍；グリセロール及び適当なプローブ（表５参 照） ５％ ｖ／ｖ］に添加し、混合し、４５℃で１５分間インキュベートした。その 後、アクリルアミドゲル（５％アクリル／ビスアクリル、０．０４％デキストラ ン硫酸、ＮＡＳＢＡ ｅｌｆｏ緩衝液＝２５ｍＭトリス、２５ｍＭホウ酸、５０ ０μＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ８．３）上で２．５μｌの試料を、０．５倍ＮＡＳＢＡ ｅｌｆｏ緩衝液に加え１５０Ｖで泳動させて分析した。電気泳動後、標準的な ＴＭＢ／ＵＰ基質溶液（比１：１で混合）を用いてゲルを約６分間染色した。普 通、ゲルを５０％メタノール（Ｏ／Ｎ）中で固定し、２枚の透明な箔の間で空気 乾燥させた。ＥＣＬ検出 ＥＣＬでも３種のプローブ溶液を用いて増幅物を検出した（表７参照）。 ハイブリダイゼーション反応開始のため、１０μｌのＥＣＬ混合物（０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、１２．５倍ＳＳＣ、２×１０¹²分子のＥＣＬ一般的プローブ ）と、１０μｌのビーズ混合物（０．１％ ｗ／ｖ ＢＳＡ、１倍ＰＢＳ、２μ ｌの適当なビーズ溶液及び適当な非標識プローブ）と、５μｌの（水での）２１ 倍稀釈増幅物とを混合し、ストーブにおいて常に振盪しつつ４５℃で３０分間イ ンキュベートした。その後、３００μｌのＥＣＬアッセイ緩衝液 を添加し、管をＥＣＬシグナル読み取りのためＥＣＬ装置に設置した。結果 感度 第Ｖ因子ｍＲＮＡのＮＡＳＢＡ増幅に用いたプライマーは、野生型及び突然変 異体配列に関して長さ１８２ｎｔの増幅物をもたらした。プライマーを系制御（ ＳＣ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＲＮＡの増幅に用いると、長さ３０５ｎｔの増幅物が 得られる。ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じた野生型、突然変異体及びＳＣ ＲＮＡの連 続稀釈物を用いて、増幅の感度を調べた（表８）。 ３種のインプットＲＮＡのいずれにおいても、分析感度は１００分子以上であ る。１０分子のインプットとの反応が陽性である場合も有り、このことは感度が 実際は１０分子と１００分子との間であることを示している。実施例４ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。 核酸の単離において野生型または突然変異体ＲＮＡが存 在する場合に当該ＲＮＡと競合しないように添加するべきＳＣ ＲＮＡの量を決 定するべく、幾つかのＳＣ ＲＮＡ量を分析した。前記量のＳＣ ＲＮＡを、試 料を加えずに、また１００μｌの全血を加えて単離し、かつ対照としてＳＣ Ｒ ＮＡの連続稀釈物を直接増幅した。増幅後のＥＬＧＡ分析の結果を表９に示す。 明らかに、核酸を単離する間に何等かの核酸損失が生じる（Ａシリーズのインプ ット３の行とＣシリーズのインプット３の行とを比較されたい）。 Ａシリーズ（表９）から、溶解緩衝液に加えるべきＳＣＲＮＡの最少量は１× １０⁵分子であるという結論を得ることができる。この量のＳＣ ＲＮＡは、１ ００μｌの全血から単離した野生型または突然変異体ＲＮＡの増幅を抑制しない 。実際のところ、ＳＣ ＲＮＡは上記の１０倍量で用いても、１００μｌの全血 から単離した野生型または突然変異体ＲＮＡに対して抑制性でない（表９のＢシ リーズ）。更に行なった実験では、適当であれば常に、核酸単離前に１０⁵分子 のＳＣ ＲＮＡを溶解緩衝液に添加した。 実施例５ 用いた方法は実施例３に述べたものと同じである。 ＧからＡへの単一塩基突然変異という、第Ｖ因子ｍＲＮ Ａの突然変異の性格に起因して、野生型プローブは突然変異体増幅物に関して甚 だしいバックグラウンドシグナルを発生し、かつこの逆も成り立つということが 予測される。このことはＥＬＧＡ検出とＥＣＬ検出との両方に該当する。複雑な ハイブリダイゼーションプロトコルを回避するためには、標識したプローブを該 プローブと対を成す非標識プローブと混合して、非相同増幅物に関するバックグ ラウンドハイブリダイゼーションを抑制する。表１０に、ＥＬＧＡ検出によって 調べた、プローブ混合物での野生型及び突然変異体増幅物の特異的検出の結果を 示す。 ＨＲＰ標識野生型プローブの場合、バックグラウンドを十分低下させるには２ ５０倍過剰な非標識突然変異体プローブを添加するべきであることは明らかであ る。ＨＲＰ標識突然変異体プローブを用いる場合は１００倍過剰な非標識野生型 プローブを添加すれば、バックグラウンドを許容可能なレベルまで低下させるの に十分である。ＥＣＬ検出を用いて、多かれ少なかれ同様の実験を行なった。Ｅ ＣＬ 法では非標識プローブは、磁性ビーズ上の特異的ビオチニル化捕捉プローブと競 合するはずである。異なる過剰倍率の非標識プローブ比率を用いて行なったＥＣ Ｌ検出の結果を表１１に示す。 後でＥＣＬ検出を行なうためには、ビーズ上のビオチニル化プローブが野生型 プローブである場合は１０倍過剰な非標識突然変異体プローブを、またビーズ上 のビオチニル化プローブが突然変異体プローブである場合は４倍過剰な 非標識野生型プローブを共に用いるべきであることが判明した。ＥＬＧＡ及びＥ ＣＬ検出を行なう場合に添加しなければならない非標識プローブ量同士の相違は ハイブリダイゼーション方式に関連するに違いない。ＥＣＬ方式では特異的プロ ーブを磁性ビーズに結合させ、従って該プローブのハイブリダイゼーション反応 は液中プローブに比べて遅い。その結果、標識しない液中プローブは比較的僅か に過剰な量で添加しなければならない。ＥＬＧＡでは２種の液中プローブ間で競 合が起こり、それによって比較的多量の非標識プローブを添加しなければならな くなる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．増大する血栓症の危険を示唆したり、患者において実際に血栓症を誘発した りする、血栓症、及び／または活性タンパク質Ｃ（ＡＰＣ）に対する弱い抗凝血 応答に関連する遺伝的欠陥の存在をスクリーニングする方法であって、第Ｖ因子 または第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸物質において、核酸物質発現時に第Ｖ因 子及び／もしくは第Ｖａ因子（第Ｖ因子の活性化の産物）及び／または第ＶＩＩ Ｉ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子（第ＶＩＩＩ因子の活性化の産物）のＡ ＰＣによる不活性化の度合いの低下と相関する突然変異の存在をそれ自体公知の 方法で確認すること、及び／または タンパク質第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もし くは第ＶＩＩＩａ因子（第ＶＩＩＩ因子の活性化の産物）に存在する、第Ｖ因子 及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因 子のＡＰＣによる不活性化の度合いの低下と相関する突然変異を、第Ｖ因子及び ／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子の 分析、または第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩ Ｉ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子のタンパク質分解フラグメントの分析を それ自体公知の方法で行なうことにより確認すること を含む方法。 ２．第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列中の突然変異が、第Ｖ 因子及び／もしくはＶａまたは第ＶＩＩＩ因子及び／もしくはＶＩＩＩａ上のＡ ＰＣ結合及び／または開裂部位をコードする核酸配列の部分内に位置し、ＡＰＣ によって僅かしか不活性化されない第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第 ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子をもたらすことを特徴とする請求 項１に記載の方法。 ３．第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列中の突然変異が、第Ｖ 因子及び／もしくはＶａまたは第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子 上のＡＰＣ開裂部位をコードする核酸配列の部分内に位置し、ＡＰＣによって僅 かしか不活性化されない第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因 子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子をもたらすことを特徴とする請求項１または ２に記載の方法。 ４．第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列中の突然変異が、第Ｖ 因子及び／もしくはＶａまたは第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子 のＨ鎖上のＡＰＣ開裂部位をコードする核酸配列の部分内に位置し、ＡＰＣによ って僅かしか不活性化されない第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩ ＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子をもたらすことを特徴とする請求項１ から３のいずれか１項に記載の方法。 ５．第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子をコードする核酸配列中に確認するべき突然 変異が、Ｘａを介して活性化された第Ｖ因子に由来する第Ｖａ因子上かまたはＸ ａを介して活性化された第ＶＩＩＩ因子に由来する第ＶＩＩＩａ因子上のＡＰＣ 結合及び／または開裂部位をコードする配列の部分に位置することを特徴とする 請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。 ６．核酸配列中に確認するべき突然変異が突然変異アミノ酸配列を有するヒト第 Ｖ及び／またはＶａ因子をコードする核酸配列をもたらし、前記突然変異アミノ 酸配列は好ましくは、血漿第Ｖ因子（参考文献２１）の配列のアミノ酸５０６に 対応する位置に別のアミノ酸を含むことを特徴と する請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。 ７．核酸配列中に確認するべき突然変異が突然変異アミノ酸配列を有するヒト第 ＶまたはＶａ因子をコードする核酸配列をもたらし、前記突然変異アミノ酸配列 は血漿第Ｖ因子（参考文献２１）の配列のアミノ酸５０６に対応する位置にグル タミンアミノ酸を含むことを特徴とする請求項１から６のいずれか１項に記載の 方法。 ８．核酸配列中に確認するべき突然変異が血漿第Ｖ因子（参考文献２１）の配列 のアミノ酸５０６に対応するアミノ酸をコードするコドンの２番目のヌクレオチ ドに対応する位置におけるヌクレオチドＧの突然変異であることを特徴とする請 求項１から７のいずれか１項に記載の方法。 ９．核酸配列中に確認するべき突然変異が血漿第Ｖ因子（参考文献２１）の配列 のアミノ酸５０６に対応するアミノ酸をコードするコドンの２番目のヌクレオチ ドに対応する位置におけるＧからＡへの突然変異であることを特徴とする請求項 １から８のいずれか１項に記載の方法。 １０．確認するべき突然変異が、突然変異が位置し得る核酸鎖の５′及び３′末 端に隣接する核酸鎖を認識してそれらとハイブリダイズするのに十分な特異性を 具えたプライ マーを用いて、及び／または突然変異が位置し得る核酸鎖を認識してそれとハイ ブリダイズするのに十分な特異性を具えたプライマーを用いて突然変異が位置し 得る核酸鎖の核酸標的増幅反応を生起させることにより検出可能であり、その際 ハイブリダイゼーションを突然変異が位置し得る核酸鎖の増幅に十分な程度に生 起させ、増幅はそれ自体公知である核酸増幅方法で行ない、その後得られた増幅 核酸を、突然変異の存在と場合によってはその種類とを検出するべくそれ自体公 知の方法で分析することを特徴とする請求項１から９のいずれか１項に記載の方 法。 １１．標的増幅反応をＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、ＰＣＲ（ポリメラ ーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）及びＲＣＲ（修復連鎖反応）の中 から選択することを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １２．確認するべき突然変異が、第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子をコードする核 酸配列の少なくとも一部とハイブリダイズするのに十分な特異性を具えた少なく とも１個の核酸配列とのハイブリダイゼーション反応をそれ自体公知の方法で生 起させ、その後このように単離した核酸を突然変異の存在と場合によってはその 種類とを検出するべくそれ 自体公知の方法で分析することにより検出可能であることを特徴とする請求項１ から１１のいずれか１項に記載の方法。 １３．単離及び／または増幅した核酸物質に対して、突然変異の存在と場合によ ってはその種類とを検出するべく、少なくとも核酸配列の突然変異を含む断片と ハイブリダイズするのに十分な長さ及び特異性を具えた対応する相補的配列を有 する核酸物質鎖とのハイブリダイゼーション試験を行なうことを特徴とする請求 項１０から１２のいずれか１項に記載の方法。 １４．単離及び／または増幅した核酸物質に対して、配列表に示した配列番号１ ２または１３の核酸物質鎖とのハイブリダイゼーション試験を行なうことを特徴 とする請求項１３に記載の方法。 １５．ハイブリダイゼーションに用いるプライマーもしくは核酸配列がヒト第Ｖ 因子をコードする核酸配列のイントロン１０の少なくとも一部かまたは該一部の 、ストリンジェント条件下に該一部とハイブリダイズし得る誘導体を含み、前記 一部は少なくとも１０ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする請求項１０ から１４のいずれか１項に記載 の方法。 １６．ハイブリダイゼーションに用いるプライマーもしくは核酸配列が、配列表 に示した配列番号１に従いヒト第Ｖ因子をコードするヌクレオチド配列の少なく とも一部、第Ｖ因子をコードする前記配列の、遺伝暗号の縮重に起因して相違す る誘導体の少なくとも一部、または第Ｖ因子をコードする前記配列もしくはその 誘導体の相補的配列の少なくとも一部を含み、このハイブリダイゼーション用プ ライマーもしくは核酸配列はストリンジェント条件下に前記一部または該一部の 相補的配列とハイブリダイズし得、前記一部は少なくとも１０ヌクレオチドの長 さを有し、かつ好ましくは配列番号１または配列番号１の相補的配列の対応する 部分と９０％より高率で相同であることを特徴とする請求項１０から１５のいず れか１項に記載の方法。 １７．ハイブリダイゼーションに用いるプライマーもしくは核酸配列を配列番号 ２〜１１の配列またはその相補的配列の中から選択することを特徴とする請求項 １０から１６のいずれか１項に記載の方法。 １８．単離及び／または増幅した、及び／またはハイブリダイズさせた核酸配列 に対してＳａｎｇｅｒジデオキシヌ クレオチド配列決定法など、それ自体公知の方法で配列分析を行ない、配列を対 応する非突然変異因子の核酸配列と比較することを特徴とする請求項１０から１ ７のいずれか１項に記載の方法。 １９．単離及び／または増幅した、及び／またはハイブリダイズさせた核酸物質 に対して制限断片分析をそれ自体公知の方法で行なうことを特徴とする請求項１ ０から１８のいずれか１項に記載の方法。 ２０．制限断片分析に用いる制限酵素をＭｎｌＩとすることを特徴とする請求項 １９に記載の方法。 ２１．タンパク質中の突然変異が、第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子上にＡＰ Ｃ結合及び／または開裂部位を提供するそのアミノ酸配列の部分内に位置し、Ａ ＰＣによって僅かしか不活性化されない第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子をも たらすか、または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子上にＡＰＣ結 合及び／または開裂部位を提供するそのアミノ酸配列の部分内に位置し、ＡＰＣ によって僅かしか不活性化されない第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ 因子をもたらすことを特徴とする請求項１に記載の方法。 ２２．第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは 第ＶＩＩＩａ因子のアミノ酸配列中の突然変異が、第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖ ａ因子上にＡＰＣ開裂部位を提供するそのアミノ酸配列の部分内に位置し、ＡＰ Ｃによって僅かしか不活性化されない第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子をもた らすか、または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子上にＡＰＣ開裂 部位を提供するそのアミノ酸配列の部分内に位置し、ＡＰＣによって僅かしか不 活性化されない第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子をもたらすこと を特徴とする請求項１または２１に記載の方法。 ２３．第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは 第ＶＩＩＩａ因子のアミノ酸配列中の突然変異が、第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖ ａ因子のＨ鎖上にＡＰＣ開裂部位を提供するそのアミノ酸配列の部分内に位置し 、ＡＰＣによって僅かしか不活性化されない第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子 をもたらすか、または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子のＨ鎖上 にＡＰＣ開裂部位を提供するそのアミノ酸配列の部分内に位置し、ＡＰＣによっ て僅かしか不活性化されない第ＶＩＩＩ 因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子をもたらすことを特徴とする請求項１、２ １及び２２のいずれか１項に記載の方法。 ２４．第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは 第ＶＩＩＩａ因子のアミノ酸配列中に確認するべき突然変異が、Ｘａを介して活 性化された第Ｖ因子または第ＶＩＩＩ因子に由来する第Ｖａ因子または第ＶＩＩ Ｉａ因子上にＡＰＣ結合及び／または開裂部位を提供する該配列の部分に位置す ることを特徴とする請求項１及び２１から２３のいずれか１項に記載の方法。 ２５．確認するべき突然変異がヒト第ＶまたはＶａ因子の突然変異アミノ酸配列 をもたらし、この突然変異アミノ酸配列は血漿第Ｖ因子（参考文献２１）のアミ ノ酸配列のアミノ酸５０６に対応する位置に別のアミノ酸を含むことを特徴とす る請求項１及び２１から２４のいずれか１項に記載の方法。 ２６．確認するべき突然変異がヒト第ＶまたはＶａ因子の突然変異アミノ酸配列 をもたらし、この突然変異アミノ酸配列は血漿第Ｖ因子（参考文献２１）のアミ ノ酸配列のアミノ酸５０６に対応する位置にグルタミンアミノ酸を含む ことを特徴とする請求項１及び２１から２５のいずれか１項に記載の方法。 ２７．突然変異体タンパク質第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩ Ｉ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子に結合し得るかまたは突然変異体タンパ ク質第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第 ＶＩＩＩａ因子の、突然変異を有する線状タンパク質分解フラグメントに結合し 得る特異的抗体を、それ自体公知のイムノアッセイ法で行なうイムノアッセイに おいて用いることによって突然変異を検出し、前記抗体は非突然変異タンパク質 または非突然変異タンパク質の対応するタンパク質分解フラグメントに対して、 突然変異体タンパク質または突然変異体タンパク質の対応するタンパク質分解フ ラグメントに対して有するものより低い結合親和性を有することを特徴とする請 求項１及び２１から２６のいずれか１項に記載の方法。 ２８．タンパク質第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子及び／または該タンパク質 のタンパク質分解フラグメントに結合し得るかまたはタンパク質第ＶＩＩＩ因子 及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子及び／または該タンパク質のタンパク 質分解フラグメントに結合し得る特異的抗体を、それ自体公知のイムノアッセイ 法で行なうイムノアッセイにおいて用いることによって突然変異を検出し、前記 タンパク質はＡＰＣによる不活性化の度合いの低下を示さず、前記抗体は対応す る突然変異体タンパク質及び／または、ＡＰＣによる不活性化の度合いの低下を 示す突然変異体タンパク質をもたらす突然変異を有する該突然変異タンパク質の タンパク質分解フラグメントに対して、非突然変異体因子またはそのタンパク質 分解フラグメントに対して有するものより低い結合親和性を有することを特徴と する請求項１及び２１から２６のいずれか１項に記載の方法。 ２９．試験するべき試料を、場合によっては１種以上のプロテアーゼと組み合わ せたＡＰＣで処理し、それによって試料中に存在する、活性なＡＰＣ開裂部位が 存在する場合にそのような突然変異が無い場合と比較して異なるタンパク質分解 フラグメントをもたらす、活性なＡＰＣ開裂部位を有する第Ｖ、Ｖａ、ＶＩＩＩ またはＶＩＩＩａ因子のいずれをも確実に切断し、その後得られた試料を２種の 抗体と接触させ、その際一方の抗体は因子またはそのタンパク質分解フラグメン ト上で、試験するべき特定のＡＰＣ開裂 部位の上流に位置する部位を特異的に認識し得、他方の抗体は因子またはそのタ ンパク質分解フラグメント上で、試験するべき特定のＡＰＣ開裂部位の下流に位 置する部位を特異的に認識し得、かついずれの抗体も因子またはそのタンパク質 分解フラグメント上の、抗体部位と試験するべき特定のＡＰＣ開裂部位との間に 他のＡＰＣ開裂部位が存在しないようにして位置する部位を認識し、任意に用い る前記１種以上のプロテアーゼは因子を、得られるタンパク質分解フラグメント 上で確認するべきＡＰＣ開裂部位と１種以上の他のプロテアーゼの開裂部位との 間に他のＡＰＣ開裂部位が存在しないように切断し、１種以上の他のプロテアー ゼは好ましくは因子を、確認するべきＡＰＣ開裂部位の下流と上流とで切断し、 試料中のタンパク質分解フラグメントへの前記両抗体の結合をそれ自体公知の方 法で行なうイムノアッセイにおいて確認することを更に含み、前記結合の検出は 突然変異を示唆し、結合の不在は因子が前記特定のＡＰＣ開裂部位に関して正常 であることを示唆することを特徴とする請求項１及び２１から２６のいずれか１ 項に記載の方法。 ３０．試験するべき試料を、確認するべき突然変異ＡＰＣ 開裂部位において切断を行ない得ず、非突然変異ＡＰＣ開裂部位の切断は行ない 得るプロテアーゼで処理し、試料の処理は場合によっては、１種以上の別のプロ テアーゼとの組み合わせで行ない、それによって試料中に存在する、活性なＡＰ Ｃ開裂部位が存在する場合に確認するべきＡＰＣ開裂部位を不活性化する突然変 異が有る場合と比較して異なるタンパク質分解フラグメントをもたらす、活性な ＡＰＣ開裂部位を有する第Ｖ、Ｖａ、ＶＩＩＩまたはＶＩＩＩａ因子のいずれを も確実に切断し、その後得られた試料を２種の抗体と接触させ、その際一方の抗 体は因子またはそのタンパク質分解フラグメント上で、試験するべき特定のＡＰ Ｃ開裂部位の上流に位置する部位を特異的に認識し得、他方の抗体は因子または そのタンパク質分解フラグメント上で、試験するべき特定のＡＰＣ開裂部位の下 流に位置する部位を特異的に認識し得、かついずれの抗体も因子またはそのタン パク質分解フラグメント上の、抗体部位と試験するべき特定のＡＰＣ開裂部位と の間に他のＡＰＣ開裂部位が存在しないようにして位置する部位を認識し、任意 に用いる前記１種以上の別のプロテアーゼは因子を、得られるタンパク質分解フ ラグメント上で確認するべきＡＰＣ開 裂部位と１種以上の別のプロテアーゼの開裂部位との間に他のＡＰＣ開裂部位が 存在しないように切断し、１種以上の別のプロテアーゼは好ましくは因子を、確 認するべきＡＰＣ開裂部位の下流と上流とで切断し、試料中のタンパク質分解フ ラグメントへの前記両抗体の結合をそれ自体公知の方法で確認することを更に含 み、前記結合の検出は突然変異を示唆し、結合の不在は因子が前記特定のＡＰＣ 開裂部位に関して正常であることを示唆することを特徴とする請求項１及び２１ から２６のいずれか１項に記載の方法。 ３１．試験するべき試料を、確認するべき突然変異ＡＰＣ開裂部位において切断 を行ない得、非突然変異ＡＰＣ開裂部位の切断は行ない得ないプロテアーゼで処 理し、試料の処理は場合によっては、１種以上の別のプロテアーゼとの組み合わ せで行ない、それによって試料中に存在する、確認するべき種類の突然変異ＡＰ Ｃ開裂部位が存在する場合にそのような突然変異が無い場合と比較して異なるタ ンパク質分解フラグメントをもたらす、前記のような突然変異ＡＰＣ開裂部位を 有する第Ｖ、Ｖａ、ＶＩＩＩまたはＶＩＩＩａ因子のいずれをも確実に切断し、 その後得られた試料を２種の抗体と接触させ、その際一方の抗体は因子また はそのタンパク質分解フラグメント上で、確認するべきＡＰＣ開裂部位に特異的 な特定のプロテアーゼの上流に位置する部位を特異的に認識し得、他方の抗体は 因子またはそのタンパク質分解フラグメント上で確認するべき特定のＡＰＣ開裂 部位の下流に位置する部位を特異的に認識し得、かついずれの抗体も因子または そのタンパク質分解フラグメント上の、抗体部位と試験するべき特定のＡＰＣ開 裂部位との間に他のＡＰＣ開裂部位が存在しないようにして位置する部位を認識 し、任意に用いる前記１種以上の別のプロテアーゼは因子を、得られるタンパク 質分解フラグメント上で確認するべきＡＰＣ開裂部位と１種以上の別のプロテア ーゼの開裂部位との間に他のＡＰＣ開裂部位が存在しないように切断し、１種以 上の別のプロテアーゼは好ましくは因子を、確認するべきＡＰＣ開裂部位の下流 と上流とで切断し、試料中のタンパク質分解フラグメントへの前記両抗体の結合 をそれ自体公知の方法で確認することを更に含み、前記結合の検出は因子が正常 であることを示唆し、結合の不在は因子が前記特定のＡＰＣ開裂部位に関して突 然変異したことを示唆し、非突然変異ＡＰＣ開裂部位を切断し得るプロテアーゼ を含有しない試料にのみ適用可能で あることを特徴とする請求項１及び２１から２６のいずれか１項に記載の方法。 ３２．イムノアッセイがサンドイッチアッセイであることを特徴とする請求項２ ９から３１のいずれか１項に記載の方法。 ３３．非突然変異第Ｖ因子及び／もしくはＶａまたは非突然変異第ＶＩＩＩ因子 及び／もしくはＶＩＩＩａに比較してＡＰＣによる不活性化の度合いが低い突然 変異体タンパク質第Ｖ因子及び／もしくはＶａまたは第ＶＩＩＩ因子及び／もし くは第ＶＩＩＩａ因子に結合し得るか、または突然変異体タンパク質第Ｖ因子及 び／もしくはＶａまたは第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子の突然 変異を有するタンパク質分解フラグメントに結合し得る抗体であって、非突然変 異タンパク質または非突然変異タンパク質の対応するタンパク質分解フラグメン トに対し突然変異体タンパク質またはその対応するタンパク質分解フラグメント に対して有するものより低い結合親和性を有する抗体。 ３４．タンパク質第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子及び／または該タンパク質 のタンパク質分解フラグメントに結合し得るか、またはタンパク質第ＶＩＩＩ因 子及び／もし くは第ＶＩＩＩａ因子及び／または該タンパク質のタンパク質分解フラグメント に結合し得る特異的抗体であって、前記タンパク質はＡＰＣによる不活性化の度 合いの低下を示さず、対応する突然変異体タンパク質及び／または該タンパク質 の、ＡＰＣによる不活性化の度合いの低下を示す突然変異体タンパク質をもたら す突然変異を有するタンパク質分解フラグメントに対し非突然変異体因子または そのタンパク質分解フラグメントに対して有する結合親和性より低い結合親和性 を有する抗体。 ３５．第Ｖ、Ｖａ、ＶＩＩＩまたはＶＩＩＩａ因子上で特定のＡＰＣ開裂部位の 上流に位置し、かつ前記因子上で抗体結合部位と前記特定のＡＰＣ開裂部位との 間に第二のＡＰＣ開裂部位が位置するようには位置しない部位を認識し得る抗体 。 ３６．第Ｖ、Ｖａ、ＶＩＩＩまたはＶＩＩＩａ因子上で特定のＡＰＣ開裂部位の 下流に位置し、かつ前記因子上で抗体結合部位と前記特定のＡＰＣ開裂部位との 間に第二のＡＰＣ開裂部位が位置するようには位置しない部位を認識し得る抗体 。 ３７．第Ｖ因子または第Ｖａ因子のアミノ酸１〜３０６、 アミノ酸３０７〜５０６、アミノ酸５０７〜６７９、アミノ酸６８０〜９９４及 びアミノ酸９９５〜末端の中から選択される一つのフラグメント上の１個の部位 を特異的に認識し得る抗体。 ３８．モノクローナル抗体であることを特徴とする請求項３３から３７のいずれ か１項に記載の抗体。 ３９．請求項３５に記載の抗体及び請求項３６に記載の抗体を含むキットであっ て、前記抗体が好ましくは請求項３７に記載の抗体の中から選択され、かつ好ま しくは請求項３８に記載の抗体であるキット。 ４０．配列表に示した配列番号１に従いヒト第Ｖ因子のイントロン１０をコード する配列の少なくとも一部かまたは対応する相補鎖の少なくとも一部を含むヌク レオチド配列であって、ヒト第Ｖ因子の少なくとも一部をコードする核酸物質の 単離、増幅及び／または検出に用いるヌクレオチドプライマーまたはハイブリダ イゼーション断片としてそれ自体公知の方法で用いるのに十分な長さを有する配 列。 ４１．配列表に示した配列番号１２または１３の配列であることを特徴とする請 求項４０に記載のヌクレオチド配列。 ４２．被験者が第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または 第ＶＩＩＩ因子及び／もしくはＶＩＩＩａにおける突然変異に関して同型である か異型であるかを確認する方法であって、ＡＰＣに対する抗凝血応答に欠陥が存 在するかどうかを確認するそれ自体公知の方法を実施し、その後好ましくは正規 化される（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）／（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）の値など、欠陥の診断に 有用であることが知られているパラメーターの値を求め、得られた値を、正常な 個人または同型もしくは異型であることが既知である個人に由来する試料から同 じ方法で得た値と比較し、それによって被験者がＡＰＣに対する抗凝血応答の欠 陥に関して同型であるか異型であるかを確定する操作を、第Ｖ因子及び／もしく は第ＶＩＩＩ因子及び／もしくは第ＶＩＩＩａ因子における突然変異の存在と場 合によってはその種類とを確認する請求項１から２８のいずれか１項に記載の方 法と組み合わせて含む方法。 ４３．被験者が第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／ もしくはＶＩＩＩａにおける突然変異に関して同型であるか異型であるかを確認 する方法であって、試験するべき試料にＣｅｐｈｏｔｅｓｔ試薬、ＣａＣｌ₂を ２５ｍＭより多く、好ましくは４０ｍＭより少ない 量で、更に好ましくは３０〜３５ｍＭの量で添加することを含む、ＡＰＣに対す る抗凝血応答に欠陥が存在するかどうかを確認する方法を実施し、好ましくは正 規化される（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）／（ＡＰＴＴ−ＡＰＣ）の値など、欠陥の診断 に有用であることが知られているパラメーターの値をＫｏｓｔｅｒ法に類似の方 法で決定し、得られた値を、正常な個人または同型もしくは異型であることが既 知である個人に由来する試料から同じ方法で得た値と比較し、それによって被験 者がＡＰＣに対する抗凝血応答の欠陥に関して同型であるか異型であるかを確定 する操作を含む方法。 ４４．被験者が第Ｖ因子及び／もしくは第Ｖａ因子または第ＶＩＩＩ因子及び／ もしくはＶＩＩＩａにおける突然変異に関して同型であるか異型であるかを確認 する方法であって、試験するべき試料にＣｅｐｈｏｔｅｓｔ試薬、ＣａＣｌ₂を ２５ｍＭより多く、好ましくは４０ｍＭより少ない量で、更に好ましくは３０〜 ３５ｍＭの量で添加することを含む、ＡＰＣに対する抗凝血応答に欠陥が存在す るかどうかを確認する方法を実施し、（ＡＰＴＴ＋ＡＰＣ）／（ＡＰＴＴ−ＡＰ Ｃ）の値など、欠陥の診断に有用である ことが知られているパラメーターの値をＫｏｓｔｅｒ法に類似の方法で決定し、 得られた値を正規化し、結果として値が０．８４を下回る場合被験者を異常と確 認し、特に値が０．５０を下回る時は突然変異に関して同型であり、０．５０〜 ０．７０の時は異型であると確認することを含む方法。 ４５．増大する血栓症事象の危険を診断する方法であって、請求項１から３２及 び４２から４４のいずれか１項に記載の方法を実施することを含む方法。