DE10052319A1 - Mutante der den Faktor VII aktivierenden Protease - Google Patents
Mutante der den Faktor VII aktivierenden ProteaseInfo
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Abstract
Es wird eine Mutante der DNA-Sequenz beschrieben, die für die den Blutgerinnungsfanktor VII und die Einketten-Plasminogenaktivatoren aktivierende Protease (FSAP) kodiert, wobei die Mutante an der Nukleotidposition 1177 einen G/C-Basenaustausch und/oder an der Nukleotidposition 1601 einen G/A-Basenaustausch aufweist. Die entsprechende Protease weist an der Aminosäureposition 393 einen Glu/Gln-Austausch und/oder an der Aminosäureposition 534 einen Gly/Glu-Austausch auf. Es werden diagnostische Verfahren beschrieben, die zum Erkennen von Patienten mit genetisch bedingter hetero- oder homozygoter Expression der FSAP dienen.
Description
Die Erfindung betrifft Mutanten der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden
Protease (FSAP), Verfahren zur Detektion der Mutanten auf Protein- sowie
RNA/DNA-Ebene und ihrer Verwendung.
Aus der deutschen Patentanmeldung 199 03 693.4 ist bereits eine aus dem
Blutplasma isolierte Protease bekannt, die den Gerinnungsfaktor VII aktivieren
kann. Aufgrund dieses ersten Befundes wurde sie als Faktor VII aktivierende
Protease (FSAP) bezeichnet. Detaillierte Untersuchungen zeigten, dass FSAP
auch ein potenter Aktivator von Einketten-Plasnninogenaktivatoren ist wie Pro
urokinase oder Einketten-Gewebe-Plasminogenaktivator (sct-PA). Aufgrund die
ser Eigenschaften wurden Anwendungsmöglichkeiten von FSAP beschrieben,
bspw. ihrer Anwendung als gerinnungsförderndes Mittel basierend auf der durch
F VII-Aktivierung unterstützten Beschleunigung der Coagulation. Allein oder in
Kombination mit Plasminogenaktivatoren kann FSAP auch zur Fibrinolyse An
wendung finden, bspw. bei thrombotischen Komplikationen.
Wie in den deutschen Patentanmeldungen 199 03 693.4 und 199 26 531.3 be
schrieben, wurden Tests zur Detektion der Protease entwickelt, die sowohl die
Quantifizierung des FSAP Antigengehaltes sowie deren Aktivität z. B. im Plasma
ermöglichen. Die Antigenbestimmung wird dabei vorzugsweise mittels eines
ELISA-Tests durchgeführt. Die FSAP-Aktivität kann - wie in der deutschen Pa
tentanmeldung 199 26 531.3 beschrieben - durch Quantifizierung der Aktivie
rung von Prourokinase zu Urokinase und deren Umsetzung eines chromogenen
Substrats mit anschließender Differenzmessung der Extinktion erfolgen. Ein ü
berraschender Befund bei Durchführung dieses Aktivitätstestes war, dass das
aus z. B. Plasma isolierte FSAP Proenzym bei den gewählten Inkubationsbedin
gungen aktiviert wurde und so die Aktivierung der Prourokinease ermöglichte.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass FSAP durch Eigenaktivierung in
die aktivierte Form überführt wird und so bspw. Prourokinase oder den F VII ak
tivieren kann. Dies wird durch die oben genannten Inkubationsbedingungen,
nämlich neutraler bis alkalischer pH-Wert, Kalziumionen und Heparin noch un
terstützt. Zudem weisen jüngste Ergebnisse darauf hin, dass Prourokina
se/Urokinase (oder Ein- und Zweiketten-tPA) selbst eine Aktivierung von Einket
ten-FSAP hervorrufen oder unterstützen.
Unter Anwendung der beiden vorstehend genannten Testsysteme, nämlich dem
ELISA- und dem Prourokinase-Aktivierungstest, wurden mehr als 180 Plasmen
gesunder Blutspender untersucht. Dabei zeigte sich, dass in 5 bis 10% aller
Proben eine gegenüber einen Plasmapool (aus mehr als 100 gesunden Spen
den) oder dem Durchschnitt des gesamten Testkollektives eine deutlich ernied
rigte Potenz der durch FSAP bewirkten Prourokinase-Aktivierung aufwiesen.
Dagegen wurden in der Mehrzahl dieser Spender (mit erniedrigter Aktivität)
durchschnittliche FSAP-Antigenwerte gemessen. Es wurde daher vermutet,
dass in den untersuchten Blutproben eine oder mehrere Modifikationen des
FSAP enthalten sein könnten, die eingeschränkte oder fehlende Aktivitäten zur
Folge hätten. Dies könnte in Polymorphismen in der Bevölkerung, also einer
oder mehrerer Mutationen in den FSAP-Strukturen, die sich in einer Änderung
der FSAP-Aminosäuresequenz zeigen, begründet sein, wie schon in der deut
schen Patentanmeldung 199 26 531.3 vermutet wurde. Die in der Regel um 50
bis 70% gegenüber dem Durchschnittswert aller untersuchten Spender ernied
rigten Aktivitäten weisen auf eine heterozygote Mutation hin. Dies könnte sich
phenotypisch durch wahrscheinlich paritätische Anwesenheit beider FSAP's,
nämlich der Wildtyp-FSAP und der mutanten Variante, im Plasma ausprägen.
Angenommen, die mutierte Variante hätte die Eigenschaft (nahezu) völlig ein
gebüßt, Prourokinase zu aktivieren, so würde im Mittel eine ungefähr halbierte
Aktivität messbar werden. Darüber hinaus wurden jedoch auch schon pseudo
homozygote Ausprägungen heterozygoter Mutationen anderer Proteine be
schrieben, bei denen lediglich das mutierte Protein detektierbar war, welches
aber als solches nur einen Teil der entsprechend detektierten biologischen Ei
genschaft eingebüßt hatte.
Um auszuschließen, dass der Mangel oder die Verminderung unbekannter po
tentieller Kofaktoren für die festgestellte Einbuße der FSAP-Aktivität verantwort
lich war, wurden FSAP-Proben von drei Spendern gereinigt, die bei wiederhol
ten Spenden eine signifikant erniedrigte Aktivität gezeigt hatten. Die hochgerei
nigten Proteine zeigten gegenüber der aus dem Plasmapool gereinigten FSAP
ebenfalls eine deutlich verminderte Aktivität. Dies reduzierte die Wahrschein
lichkeit eines Kofaktoreinflusses und erhöhte die einer Proteinmodifikation im
oben genannten Sinne. Überraschend war der Befund, dass die Potenz zur Ak
tivierung von Faktor VII nicht eingeschränkt zu sein scheint. Aus diesem Grunde
sind solche Mutanten besonders für die oben genannte Anwendung als gerin
nungsförderndes Mittel - wie in der deutschen Patentanmeldung 199 03 693.4
beschrieben - geeignet, da deren fibrinolytisches Potential offenbar limitiert ist.
Diese Mutanten können basierend auf den im folgenden beschriebenen Er
kenntnissen der Nukleotidsequenz-Änderungen rekombinant oder transgen her
gestellt werden. Sie können aber auch ebenso wie das entsprechende FSAP-
Protein (Ein- oder Zweiketten-FSAP) aus natürlichen Quellen wie Blutplasma
direkt isoliert werden. In den deutschen Patentanmeldungen 199 03 693.4,
199 37 219.5 und 199 37 318.7 wurden bereits Verfahren beschrieben, die die Her
stellung von FSAP erlauben, bevorzugt mit Hilfe der Immunabsorption, wie es in
der deutschen Patentanmeldung 100 36 641.4 im einzelnen erläutert ist. Die
bisher verwendeten monoklonalen Antikörper unterscheiden jedoch so weit be
kannt nicht zwischen dem Wildtyp und dem Mutanten des FSAP. Entsprechend
können monoklonale Antikörper, die spezifisch mit den Mutanten reagieren, zur
Herstellung der Mutanten verwendet werden. Dabei können die Antikörper durch
Immunisierung mit der Mutante gewonnen werden. Außerdem können Peptide
mit Proteinregionen, die den Aminosäuren 389 bis 397 (. . .SFRVQKIFK. . .)
und/oder 534 bis 539 (. . .EKRPGV. . .) der SEQ. ID No. 3 des Sequenzprotokolls
entsprechen, nach bekannten Methoden zur Immunisierung und Generierung
entsprechender Antikörper verwendet werden. Außerdem finden diese Antikör
per auch Anwendung zur spezifischen Detektion dieser Mutanten, z. B. als Rea
genzien in Nachweisverfahren wie ELISA, Western Blots, in der Immunhistolo
gie oder beim Fluorescence Assisted Cell Sorting (= FACS).
Dagegen können Antikörper, die spezifisch für den FSAP-Wildtyp sind bzw. ge
gen die entsprechenden Aminosäuresequenzen des Wildtyps gerichtet sind,
z. B. gegen die Aminosäuresequenzen 389 bis 397 (. . .SFRVEKIFK. . .) und/oder
gegen die Aminosäuresequenz 534 bis 539 (. . .GKRPGV. . .) gerichtet sind vor
allem in humanisierter Form als Pharmazeutikum zur prophylaktischen oder the
rapeutischen Inhibition der FSAP-Aktivität verwendet werden, um bspw. Blutun
gen zugrundeliegenden Hyperfibrinolysen entgegenzuwirken. Außerdem können
diese Antikörper auch zur Reinigung, Detektion und Differenzierung der Wildtyp-
FSAP in der oben beschriebenen Weise verwendet werden.
Die genomische Sequenz des FSAP wurde in der Genbank unter der Accession
No. AC 006097 durch Abgleich mit der bekannten cDNA-Sequenz (Choi-Miura,
Accession No. S 83182) identifiziert und dabei Intron- und Exon-Sequenzen ab
geleitet. Insgesamt wurden 12 Primerpaare entworfen, um die kodierernden Se
quenzen in spezifischen PCR-Reaktionen zusammen mit einem kleinen Teil der
jeweils flankierenden Intron-Sequenzen amplifizieren zu können.
Zunächst wurde die genomische DNA aus Blut von 2 Probanden mit erniedrigter
und von 4 Probanden mit normaler Prourokinase-Aktivität isoliert, mit allen
Primerpaaren amplifiziert und anschließend unter Verwendung der PCR-Primer
die DNA-Sequenz bestimmt. Das Ergebnis ist in Tab. 1 dargestellt. Insgesamt 4
Nukleotidpositionen in der kodierenden Region waren polymorph, d. h. an diesen
Stellen werden zwei Basen gleichzeitig nachgewiesen. Es ist daher davon aus
zugehen, dass in diesen Fällen Heterozygosität vorliegt, mit einem Wildtyp- und
einem mutanten Allel. Zwei davon (an Position 183 und 957) sind Drittbasenaus
tausche, die nicht zu einem Aminosäureaustausch führen. Die beiden anderen,
die nur in der DNA der Probanden mit erniedrigter Prourokinase-Aktivität gefun
den wurden, führen zu Aminosäureaustauschen wie in Tab. 1 dargestellt.
Um die Korrelation der beiden Mutationen mit erniedrigter Prourokinase-Aktivität
zu untersuchen, wurden die DNAs weiterer Personen an diesen Stellen sequen
ziert. Das Ergebnis ist in Tab. 2 zusammengefasst. Alle 6 Probanden mit ernied
rigter Prourokinase-Aktivität waren heterozygot an der Nukleotidposition 1601
(Gly-Glu Austausch), vier hatten zusätzlich die Heterozygosität an der Position
1177 (Glu-Gln Austausch). Keiner der insgesamt 11 Probanden mit normaler
oder am unteren Normalbereich befindlicher Prourokinase-Aktivität wie die oben
genannte Heterozygositäten auf. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass
zumindest der Austausch an Aminosäureposition 534 ursächlich mit der ernied
rigten Prourokinase-Aktivität zusammenhängt. Ob ein Aminosäureaustausch
allein in der Position 393 eine Erniedrigung der Prourokinase-Aktivität zur Folge
haben könnte, ist derzeit noch ungewiss.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine Mutante der DNA-Sequenz, die für die
den Blutgerinnungsfaktor VII und Einketten-Plasminogenaktivatoren aktvierende
Protease (FSAP) kodiert, die an der Nukleotidposition 1177 einen
G/C-Basenaustausch und/oder an der Nukleotidposition 1601 einen
G/A-Basenaustausch aufweist.
Die Nukleotidsequenz SEQ. ID No. 1 des beiliegenden Sequenzprotokolles gibt
die Sequenz des Wildtyps wieder. Die DNA-Sequenz der Mutante mit beiden
Austauschen an den Nukleotidpositionen 1177 und 1601 ist durch die
SEQ. ID No. 2 des Sequenzprotokolls beschrieben. Die entsprechende Aminosäurese
quenz des Wildtyps kann der SEQ. ID No. 3 des Sequenzprotokolls entnommen
werden. Die SEQ. ID No. 4 zeigt die Aminosäuresequenz der Mutante mit den
beiden Aminosäureaustauschen (Glu-Gln 393 und Gfy-Glu 534).
Mit dem Auffinden der im Sequenzprotokoll genannten DNA- und Aminosäure
sequenzen sind die Voraussetzungen zur Entwicklung diagnostischer Verfahren
zum Erkennen von Patienten mit genetisch bedingter hetero- oder homozygoter
Expression des FSAP geschaffen worden. Man kann die Mutationen entweder in
der genomischen DNA oder in der daraus abgeleiteten mRNA nachweisen. Der
Nachweis gelingt aber auch auf der Proteinebene mit monoklonalen oder po
lyklonalen Antikörpern, die gegen die Mutante mit der abgewandelten Amino
säuresequenz gerichtet sind.
Diagnostische Verfahren können erfindungsgemäß so durchgeführt werden,
dass man
- a) eine Probe, die die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 enthalten könnte, mit einem auf einem festen Träger fixierten ersten Antikörper ge mäß Anspruch 7 inkubiert und danach wäscht, dann einen zweiten, mar kierten Antikörper gemäß Anspruch 7 oder gegen den Wildtyp gerichteten markierten Antikörper zugibt und abermals auswäscht und das vom zwei ten Antikörper hervorgerufenen Signal misst oder
- b) eine Probe, die die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 enthalten könnte, mit einem auf einem festen Träger fixierten ersten Antikörper ge gen den Wildtyp inkubiert und danach wäscht, dann einen zweiten, mar kierten Antikörper gemäß Anspruch 7 zugibt und abermals auswäscht und das vom zweiten Antikörper hervorgerufenen Signal misst oder
- c) auf einem Träger die auf das Vorliegen der Mutante gemäß den Ansprü chen 3 oder 4 zu untersuchende Probe fixiert und sie mit einem markier ten Antikörper gemäß Anspruch 7 allein oder in Mischung mit einem un markierten Antikörper und anschließendem Nachweis des markierten An tikörpers detektiert oder
- d) einen auf einem Träger fixierten Antikörper gemäß Anspruch 7 mit einer auf das Vorliegen der Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 zu unter suchenden Probe in Gegenwart einer markierten Mutante versetzt und das durch die Markierung hervorgerufene Signal misst.
Bevorzugt ist ein diagnostisches Verfahren, bei dem man die Aktivität der FSAP
misst, indem man die die Protease enthaltende Probe an einem festen Träger
inkubiert, den zuvor ein gegen die Protease gerichteter Antikörper nach An
spruch 7 gekoppelt wurde und nach Auswaschen des festen Trägers die fixierte
Protease mit Reagenzien inkubiert, die deren Aktivitätsbestimmung erlaubt.
Dabei kann die Aktivität der Protease durch eine photometrische Bestimmung
der bei der Einwirkung auf chromogene Substrate auftretenden Extinktion ge
messen werden.
Es ist auch möglich, die Aktivität der Protease durch Messung
- - ihrer die Blutgerinnungsfaktoren VII/VIIa und V/Va inaktivierende Wirkung oder
- - ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Gerin nungstests oder
- - ihrer Plasminogenaktivatoren aktivierende Wirkung oder
- - ihre den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Wirkung zu bestimmen.
Schließlich stehen auch Verfahren zur Verfügung, bei denen die die Plasmino
genaktivatoren aktivierende Wirkung gemessen wird, durch die Aktivierung der
- - Einketten-Urokinase (scuPA, single chain urokinase plasminogen activa tor) oder des
- - Einketten-tPA (sctPA, single chain tissue plasminogen activator).
Zum Nachweis der für die Erniedrigung der Prourokinase-Aktivität verantwortli
chen Mutationen auf DNA- und RNA-Ebene können Verfahren eingesetzt wer
den, wie sie auch zum Nachweis von single nucleotid polymorphisms angewen
det werden, z. B.
- - die cDNA-Amplifikation der RNA oder die Amplifikation der genomischen DNA und ihre anschließende Sequenzierung;
- - der Mutationsnachweis auf Ebene der cDNA oder genomischen DNA o
der deren Amplifikate durch
- - die Hybridisierung mit sequenzspezifischen Sonden, die auch Markierungen zum Nachweis tragen können wie En zyme, alkalische Phosphatase, HRP, und deren Substrate, Fluoreszenzfarbstoffe, auch Reporter-Quencher-Paare (wie z. B. Scorpions, Molecular Beacons, TaqMan-Sonden), ra dioaktive Atome, Chromophore, Chemo- und Elektrochemo lumineszenzmarkierungen) oder
- - durch Verfahren wie die selektrive 2'-Amin-Acylierung, die elektro chemische Oxidation von Nukleinsä uren, durch "minor groove bin der" Oligonukleotid-Konjugate oder durch die HPLC.
Auf der Grundlage der Untersuchungsergebnisse, die durch die vorstehend ge
nannten Antigen- und Aktivitätstests erhalten wurden, konnten drei Gruppen von
gesunden Spendern hinsichtlich potentieller Mutationen auf genomischer Ebene
untersucht werden. Dazu wurde den Spendern Blut entnommen, und die
Blutzelle durch Zentrifugation vom Plasma getrennt. Die Plasmen wurden dann
zur Quantifizierung der FSAP-Antigen- und Aktivitätsspiegel verwendet und ent
sprechend den letzteren in drei Gruppen unterteilt, nämlich in
"hoch/durchschnittlich", "durchschnittlich/erniedrigt" und "signifikant erniedrigt".
Die gewonnenen Blutzellen wurden dann zur DNA/RNA-Extraktion verwendet.
Basierend auf den vorliegenden Ergebnissen ist nunmehr die rasche Detektion
einer oder beider beschriebenen Mutationen, gleichgültig ob hetero- oder homo
zygoten Genotyps, auf der Ebene der entsprechenden FSAP-Nukleotidsequenz
möglich. Während die vorstehend genannten Antigen- und Aktivitätstests in ge
sundem Zustand eines Spenders durchaus den Genotyp widerspiegeln, kann
dies bei Einflüssen auf die FSAP-Plasmaspiegel schwierig oder unmöglich wer
den. So können Parameter wie hormonelle Schwankungen, Lebensstil usw. be
sonders aber Krankheitszustände Antigen- und/oder Aktivitätsspiegel mehr oder
minder stark beeinflussen. Wie in der deutschen Patentanmeldung 199 26 531.3
beschrieben, kann bei einem Herzinfarkt die messbare FSAP-Aktivität bei kaum
erhöhtem Antigengehalt deutlich gegenüber dem Normalwert ansteigen, wo
durch Spender, die im gesunden Zustand eine erniedrigte FSAP-Aktivität auf
weisen, nun als "durchschnittlich" erscheinen.
Bspw. sind Untersuchungen, ob Patienten mit FSAP-Mutation ein erhöhtes Risi
ko haben, thrombotische Komplikationen wie Herzinfarkte zu erleiden, aufgrund
der vorstehend genannten Beschränkungen nur schwer möglich. Dagegen kön
nen bspw. Leberinsuffizienzen zu erniedrigten Plasmaspiegeln führen, was e
benfalls zu Missinterpretationen der "wahren" genetischen Prädisposition führen
kann. Ein Test auf FSAP-Mutationen auf DNA/RNA-Ebene ist dagegen von
temporären Ereignissen unabhängig. Die Kombination aller genannten Assays
ermöglicht ein komplettes Bild des Spenders/Patienten, nämlich die Beurteilung
einer potentiellen Mutation und des akuten Zustandes hinsichtlich einer Beein
flussung des Antigen-Aktivitätsverhältnisses. Daraus können prophylaktische
und therapeutische Maßnahmen resultieren.
Claims (19)
1. Mutante der DNA-Sequenz, die für die den Blutgerinnungsfaktor VII und
die Einketten-Plasminogenaktivatoren aktivierende Protease (FSAP) kodiert,
dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante an der Nukleotidposition 1177 ei
nen G/C-Basenaustausch und/oder an der Nukleotidposition 1601 einen
G/A-Basenaustausch aufweist.
2. Mutante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie die
Nukleotidsequenz SEQ. ID No. 1 des Sequenzprotokolls aufweist.
3. Mutante der FSAP, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante an der
Aminosäureposition 393 einen Glu/Gln-Austausch und/oder an der Aminosäure
position 534 einen Gly/Glu Austausch aufweist.
4. Mutante nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Ami
nosäuresequenz SEQ. ID No. 3 des Sequenzprotokolls aufweist.
5. Diagnostische Verfahren zum Erkennen von Personen mit genetisch be
dingter hetero- oder homozygoter Expression der FSAP, dadurch gekenn
zeichnet, dass man die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 und 4 in der geno
mischen DNA oder in der davon abgeleiteten mRNA nachweist.
6. Diagnostische Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Mutante auf der Proteinebene nachweist.
7. Monoklonale oder polyklonale Antikörper, dadurch gekennzeichnet,
dass sie gegen die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 gerichtet sind.
8. Diagnostische Verfahren zum Erkennen von Patienten mit genetisch be
dingter hetero- oder homozygoter Expression der FSAP, dadurch gekenn
zeichnet, dass man die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 und 4 durch Ver
wendung von Antikörpern nach Anspruch 7 nachweist.
9. Diagnostische Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass man
- a) eine Probe, die die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 enthalten könnte, mit einem auf einem festen Träger fixierten ersten Antikörper ge mäß Anspruch 7 inkubiert und danach wäscht, dann einen zweiten, mar kierten Antikörper gemäß Anspruch 7 oder gegen den Wildtyp gerichteten markierten Antikörper zugibt und abermals auswäscht und das vom zwei ten Antikörper hervorgerufenen Signal misst oder
- b) eine Probe, die die Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 enthalten könnte, mit einem auf einem festen Träger fixierten ersten Antikörper ge gen den Wildtyp inkubiert und danach wäscht, dann einen zweiten, mar kierten Antikörper gemäß Anspruch 7 zugibt und abermals auswäscht und das vom zweiten Antikörper hervorgerufenen Signal misst oder
- c) auf einem Träger die auf das Vorliegen der Mutante gemäß den Ansprü chen 3 oder 4 zu untersuchende Probe fixiert und sie mit einem markier ten Antikörper gemäß Anspruch 7 allein oder in Mischung mit einem un markierten Antikörper und anschließendem Nachweis des markierten An tikörpers detektiert oder
- d) einen auf einem Träger fixierten Antikörper gemäß Anspruch 7 mit einer auf das Vorliegen der Mutante gemäß den Ansprüchen 3 oder 4 zu unter suchenden Probe in Gegenwart einer markierten Mutante versetzt und das durch die Markierung hervorgerufene Signal misst.
10. Diagnostisches Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Aktivität der FSAP misst, indem man die
die Protease enthaltende Probe an einem festen Träger inkubiert, an den zuvor ein gegen die Protease gerichteter Antikörper nach Anspruch 7 ge koppelt wurde, und
nach Auswaschen des freien Trägers die daran fixierte Protease mit Rea genzien inkubiert, die deren Aktivitätsbestimmung erlauben.
die Protease enthaltende Probe an einem festen Träger inkubiert, an den zuvor ein gegen die Protease gerichteter Antikörper nach Anspruch 7 ge koppelt wurde, und
nach Auswaschen des freien Trägers die daran fixierte Protease mit Rea genzien inkubiert, die deren Aktivitätsbestimmung erlauben.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivi
tät der Protease durch eine photometrische Bestimmung der bei der Einwirkung
auf chromogene Substrate auftretenden Extinktion gemessen wird.
12. Verfahren nach den Ansprüchen 10 und 11, dadurch gekennzeichnet,
dass die Aktivität der Protease gemessen wird durch
ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa und V/Va inaktivierende Wir kung oder
ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Gerin nungstests oder
ihre Plasminogenaktivatoren aktivierende Wirkung oder
ihre den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Wirkung.
ihre die Blutgerinnungsfaktoren VIII/VIIIa und V/Va inaktivierende Wir kung oder
ihre die Blutgerinnungszeiten verkürzende Wirkung in globalen Gerin nungstests oder
ihre Plasminogenaktivatoren aktivierende Wirkung oder
ihre den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierende Wirkung.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die die
Plasminogenaktivatoren aktivierende Wirkung gemessen wird durch die Aktivie
rung der
Einketten-Urokinase (scuPA, single chain urokinase plasminogen activa tor) oder des
Einketten-tPA (sctPA, single chain tissue plasminogen activator).
Einketten-Urokinase (scuPA, single chain urokinase plasminogen activa tor) oder des
Einketten-tPA (sctPA, single chain tissue plasminogen activator).
14. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikör
per nach Anspruch 7 zur Detektion der Mutanten auf Western blots, zur Immun
histologie, Fluoreszenz-unterstützten Cell Sorting (FACS) oder vergleichbaren
Methoden verwendet werden.
15. Testsysteme zur Durchführung diagnostischer Verfahren nach den An
sprüchen 5 bis 13.
16. Verfahren zur Präparation der Protease-Mutanten nach Ansprüchen 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, dass einer oder mehrere Antikörper nach An
spruch 7 an einem Träger fixiert werden, das Immunadsorbens mit der Probe
inkubiert und anschließend gewaschen wird und danach die Mutante durch Elu
tion gewonnen wird.
17. Herstellung der Mutanten durch rekombinante und/oder transgene Ex
pression.
18. Verfahren zur Präparation der Mutanten nach Ansprüchen 1 bis 3, 16 und
17 aus Körperflüssigkeiten, Zellkulturüberständen und Flüssigkeiten transgener
Tiere.
19. Verwendung der Mutanten nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, dass die Protease zur Prophylaxe und/oder Therapie von Blu
tungen, bei angeborenen und erworbenem Mangel von FVIII, von Willebrand
Faktor, FV, FIX, FX, FXI, FXII und/oder gegen diese Proteine gerichtete Anti
körper, eingesetzt werden.
Priority Applications (20)
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