DE19848665A1

DE19848665A1 - Ein automatisierbarer Schnelltest zum direkten Nachweis der APC Resistenz Mutation mit spezifischen Primern und Probes

Info

Publication number: DE19848665A1
Application number: DE19848665A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Springer
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1998-10-22
Publication date: 2000-04-27
Also published as: WO2000024928A2; AU6337699A; WO2000024928A3; EP1121467A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft einen automatisierbaren Gentest zum Nachweis des Thromboserisikofaktors APC (aktiviertes Protein C), geeignete Starteroligonukleotide, Oligonukleotidsonden für diesen Gentest, sowie ein Verfahren und ein Testteil zum Nachweis der APC Resistenz-Mutation.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen automatisierbaren Gentest zum Nachweis des Thromboserisikofaktors APC (aktiviertes Protein C) geeignete Starteroligo nukleotide, Oligonukleotidsonden für diesen Gentest, sowie ein Verfahren und ein Testkit zum Nachweis der APC Resistenz-Mutation.

1993 publizierten Dahlbäck et al. (PNAS 90.1004.1993) einen bisher nicht bekannten Gerinnungsdefekt, der mit einer deutlich erhöhten Frequenz an venösen und möglicherweise auch arteriellen Thrombosen korreliert ist. Bei Patienten mit throm bophiler Diathese wurde nach Zugabe von aktiviertem Protein C (APV) eine geringe Verlängerung der aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (aPTT) festgestellt. Dieses Phänomen wird als APC-Resistenz bezeichnet.

Defekte des Gerinnungssystems betreffen in erster Linie die antikoagulatorisch wirkenden Proteine Antithrombin III (Hach-Wunderle et al., Dtsch.med.Wschr. 118,187,1993; Hirsch et al., Amer. J. Med. 87 Suppl 3B,345,1989) Protein C (Clouse, New Engl. J. Med. 314,1298,1986) und Protein S (Gladson et al., Thrombos. Haemostas 59,18,1988). Schwere angeborene Hypoplasminogenämien (Gladson et al., Blood, 66 Supppl. 1,350A,1985) und Fälle von kongenitalem Heparin-Cofaktor II Mangel (Bertina, Thrombos Haemostas, 57,196,1987) sind sehr selten. Eine gesteigerte Thromboseneigung kann auch durch eine Verminderung der fibrinolytischen Aktivität in Form einer gestören t-PA-Freisetzung (Grimaudo et al., Thrombos Haemostas, 67,397,1992) oder Erhöhung des Plaminogen-Aktivator- Inhibitors (Engesser et al., Thrombos Haemostas, 62,673,1989) erfolgen. Eine Ver erbung dieser Defekte wurde allerdings nicht beobachtet.

Der Defekt des Gerinnungsfaktors V bewirkt die Entwicklung der APC-Resistenz (Dahlbäck et al., PNAS 91,1396,1994). Faktor V hat neben der klassischen pro koagulatorischen Aufgabe, nämlich der Umwandlung von Prothrombin in Thrombin zusätzlich eine antikoagulatorische Funktion. Er ist bei der proteolytischen Inakti vierung von Faktor Va als Cofaktor von aktiviertem Protein C beteiligt. Durch Thrombinaktivierung wird die prokoagulatorische Wirkung des Faktor V verstärkt.

Bertina et al. (Nature, 369,64,1994) konnten zeigen, daß der Phänotyp einer APC- Resistenz mit einer Punktmutation in Position 1691 des Faktor V Gens korreliert ist. Guanin ist durch Adenin ersetzt, was im Faktor V Protein zu einem Glutamin/- Arginin-Austausch in Position 506 führt. Diese Mutation verändert die Cofaktor- Funktion von Faktor V, die prokoagulatorische Funktion bleibt jedoch erhalten. Der Defekt wurde von den Entdeckern als Faktor V Leiden gezeichnet.

Verschiedene klassische Tests wie der APC-Ratio-Test (Dahlbäck et al., PNAS, 90,1004,1993), APC-Response-Test (Moritz et al., Hamburger Hämophilie Symposium, 1994 S. 20) wurden entwickelt und werden in den Kliniken teilweise eingesetzt. Diese Tests sind jedoch sehr zeit- und arbeitsaufwendig. Auch die bislang beschriebenen molekularbiologischen Faktor V Gentests, die von einer Amplifika tion des Mutation tragenden Fragmentes ausgehen mit anschließender Spaltung des Fragmentes mit Restriktionsenzymen und der Identifizierung von unterschiedlichen Fragmentgrößen, je nach dem homozygoten, heterozygoten Vorliegen der Mutation oder dem Fehlen der Mutation (Wildtyp). (De Lucia D et al., Medlab 97 St. 236, Grenngard, Thrombosis research, 80,441,1995; Guillerm, Clinical chemistry 42,329,1996; Bertina, Nature 369,64,1994). Ein weiterer Nachteil dieser Methoden ist, daß sie nicht automatisierbar sind.

Der große Vorteil der beschriebenen Erfindung dagegen ist, daß durch die Verwen dung von speziellen, im Hinblick auf Länge und Mismatchsequenzen am 3. Ende optimierte mutations- und wildtypspezifischen Primern im Gegensatz zu den bisher bekannten auf Amplifikation basierenden Methoden keine nachträgliche Spaltung des Amplikons mit einem Restriktionsenzym notwendig ist und der Nachweis von homozygotem, heterozygotem Vorliegen der Mutation oder des Wildtyps nicht durch Nachweis der Fragmente in einer Gelelektrophorese notwendig ist, sondern durch einen vollautomatisierbaren Read out durch direkte Messung der Menge des gebil deten Amplikons über einen Chemilumineszentztest oder colorimetrischen Test. Durch die Verwendung einer RNA Detector Probe in Verbindung mit einem DNA/RNA Antikörper konnte darüber hinaus die Signalstärke des Amplikons um den Faktor 10 und die Sensitivität des Tests gegenüber herkömmlichen DNA-Tests um den Faktor 10 bis 100 gesteigert werden. Dadurch konnte die Menge an erforder lichem Testmaterial stark reduziert werden und die Zuverlässigkeit der Testaussage durch die deutlich höheren Signale selbst bei geringen Mengen an Testmaterial deutlich verbessert werden. Durch die bereits entwickelte Automatisierung des Ver fahrens ist der Read out einer großen Probenzahl (< 100) innerhalb von 20 Minuten möglich.

Die vorliegende Erfindung beschreibt mutationsspezifische Primer und Oligonukleo tidsonden und ihre Verwendung zum schnellen Nachweis der APC-Resistenz auf der Basis der Mutation 1691 im Exon 10 des Faktor V Gens in klinischen Probenmaterial und biologischen Körperflüssigkeiten ohne Restriktionsenzymspaltung und gelelek trophoretische Identifizierung der Spaltprodukte. Die Amplifikation mit dem Muta tionsprimer oder dem Wildtypprimer erfolgt nur wenn die Mutation bzw. keine Mutation vorhanden ist. Die Methode ist deshalb besonders schnell und automa tisierbar, weil direkt über die Amplifikation der Mutationstyp der APC Resistenz bestimmbar ist und in dem Read out beispielsweise mit magnetischen Beads nach dem in Beispiel 5 und 6 beschriebenen Methoden eine automatische Durchführung möglich ist, z. B. Immuno I, Bayer Diagnostics, Tarrytown.

Die Erfindung betrifft Starteroligonukleotide enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 1. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Set aus dem vorstehend genannten Starteroligonukleotid und einem Starternukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 3. Dieses Set eignet sich für die Amplifikation und den spezifischen Nachweis von G/A-Punktmutationen in Position 1691 der Nukleotidsequenz des Exons X vom Faktor V Leiden Gen.

Die Erfindung betrifft weiterhin Starteroligonukleotide enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 2 sowie ein Set enthaltend das vorstehend genannte Starteroligonukleotid sowie ein Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 3. Dieses Set eignet sich für die Amplifikation und den spezifischen Nachweis der Wildtypbase G in Position 1691 der Nukleotidsequenz des Exons X vom Faktor V Leiden Gen.

Weiterhin betrifft die Erfindung Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 4; Oligo nukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 5; Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 6 sowie Oligonukleotidsonden, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 7.

Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von APC-Gen sequenzen in einem Probenmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) aus der Probe die DNA isoliert,
b) die Proben-DNA mit dem oben beschriebenen mutationsspezifischen Set von Starteroligonukleotiden amplifiziert,
c) die Proben-DNA in einem weiteren Ansatz mit dem oben beschriebenen Wildtyp-spezifischen Set von Starteroligonukleotiden amplifiziert und
d) die Amplifikationssignale auswertet.

Weiterhin betrifft die Erfindung einen Testkit zum Nachweis der APC-Resistenz- Mutation enthaltend eines oder mehrere der obengenannten Starteroligonukleotide sowie gegebenenfalls eine oder mehrere der obengenannten Oligonukleotidsonden.

Die Starteroligonukleotide (Primer) wurden aus der Gensequenz des Faktor V Gens (Cripe, Biochemistry 1992, Genbank Acession Number J05368) durch chemische Synthese hergestellt.

Die Erfindung betrifft Primer und Probes mit einer Länge von 15 bis 50, bevorzugt 18 bis 30, besonders bevorzugt 19 bis 25 Nukleotiden aus dem Bereich der Mutation 1691. Die Primer tragen am 3'-Ende das Nukleotid der Mutation oder des Wildtyps und zusätzlich mehrere, bevorzugt zwei bis fünf, besonders bevorzugt 2 weitere Mis matchbasen zur besseren Differenzierung zwischen Wildtyp und Mutation.

Die bevozugten Primer wurden aus dem Bereich ausgewählt

a) der spezifisch ist für den Mutationstyp G/A (Primer 1 SEQ ID No. 1)
b) der spezifisch ist für den Wildtyp (Primer 2 SEQ ID No. 2)
c) der spezifisch sit für das Wildtyp und Mutation tragende Faktor V Gen als Gegenstrang-Primer (universal Primer) (Primer 3 SEQ ID No. 3).

Die Oligonukleotidsonden aus dem Bereich 1533-1616 wurden durch chemische Synthese hergestellt (SEQ ID No. 4, 5). Dieser Bereich wird von allen Primern amplifiziert und ist spezifisch für das Faktor V Gen. Die Oligonukleotidsonden haben eine Länge von 20 bis 100, bevorzugt 20 bis 40 Nukleotide.

Die genomische DNA wurde durch Nukleinsäureisolierungsverfahren aus Blut isoliert.

Die Amplifikation von Teilen des Exon 10 vom Faktor V Gen wurde mit den spezifischen Primern 1 oder 2 aus dem kodierenden Bereich, die am 3. Ende die Base der Resistenzmutation tragen (A statt G (Mutationsprimer) und G (Wildtypprimer)) und einen spezifischen Primer 3 aus dem nichtkodierenden Strang des Gens, der als Gegenstrang-Primer (forward primer) für alle Amplifikationen eingesetzt wird, durchgeführt.

Für den Nachweis der Amplicons mit den Mutationen G/A, und Wildtyp G/G wird bevorzugt eine capture und detector Probe aus dem Nukleotidbereich 1533-1568 bzw. 1581-1616 (analog 108-143 bzw. 156-191 entsprechend Exon 10) eingesetzt. Diese haben im allgemeinen eine Länge von 20 bis 100 Nukleotiden, bevorzugt von 20 bis 50 Nukleotiden.

Die Amplifikation wurde mit Hilfe von bekannten Amplifikationstechniken, bevor zugt der PCR-DNA-Amplifikationsmethode (EP200362) durchgeführt:

Der Nachweis des spezifischen Amplifikationsproduktes kann nach an sich be kannten Methoden durchgeführt werden, beispielsweise durch:

a) direkte Elektrophorese des Amplifikationsproduktes im Agarosegel und Anfärbung durch interkalierende Agenzien wie Ethidiumbromid;
b) durch Fluoreszenzbestimmung des während der Amplifikation mit Fluores zenznukleotiden oder fluoreszenzmarkierten Primern markierten Amplifika tionsproduktes. Das Amplifikationsprodukt wird über zusätzlich eingebautes Biotin (Primer oder Nukleotid) separiert;
c) bevorzugt durch Hybidisierung des während der Amplifikation markierten Amplifikationsproduktes mit den obengenannten Oligonukleotidsonden durchgeführt. Der Hybridiserungskomplex wird mit Fluorescein Antikörper gecoateten magnetischen Partikeln separiert.

Die Auswertung des gebildeten Hybridisierungskomplexes als Maß für die Menge oder das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der APC Resistenz Mutation kann nach an sich bekannten Methoden erfolgen. Bevorzugt ist ein Chemilumineszenztest mit Antidigoxigenin-Antikörpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind (PCR) und mit dem in die Detektorsonde eingebauten Digoxigenin reagieren.

Der Test wird jeweils mit einem Ansatz mit Mutationsprimer und einem Ansatz Wildtyp-Primer durchgeführt zur Genotypdifferenzierung von wildtypspezifischen, heterozygoten oder homozygoten Vorliegen des Gendefektes. Bei normalem APC Gen erfolgt Amplifikation nur mit dem Wildtypprimer, der Mutationsprimer ergibt kein Amplicon und damit auch kein Chemilumineszenzsignal. Bei heterozygotem Gendefekt entsteht ein Amplicon sowohl mit Mutationsprimer wie Wildtypprimer und bei homozygotem Gendefekt ergibt nur er Mutationsprimer ein Amplicon und Chemilumineszenzsignal.

Der große Vorteil dieses Tests gegenüber den bislang publizierten Tests und in den Kliniken eingesetzten Tests besteht darin; daß nach der Amplifikation kein Restriktionsverdau des Amplikons durchgeführt werden muß mit anschließender Gelelektrophorese. Bei dem vorliegenden Test kann direkt über die Amplifikation entschieden werden welcher Gendefekt vorliegt, der Test ist automatisierbar und aufgrund nur eines einzigen Amplifikationsschrittes viel schneller und weniger arbeits- und kostenaufwendig als herkömmliche Tests.

Die Gensonden-Diagnostik insbesondere in Verbindung mit Amplifikationstechniken ist eine schnelle, spezifische und hochempfindliche Methode, die eine Früherken nung von spezifischen Genen, Genfragmenten oder Einzelmutationen auf DNA/RNA Ebene ermöglicht. Die Technik kann direkt im Untersuchungsmaterial durchgeführt werden. Sie basiert auf der DNA/RNA Hybridisierungstechnik, d. h. der spezifischen in vitro Bindung von komplementärer Einzelstrang-Nukleinsäure unter Bildung von Watson-Crick-Basenpaaren. Die gebildeten DNA/DNA oder DNA/RNA Doppel stränge werden auch als DNA-Hybride bezeichnet. Zur Detektion der spezifischen DNA oder RNA durch die Hybridiserungsreaktion werden komplementäre sequenz spezifische Gensonden verwendet. Diese Gensonden sind kurze, chemisch synthe tisierte Oligonukleotidsonden mit einer Länge von 10 bis 200, bevorzugt 18 bis 35, Nukleotiden.

Die Gensonden können fotochemisch (N. Dattagupta, P. M. M. Rae, E. D. Huguenel, E. Carlson, A. Lyga, J. S. Shapiro, J. P. Albarella, Analytical Biochem. 177.85.1989) oder enzymatisch durch nick Translation (Rigby, P. W. J. et al., J. Mol.Biol. 113.237.1977) oder Random Primed Techniken (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 132.6.1983) mit einer radioaktiven oder nichtradioaktiven Markierung versehen werden. Geeignet sind hierfür Markierungen mit ³²PNTPs oder nicht radioaktive Markierungen mit Reporter-Molekülen wie Digoxigenind-UTP, Biotin- dUTP oder direkte Markierung mit Enzymen wie alk. Phosphatase oder Horseradish Peroxidase.

Für die spezifische Hydribisierung zwischen der nachzuweisenden Nukleinsäure der spezifischen Gensonde werden die Nukleinsäuren zunächst durch Denaturierung (Hitze oder Alkalibehandlung) in Einzelstränge getrennt und dann unter stringenten Bedingungen, die durch Temperatur, Ionenstärke der Puffer und organische Lösungs mittel erreicht werden, ganz spezifisch miteinander hybridisiert. Bei geeigneten Hy bridisierungsbedingungen bindet die Gensonde nur an komplementäre Sequenzen der nachzuweisenden DNA oder RNA. Diese Hybridisierungsreaktion kann in ver schiedenen Testformaten z. B. als Festphasen an einen Träger wie z. B. Nitrozellulose gekoppelter Target-DNA oder Gensonde oder als Flüssighybridisierung durchgeführt werden. Die Auswertung (Read Out) erfolgt über die Markierung der Gensonde mit einem Reportermolekül wie oben aufgeführt oder wie in dem hier dargestellten Reversed Phase Hybridisierungssystem über die Target-DNA, die während der Amplifikation mit Digoxigenin-dUTP markiert wird und die Gensonde, die zur Bindung an magnetische Partikel mit Biotin markiert wird. Der Hybridisierungs komplex aus Target-DNA und markierter Gensonde wird nach Entfernen von nicht gebundener Gensonde über das verwendete Reportermolekül quantitativ bestimmt. Dieser Read Out kann direkt erfolgen bei Fluoreszenz-Markierung oder radioaktiver Markierung oder indirekt durch Enzymteste und immunologische Verfahren mit Antikörperkonjugaten, die Enzyme wie die alk. Phosphatase enthalten und dann eine Farbreaktion oder Chemilumineszenz-Reaktion ermöglichen.

Die Testsensitivität mit der Gensonden-Diagnostik liegt im Bereich von 10⁵ bis 10⁶ Kopien auf der Basis der Detektion von Einzelgenen. Eine Erhöhung der Testsensiti vität kann durch die Kombination mit DNA oder RNA-Amplifikationstechniken wie der PCR (EP 200362). LCR (EP 320308), NASBA (EP 329822), Qβ (PCT 87/06270) oder HAS-Technik (EP 427074) erreicht werden. Mit diesen Techniken kann eine bis zu 10⁹-fache Multiplikation der nachzuweisenden DNA erzielt werden. Durch die Kombination von Amplifikation und Hybridisierung wird so die Detektion von einzelnen DNA-Molekülen möglich.

Auswahl und Synthese von Primern

Die Auswahl von geeigneten spezifischen Primern erfolgte anhand der Nukleotid sequenz des Exon 10 des Faktor V Leiden Gens (Cripe, Biohemistry 1992, Genbank Acession Number J05268). Auf der Basis der Mutationssequenz und der Wildtyp- Nukleotidsequenz wurden Primer ausgewählt, die am 3. Ende die Base der Punkt mutation tragen. Für den Mutationstyp G/A wurde der Primer SEQ ID No. 1 syn thetisiert. Für den Wildtyp wurde der Primer 2 SEQ ID No. 2 syntetisiert. Für die Amplifikation der Mutation tragenden Sequenz wurde als Gegenstrang-Primer der Primer 3 SEQ ID No. 3 der allen Primer-Sets gemeinsam ist (Primer 1+3, 2+3) synthetisiert. Die Primer tragen am 3'-Ende zusätzlich mehrere, bevorzugt 2 weitere Mismatchbasen, zur besseren Differenzierung zwischen Wildtyp und Mutation.

Die chemische Synthese der ausgewählten Primer erfolgte nach der Phosphor amiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981.

Amplifikation von genomischer DNA

Für die Amplifikation der mutationstragenden Sequenz des Exons 10 von Faktor V Leiden wurden die obengenannten Primer jeweils als Primerset 1 (Primer 1+3), Primerset 2 (Primer 2+3) zur spezifischen Amplifikation der beiden APC-Formen (Mutante/Wildtyp) eingesetzt. Sie ergeben mit der genomischen DNA vom Wildtyp nur mit dem Wildtypprimer (Primerset II) im Agarosegel ein sichtbares Ampli fikationsprodukt. Die genomische DNA mit den Primerset I ergibt nur für das die APC Mutation tragende Exon 10 eine starke Amplifikationsbande und zeigt so die vorhandene Punktmutation an.

Bei der PCR-Amplifikation kann neben den 4 dNTPs (Desoxyadenosintriphophat, Desoxyguanosintriphosphat, Desoxycytidintriphosphat und Thymidintriphosphat) zusätzlich z. B. Digoxigenin-dUTP in das Amplifikationsprodukt eingebaut werden. Dadurch kann das Amplifikationsprodukt mit einem Antidigoxigenin-Antikörper, der z. B. alk. Phosphatase gekoppelt enthält, über einen Chemilumineszenztest mit AMPPD als Substrat oder einem Farbstoffiest mit pNPP ausgewertet werden.

Alternativ besteht die Möglichkeit fluoreszenzmarkierte Nukleosidtriphosphate wie z. B. Fluoreszein-dUTP oder Cumann-dUTPs in das Amplifikationsprodukt einzu bauen und das Amplifikationsprodukt mit viel höherer Sensitivität als mit Ethidium bromidanfärbung zu identifizieren. Bei der Verwendung von biotinylierten Primern besteht so die Möglichkeit das fluoreszenzmarkierte, biotinylierte Amplifikations produkt über Streptavidin gecoatete magnetische Partikel abzutrennen und im Fluoreszenzfotometer quantitativ zu bestimmen. Alternativ und bevorzugt in dieser Erfindung werden eine DNA capture Probe und eine unmarkierte RNA Probe als Detektorprobe eingesetzt und der Read out über einen DNA/RNA Antikörper durch geführt. Es kann auch nur eine Probe in Form einer fluoresceinmarkierten RNA- Probe eingesetzt werden, die als Capture- und Detector-Probe dient. Mit diesem neuen Gentest unter Verwendung des DNA/RNA Antikörpers werden deutlich bessere Sensitivitäten als mit den bisher üblichen Gentesten für andere Targets erreicht und damit sehr wenig Ausgangsmaterial für die Durchführung des Tests benötigt.

Auswahl und Synthese der Oligonukleotidsonden

Die Auswahl der für die Amplifikationsprodukte der Primersets spezifischen Oligo nukleotidsonden erfolgte aus dem Bereich 8167-8486 für das das mutationsspezi fische und wildtypspezifische Amplifikationsprodukt gemeinsam ist. Es wurde 30-36 Primere mit der Sequenz SEQ ID No. 4 und 5 synthetisiert, die spezifisch für die beiden Amplifikationsprodukte sind. Alternativ für SEQ ID No. 4 kann SEQ ID No. 6 oder No. 7 verwendet werden.

Die chemische Synthese erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucae und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22, 1859, 1981.

Mit den Oligonukleotidsonden besteht die Möglichkeit die mutationspezifischen und wildtypspezifischen Amplifikationsprodukte spezifisch zu hybridisieren. Das Verfah ren, bei dem zunächst mit den mutationsspezifische Primern Teile des Exons 10 vom Faktor V Leiden Gen amplifiziert werden und dann anschließend das Amplifikations produkt spezifisch mit den beiden Oligonukleotidsonden hybridisiert wird, hat ge genüber der reinen Amplifikationsdiagnostik über das Gel den Vorteil, daß die Test sensitivität um den Faktor 100-1000 höher ist und das Zeit- und arbeitsaufwendige Verfahren darüber hinaus nicht automatisierbar ist:

Detektion der APC Resistenz-Mutation

Die APC Mutation kann direkt nach Amplikation eines Teils des Exon 10 Gens von Factor V Leiden durch die in der Erfindung beschriebenen Primersets mit beliebigen Analyseverfahren bestimmt werden.

Eine mögliche Read Out Methode ist die Anfärbung des durch Agarosegelektro phorese separierten Amplifikationsproduktes mit interkalierenden Agenzien wie Ethidiumbromid.

Eine andere Möglichkeit ist der Einbau von fluoreszenzmarkierten Nukleosidtri phosphaten in das Amplifikationsprodukt. Hierdurch wird eine deutliche Verbes serung der Testsensitivität erreicht.

Eine weitere Möglichkeit ist die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Primern für die Amplifikation oder die Kombination von biotinylierten Primern mit Fluoreszenz nukleotiden, so daß ein endständig biotinyliertes, fluoreszenzmarkiertes Amplifika tionsprodukt entsteht, das an Streptavidin gekoppelte magnetische Partikel gebunden und separiert werden kann und die Fluoreszenz semiquantitativ bestimmt werden kann.

Die sensitivste und bevorzugte Methode ist die beschriebene Methode der Hybri disierung der Amplifikationsprodukte mit der beschriebenen Oligonukleotidsonde. Beim Einbau von z. B. Digoxigenin-dUTP während der Amplifikation und Ver wendung einer biotinylierten oder fluoreszinierten Oligonukleotidsonde, läßt sich der Hybridisierungskomplex an Streptavidin/Fluorescein-Antikörper gecoateten magneti schen Partikeln separieren und bei Verwendung von Antigigoxigenin-Antikörpern, die mit alk. Phosphatase gekoppelt sind, mit AMPPD oder CSPD als Subsrat über Chemilumineszenz semiquantitativ auswerten. Die bevorzugte Methode ist die Amplifikation ohne irgendeinen Einbau von Markermolekülen und der Nachweis des Amplikons durch Hybridisierung mit einer fluoreseinmarkierten Capture Probe und einer zusätzlichen RNA Probe als Detektorprobe. Die Detektion des hybridisierten Amplicons erfolgt dabei mit einem DNA/RNA Antikörper. Dieser Read out ergibt die höchste Sensitivität von allen bisher getesteten Testverfahren und wurde speziell für automatisierte Verfahren beispielsweise im Immunol Automaten und Nachfolge geräten entwickelt.

Beispiel 1 Synthese Starteroligonukleotiden (Primer)

Die chemische Synthese der ausgewählten Starteroligonukleotide (Primer) erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981. Folgende Nukleotidsequenzen wurden synthetisiert:
PCR-Primer 1 spezifisch f Mutation APC: SEQ ID No. 1
PCR-Primer 2 spezifisch f. Wildtyp APC: SEQ ID No. 2
PCR-Primer 3 universal Gegenstrangprimer: SEQ ID No. 3

Beispiel 2 Synthese und Auswahl der Oligonukleotidsonden

Die Oligonukleotidsonden (capture und detector probe) wurde aus dem Nukleotid bereich 8167-8486 des exons 10 des Faktor V Leiden Gens ausgewählt, der die mutationsrelevante Region enthält. Die chemische Synthese der ausgewählten Oligo nukleotidsonden erfolgte nach der Phosphoramiditmethode von S. L. Beaucage und M. Caruthers, Tetrahedron Letters, 22.1859.1981. Folgende Nukleotidsequenzen wurden synthetisiert:

DNA-Probes für Primer 1-3

Detector Probe: SEQ ID No. 4
TACTTATAAGTGGAACATCTTAGAGTTTGATGAACC
Capture Probe: SEQ ID No. 5
TGCCCAGTGCTTAACAAGACCATACTACAGTGACGT

RNA-Probes: SEQ ID No. 6-7

Detector Probes: SEQ ID No. 6
5'UACUUAUAAGUGGAACAUCUUAGAGUUUGAUGAACC
SEQ ID No. 7
5'UACUUAUAAGUGGAACAUCUUAGAGUUUGA

Die Detector Probe wurde nach der Methode von Bollum, The enzymes, Bayer ed, Vol. 10, p 145 Academic Press New York, am 3. Ende markiert. Die Endgruppen markierung wurde nicht radioaktiv mit Fluorescein-dUTP vorgenommen (Chang, L. M. S., Bollum T. J., J. Biol. Chem. 246.909.1971). In einem 50 ml Ansatz mit 10 ml Reaktonspuffer (Kaliumkakodylat 1 mol/l; Tris/HCl 125 mmol/l; Rinderserum albumin 125 mg/ml; pH 6,6; 25°C) 1 bis 2 mg Oligonukleotid, 25 Einheiten Terminale Transferase CoCl₂ 2,5 mmol/l und 1 ml Gluorescein-dUTP (1 mmol/l) werden nach 60 Minuten bei 37°C ca. 50% 3. Endmarkierung erreicht. Die Detector Probe wurde analog mit Digoxigenin-dUTP markiert oder es wurde eine nicht markierte RNA Probe eingesetzt.

Beispiel 3 APC spezifische DNA-Amplifikation mit der PCR-Methode

Die Amplifikation der Target-DNA wurde nach der Polymerase Chain Reaktion (EP 200362; 201184) durchgeführt. Zur PCR-Reaktion wurden eingesetzt 100 pg genomische DNA von Blutzellen (Leucozyten), 0,17 µmol Primer 1-5 SEQ ID No. 1-5, 2,5 Units Taq-Polymerase von Cetus/Perkin-Elmer sowie jeweils 200 µmol/l dNTPS in insgesamt 100 µl PCR-Puffer (50 mM KCl, 10 mM Tris/HCl pH 8,3, 2 mM MgCl₂, und 0,01% Gelatine. Die Amplifikation wurde in einem PCR- Prozessor der Firma CetuslPerkin-Elmer durchgefürht. Es wurden insgesamt 2 PCR- Ansätze mit Primerset 1 (Primer 1+3) und Primerset 2 (Primer 2+3 für den Nachweis von homozygoter, heterozygoter oder Wildtyp APC-Gen angesetzt. Eine Amplifika tionssignal mit Wildtyp + Mutationsprimer zeigt das heterozygote Vorliegen der Mutation, ein Signal mit Wildtyp, aber nicht mit Mutationsprimern zeigt den Wildtyp und ein Signal mit dem Mutationsprimerset, aber nicht mit dem Wildtypprimern zeigt das homozygote Vorliegen der Mutation.

Für den Chemilumineszenztest nach Beispiel 6 wurde in der PCR zusätzlich 0,15 mmol) Digoxigenin-dUTP zur Markierung des PCR-Produktes eingesetzt. Bei Verwendung einer RNA Probe als Detector Probe in Verbindung mit einem DNA/RNA Antikörper (Beispiel 7) wird die PCR ohne Markierungszusätze durchgeführt.

Standardbedingungen:

PCR Bedingungen
5 Min.	94°C
1 Min.	94°C denat.
1 Min.	54°C anneal.
130 Min.	72°C ext.
7 Min.	72°C
∞	4°C
AL=L<32 Zyklen

Vor der PCR muß die Plasmid-DNA 1 : 10⁵ verdünnt werden. Von dieser Verdünnung wird dann 1 µl eingesetzt und 99 µl PCR-Mix. Das entspricht einer Konzentration von 100 ng klinischer Probe. Die klinische Probe wird in einer Konzentration von 100 ng eingesetzt, ebenfalls 1 µ1 DNA und 99 µl Mix.

PCR-Mix, 10-fach
100 µl	10 × PCR-Puffer
20 µl	MgCl₂
20 µl	d'NTP's
2,5 µl	Primer Faktor V (250 ng/Ansatz)
2,5 µl	entspr. Gegenprimer (250 ng/Ansatz)
5 µl	Taq-Polymerase
850 µl	destilliertes Wasser
1 µl	DNA-Lösung (100 ng/Ansatz)

Beispiel 4 Direkte Auswertung des Amplifikationsproduktes

Zur direkten Auswertung des DNA-Amplifikationsproduktes wurden nach der Amplifikation interkalierende Agenzien wie z. B. Ethidiumbromid eingesetzt oder während der Amplifikation Fluoreszenz-Nukleotidtriphosphate wie z. B. Fluoreszein dUTP/ oder Cumann dUTP eingebaut. Es können auch Biotin-dUTP oder Digoxigenin-dUTP eingesetzt werden und mit Antikörper gekoppelter alk. Phosphatase ein Farbstoff-Read out durchgeführt werden. Auch können bei ge ringerer Sensitivität entsprechend fluoreszenzmarkierte Primer verwendet werden.

Die bevorzugte Methode war der Einbau von Cumann-UTP, weil dabei die beste Testsensitivität erreicht wurde. Das Amplifikationsprodukt wurde auf ein 0,8%iges Agarosegel aufgetragen und 30 Minuten bei 100 mA elektrophoretisiert. Die Fluor eszenz-Signale wurden unter einem UV-Transilluminator direkt ausgewertet.

Beispiel 5 Gensondentest von DNA-Amplifikationsprodukten

Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR) (EP200362), LCR (EP320308) und der Genson dentechnik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den herkömm lichen Gensonden-Read out Methoden erzielt.

Die Flüssighybridisierungstests wurden mit 100 ng 3-biotinylierten oder digoxi genierter Detectorsonde und fluoreszinierter Capturesonde und amplifizierter DNA nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durchgeführt.

Nach 5-minütigem Erhitzen auf 100°C wurden 50 µl 2x Hybridisierungsmix (50 ml 20XSSC, 1 g Blocking Reagenz (Boehringer), 2 ml 10%iges Lauroylsarcosin, 200 ml 20%iges SDS ad 100 ml bidest H₂O) zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei 37°C hyridisiert (Oligonukleotidsonde). Die magnetischen Beads (20 µl) werden zu 100 µl 1× Hybridisiermix zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybridisierungskomplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer B (0,1 SSC; 0,1% SDS) 1× gewaschen.

Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die mit DNA beladenen Beads wurden 1× mit 500 µl Blocking Puffer (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde separiert, abpipettiert und 250 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 2500 in Blocking Puffer) zugeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 500 µl Waschpuffer (Blocking Puffer + 0,3% Twenn 20) behandelt 4× 30 Sekunden, 1× 2 Minuten bei schwacher Bewe gung. Es wurde dann mit 100 µl Detektionslösung 0,8 µl CDP von Promega in Lumineszensmix (100 µl) 5 Min. bei Raumtemperatur inkubiert, dann die Chemilu mineszenz im Lumineszenz-Fotometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) 10 sec. gemessen.

Lumineszensmix
20,1 g	Diethanolamin 1 M
0,32 g	Pyranine 3mM
200 µl	IM MgCl 0,1 mM
0,1 g	Triton X100 0,5%/Vol
0,2 g	Na-azid 0,1%/Vol

mit HCl konz. auf pH 10 stellen
ad 200 ml bidest

Im Chemilumineszenztest mit Dig-Detector-Probe werden 40 µl des jeweiligen Amplicons eingesetzt, sowie 5 µl (50 ng) der fluoreszinierten capture Probe (APC-2) und 4 µl (1 : 10 verdünnt) (4 ng) der digoxigenierten Detection-Probe (APC-1).

Beispiel 6 Gensondentest von DNA-Amplifikationsprodukten mit DNA/RNA Antikörper- Read out

Durch die Kombination von geeigneten Target-Amplifikationsmethoden wie der Polymerase Chain Reaction (PCR) (EP200362), LCR (EP320308) und der Gen sonentechnik wird eine signifikante Sensitivitätssteigerung gegenüber den herkömm lichen Gensonden-Read out Methoden erzielt.

Die Flüssighybridierungstests wurden mit 100 ng 3'-unmarkierer RNA Detectorsond und fluoreszinierter Captur sonde und amplifizierter DNA nach Beispiel 3 in einem Volumen von 50 µl durchgeführt.

Nach 5-minütigem Erhitzen auf 100°C wurden 50 µl 2x Hybridisierungsmix (50 ml 20XSSC, 1 g Blocking Reagenz (Boehringer), 2 ml 10%iges Lauroylsarcosin, 200 ml 20%iges SDS ad 100 ml Bidest H₂O) zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei 37°C hybridisiert (Oligonukleotidsonde). Die magnetischen Beads (20 µl) werden zu Hybridisierungsansatz und 100 µl 1× Hybridsiermix zugegeben und 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur unter schwacher Bewegung inkubiert. Der gekoppelte Hybri disierungskomplex wurde mit den Beads separiert, die Restflüssigkeit abpipettiert und einmal mit Puffer B (0,1 SSC; 0,1% SDS) 1× gewaschen.

Anschließend wurde die Blocking Reaktion und Antikörper-Reaktion zum Nachweis der Hybridisierung über Chemilumineszenz durchgeführt. Die mit dem DNA RNH Hybrid beladenen Beads wurden 1× mit 500 µl Blocking Puffer (0,1 M Maleinsäure; 0,15 M NaCl pH 7,5; 1% Blocking Reagenz (Boehringer)) zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurde separiert, abpipettiert und 250 µl Antikörperkonjugat-Lösung (AK 1 : 2500 in Blocking Puffer) zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, dann separiert, abpipettiert und mit 500 µl Waschpuffer (Blocking Puffer + 0,3% Tween 20) behandelt 2× 30 Sekunden, 1× 2 Minuten bei schwacher Bewegung. Es wurde dann mit 100 µl Detektionslösung (0,8 µl CDP von Promega in Lumineszenzmix (100 µl) siehe Beispiel 5) 5 Minuten bei Raumtemperatur mit AMPPD 1 : 100 in Puffer 3 inkubiert, dann die Chemilumineszenz 10 sec. im Lumineszenz-Fotometer bei 477 nm (Lumacounter von Lumac) gemessen. Das Verfahren ist automatisiert auf dem Immunol oder Nach folgegeräten durchführbar.

Im Chemilumineszenztest mit den RNA-Probes wird nur 4 µl Amplikon eingesetzt, sowie 5 µl Fluorescein-capture-Probe (50 ng) und 1 µl RNA-Probe (3 µl Oligo + 17 µl Wasser verd.) (150 ng).

Beispiel 7 Isolierung von Blut-DNA

0,1 bis 1 ml Blut mit 1 Volumen 0,1 bis 1 ml Puffer Cl und 3 Volumen eiskaltem H₂O vermischt und 10 Minuten auf Eis inkubiert. Das lysierte Blut wird bei 4°C und 1300 g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Nach Zugabe von 250 µl eiskalten Puffer C1 und 750 µl H₂O wird gemixt und nochmals 5 Minuten bei 1300 g zentrifugiert. Dann werden 1 ml Puffer G2 zugegeben und durch Vortexen 10 bis 30 Sekunden gemischt.

Nach Zugabe von 25 µl Protease Stammlösung wird 30 Minuten bei 50°C inkubiert und auf die Qiagensäule mit 1 ml Puffer QBT aufgetragen und eluiert. Die Qiagen säule wird mit 3× 1 ml Puffer QC gewaschen und dann die genomische DNA mit 2× 1 ml Puffer QF eluiert. Nach Zugabe von 0,7 ml Isopropanol wird bei 4°C 15 Minuten bei <5000 g zentrifugiert und abdekantiert, dann das Präzipitat mit 1 ml Ethanol gewaschen, 10 Minuten luftgetrocknet und dann in 0,1 bis 0,2 ml H₂O aufgenommen und für die Tests eingesetzt. Die Zusammensetzung der Puffer ist im Qiagen-DNA-Handbook 1995 beschrieben. Das Kit ist unter der Katalognummer 13323 erhältlich.

Beispiel 8 Nachweis der APC Resistenzmutation in klinischem Probenmaterial (Blut)

Die Leucozyten DNA wurde aus dem klinischen Probenmaterial (Blut) nach der in Beispiel 7 beschriebenen Methode isoliert. Das DNA-Lysat wurde dann mit Hilfe geeigneter Amplifikationsmethoden wie im Beispiel 5 beschrieben mit spezifischen Oligonukleotid-Primern amplifiziert. Die amplifizierte Nukleinsäure wurde dann mit den Oligonukleotidsonden SEQ ID No. 4+5 hybridisiert und der unter stringenten Bedingungen sich ausbildende spezifische Hybridisierungskomplex wurde mit mag netischen Partikeln von Bayer Diagnostics separiert und wie im Beispiel 6 oder be vorzugt 7, durch Chemilumineszenz-Read out quantitativ bestimmt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenz protokoll SEQ ID No. 1.

2. Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzpro tokoll SEQ ID No. 2.

3. Starteroligonukleotid enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 3.

4. Oligonukleotidsonde, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 4.

5. Oligonukleotidsonde, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 5.

6. Oligonukleotidsonde, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 6

7. Oligonukleotidsonde, gegebenenfalls markiert, enthaltend die Nukleotid sequenz gemäß Sequenzprotokoll SEQ ID No. 7.

8. Set aus Starteroligonukleotiden enthaltend das Starteroligonukleotid gemäß Anspruch 1 und ein Starteroligonukleotid gemäß Anspruch 3.

9. Set aus Starteroligonukleotiden enthaltend das Starteroligonukleotid gemäß Anspruch 2 und ein Starteroligonukleotid gemäß Anspruch 3.

10. Verfahren zum Nachweis von APC-Gensequenzen in einem Probenmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) aus der Probe die DNA isoliert,
b) die Proben-DNA mit dem mutationsspezifischen Set von Starteroligo nukleotiden gemäß Anspruch 8, amplifiziert,
c) die Proben-DNA in einem weiteren Ansatz mit dem Wildtyp-spezifi schen Set von Starteroligonukleotiden gemäß Anspruch 9 amplifiziert und
d) die Amplifikationssignale auswertet.

11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt d) die Oligonukleotidsonden gemäß den Ansprüchen 4 bis 7 zur spezifischen Hybridisierung und Detektion der APC-Resistenz-Mutationsamplikons und Wildtyp-Amplikons einsetzt.

12. Testkit zum Nachweis der APC-Resistenz-Mutation enthaltend eines oder mehrere der Starteroligonukleotide gemäß den Ansprüchen 1 bis 3 sowie ge gebenenfalls eines oder mehrere der Oligonukleotide gemäß den Ansprüchen 4 bis 7.

13. Testkit gemäß Anspruch 12 enthaltend das Set aus Starteroligonukleotiden gemäß Anspruch 8 und das Set aus Starteroligonukleotiden gemäß Anspruch 9.