JP2000023696A - 血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテア―ゼ - Google Patents
血液凝固第ｖｉｉ因子を活性化するプロテア―ゼInfo
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 新規なＦVII活性化プロテアーゼの発見とそ
の応用。 【解決手段】 ａ）アプロチニンの存在によって阻害さ
れ、ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもし
くはヘパリン類縁物質によってその活性が上昇し、また
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での
染色では分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは
２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量１０〜３
５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示
す、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼなら
びにそのプロ酵素は、血漿またはプロトロンビン複合体
（ＰＰＳＢ）濃縮物から予め陰イオン交換クロマトグラ
フィーに付したのち、ヘパリンもしくはヘパリン類縁物
質またはデキストラン硫酸を用いる親和性クロマトグラ
フィーによって得られる。
の応用。 【解決手段】 ａ）アプロチニンの存在によって阻害さ
れ、ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもし
くはヘパリン類縁物質によってその活性が上昇し、また
ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での
染色では分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは
２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量１０〜３
５ｋＤａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示
す、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼなら
びにそのプロ酵素は、血漿またはプロトロンビン複合体
（ＰＰＳＢ）濃縮物から予め陰イオン交換クロマトグラ
フィーに付したのち、ヘパリンもしくはヘパリン類縁物
質またはデキストラン硫酸を用いる親和性クロマトグラ
フィーによって得られる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は血液凝固第VII因子
の活性化のためのプロテアーゼ、それを単離、検出およ
び不活性化する方法ならびにこのプロテアーゼからなる
医薬製剤に関する。
の活性化のためのプロテアーゼ、それを単離、検出およ
び不活性化する方法ならびにこのプロテアーゼからなる
医薬製剤に関する。
【０００２】
【従来技術】血液凝固系は、血漿中に存在する血液凝固
因子を活性化する２つの異なるカスケード様経路から構
成される。その誘導機構によって、内因系または外因系
経路が血液凝固の開始に優先的に使用される。
因子を活性化する２つの異なるカスケード様経路から構
成される。その誘導機構によって、内因系または外因系
経路が血液凝固の開始に優先的に使用される。
【０００３】組織が傷害された場合、トロンボプラスチ
ン（組織因子、ＴＦとリン脂質）が外因性凝血経路のス
ターターとして冒された細胞により暴露される。膜局在
性のトロンボプラスチンは、血液凝固第VII因子（ＦVI
I）および循環する、活性化ＦVII（ＦVIIａ）の両者を
結合することができる。カルシウムイオンおよび脂質の
存在下に、このＴＦ−ＦVIIａ複合体はＦＸの結合を招
き、これは限定された蛋白分解によってその活性化型
（ＦＸａ）に変換される。続いてＦＸａはプロトロンビ
ンを活性化してトロンビンを形成させることにより、フ
ィブリンの形成を招来し、それによって最終的に創傷の
閉鎖が起こる。
ン（組織因子、ＴＦとリン脂質）が外因性凝血経路のス
ターターとして冒された細胞により暴露される。膜局在
性のトロンボプラスチンは、血液凝固第VII因子（ＦVI
I）および循環する、活性化ＦVII（ＦVIIａ）の両者を
結合することができる。カルシウムイオンおよび脂質の
存在下に、このＴＦ−ＦVIIａ複合体はＦＸの結合を招
き、これは限定された蛋白分解によってその活性化型
（ＦＸａ）に変換される。続いてＦＸａはプロトロンビ
ンを活性化してトロンビンを形成させることにより、フ
ィブリンの形成を招来し、それによって最終的に創傷の
閉鎖が起こる。
【０００４】トロンボプラスチン結合ＦVIIの更なる活
性化は最初は自触反応によって起こるが、特に、凝血カ
スケードの開始後には、それはＦＸａおよびトロンビン
によって支持され、特に反応カスケードの著しい強化を
招くことになる。
性化は最初は自触反応によって起こるが、特に、凝血カ
スケードの開始後には、それはＦＸａおよびトロンビン
によって支持され、特に反応カスケードの著しい強化を
招くことになる。
【０００５】ＦVIIａまたはＦVIIａ含有濃縮物の投与は
ある種の臨床状態に適用されている。たとえば、血友病
Ａに冒されＦVIII投与の結果としてＦVIIIに対する抗体
が発生している患者では、ＦVIIａのいわゆるＦVIII副
経路活性（ＦＥＩＢＡ）が用いられる。現時点で分かっ
ている所見によれば、ＦVIIａはこの関係で十分な耐容
性を有し、それは血栓傾向を生じることはなく、限られ
ているが適切な程度の凝血が起こることを保証するのに
適している。組換えＦVIIａは既に治療的におよび予防
的に使用されている。血漿から単離されたＦVIIはま
た、活性化されてから用いることもできる。トロンビン
のようなプロテアーゼをこの活性化に使用できるが、し
かしながら、これらのプロテアーゼは、それら自体凝血
を強力に活性化することが可能で、血栓の危険を招くこ
とがある。この理由から、以後のトロンビンの除去また
は不活性化が必要であり、損失を生じることになる。そ
れに伴う血栓の危険の結果として、多くの場合、ＦＸａ
もしくはＦIIａ（トロンビン）の使用は禁忌とされ、緊
急時、たとえば血液の著しい喪失および止血不能の出血
の関連でのみ適用される。
ある種の臨床状態に適用されている。たとえば、血友病
Ａに冒されＦVIII投与の結果としてＦVIIIに対する抗体
が発生している患者では、ＦVIIａのいわゆるＦVIII副
経路活性（ＦＥＩＢＡ）が用いられる。現時点で分かっ
ている所見によれば、ＦVIIａはこの関係で十分な耐容
性を有し、それは血栓傾向を生じることはなく、限られ
ているが適切な程度の凝血が起こることを保証するのに
適している。組換えＦVIIａは既に治療的におよび予防
的に使用されている。血漿から単離されたＦVIIはま
た、活性化されてから用いることもできる。トロンビン
のようなプロテアーゼをこの活性化に使用できるが、し
かしながら、これらのプロテアーゼは、それら自体凝血
を強力に活性化することが可能で、血栓の危険を招くこ
とがある。この理由から、以後のトロンビンの除去また
は不活性化が必要であり、損失を生じることになる。そ
れに伴う血栓の危険の結果として、多くの場合、ＦＸａ
もしくはＦIIａ（トロンビン）の使用は禁忌とされ、緊
急時、たとえば血液の著しい喪失および止血不能の出血
の関連でのみ適用される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ＦVIIａは、健康人の
血漿中にはきわめて低濃度でしか見出されない。血液中
を循環するＦVIIａの形成および起源についてはこれま
でほとんど知られていない。細胞の破壊に伴って発現ま
たは放出された痕跡のトロンボプラスチンはこの関連で
ある役割を果たしている可能性がある。第XIIａ因子
は、たとえばある種の条件下にＦVIIの活性化を生じる
ことが知られているが、この反応の生理学的な関連はま
だ明らかにされていない。
血漿中にはきわめて低濃度でしか見出されない。血液中
を循環するＦVIIａの形成および起源についてはこれま
でほとんど知られていない。細胞の破壊に伴って発現ま
たは放出された痕跡のトロンボプラスチンはこの関連で
ある役割を果たしている可能性がある。第XIIａ因子
は、たとえばある種の条件下にＦVIIの活性化を生じる
ことが知られているが、この反応の生理学的な関連はま
だ明らかにされていない。
【０００７】驚くべきことに今回、従来知られているす
べてのプロテアーゼとは異なるＦVII活性化プロテアー
ゼが、ヒト血漿およびある種のプロトロンビン複合体濃
縮物の分画に関連し発見された。このプロテアーゼの検
討から、それは ChromogenixAB，Swedenからのペプチド
基質Ｓ２２８８（ＨＤ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−
Ｌ−アルギニン−ｐＮＡ）に対して特に高いアミド分解
活性を示すことが示された。このプロテアーゼの特殊な
性質は、そのアミド分解活性がアプロチニンによって効
果的に阻害されることである。他のインヒビター、たと
えばアンチトロンビンIII／ヘパリン複合体もその阻害
に適している。他方、その活性はヘパリンおよびヘパリ
ン関連物質たとえばヘパリン硫酸またはデキストラン硫
酸およびカルシウムイオンにより上昇する。最後に、こ
のプロテアーゼは、時間およびその濃度に依存する様式
でＦVIIをＦVIIａに変換できることが見出された。この
反応もアプロチニンによって阻害される。
べてのプロテアーゼとは異なるＦVII活性化プロテアー
ゼが、ヒト血漿およびある種のプロトロンビン複合体濃
縮物の分画に関連し発見された。このプロテアーゼの検
討から、それは ChromogenixAB，Swedenからのペプチド
基質Ｓ２２８８（ＨＤ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−
Ｌ−アルギニン−ｐＮＡ）に対して特に高いアミド分解
活性を示すことが示された。このプロテアーゼの特殊な
性質は、そのアミド分解活性がアプロチニンによって効
果的に阻害されることである。他のインヒビター、たと
えばアンチトロンビンIII／ヘパリン複合体もその阻害
に適している。他方、その活性はヘパリンおよびヘパリ
ン関連物質たとえばヘパリン硫酸またはデキストラン硫
酸およびカルシウムイオンにより上昇する。最後に、こ
のプロテアーゼは、時間およびその濃度に依存する様式
でＦVIIをＦVIIａに変換できることが見出された。この
反応もアプロチニンによって阻害される。
【０００８】
【課題を解決するための手段】したがって、本発明の主
題の一部は、 ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、 ｂ）その活性はカルシウムイオンおよび／またはヘパリ
ンもしくはヘパリン関連物質によって上昇し、そして ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での
染色では分子量５０〜７５ｋＤａの範囲に１個もしくは
２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５
５ｋＤａに１個のバンドならびに分子量１０〜３５ｋＤ
ａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示す、血液
凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼである。
題の一部は、 ａ）アプロチニンの存在によって阻害され、 ｂ）その活性はカルシウムイオンおよび／またはヘパリ
ンもしくはヘパリン関連物質によって上昇し、そして ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、以後の非還元状態での
染色では分子量５０〜７５ｋＤａの範囲に１個もしくは
２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５
５ｋＤａに１個のバンドならびに分子量１０〜３５ｋＤ
ａの範囲の１個もしくは２個以上のバンドを示す、血液
凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼである。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下の明細書においては、そのプ
ロテアーゼの活性化型を「プロテアーゼ」と呼び、非活
性化型を「プロ酵素」と呼ぶ。
ロテアーゼの活性化型を「プロテアーゼ」と呼び、非活
性化型を「プロ酵素」と呼ぶ。
【００１０】このプロテアーゼについてさらに検討し、
濃縮または単離後には急速な活性の喪失を受け、それは
２０ｍＭ ｔｒｉｓ、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐ
Ｈ７.５の溶液中で観察された。濃度０.１％のアルブミ
ンの添加も、このプロテアーゼの活性が室温で１時間後
に５０％まで低下するのを防止することはできなかっ
た。他方、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムによりｐＨ
６.５に緩衝化した溶液中では、このプロテアーゼのき
わめて良好な安定化が観察された。溶液をｐＨ４〜７.
２好ましくはｐＨ５.０〜７.０に調整すると、プロテア
ーゼ溶液に特に安定剤を加えなくても活性の喪失は全く
またはきわめてわずかしか認められなかった。しかしな
がら、溶液には安定化剤を添加することが得策であり、
適当な安定剤としてはクエン酸塩のほかに、特にグルタ
メート、アミノ酸たとえばアルギニン、グリシンまたは
リジン、カルシウムイオンおよび糖たとえばグルコー
ス、アラビノースまたはマンノースの１〜２００mmol／
L好ましくは５〜１００mmol／L量を挙げることができ
る。有効な安定化は、グリコールたとえばエチレングリ
コールまたはグリセロール５〜８０重量％の添加によっ
ても達成され、好ましくは１０〜６０重量％が使用され
る。その場合、安定化された溶液のｐＨ値は４〜９でな
ければならない。
濃縮または単離後には急速な活性の喪失を受け、それは
２０ｍＭ ｔｒｉｓ、０.１５Ｍ ＮａＣｌを含有するｐ
Ｈ７.５の溶液中で観察された。濃度０.１％のアルブミ
ンの添加も、このプロテアーゼの活性が室温で１時間後
に５０％まで低下するのを防止することはできなかっ
た。他方、５０ｍＭのクエン酸ナトリウムによりｐＨ
６.５に緩衝化した溶液中では、このプロテアーゼのき
わめて良好な安定化が観察された。溶液をｐＨ４〜７.
２好ましくはｐＨ５.０〜７.０に調整すると、プロテア
ーゼ溶液に特に安定剤を加えなくても活性の喪失は全く
またはきわめてわずかしか認められなかった。しかしな
がら、溶液には安定化剤を添加することが得策であり、
適当な安定剤としてはクエン酸塩のほかに、特にグルタ
メート、アミノ酸たとえばアルギニン、グリシンまたは
リジン、カルシウムイオンおよび糖たとえばグルコー
ス、アラビノースまたはマンノースの１〜２００mmol／
L好ましくは５〜１００mmol／L量を挙げることができ
る。有効な安定化は、グリコールたとえばエチレングリ
コールまたはグリセロール５〜８０重量％の添加によっ
ても達成され、好ましくは１０〜６０重量％が使用され
る。その場合、安定化された溶液のｐＨ値は４〜９でな
ければならない。
【００１１】新規なプロテアーゼ、および同じくそのプ
ロ酵素は、組換えＤＮＡ法、またはたとえば適当なトラ
ンスジェニック動物の乳汁中における産生によって得ら
れ、特に血漿もしくはプロトロンビン複合体（ＰＰＳ
Ｂ）濃縮物の分画化によって得ることができる。出発原
料をついで最初に陰イオン交換クロマトグラフィーに付
し、続いて、溶出液の親和性クロマトグラフィーを行
う。親和性クロマトグラフィーにはマトリックス上に固
定化されたヘパリンまたはヘパリン関連物質たとえばヘ
パリン硫酸またはデキストラン硫酸が特に適している。
このようなクロマトグラフィー法を用いた場合、新規な
プロテアーゼおよび／またはプロ酵素は選択的に結合さ
れ、ついで既知の方法を用いて再び溶出することができ
る。マトルックスにリガンドをカップリングするために
は、スペーサーの使用を推薦できる。新規プロテアーゼ
の単離にはヘパリン−リジンマトリックスが特に適して
いることが見出されている。
ロ酵素は、組換えＤＮＡ法、またはたとえば適当なトラ
ンスジェニック動物の乳汁中における産生によって得ら
れ、特に血漿もしくはプロトロンビン複合体（ＰＰＳ
Ｂ）濃縮物の分画化によって得ることができる。出発原
料をついで最初に陰イオン交換クロマトグラフィーに付
し、続いて、溶出液の親和性クロマトグラフィーを行
う。親和性クロマトグラフィーにはマトリックス上に固
定化されたヘパリンまたはヘパリン関連物質たとえばヘ
パリン硫酸またはデキストラン硫酸が特に適している。
このようなクロマトグラフィー法を用いた場合、新規な
プロテアーゼおよび／またはプロ酵素は選択的に結合さ
れ、ついで既知の方法を用いて再び溶出することができ
る。マトルックスにリガンドをカップリングするために
は、スペーサーの使用を推薦できる。新規プロテアーゼ
の単離にはヘパリン−リジンマトリックスが特に適して
いることが見出されている。
【００１２】ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く染色では、
この方法によって単離されたプロテアーゼは、非還元状
態において、分子量５５〜７５ｋＤａの範囲の互いに接
近した存在する１個から数個のバンドを示す。還元後に
は、分子量１５〜３５ｋＤａの範囲に１個から数個のバ
ンドが観察され、１個のバンドが４０〜５５ｋＤａに観
察された。６０〜６５ｋＤａのさらに１個のバンドは、
走査および定量的評価後、総タンパク質の５〜１０％を
構成し、非活性化プロ酵素も存在することが示された。
この結果は、このプロテアーゼに対するモノクローナル
抗体を使用する適当な検討によって支持された。したが
って、このプロテアーゼのプロ酵素もまた、本発明の方
法により調製し、滅菌し、使用することができると結論
された。本発明の主題の一部は、したがって、血液凝固
第VII因子を活性化するプロテアーゼのプロ酵素であ
る。プロ酵素の比率は６０〜６５ｋＤａのバンドにより
指示される。プロ酵素の適当な生理学的アクティベータ
ーの例は、それらの基質特異性に応じて、プロ酵素、ト
ロンビン、カリクレインまたはＦVIIａの活性化領域を
構成するアミノ酸配列に相当する。
この方法によって単離されたプロテアーゼは、非還元状
態において、分子量５５〜７５ｋＤａの範囲の互いに接
近した存在する１個から数個のバンドを示す。還元後に
は、分子量１５〜３５ｋＤａの範囲に１個から数個のバ
ンドが観察され、１個のバンドが４０〜５５ｋＤａに観
察された。６０〜６５ｋＤａのさらに１個のバンドは、
走査および定量的評価後、総タンパク質の５〜１０％を
構成し、非活性化プロ酵素も存在することが示された。
この結果は、このプロテアーゼに対するモノクローナル
抗体を使用する適当な検討によって支持された。したが
って、このプロテアーゼのプロ酵素もまた、本発明の方
法により調製し、滅菌し、使用することができると結論
された。本発明の主題の一部は、したがって、血液凝固
第VII因子を活性化するプロテアーゼのプロ酵素であ
る。プロ酵素の比率は６０〜６５ｋＤａのバンドにより
指示される。プロ酵素の適当な生理学的アクティベータ
ーの例は、それらの基質特異性に応じて、プロ酵素、ト
ロンビン、カリクレインまたはＦVIIａの活性化領域を
構成するアミノ酸配列に相当する。
【００１３】上述した新規なプロテアーゼの性質の一
部、すなわちそれが血漿または血漿に由来するプロトロ
ンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から単離できるという
事実、そのアミド分解活性のアプロチニンによる阻害な
らびに還元および非還元状態の両者でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおける上述の泳動挙動は、Hunfeldら（Ann．Hemato
l．1997，74：A87，113；Ann．Hematol．1998，76：A10
1，P294 および Etscheidら，Ann．Hematol．1999，7
8：A42）によって詳細は定義されていないＰＰＳＢ濃縮
物から単離されたプロテアーゼを想起させる。その場合
は、調製は主としてアプロチニンマトリックスを用いて
達成された。ある種のペプチド基質のアミド分解による
切断の結果として、活性はトロンビン様活性と記述され
ている。Hunfeld らは包括的な血液凝固パラメーターた
とえばプロトロンビン時間、クウイックまたは血小板凝
集に対する影響は全く見出していない。
部、すなわちそれが血漿または血漿に由来するプロトロ
ンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から単離できるという
事実、そのアミド分解活性のアプロチニンによる阻害な
らびに還元および非還元状態の両者でのＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅにおける上述の泳動挙動は、Hunfeldら（Ann．Hemato
l．1997，74：A87，113；Ann．Hematol．1998，76：A10
1，P294 および Etscheidら，Ann．Hematol．1999，7
8：A42）によって詳細は定義されていないＰＰＳＢ濃縮
物から単離されたプロテアーゼを想起させる。その場合
は、調製は主としてアプロチニンマトリックスを用いて
達成された。ある種のペプチド基質のアミド分解による
切断の結果として、活性はトロンビン様活性と記述され
ている。Hunfeld らは包括的な血液凝固パラメーターた
とえばプロトロンビン時間、クウイックまたは血小板凝
集に対する影響は全く見出していない。
【００１４】Hunfeldらにより記載されたプロテアーゼ
のＮ末端配列決定は、そのｃＤＮＡがChoi−Miuraら
（J．Biochem．119：1157−1165，1996）により報告さ
れたタンパク質の場合と一致を示す。その一次構造で
は、相当するタンパク質が肝細胞増殖因子活性化酵素
（ＨＧＦＡ）と命名されている酵素とホモロジーを示
す。
のＮ末端配列決定は、そのｃＤＮＡがChoi−Miuraら
（J．Biochem．119：1157−1165，1996）により報告さ
れたタンパク質の場合と一致を示す。その一次構造で
は、相当するタンパク質が肝細胞増殖因子活性化酵素
（ＨＧＦＡ）と命名されている酵素とホモロジーを示
す。
【００１５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥから還元条件下に単離さ
れた２つのバンドをＮ末端配列決定に付し、以下の一致
が確立された。 バンドの分子量範囲 アミノ酸配列 報告者 １０〜３５kDa IYGGFKSTAGK 本発明 ３０kDa IYGGFKSTAG Hunfeldら １７kDa IYGGFKSTAGKH Choi−Miuraら ４０〜５５kDa LLESLDP 本発明 ５０kDa SLDP Hunfeldら ５７kDa SLLESLDPWTPD Choi−Miuraら 一致は他の試験結果たとえば基質特異性および阻害され
る活性の能力にも見出される。それにもかかわらず、現
時点ではこれらのタンパク質が同一であるとの推定はな
お不可能である。いずれにしても、以前に研究された上
述のタンパク質にはＦVIIａまたは他の因子の活性化の
性質をもつことは報告されていない（下記参照）。
れた２つのバンドをＮ末端配列決定に付し、以下の一致
が確立された。 バンドの分子量範囲 アミノ酸配列 報告者 １０〜３５kDa IYGGFKSTAGK 本発明 ３０kDa IYGGFKSTAG Hunfeldら １７kDa IYGGFKSTAGKH Choi−Miuraら ４０〜５５kDa LLESLDP 本発明 ５０kDa SLDP Hunfeldら ５７kDa SLLESLDPWTPD Choi−Miuraら 一致は他の試験結果たとえば基質特異性および阻害され
る活性の能力にも見出される。それにもかかわらず、現
時点ではこれらのタンパク質が同一であるとの推定はな
お不可能である。いずれにしても、以前に研究された上
述のタンパク質にはＦVIIａまたは他の因子の活性化の
性質をもつことは報告されていない（下記参照）。
【００１６】その上述の性質に基づいて、その新規なプ
ロテアーゼは診断的におよび治療的に使用することがで
きる。
ロテアーゼは診断的におよび治療的に使用することがで
きる。
【００１７】１．新規なプロテアーゼを用いる試験シス
テム 新規なプロテアーゼは試験試薬中に診断的に使用するこ
とができる。すなわち第VII因子の存在は新規なプロテ
アーゼの添加により血液凝固試験において定性的および
定量的に決定することができる。
テム 新規なプロテアーゼは試験試薬中に診断的に使用するこ
とができる。すなわち第VII因子の存在は新規なプロテ
アーゼの添加により血液凝固試験において定性的および
定量的に決定することができる。
【００１８】それとは逆に、ＦVIIの活性化を測定する
ために開発されたこの試験システムはプロテアーゼの検
出および定量にも使用することができる。このために
は、プロテアーゼを含有する溶液をＦVII含有溶液と混
合し、適当なインキュベーション時間後に生成したＦVI
Iａの両を定量する。これは、たとえば Staclot(R)ＦVI
Iａ−ｒＴＦテスト（Stago／Boehringer Mannheim）を
用いて実施できる。好ましい操作を用いた場合は、この
試験は供給されるＦVIIの濃度には限定されない。総タ
ンパク質の比率の型でのプロテアーゼ量を知る場合に
は、その比率は：−純粋なプロテアーゼプレパレーショ
ン中、キエルダール法または本技術分野の熟練者には周
知の他のタンパク質のアッセイ法により、または−たと
えば特異的な抗体に基づく抗原試験および適当な免疫化
学的測定方法たとえばＥＬＩＳＡを用いて決定すること
が可能であり、ついでプロテアーゼプレパレーションの
比活性を相当する様式で測定することができる。
ために開発されたこの試験システムはプロテアーゼの検
出および定量にも使用することができる。このために
は、プロテアーゼを含有する溶液をＦVII含有溶液と混
合し、適当なインキュベーション時間後に生成したＦVI
Iａの両を定量する。これは、たとえば Staclot(R)ＦVI
Iａ−ｒＴＦテスト（Stago／Boehringer Mannheim）を
用いて実施できる。好ましい操作を用いた場合は、この
試験は供給されるＦVIIの濃度には限定されない。総タ
ンパク質の比率の型でのプロテアーゼ量を知る場合に
は、その比率は：−純粋なプロテアーゼプレパレーショ
ン中、キエルダール法または本技術分野の熟練者には周
知の他のタンパク質のアッセイ法により、または−たと
えば特異的な抗体に基づく抗原試験および適当な免疫化
学的測定方法たとえばＥＬＩＳＡを用いて決定すること
が可能であり、ついでプロテアーゼプレパレーションの
比活性を相当する様式で測定することができる。
【００１９】驚くべきことに、プロテアーゼの特性の更
なる解明に伴い、付加的な測定を可能にする性質が新た
に見出された。上記プロテアーゼと血液凝固VIII／VIII
ａおよびV／Vａ因子のインキュベーション、それに続く
定量に関連して、上記血液凝固因子はプロテアーゼ濃度
およびインキュベーションの長さには無関係な様式で不
活性化されることが明らかにされた。
なる解明に伴い、付加的な測定を可能にする性質が新た
に見出された。上記プロテアーゼと血液凝固VIII／VIII
ａおよびV／Vａ因子のインキュベーション、それに続く
定量に関連して、上記血液凝固因子はプロテアーゼ濃度
およびインキュベーションの長さには無関係な様式で不
活性化されることが明らかにされた。
【００２０】本発明の主題の他の一部は、したがって、
血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼを定性的
および定量的に検出する新規な試験システムであり、こ
のシステムにおいては、プロテアーゼは血液凝固第VIII
／VIIIａまたはV／Vａ因子を不活性化するその活性によ
って定量することができる。この試験システムは、プロ
テアーゼを含有する溶液を第VIII／VIIIａまたはV／Vａ
因子とインキュベートして、残留した第VIII／VIIIａ因
子の量または残留した第V／Vａ因子の量を慣用の活性試
験によって測定し、ついでこれからプロテアーゼの量を
標準曲線との比較により決定する操作に基づくものであ
る。この試験の実施に際し、プロテアーゼ活性のインキ
ュベーションを予め定められた時間、限られた量のアプ
ロチニンの添加によって阻害すると、これらの濃度では
試験システムの以後の測定に影響しないという利点があ
る。その後、血液凝固因子の残留活性を本技術分野の熟
練者に周知の試験方法で測定する。このためには、主と
して第IXおよびX因子を含有し、得られたＦＸａの量を
トロンビンインヒビターの存在下に色素原基質の変換に
より定量するいわゆる Coamatic(R)第VIII因子テスト
（Chromogenix AB）を使用可能にする点で（［０００
７］の記述参照）、特に試験システムの価値が証明され
ている。一方、この量は、ＦVIIまたはＦVIIａの量に比
例する。ついで、残留するＦVIII活性を決定すれば、存
在するプロテアーゼの濃度を帰納することが可能にな
る。
血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼを定性的
および定量的に検出する新規な試験システムであり、こ
のシステムにおいては、プロテアーゼは血液凝固第VIII
／VIIIａまたはV／Vａ因子を不活性化するその活性によ
って定量することができる。この試験システムは、プロ
テアーゼを含有する溶液を第VIII／VIIIａまたはV／Vａ
因子とインキュベートして、残留した第VIII／VIIIａ因
子の量または残留した第V／Vａ因子の量を慣用の活性試
験によって測定し、ついでこれからプロテアーゼの量を
標準曲線との比較により決定する操作に基づくものであ
る。この試験の実施に際し、プロテアーゼ活性のインキ
ュベーションを予め定められた時間、限られた量のアプ
ロチニンの添加によって阻害すると、これらの濃度では
試験システムの以後の測定に影響しないという利点があ
る。その後、血液凝固因子の残留活性を本技術分野の熟
練者に周知の試験方法で測定する。このためには、主と
して第IXおよびX因子を含有し、得られたＦＸａの量を
トロンビンインヒビターの存在下に色素原基質の変換に
より定量するいわゆる Coamatic(R)第VIII因子テスト
（Chromogenix AB）を使用可能にする点で（［０００
７］の記述参照）、特に試験システムの価値が証明され
ている。一方、この量は、ＦVIIまたはＦVIIａの量に比
例する。ついで、残留するＦVIII活性を決定すれば、存
在するプロテアーゼの濃度を帰納することが可能にな
る。
【００２１】蛋白分解作用によるＦVIII／ＦVIIIａまた
はＦV／ＦVａ因子の分解は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
明瞭に証明できる。プロテアーゼをたとえばＦVIII濃縮
物とインキュベートした時間に依存して、ＦVIIIに典型
的なバンドは消失し、一方、他の新しいバンドが発生
し、または弱いバンドの強度が増大する。したがって、
プロテアーゼの活性はまた、バンドの減弱または増強を
定量することにより関連づけることが可能で、その結
果、たとえばプロテアーゼ標品を用いて定量的に測定す
ることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図における
バンドの強度、または他の電気泳動法によるバンドの強
度の変化を、本技術分野の熟練者には周知のたとえばス
キャナーおよび適当なプログラムを用いて定量すること
ができる。これに加えて、上記血液凝固因子に対する抗
体はウエスタンブロットに使用可能であり、また上述の
方法における評価に採用することができる。減弱したバ
ンドまたは、特に発生したバンドを特異的に検出する抗
体が特に適している。これに関連して、これらの抗体は
他の免疫化学的試験、たとえばＥＬＩＳＡの確立にも使
用することができる。
はＦV／ＦVａ因子の分解は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって
明瞭に証明できる。プロテアーゼをたとえばＦVIII濃縮
物とインキュベートした時間に依存して、ＦVIIIに典型
的なバンドは消失し、一方、他の新しいバンドが発生
し、または弱いバンドの強度が増大する。したがって、
プロテアーゼの活性はまた、バンドの減弱または増強を
定量することにより関連づけることが可能で、その結
果、たとえばプロテアーゼ標品を用いて定量的に測定す
ることができる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図における
バンドの強度、または他の電気泳動法によるバンドの強
度の変化を、本技術分野の熟練者には周知のたとえばス
キャナーおよび適当なプログラムを用いて定量すること
ができる。これに加えて、上記血液凝固因子に対する抗
体はウエスタンブロットに使用可能であり、また上述の
方法における評価に採用することができる。減弱したバ
ンドまたは、特に発生したバンドを特異的に検出する抗
体が特に適している。これに関連して、これらの抗体は
他の免疫化学的試験、たとえばＥＬＩＳＡの確立にも使
用することができる。
【００２２】ＦVIII／ＦVIIIａの場合に記載された蛋白
分解的不活性化はまた、ＦVIIIとある程度の構造的ホモ
ロジーを示す第V／Vａ因子とプロテアーゼをインキュベ
ートした場合にも観察される。分解は適当な活性試験シ
ステムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティ
ングにおいてモニターできる。
分解的不活性化はまた、ＦVIIIとある程度の構造的ホモ
ロジーを示す第V／Vａ因子とプロテアーゼをインキュベ
ートした場合にも観察される。分解は適当な活性試験シ
ステムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティ
ングにおいてモニターできる。
【００２３】ＦＶおよびＦVIIIの不活性化にもかかわら
ず、今回、血液、血小板濃縮血漿または血漿へのプロテ
アーゼの添加は血液凝固時間を短縮すること、すなわち
各種のいわゆる「包括的血液凝固試験」において卓越し
たプロコアギュラント活性を示すことが見出された。こ
れらの試験システムは、たとえば、非活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間
（ＰＴ）およびカルシウム再沈着時間であると理解され
る。たとえばいわゆる血液凝固計において、血栓弾性記
録計により、またはほかに色素原試験で測定されるこれ
らの時間の短縮化は、血液凝固促進物質の濃度と相関す
るので、サンプル中のその物質の濃度は、血液凝固時間
の検量曲線を使用して逆に推論することができる。「Ｆ
VIIアクティベーター」の濃度は同様、選択された包括
的血液凝固試験を用いて決定することができる。
ず、今回、血液、血小板濃縮血漿または血漿へのプロテ
アーゼの添加は血液凝固時間を短縮すること、すなわち
各種のいわゆる「包括的血液凝固試験」において卓越し
たプロコアギュラント活性を示すことが見出された。こ
れらの試験システムは、たとえば、非活性化部分トロン
ボプラスチン時間（ＮＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間
（ＰＴ）およびカルシウム再沈着時間であると理解され
る。たとえばいわゆる血液凝固計において、血栓弾性記
録計により、またはほかに色素原試験で測定されるこれ
らの時間の短縮化は、血液凝固促進物質の濃度と相関す
るので、サンプル中のその物質の濃度は、血液凝固時間
の検量曲線を使用して逆に推論することができる。「Ｆ
VIIアクティベーター」の濃度は同様、選択された包括
的血液凝固試験を用いて決定することができる。
【００２４】「ＦVIIアクティベーター」は同様に、単
一鎖ウロキナーゼ（scuＰＡ、単一鎖ウロキナーゼプラ
スミノーゲンアクティベーター）、および単一鎖ｔＰＡ
（sctＰＡ、単一鎖組織プラスミノーゲンアクティベー
ター）の効果的なアクティベーターをもたらすことがで
きること、すなわちプラスミノーゲンアクティベーター
アクティベーター（ＰＡＡ）として作用できることがま
た驚くべきことに見出された。活性化ＰＡの活性はたと
えば、色素原物質を用いて測定できる。すなわちこの性
質は、したがって、「ＦVIIアクティベーター」の検出
および定量化に使用することができる。プラスミノーゲ
ンアクティベーターの活性化はまた、プラスミノーゲン
の存在下、プラスミンそれ自身の形成によりまたはプラ
スミンによってもたらされるフィブリン凝血の溶解によ
り、カップリング反応で決定することができる。
一鎖ウロキナーゼ（scuＰＡ、単一鎖ウロキナーゼプラ
スミノーゲンアクティベーター）、および単一鎖ｔＰＡ
（sctＰＡ、単一鎖組織プラスミノーゲンアクティベー
ター）の効果的なアクティベーターをもたらすことがで
きること、すなわちプラスミノーゲンアクティベーター
アクティベーター（ＰＡＡ）として作用できることがま
た驚くべきことに見出された。活性化ＰＡの活性はたと
えば、色素原物質を用いて測定できる。すなわちこの性
質は、したがって、「ＦVIIアクティベーター」の検出
および定量化に使用することができる。プラスミノーゲ
ンアクティベーターの活性化はまた、プラスミノーゲン
の存在下、プラスミンそれ自身の形成によりまたはプラ
スミンによってもたらされるフィブリン凝血の溶解によ
り、カップリング反応で決定することができる。
【００２５】したがって、要約すれば、プロテアーゼは
それをＦVIIIまたはＦVIIIａを含有する溶液とインキュ
ベートし、ついでＦVIII／ＦVIIIａの残留量を適当な活
性試験により検出および定量の両者が可能であるという
ことができる。同じ方法でＦVまたはＦVａをプロテアー
ゼとインキュベートし、ＦV／ＦVａの残留量をついで定
量することができる。未知のプロテアーゼ濃度は試験に
包含されるプロテアーゼの量の上昇を標準曲線と比較し
て定量的に決定することができる。様々な包括的血液凝
固試験が同様に定量化に適当であり、プロテアーゼ濃度
は凝固時間の短縮に基づいて検量曲線から読み取られ
る。プロテアーゼのＰＡＡ活性も定量の目的に使用する
ことができる。
それをＦVIIIまたはＦVIIIａを含有する溶液とインキュ
ベートし、ついでＦVIII／ＦVIIIａの残留量を適当な活
性試験により検出および定量の両者が可能であるという
ことができる。同じ方法でＦVまたはＦVａをプロテアー
ゼとインキュベートし、ＦV／ＦVａの残留量をついで定
量することができる。未知のプロテアーゼ濃度は試験に
包含されるプロテアーゼの量の上昇を標準曲線と比較し
て定量的に決定することができる。様々な包括的血液凝
固試験が同様に定量化に適当であり、プロテアーゼ濃度
は凝固時間の短縮に基づいて検量曲線から読み取られ
る。プロテアーゼのＰＡＡ活性も定量の目的に使用する
ことができる。
【００２６】これらの試験の特徴は、ＦVおよびＦVIII
不活性化ならびにＰＡＡ活性が適当な高濃度のカルシウ
ム、好ましくは＞０.００１ｍＭ、特に好ましくは＞０.
００５ｍＭをＣaＣl2の形で存在させると、特に良好に
発揮されることである。上述のように、ヘパリンおよび
ヘパリン様物質の両者およびカルシウムもプロテアーゼ
活性を上昇させる直接的な色素原アッセイの場合とは対
照的に、ＦV／ＦVIIIの不活性化はヘパリンによっては
促進されないか、または有意ではない促進が認められる
にすぎない。これに反し、ＰＡＡ活性はいずれの物質の
存在でも、すなわちカルシウムおよび／またはヘパリン
もしくはヘパリン様物質によって刺激される。
不活性化ならびにＰＡＡ活性が適当な高濃度のカルシウ
ム、好ましくは＞０.００１ｍＭ、特に好ましくは＞０.
００５ｍＭをＣaＣl2の形で存在させると、特に良好に
発揮されることである。上述のように、ヘパリンおよび
ヘパリン様物質の両者およびカルシウムもプロテアーゼ
活性を上昇させる直接的な色素原アッセイの場合とは対
照的に、ＦV／ＦVIIIの不活性化はヘパリンによっては
促進されないか、または有意ではない促進が認められる
にすぎない。これに反し、ＰＡＡ活性はいずれの物質の
存在でも、すなわちカルシウムおよび／またはヘパリン
もしくはヘパリン様物質によって刺激される。
【００２７】プロテアーゼ誘導反応は、プロテアーゼを
インヒビター特にヘパリンまたはヘパリン様物質の存在
下（好ましくはヘパリンの存在下）アンチトロンビンII
I、Ｃ1−エステラーゼインヒビター、α2−アンチプラ
スミン、インターα−トリプシンインヒビターまたは既
知の低分子量プロテアーゼインヒビターたとえば商品名
ＦＯＹ(R)として入手できるグアニジノカプロン酸−ｐ
−エトキシカルボニルフェニルエステルとインキュベー
トすることによってきわめて効率的に減弱または防止す
ることができる。これらの物質は、したがって、たとえ
ばインキュベーション時間を正確に決定するため、また
は試験の特異性をさらに上昇させる目的で、反応を停止
させるために使用することができる。混合物中の遊離の
カルシウムイオンをたとえばキレート剤で減少させる
と、この目的に使用することもできる。
インヒビター特にヘパリンまたはヘパリン様物質の存在
下（好ましくはヘパリンの存在下）アンチトロンビンII
I、Ｃ1−エステラーゼインヒビター、α2−アンチプラ
スミン、インターα−トリプシンインヒビターまたは既
知の低分子量プロテアーゼインヒビターたとえば商品名
ＦＯＹ(R)として入手できるグアニジノカプロン酸−ｐ
−エトキシカルボニルフェニルエステルとインキュベー
トすることによってきわめて効率的に減弱または防止す
ることができる。これらの物質は、したがって、たとえ
ばインキュベーション時間を正確に決定するため、また
は試験の特異性をさらに上昇させる目的で、反応を停止
させるために使用することができる。混合物中の遊離の
カルシウムイオンをたとえばキレート剤で減少させる
と、この目的に使用することもできる。
【００２８】２．第Vおよび第VIII因子の安定化された
プレパレーション 血液凝固第Vおよび第VIII因子に対する新規プロテアー
ゼの蛋白分解活性に関する上述の観察からプロテアーゼ
活性の阻害またはその活性の減弱の課題が、生成の喪失
および、多分妨害性タンパク質のフラグメントと考えら
れる断片の形成を回避するために生じる。これはすべ
て、ＦVおよびＦVIIIが血漿より得られた寒冷沈殿物か
らカルシウムイオンの存在下に通常調製され、後者はタ
ンパク質のコンフォーメーションの維持に要求されるこ
とから、益々重要である。
プレパレーション 血液凝固第Vおよび第VIII因子に対する新規プロテアー
ゼの蛋白分解活性に関する上述の観察からプロテアーゼ
活性の阻害またはその活性の減弱の課題が、生成の喪失
および、多分妨害性タンパク質のフラグメントと考えら
れる断片の形成を回避するために生じる。これはすべ
て、ＦVおよびＦVIIIが血漿より得られた寒冷沈殿物か
らカルシウムイオンの存在下に通常調製され、後者はタ
ンパク質のコンフォーメーションの維持に要求されるこ
とから、益々重要である。
【００２９】本発明の主題の他の部分は、したがって、
血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼが阻害さ
れるとい事実の結果としての蛋白分解により形成された
第Vおよび第VIII因子フラグメントを含まないＦVまたは
ＦVIIIの安定化されたプレパレーションである。さらに
詳細な検討によって、上記プロテアーゼによる第Vおよ
び第VIII因子の不活性化は特に０.５ｍＭ以上の濃度の
カルシウムイオンの存在下において効率的に起こること
が示されたことから、血液凝固第VII因子を活性化する
プロテアーゼの阻害のために第Vまたは第VIII因子プレ
パレーション中のカルシウムイオンの濃度を１.０ｍＭ
未満、好ましくは０.５ｍＭ未満に調整すると第Vおよび
第VIII因子のプレパレーションを効率的に安定化するこ
とができる。プロテアーゼの第Vおよび第VIII因子不活
性化作用はこれらの濃度で著しく低下するが、カルシウ
ムイオンの量はＦVおよびＦVIII分子のコンフォーメー
ションを安定化するのになお十分である。上述のカルシ
ウムイオン量は、単に最終製品においてのみではなく、
寒冷沈殿物自体および以後の精製工程でも過剰になって
はならない。
血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼが阻害さ
れるとい事実の結果としての蛋白分解により形成された
第Vおよび第VIII因子フラグメントを含まないＦVまたは
ＦVIIIの安定化されたプレパレーションである。さらに
詳細な検討によって、上記プロテアーゼによる第Vおよ
び第VIII因子の不活性化は特に０.５ｍＭ以上の濃度の
カルシウムイオンの存在下において効率的に起こること
が示されたことから、血液凝固第VII因子を活性化する
プロテアーゼの阻害のために第Vまたは第VIII因子プレ
パレーション中のカルシウムイオンの濃度を１.０ｍＭ
未満、好ましくは０.５ｍＭ未満に調整すると第Vおよび
第VIII因子のプレパレーションを効率的に安定化するこ
とができる。プロテアーゼの第Vおよび第VIII因子不活
性化作用はこれらの濃度で著しく低下するが、カルシウ
ムイオンの量はＦVおよびＦVIII分子のコンフォーメー
ションを安定化するのになお十分である。上述のカルシ
ウムイオン量は、単に最終製品においてのみではなく、
寒冷沈殿物自体および以後の精製工程でも過剰になって
はならない。
【００３０】プロテアーゼまたはプロ酵素のヘパリンお
よびヘパリン様物質に対する上述の親和性により、プロ
テアーゼ／プロ酵素はＦVIIIまたはＦV含有溶液から、
固定化ヘパリンまたは他の免疫性もしくは親和性吸着物
質とインキュベートすることによって除去できる。免疫
性吸着物質の調製に有用なポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体、それぞれの抗体フラグメントは本技術分
野において既知の技術により、プロテアーゼまたはプロ
酵素の全体または部分を抗原として用い、容易に入手す
ることができる。
よびヘパリン様物質に対する上述の親和性により、プロ
テアーゼ／プロ酵素はＦVIIIまたはＦV含有溶液から、
固定化ヘパリンまたは他の免疫性もしくは親和性吸着物
質とインキュベートすることによって除去できる。免疫
性吸着物質の調製に有用なポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体、それぞれの抗体フラグメントは本技術分
野において既知の技術により、プロテアーゼまたはプロ
酵素の全体または部分を抗原として用い、容易に入手す
ることができる。
【００３１】しかしながら、ＦVまたはＦVIIIの蛋白分
解を防止するためには、カルシウムイオン量の低下に加
え適宜、天然または合成プロテアーゼインヒビターを使
用することもできる。アプロチニン、α2−アンチプラ
スミン、Ｃ1−エステラーゼインヒビターまたはインタ
ートリプシンインヒビターのような蛋白質もインヒビタ
ーとして使用できる。本技術分野の熟練者には合成セリ
ンプロテアーゼインヒビターとして知られている低分子
量物質もこれに関連して使用することができる。阻害強
度がヘパリンまたはヘパリノイドによって上昇するアン
チトロンビンIIIのようなインヒビターも同様に添加で
きる。すなわち、ヘパリンはそれ自身、小色素原物質に
対するプロテアーゼのアミド分解活性を増大できるが、
それはＦV／ＦVIIIの不活性化を支持しないことが驚く
べきことに見出された。
解を防止するためには、カルシウムイオン量の低下に加
え適宜、天然または合成プロテアーゼインヒビターを使
用することもできる。アプロチニン、α2−アンチプラ
スミン、Ｃ1−エステラーゼインヒビターまたはインタ
ートリプシンインヒビターのような蛋白質もインヒビタ
ーとして使用できる。本技術分野の熟練者には合成セリ
ンプロテアーゼインヒビターとして知られている低分子
量物質もこれに関連して使用することができる。阻害強
度がヘパリンまたはヘパリノイドによって上昇するアン
チトロンビンIIIのようなインヒビターも同様に添加で
きる。すなわち、ヘパリンはそれ自身、小色素原物質に
対するプロテアーゼのアミド分解活性を増大できるが、
それはＦV／ＦVIIIの不活性化を支持しないことが驚く
べきことに見出された。
【００３２】３．新規プロテアーゼからなる医薬 新規なプロテアーゼおよび／またはプロ酵素は治療的に
用いることができる。それらはそれら単独、またはプロ
テアーゼの活性を増大させる物質、たとえばヘパリンま
たはヘパリン関連物質、たとえばヘパリン硫酸、および
／またはカルシウムイオンとともに使用することができ
る。この薬剤にはさらに、第VII因子を同様に添加する
ことも可能である。そのＦVIII副経路活性（ＦＥＩＢ
Ａ）を利用するこのような薬剤の使用は、たとえば、Ｆ
VIIIおよび／またはＦIXおよび／またはＦXIおよび／ま
たは接触相タンパク質たとえばＦXIIに対してたとえば
抗体の存在のために耐容性が存在する場合、または他の
タイプの欠損状態が存在する場合に適用することができ
る。この関連で、ＦVIIはインビトロ、血漿中、濃縮分
画中のいずれかまたは精製ＦVII上に対する作用により
活性化することができる。また、新規な血液凝固剤は、
全身性の出血の予防のためまたは出血を停止させるため
にエキソビボで使用することも可能である。
用いることができる。それらはそれら単独、またはプロ
テアーゼの活性を増大させる物質、たとえばヘパリンま
たはヘパリン関連物質、たとえばヘパリン硫酸、および
／またはカルシウムイオンとともに使用することができ
る。この薬剤にはさらに、第VII因子を同様に添加する
ことも可能である。そのＦVIII副経路活性（ＦＥＩＢ
Ａ）を利用するこのような薬剤の使用は、たとえば、Ｆ
VIIIおよび／またはＦIXおよび／またはＦXIおよび／ま
たは接触相タンパク質たとえばＦXIIに対してたとえば
抗体の存在のために耐容性が存在する場合、または他の
タイプの欠損状態が存在する場合に適用することができ
る。この関連で、ＦVIIはインビトロ、血漿中、濃縮分
画中のいずれかまたは精製ＦVII上に対する作用により
活性化することができる。また、新規な血液凝固剤は、
全身性の出血の予防のためまたは出血を停止させるため
にエキソビボで使用することも可能である。
【００３３】他方、アプロチニンまたは上述のインヒビ
ターによる新規プロテアーゼの観察された阻害は、プロ
テアーゼインヒビターからなり血液を凝固させる能力が
減弱した薬剤の開発に使用できる。これに加えて、新規
なプロテアーゼはまた、それらのプロテアーゼ阻害作用
によって血液凝固を損なう生理学的および非生理学的因
子たとえば合成ペプチドを同定するためにも使用でき
る。特に効率的にトランスフォームされる色素原基質、
たとえばＳ２２８８（詳細は上記参照）のペプチド配列
はこのための構造的基盤として使用することができる。
これらのプレパレーションが蛋白分解活性を含まない場
合には、凝血プレパレーションに対する適当なインヒビ
ターの添加が、それらの調製時にも必要なことがある。
ターによる新規プロテアーゼの観察された阻害は、プロ
テアーゼインヒビターからなり血液を凝固させる能力が
減弱した薬剤の開発に使用できる。これに加えて、新規
なプロテアーゼはまた、それらのプロテアーゼ阻害作用
によって血液凝固を損なう生理学的および非生理学的因
子たとえば合成ペプチドを同定するためにも使用でき
る。特に効率的にトランスフォームされる色素原基質、
たとえばＳ２２８８（詳細は上記参照）のペプチド配列
はこのための構造的基盤として使用することができる。
これらのプレパレーションが蛋白分解活性を含まない場
合には、凝血プレパレーションに対する適当なインヒビ
ターの添加が、それらの調製時にも必要なことがある。
【００３４】プロテアーゼの特性がさらに解明されるに
伴い、いわゆる「第VII因子アクティベーター」プロテ
アーゼとしての付加的用途の可能性を開く性質が発見さ
れた。一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター、たと
えば、プロウロキナーゼ（一本鎖ウロキナーゼ、sucＰ
Ａ、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベー
ター）または sctＰＡ（一本鎖組織プラスミノーゲンア
クティベーター）をインキュベートすると、「第VII因
子アクティベーター」がこれらのプラスミノーゲンアク
ティベーター（ＰＡ）の活性化をもたらす。これに関連
して、一本鎖ＰＡの蛋白分解には限界があり、二重鎖プ
ロテアーゼの形成を生じ、これは特にプラスミノーゲン
の活性化に適している。生成したプラスミンはフィブリ
ン溶解のエフェクター、すなわち血栓の溶解に関与する
生理学的システムである。プロウロキナーゼまたはｔＰ
ＡのようなＰＡは、必要に応じて放出され、また既知の
ようにプラスミンまたはカリクレイン（scuＰＡ）によ
って活性化される内因性タンパク質である。健康状態に
おいてscuＰＡが活性化される機構は、まだ完全には解
明されていない。
伴い、いわゆる「第VII因子アクティベーター」プロテ
アーゼとしての付加的用途の可能性を開く性質が発見さ
れた。一本鎖プラスミノーゲンアクティベーター、たと
えば、プロウロキナーゼ（一本鎖ウロキナーゼ、sucＰ
Ａ、一本鎖ウロキナーゼプラスミノーゲンアクティベー
ター）または sctＰＡ（一本鎖組織プラスミノーゲンア
クティベーター）をインキュベートすると、「第VII因
子アクティベーター」がこれらのプラスミノーゲンアク
ティベーター（ＰＡ）の活性化をもたらす。これに関連
して、一本鎖ＰＡの蛋白分解には限界があり、二重鎖プ
ロテアーゼの形成を生じ、これは特にプラスミノーゲン
の活性化に適している。生成したプラスミンはフィブリ
ン溶解のエフェクター、すなわち血栓の溶解に関与する
生理学的システムである。プロウロキナーゼまたはｔＰ
ＡのようなＰＡは、必要に応じて放出され、また既知の
ようにプラスミンまたはカリクレイン（scuＰＡ）によ
って活性化される内因性タンパク質である。健康状態に
おいてscuＰＡが活性化される機構は、まだ完全には解
明されていない。
【００３５】プラスミノーゲンアクティベーターは，血
栓性疾患または併発症たとえば大腿静脈血栓症、心筋梗
塞または卒中に関連した医薬製剤中において、単離もし
くは組換えによって調製されたタンパク質として治療的
に使用することができる。
栓性疾患または併発症たとえば大腿静脈血栓症、心筋梗
塞または卒中に関連した医薬製剤中において、単離もし
くは組換えによって調製されたタンパク質として治療的
に使用することができる。
【００３６】今回発見された「第VII因子アクティベー
ター」の性質により、後者はプラスミノーゲンアクティ
ベーターたとえばウロキナーゼまたはsctＰＡのインビ
ボまたはエキソビボ活性化に使用することができる。こ
の活性はまたこのプロテアーゼを、特に一本鎖または二
本鎖プラスミノーゲンアクティベーターまたは抗凝固剤
と組合わせて同様に、血栓塞栓性疾患の予防または治療
のための使用に適用できる。この使用の可能性は、プロ
テアーゼがまたプロコアグラント様式で作用できる事実
と矛盾しない。２つの反応のどちらが優先するかの問題
は生理学的物質の利用性によって多分解決される。現時
点での知識によれば、第VII因子は血漿中で中程度に活
性化されて、突然の血管障害に直ちに対処できるように
ある濃度に絶えず維持されている。他方、組織プラスミ
ノーゲンアクティベーターならびにウロキナーゼプラス
ミノーゲンアクティベーターは血漿１ml中にわずかナノ
グラム単位の量で存在するのみである。その濃度がプラ
スミノーゲンアクティベーターの分泌または合成によっ
て上昇するのはフィブリンの沈着または血栓が起こった
場合のみで、それらはついで、局所的に特にそれらが血
栓に結合した場合に活性化されたのち、プラスミノーゲ
ンを活性化して、それらの血栓溶解作用を発揮する。一
本鎖ＰＡが存在する場合、特に局所的に限定された様式
ではそれらの活性化がＦVIIの活性化を上回り、それに
より生理学的状態への調整が可能になる。したがって、
このプロテアーゼはまた止血を調整し、それによって先
天的または後天的欠損状態の症例におけるプロテアーゼ
および／またはプロ酵素による置換に適用される可能性
がある。
ター」の性質により、後者はプラスミノーゲンアクティ
ベーターたとえばウロキナーゼまたはsctＰＡのインビ
ボまたはエキソビボ活性化に使用することができる。こ
の活性はまたこのプロテアーゼを、特に一本鎖または二
本鎖プラスミノーゲンアクティベーターまたは抗凝固剤
と組合わせて同様に、血栓塞栓性疾患の予防または治療
のための使用に適用できる。この使用の可能性は、プロ
テアーゼがまたプロコアグラント様式で作用できる事実
と矛盾しない。２つの反応のどちらが優先するかの問題
は生理学的物質の利用性によって多分解決される。現時
点での知識によれば、第VII因子は血漿中で中程度に活
性化されて、突然の血管障害に直ちに対処できるように
ある濃度に絶えず維持されている。他方、組織プラスミ
ノーゲンアクティベーターならびにウロキナーゼプラス
ミノーゲンアクティベーターは血漿１ml中にわずかナノ
グラム単位の量で存在するのみである。その濃度がプラ
スミノーゲンアクティベーターの分泌または合成によっ
て上昇するのはフィブリンの沈着または血栓が起こった
場合のみで、それらはついで、局所的に特にそれらが血
栓に結合した場合に活性化されたのち、プラスミノーゲ
ンを活性化して、それらの血栓溶解作用を発揮する。一
本鎖ＰＡが存在する場合、特に局所的に限定された様式
ではそれらの活性化がＦVIIの活性化を上回り、それに
より生理学的状態への調整が可能になる。したがって、
このプロテアーゼはまた止血を調整し、それによって先
天的または後天的欠損状態の症例におけるプロテアーゼ
および／またはプロ酵素による置換に適用される可能性
がある。
【００３７】したがって本発明の主題の他の部分は、血
液凝固第VII因子活性化プロテアーゼおよび／またはそ
のプロ酵素型の、フィブリン含有血栓を溶解するのに十
分な量からなる医薬製剤である。この製剤はさらに、一
本鎖プラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）および
／または抗凝固剤を含有させることもできる。プロ酵素
が存在する場合には、上述の医薬製剤内にまたはそれと
ともに、適当な活性化剤を使用することも有利である。
液凝固第VII因子活性化プロテアーゼおよび／またはそ
のプロ酵素型の、フィブリン含有血栓を溶解するのに十
分な量からなる医薬製剤である。この製剤はさらに、一
本鎖プラスミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）および
／または抗凝固剤を含有させることもできる。プロ酵素
が存在する場合には、上述の医薬製剤内にまたはそれと
ともに、適当な活性化剤を使用することも有利である。
【００３８】「ＦVIIアクティベーター」のプラスミノ
ーゲンアクティベーター増強作用は、特にカルシウムお
よび／またはヘパリンおよびヘパリン様物質たとえばデ
キストラン硫酸によって促進されることが見出されたこ
とから、さらに可溶性カルシウム塩および／またはヘパ
リンもしくはヘパリン様物質を含有する医薬製剤は、フ
ィブリン含有血栓を本発明によって溶解するために有利
に使用できる。これに関連して、プロテアーゼ／プロ酵
素はその単独または一本鎖または二本鎖プラスミノーゲ
ンアクティベーターと組合わせ、所望によりプロテアー
ゼに対して特定の親和性を発揮し、それによって血漿中
半減期を延長する担体物質としてまたは表面へのメディ
エーターとしてその活性を増大させる物質とともに使用
することができる。
ーゲンアクティベーター増強作用は、特にカルシウムお
よび／またはヘパリンおよびヘパリン様物質たとえばデ
キストラン硫酸によって促進されることが見出されたこ
とから、さらに可溶性カルシウム塩および／またはヘパ
リンもしくはヘパリン様物質を含有する医薬製剤は、フ
ィブリン含有血栓を本発明によって溶解するために有利
に使用できる。これに関連して、プロテアーゼ／プロ酵
素はその単独または一本鎖または二本鎖プラスミノーゲ
ンアクティベーターと組合わせ、所望によりプロテアー
ゼに対して特定の親和性を発揮し、それによって血漿中
半減期を延長する担体物質としてまたは表面へのメディ
エーターとしてその活性を増大させる物質とともに使用
することができる。
【００３９】血液凝固第VII因子活性化プロテアーゼか
らなる医薬製剤は、その特異的なフィブリン溶解作用に
より、フィブリン含有血栓によって引き起こされる疾患
の処置に使用することができる。フィブリン溶解過程は
また創傷治癒過程に関与する。この関連で、上記プロテ
アーゼおよび／またはプロ酵素は、静脈内もしくは局部
的、皮下、皮内または筋肉内あるいは傷害もしくは創傷
の場合は局所的にまたは適当な担体マトリックスに結合
させて投与することができる。体液たとえば血液または
血漿から単離されたプロテアーゼ／プロ酵素および組換
えまたは遺伝子導入により調製されたプロテアーゼ／プ
ロ酵素はいずれもこの関連で使用できる。プロテアーゼ
／プロ酵素はまた、いわゆるフィブリン接着剤の成分と
しても適当で、これにはアプロチニンのようなプロテア
ーゼ／プロ酵素を阻害する物質を含有してはならない。
この場合、プロテアーゼの凝血短縮作用が利用される。
らなる医薬製剤は、その特異的なフィブリン溶解作用に
より、フィブリン含有血栓によって引き起こされる疾患
の処置に使用することができる。フィブリン溶解過程は
また創傷治癒過程に関与する。この関連で、上記プロテ
アーゼおよび／またはプロ酵素は、静脈内もしくは局部
的、皮下、皮内または筋肉内あるいは傷害もしくは創傷
の場合は局所的にまたは適当な担体マトリックスに結合
させて投与することができる。体液たとえば血液または
血漿から単離されたプロテアーゼ／プロ酵素および組換
えまたは遺伝子導入により調製されたプロテアーゼ／プ
ロ酵素はいずれもこの関連で使用できる。プロテアーゼ
／プロ酵素はまた、いわゆるフィブリン接着剤の成分と
しても適当で、これにはアプロチニンのようなプロテア
ーゼ／プロ酵素を阻害する物質を含有してはならない。
この場合、プロテアーゼの凝血短縮作用が利用される。
【００４０】上記プロテアーゼ／プロ酵素は、先天性ま
たは後天性止血欠損、（汎発性）出血の発生、各種血栓
関連併発症に使用することができる。出血の処置に使用
する場合は、プロテアーゼ／プロ酵素をＦVIIIととも
に、所望により、さらに他の凝血因子を付加することが
有利である。
たは後天性止血欠損、（汎発性）出血の発生、各種血栓
関連併発症に使用することができる。出血の処置に使用
する場合は、プロテアーゼ／プロ酵素をＦVIIIととも
に、所望により、さらに他の凝血因子を付加することが
有利である。
【００４１】４．ＦVII活性化プロテアーゼを滅菌する
方法 ヒト血漿から単離されたタンパク質であるから、新規な
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素は、予めウイ
ルスを不活性化する処理に付した場合にのみ、医薬製剤
として使用することができる。滅菌過程が特にウイルス
の不活性化に最も重要な過程として認識されている。し
かしながら、処理すべきタンパク質には約６０℃で１０
時間までの過熱に適当な安定性が要求される。各タンパ
ク質について至適な安定剤を別個に決定し、それらの濃
度を至適化しなければならない。新規なプロテアーゼお
よび／またはそのプロ酵素の場合、滅菌は行わない溶液
中のタンパク質を安定化する条件は既に上述した。この
場合わずかに酸性のｐＨが特に有利なことが証明されて
いる。しかしながら、これらの条件下に滅菌を行うと、
新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素では通
常、元の活性の５０％以上が失われる。
方法 ヒト血漿から単離されたタンパク質であるから、新規な
プロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素は、予めウイ
ルスを不活性化する処理に付した場合にのみ、医薬製剤
として使用することができる。滅菌過程が特にウイルス
の不活性化に最も重要な過程として認識されている。し
かしながら、処理すべきタンパク質には約６０℃で１０
時間までの過熱に適当な安定性が要求される。各タンパ
ク質について至適な安定剤を別個に決定し、それらの濃
度を至適化しなければならない。新規なプロテアーゼお
よび／またはそのプロ酵素の場合、滅菌は行わない溶液
中のタンパク質を安定化する条件は既に上述した。この
場合わずかに酸性のｐＨが特に有利なことが証明されて
いる。しかしながら、これらの条件下に滅菌を行うと、
新規なプロテアーゼおよび／またはそのプロ酵素では通
常、元の活性の５０％以上が失われる。
【００４２】新規なプロテアーゼおよび／またはそのプ
ロ酵素からなる医薬製剤の滅菌は、プレパレーションを ａ）ｐＨ範囲３.５〜８.０、好ましくはｐＨ範囲４.０
〜６.８； ｂ）添加した１種または２種以上のアミノ酸０.０１mol
／L以上、好ましくは０.０５mol／L以上の存在下；およ
び／または ｃ）添加した１種の糖または異なる糖の組合わせ、総濃
度０.０５ｇ／ml以上、好ましくは０.２ｇ／ml以上の存
在下；および／または ｄ）添加したカルシウムイオンと錯体を形成できる物質
たとえばクエン酸、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸
等１種または２種以上の存在下に調製されると、至適な
安定化結果が保証される。
ロ酵素からなる医薬製剤の滅菌は、プレパレーションを ａ）ｐＨ範囲３.５〜８.０、好ましくはｐＨ範囲４.０
〜６.８； ｂ）添加した１種または２種以上のアミノ酸０.０１mol
／L以上、好ましくは０.０５mol／L以上の存在下；およ
び／または ｃ）添加した１種の糖または異なる糖の組合わせ、総濃
度０.０５ｇ／ml以上、好ましくは０.２ｇ／ml以上の存
在下；および／または ｄ）添加したカルシウムイオンと錯体を形成できる物質
たとえばクエン酸、シュウ酸、エチレンジアミン四酢酸
等１種または２種以上の存在下に調製されると、至適な
安定化結果が保証される。
【００４３】添加物たとえばアルブミン、Haemacce
l(R)、ヘパリンおよびヘパリノイド、グリセロール、グ
リコールおよびポリエチレングリコールを別個にまたは
一緒に混合して使用することができる。滅菌が完了した
のち、安定剤として添加した糖、アミノ酸および他の添
加物は、本技術分野の熟練者には周知の方法を用いてプ
レパレーションから減量または完全に除去することがで
きる。滅菌過程の結果は実施例１２および１３に示す。
l(R)、ヘパリンおよびヘパリノイド、グリセロール、グ
リコールおよびポリエチレングリコールを別個にまたは
一緒に混合して使用することができる。滅菌が完了した
のち、安定剤として添加した糖、アミノ酸および他の添
加物は、本技術分野の熟練者には周知の方法を用いてプ
レパレーションから減量または完全に除去することがで
きる。滅菌過程の結果は実施例１２および１３に示す。
【００４４】
【実施例】実施例１ 調製されたプロテアーゼによるＦVIIの活性化を、Stacl
ot(R)ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステム（Stago／Boehrin
ger Mannheim）を用いて証明した。この検出システム
は、予め形成された活性化ＦVII（ＦVIIａ）を外因系凝
固経路の阻害にのみ使用できる特定の性質の（組換え）
可溶性組織因子（ｒＴＦ）に基づくものである。これ
は、完全な組織因子を用いた場合とは異なり、ＦVIIａ
の実際の含有量を正確に決定することを可能にする。
ot(R)ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステム（Stago／Boehrin
ger Mannheim）を用いて証明した。この検出システム
は、予め形成された活性化ＦVII（ＦVIIａ）を外因系凝
固経路の阻害にのみ使用できる特定の性質の（組換え）
可溶性組織因子（ｒＴＦ）に基づくものである。これ
は、完全な組織因子を用いた場合とは異なり、ＦVIIａ
の実際の含有量を正確に決定することを可能にする。
【００４５】単離されたＦVII（Enzyme Research Lab
s）を用いて活性化実験を行った。このＦVII自体はヒト
血漿から単離されたために痕跡のＦVIIａを含んでい
る。緩衝液で希釈して濃度をＦVII ０.０５IU／mlに調
整した。ＦVIIを試験物質と室温で１０分間インキュベ
ートし、ついで真のＦVIIａ含量を試験した。ＦVIIａ含
量は平行して構築した標準曲線を用いて定量した。
s）を用いて活性化実験を行った。このＦVII自体はヒト
血漿から単離されたために痕跡のＦVIIａを含んでい
る。緩衝液で希釈して濃度をＦVII ０.０５IU／mlに調
整した。ＦVIIを試験物質と室温で１０分間インキュベ
ートし、ついで真のＦVIIａ含量を試験した。ＦVIIａ含
量は平行して構築した標準曲線を用いて定量した。
【００４６】本明細書には記載していない予備実験で、
用いた濃度ではアプロチニンは調製されたプロテアーゼ
の活性を完全に阻害したが、ＦVIIａに直接の作用をも
たず、ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに有意な影響を
示さないことが確認された。以下に掲げる結果は、各場
合、三重の測定に関する。すなわち、以下の実験は次の
ようにセットアップされた。
用いた濃度ではアプロチニンは調製されたプロテアーゼ
の活性を完全に阻害したが、ＦVIIａに直接の作用をも
たず、ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに有意な影響を
示さないことが確認された。以下に掲げる結果は、各場
合、三重の測定に関する。すなわち、以下の実験は次の
ようにセットアップされた。
【００４７】１．ＦVII：対照アッセイとしては非活性
化ＦVIIを使用した。これは、既に痕跡のＦVIIａを（上
記参照）をＦVIIａ １０mIU／mlのオーダーで含有して
いる。
化ＦVIIを使用した。これは、既に痕跡のＦVIIａを（上
記参照）をＦVIIａ １０mIU／mlのオーダーで含有して
いる。
【００４８】２．ＦVII＋アプロチニン：このアッセイ
では、ＦVIIはアプロチニンの存在下にインキュベート
し、ＦVIIａ自体は阻害されないことまたテストは用い
たアプロチニンによって影響されないことを証明するた
めに、ＦVIIａ−ｒＴＦアッセイを使用した。これは確
認された（アッセイ１との比較で）。
では、ＦVIIはアプロチニンの存在下にインキュベート
し、ＦVIIａ自体は阻害されないことまたテストは用い
たアプロチニンによって影響されないことを証明するた
めに、ＦVIIａ−ｒＴＦアッセイを使用した。これは確
認された（アッセイ１との比較で）。
【００４９】３．プロテアーゼ＋ＦVII（インキュベー
ト）ついでアプロチニンの添加： 結果：ＦVIIａ １８mIU／ml この場合、プロテアーゼにはＦVIIａを活性化する時間
を与えた。アプロチニンはプロテアーゼをそがいするた
めに単に添加し、１０分間のインキュベーション後に行
われた。得られたＦVIIａをＦVIIａ−ｒＴＦアッセイで
定量した。すなわち、ＦVIIａの基底値（アッセイ１）
を差し引くと、選択された条件下でのプロテアーゼの活
性によってＦVIIａ ８mIU／mlが形成された。
ト）ついでアプロチニンの添加： 結果：ＦVIIａ １８mIU／ml この場合、プロテアーゼにはＦVIIａを活性化する時間
を与えた。アプロチニンはプロテアーゼをそがいするた
めに単に添加し、１０分間のインキュベーション後に行
われた。得られたＦVIIａをＦVIIａ−ｒＴＦアッセイで
定量した。すなわち、ＦVIIａの基底値（アッセイ１）
を差し引くと、選択された条件下でのプロテアーゼの活
性によってＦVIIａ ８mIU／mlが形成された。
【００５０】４．プロテアーゼ＋アプロチニン、ついで
ＦVIIの添加： 結果：ＦVIIａ １１mIU／ml このアッセイでは、プロテアーゼをＦVIIと接触させる
前にアプロチニンで阻害した。以後のＦVIIとのインキ
ュベーションでもまた続くＦVIIａの定量でも、有意な
ＦVIIａ含量の上昇は生じなかった（アッセイにおける
変動の範囲、すなわち、アッセイ１における１１と１０
mIU／mlは有意とはみなされない）。
ＦVIIの添加： 結果：ＦVIIａ １１mIU／ml このアッセイでは、プロテアーゼをＦVIIと接触させる
前にアプロチニンで阻害した。以後のＦVIIとのインキ
ュベーションでもまた続くＦVIIａの定量でも、有意な
ＦVIIａ含量の上昇は生じなかった（アッセイにおける
変動の範囲、すなわち、アッセイ１における１１と１０
mIU／mlは有意とはみなされない）。
【００５１】５．プロテアーゼ： 結果：ＦVIIａ ０mIU／ml このアッセイでは、選択された濃度においてプロテアー
ゼはそれ自体ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに何ら影
響を与えないことが証明された。要約すれば、以上から −記述したプロテアーゼはＦVIIを活性化する； −プロテアーゼによるＦVIIの活性化は「直接」、すな
わち、ｒＴＦの存在とは独立に起こる； −ＦVIIの活性化はアプロチニンによって阻害される；
アプロチニンそれ自体はテストシステムに何ら有意な影
響は与えない；と結論される。
ゼはそれ自体ＦVIIａ−ｒＴＦテストシステムに何ら影
響を与えないことが証明された。要約すれば、以上から −記述したプロテアーゼはＦVIIを活性化する； −プロテアーゼによるＦVIIの活性化は「直接」、すな
わち、ｒＴＦの存在とは独立に起こる； −ＦVIIの活性化はアプロチニンによって阻害される；
アプロチニンそれ自体はテストシステムに何ら有意な影
響は与えない；と結論される。
【００５２】実施例２ この実施例はプロテアーゼの濃度およびプロテアーゼが
ＦVIIとインキュベートされた時間とは独立の反応にお
いて、ＦVIIがいかにして活性化されるかを説明する。
テストシステムおよび試薬は実施例１の記載に相当する
ように選択された。最初のシリーズの実験では、最初に
導入されたＦVIIは様々な希釈度（１：５、１：１０お
よび１：２０）のプロテアーゼ含有溶液とプレインキュ
ベートし（室温５分）、ついでアプロチニン（プロテア
ーゼを阻害する）で処理し、続いて、そのＦVIIａ含量
をＦVIIａ−ｒＴＦアッセイにおいて試験した。この場
合も、プロテアーゼをＦVIIと接触させる前にアプロチ
ニンによって阻害したアッセイを平行して行い、対照と
した。
ＦVIIとインキュベートされた時間とは独立の反応にお
いて、ＦVIIがいかにして活性化されるかを説明する。
テストシステムおよび試薬は実施例１の記載に相当する
ように選択された。最初のシリーズの実験では、最初に
導入されたＦVIIは様々な希釈度（１：５、１：１０お
よび１：２０）のプロテアーゼ含有溶液とプレインキュ
ベートし（室温５分）、ついでアプロチニン（プロテア
ーゼを阻害する）で処理し、続いて、そのＦVIIａ含量
をＦVIIａ−ｒＴＦアッセイにおいて試験した。この場
合も、プロテアーゼをＦVIIと接触させる前にアプロチ
ニンによって阻害したアッセイを平行して行い、対照と
した。
【００５３】結果は活性化係数として与える。すなわ
ち、上述の対照アッセイで測定された値のｘ倍に相当す
る。 アッセイ：プロテアーゼ＋ＦVII、インキュベーショ
ン、＋アプロチニン 対照：プロテアーゼ＋アプロチニン、インキュベーショ
ン＋ＦVII
ち、上述の対照アッセイで測定された値のｘ倍に相当す
る。 アッセイ：プロテアーゼ＋ＦVII、インキュベーショ
ン、＋アプロチニン 対照：プロテアーゼ＋アプロチニン、インキュベーショ
ン＋ＦVII
【表１】 これから、ＦVIIはプロテアーゼにより、プロテアーゼ
の濃度に依存する様式で活性化されると結論される。
の濃度に依存する様式で活性化されると結論される。
【００５４】共反応物質の濃度を一定に保持した場合、
ＦVIIはインキュベーションの長さとは独立の様式で、
プロテアーゼによって活性化されることも同様に証明さ
れた。ＦVII ０.２IU／mlおよび１：１０−希釈プロテ
アーゼ溶液を含有する溶液の等容量を一緒にインキュベ
ートした場合には、相当時間のインキュベーション後に
アプロチニンを添加して(活性化を停止させるため)、以
下のＦVIIａ含量が得られた。
ＦVIIはインキュベーションの長さとは独立の様式で、
プロテアーゼによって活性化されることも同様に証明さ
れた。ＦVII ０.２IU／mlおよび１：１０−希釈プロテ
アーゼ溶液を含有する溶液の等容量を一緒にインキュベ
ートした場合には、相当時間のインキュベーション後に
アプロチニンを添加して(活性化を停止させるため)、以
下のＦVIIａ含量が得られた。
【表２】 これから、ＦVIIは、プロテアーゼによって時間依存性
の様式で活性化されると結論される。
の様式で活性化されると結論される。
【００５５】実施例３ この実施例を用い、ＦVIIのプロテアーゼによる活性化
はカルシウムイオンおよびヘパリンの存在によって増大
することを証明することとする。２５μlのプロテアー
ゼ含有溶液を、５０μlの −緩衝液（対照） −１５ｍＭ ＣaＣl2 −ヘパリン ５０ＵＳＰ単位／ml −Pathromtin（脂質混合物、アリコートを製造業者の指
示書に従って溶解）と室温で５分間混合し、ついで１５
０μlのｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（pH８.２）および２
５μlの色素原基質Ｓ２２８８（３mM）で処理し、つい
で４０５nmにおける吸光度の経時的変化を測定した（３
７℃）。緩衝液対照に対する活性化係数（ｘ倍）は下表
に示す。
はカルシウムイオンおよびヘパリンの存在によって増大
することを証明することとする。２５μlのプロテアー
ゼ含有溶液を、５０μlの −緩衝液（対照） −１５ｍＭ ＣaＣl2 −ヘパリン ５０ＵＳＰ単位／ml −Pathromtin（脂質混合物、アリコートを製造業者の指
示書に従って溶解）と室温で５分間混合し、ついで１５
０μlのｔｒｉｓ／ＮａＣｌ緩衝液（pH８.２）および２
５μlの色素原基質Ｓ２２８８（３mM）で処理し、つい
で４０５nmにおける吸光度の経時的変化を測定した（３
７℃）。緩衝液対照に対する活性化係数（ｘ倍）は下表
に示す。
【表３】 この実施例で用いた条件下には、プロテアーゼ活性の著
しい上昇をカルシウムイオンおよび／またはヘパリンの
存在下に観察することができる。
しい上昇をカルシウムイオンおよび／またはヘパリンの
存在下に観察することができる。
【００５６】実施例４ いずれの場合も、プロテアーゼ１０、１または０.１μg
／mlを含有する溶液を、２５μlのＦVII（２IU／ml）と
混合したのち、２５μlのＣaＣl2（２５mM）および２５
μlのPathromtin(R)(Dade Behring GmbH）を加えた。３
７℃において０、３、１０および２０分間インキュベー
トしたのち、４００μlのアプロチニン（５００KIU／m
g）を添加して反応を停止させた。アプロチニンを最初
に添加したサンプルを対照として用いた。
／mlを含有する溶液を、２５μlのＦVII（２IU／ml）と
混合したのち、２５μlのＣaＣl2（２５mM）および２５
μlのPathromtin(R)(Dade Behring GmbH）を加えた。３
７℃において０、３、１０および２０分間インキュベー
トしたのち、４００μlのアプロチニン（５００KIU／m
g）を添加して反応を停止させた。アプロチニンを最初
に添加したサンプルを対照として用いた。
【００５７】各サンプルをｔｒｉｓ緩衝液／ＢＳＡに希
釈した。各場合、この溶液５０μlを因子試薬［主とし
てＦIXａ、ＦXおよびトロンビンインヒビターからな
り、Cosmatic(R)ＦVIIIテスト、Chromogenix AB に従っ
て改変］５０μlと混合し、３７℃において１０分間イ
ンキュベートした。５０μlの基質（たとえばＳ２７６
５、Ｎ−ａ−Ｃbo−Ｄ−Ａrg−Ｇly−Ａrg−pＮＡ）を
加えてたのち、既定時間のインキュベーション後に５０
μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、つい
でＯＤ405nmを測定した。ＦVIIIの標準曲線を用いてサ
ンプル中の濃度を決定した。
釈した。各場合、この溶液５０μlを因子試薬［主とし
てＦIXａ、ＦXおよびトロンビンインヒビターからな
り、Cosmatic(R)ＦVIIIテスト、Chromogenix AB に従っ
て改変］５０μlと混合し、３７℃において１０分間イ
ンキュベートした。５０μlの基質（たとえばＳ２７６
５、Ｎ−ａ−Ｃbo−Ｄ−Ａrg−Ｇly−Ａrg−pＮＡ）を
加えてたのち、既定時間のインキュベーション後に５０
μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、つい
でＯＤ405nmを測定した。ＦVIIIの標準曲線を用いてサ
ンプル中の濃度を決定した。
【００５８】結果：最初のアッセイでは、プロテアーゼ
をＦVIII（２IU／ml）とインキュベートする時間を一定
（１０分）に保持したが、プロテアーゼの濃度は変動さ
せた（０.１、１および１０μg／ml）。反応を停止さ
せ、活性なＦVIIIの残留濃度を測定した。プロテアーゼ
濃度が上昇すると、それに対応してＦVIIIは不活性化さ
れた（図１）。サンプルのプロテアーゼ含量は適当な標
準曲線を用いて定量化できる。第二のアッセイではプロ
テアーゼの濃度を一定に保持して（１０μg／ml）、ＦV
III（２IU／ml）とインキュベーション時間を変動させ
た。活性なＦVIIIの残留濃度の著しい低下がインキュベ
ーション時間の延長とともに認められた（図２）。
をＦVIII（２IU／ml）とインキュベートする時間を一定
（１０分）に保持したが、プロテアーゼの濃度は変動さ
せた（０.１、１および１０μg／ml）。反応を停止さ
せ、活性なＦVIIIの残留濃度を測定した。プロテアーゼ
濃度が上昇すると、それに対応してＦVIIIは不活性化さ
れた（図１）。サンプルのプロテアーゼ含量は適当な標
準曲線を用いて定量化できる。第二のアッセイではプロ
テアーゼの濃度を一定に保持して（１０μg／ml）、ＦV
III（２IU／ml）とインキュベーション時間を変動させ
た。活性なＦVIIIの残留濃度の著しい低下がインキュベ
ーション時間の延長とともに認められた（図２）。
【００５９】実施例５ 第V因子の活性に対する「ＦVIIアクティベーター」の影
響を検討した。２５μlのプロテアーゼ含有溶液（０〜
１００μg／ml）を５０μlのＦV（５IU／ml）および２
５μlのＣaＣl2 とインキュベートし（０〜２０分）、
ついで１００KIU／mlのアプロチニンを含む緩衝液４０
０μlを加えた。いずれの場合も、各１００μlのインキ
ュベーションアッセイをついで１００μlのＦV欠乏血漿
と３７℃で１分間インキュベートし、次に２００μlのT
hromborelＳ(R)を加えて混合し、Schnitger & Gross 血
液凝固計で血液凝固時間を測定した。ＦVの残留活性を
決定した。 結果：
響を検討した。２５μlのプロテアーゼ含有溶液（０〜
１００μg／ml）を５０μlのＦV（５IU／ml）および２
５μlのＣaＣl2 とインキュベートし（０〜２０分）、
ついで１００KIU／mlのアプロチニンを含む緩衝液４０
０μlを加えた。いずれの場合も、各１００μlのインキ
ュベーションアッセイをついで１００μlのＦV欠乏血漿
と３７℃で１分間インキュベートし、次に２００μlのT
hromborelＳ(R)を加えて混合し、Schnitger & Gross 血
液凝固計で血液凝固時間を測定した。ＦVの残留活性を
決定した。 結果：
【表４】 この実施例では、ＦVがプロテアーゼによって経時的に
不活性化されたことが証明される。
不活性化されたことが証明される。
【００６０】実施例６ 「ＦVIIアクティベーター」のいわゆる包括的試験にお
ける血液凝固時間に対する影響を、Schnitger & Gross
血液凝固計を用いて検討した。掲げた差の値は、すべて
この量で短縮された血液凝固時間に相当する。
ける血液凝固時間に対する影響を、Schnitger & Gross
血液凝固計を用いて検討した。掲げた差の値は、すべて
この量で短縮された血液凝固時間に相当する。
【００６１】ＮＡＰＴＴ（非活性化部分トロンボプラス
チン時間） プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０お
よび３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１０
０μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プール
または個々のドナーから）および１００μlのPathromti
n(R)と３７℃で２分間インキュベートし、ついで１００
μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、ついで血液凝固時間を
測定した。これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝
液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求
めた。
チン時間） プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０お
よび３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１０
０μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プール
または個々のドナーから）および１００μlのPathromti
n(R)と３７℃で２分間インキュベートし、ついで１００
μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、ついで血液凝固時間を
測定した。これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝
液を用いて得られた相当する血液凝固時間の間の差を求
めた。
【表５】 ＦVIIアクティベーターの添加はＮＡＰＴＴの濃度依存
性の短縮を生じた。
性の短縮を生じた。
【００６２】血漿カルシウム再沈殿時間 プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０お
よび３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１０
０μｌを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プー
ルまたは個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュ
ベートし、ついで１００μlの２５ｍＭ ＣａＣｌ2を加
え、ついで血液凝固時間を測定した。これらの測定値と
プロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する
血液凝固時間の間の差を求めた。
よび３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１０
０μｌを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プー
ルまたは個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュ
ベートし、ついで１００μlの２５ｍＭ ＣａＣｌ2を加
え、ついで血液凝固時間を測定した。これらの測定値と
プロテアーゼに代えて緩衝液を用いて得られた相当する
血液凝固時間の間の差を求めた。
【表６】
【００６３】ＰＴ（プロトロンビン時間） プロテアーゼ含有溶液を緩衝液で１００、３０、１０お
よび３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１０
０μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プール
または個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュベ
ートし、ついで２００μlのThromborelＳ(R)（Dade Beh
ring GmbH）を加え、ついで血液凝固時間を測定した。
これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて
得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
よび３μg／mlに希釈した。これらの溶液それぞれ１０
０μlを、１００μlの加クエン酸血漿（標準血漿プール
または個々のドナーから）と３７℃で１分間インキュベ
ートし、ついで２００μlのThromborelＳ(R)（Dade Beh
ring GmbH）を加え、ついで血液凝固時間を測定した。
これらの測定値とプロテアーゼに代えて緩衝液を用いて
得られた相当する血液凝固時間の間の差を求めた。
【表７】
【００６４】実施例７ 「ＦVIIアクティベーター」のプラスミノーゲンアクテ
ィベーター活性化作用を一本鎖ウロキナーゼ（scuＰ
Ａ）および一本鎖ｔＰＡ（sctＰＡ）を使用して検討し
た。 アッセイ： ０.１ml ＰＡ溶液（20μg／mlのscuPAまたは100μg
／mlのsctPA） ＋０.１ml 試験緩衝液または試験緩衝液中１００Ｕ／m
lのヘパリンまたは試験緩衝液中２０ｍＭ ＣaＣl2 ＋０.５ml 試験緩衝液 ＋０.１ml プロテアーゼ／サンプル（濃度上昇；２〜1
0μg／mlのscuPAまたは50〜200μg／mlのsctPA） ３７℃でインキュベーション ＋０.１ml 試験緩衝液中１００KIU／mlのアプロチニン ３７℃で２分間インキュベーション ＋０.１ml 基質Ｓ−２４４４（３mM） 対照としては、最初のインキュベーションの前に、プラ
スミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）に代えてアプロ
チニンを最初に導入し、以下、各場合を通して同様に実
施する。一方、ＰＡは、以後アプロチニンの代わりに添
加するまで加えなかった。測定値の差（Δ）ΔＯＤ
405nmを光学的に測定した。得られた対照値をサンプル
／プロテアーゼ値から差し引き、この方法で、ＰＡＡ活
性によって生じたＰＡ活性を測定した（ｍＩＵ／分）。
ィベーター活性化作用を一本鎖ウロキナーゼ（scuＰ
Ａ）および一本鎖ｔＰＡ（sctＰＡ）を使用して検討し
た。 アッセイ： ０.１ml ＰＡ溶液（20μg／mlのscuPAまたは100μg
／mlのsctPA） ＋０.１ml 試験緩衝液または試験緩衝液中１００Ｕ／m
lのヘパリンまたは試験緩衝液中２０ｍＭ ＣaＣl2 ＋０.５ml 試験緩衝液 ＋０.１ml プロテアーゼ／サンプル（濃度上昇；２〜1
0μg／mlのscuPAまたは50〜200μg／mlのsctPA） ３７℃でインキュベーション ＋０.１ml 試験緩衝液中１００KIU／mlのアプロチニン ３７℃で２分間インキュベーション ＋０.１ml 基質Ｓ−２４４４（３mM） 対照としては、最初のインキュベーションの前に、プラ
スミノーゲンアクティベーター（ＰＡ）に代えてアプロ
チニンを最初に導入し、以下、各場合を通して同様に実
施する。一方、ＰＡは、以後アプロチニンの代わりに添
加するまで加えなかった。測定値の差（Δ）ΔＯＤ
405nmを光学的に測定した。得られた対照値をサンプル
／プロテアーゼ値から差し引き、この方法で、ＰＡＡ活
性によって生じたＰＡ活性を測定した（ｍＩＵ／分）。
【００６５】結果：scuＰＡの活性化（20μg／mlのscuP
A、２〜10μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」）
A、２〜10μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」）
【表８】 表は、scuＰＡが「ＦVIIアクティベーター」の濃度およ
びインキュベーションの長さに依存する様式で活性化さ
れる事実を例示する。同時に、ヘパリンおよびカルシウ
ムの両者がプロテアーゼによってもたらされたＰＡの活
性化に刺激作用を示した。
びインキュベーションの長さに依存する様式で活性化さ
れる事実を例示する。同時に、ヘパリンおよびカルシウ
ムの両者がプロテアーゼによってもたらされたＰＡの活
性化に刺激作用を示した。
【００６６】scuＰＡの活性化（100μg／mlのsctPA、50
〜200μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」） 活性化ｔＰＡの代謝回転速度はｔＰＡプロ酵素に比較し
て係数３〜４まで上昇するにすぎない（ｕＰＡの場合は
係数１０００〜１５００上昇する）ので、分析可能な測
定シグナルを得るために、２種の共反応物質の高い濃度
を選択しなければならなかった。
〜200μg／mlの「ＦVIIアクティベーター」） 活性化ｔＰＡの代謝回転速度はｔＰＡプロ酵素に比較し
て係数３〜４まで上昇するにすぎない（ｕＰＡの場合は
係数１０００〜１５００上昇する）ので、分析可能な測
定シグナルを得るために、２種の共反応物質の高い濃度
を選択しなければならなかった。
【表９】 表は sctＰＡもプロテアーゼの濃度およびインキュベー
ション時間に依存する様式で活性化されたことを証明す
る。ヘパリンおよびカルシウムイオンの両者が「ＦVII
アクティベーター」のＰＡの活性化能力に対して刺激作
用を示した。
ション時間に依存する様式で活性化されたことを証明す
る。ヘパリンおよびカルシウムイオンの両者が「ＦVII
アクティベーター」のＰＡの活性化能力に対して刺激作
用を示した。
【００６７】実施例８ ２種のＦVIII含有溶液、一方はフォン・ヴィルブラント
因子を本質的に含まず、他方はｖＷＦを含有する溶液を
上述のプロテアーゼとカルシウムの存在下にインキュベ
ートした。予め定められた時間後に、色素原試験によっ
て残留ＦVIII活性を測定し、プロテアーゼを含まない対
照アッセイと関連させた。
因子を本質的に含まず、他方はｖＷＦを含有する溶液を
上述のプロテアーゼとカルシウムの存在下にインキュベ
ートした。予め定められた時間後に、色素原試験によっ
て残留ＦVIII活性を測定し、プロテアーゼを含まない対
照アッセイと関連させた。
【００６８】このためには、０.１IU／mlのＦVIIIを含
有する溶液２５μlを同容量のプロテアーゼ溶液（μg／
ml）で処理し、全体を２５μlのＣaＣl2（２５mM）と混
合した。０、５、１０および２０分間３７℃でインキュ
ベートしたのち、プロテアーゼの蛋白分解活性を停止さ
せるために各場合、２００KIU／mlのアプロチニンを含
有する溶液４００μlで処理した。予備実験では、アプ
ロチニンのこの濃度はいかに記述するＦVIII活性試験
（アッセイ１＋３）に有意な干渉作用をもたないことが
示された。アッセイ２においては、プロテアーゼをＦVI
IIと接触させる前にアプロチニンとインキュベートし、
ついで上述のように操作した。
有する溶液２５μlを同容量のプロテアーゼ溶液（μg／
ml）で処理し、全体を２５μlのＣaＣl2（２５mM）と混
合した。０、５、１０および２０分間３７℃でインキュ
ベートしたのち、プロテアーゼの蛋白分解活性を停止さ
せるために各場合、２００KIU／mlのアプロチニンを含
有する溶液４００μlで処理した。予備実験では、アプ
ロチニンのこの濃度はいかに記述するＦVIII活性試験
（アッセイ１＋３）に有意な干渉作用をもたないことが
示された。アッセイ２においては、プロテアーゼをＦVI
IIと接触させる前にアプロチニンとインキュベートし、
ついで上述のように操作した。
【００６９】いずれの場合も、５０μlの停止したサン
プル（またはさらに希釈後）をついで主としてＦIX、Ｆ
Xおよびトロンビンインヒビターからなる、いわゆる因
子試薬で処理し、３７℃において１０分間インキュベー
トした。活性化ＦXによって切断される色素原基質５０
μlの添加に続いて５分間インキュベートしたのち５０
μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、つい
でΔＯＤ405nmを測定した。ＦVIII活性（mIU）は、ＦVI
II濃縮物から調製し、テストに包含された希釈系列を用
いて構築した標準曲線を利用して確認した。
プル（またはさらに希釈後）をついで主としてＦIX、Ｆ
Xおよびトロンビンインヒビターからなる、いわゆる因
子試薬で処理し、３７℃において１０分間インキュベー
トした。活性化ＦXによって切断される色素原基質５０
μlの添加に続いて５分間インキュベートしたのち５０
μlの酢酸（５０％）を添加して反応を停止させ、つい
でΔＯＤ405nmを測定した。ＦVIII活性（mIU）は、ＦVI
II濃縮物から調製し、テストに包含された希釈系列を用
いて構築した標準曲線を利用して確認した。
【００７０】ＦVIII活性はプロテアーゼを添加しなかっ
た対照に対する百分率で示す。 結果：
た対照に対する百分率で示す。 結果：
【表１０】 ＣaＣl2（この場合は６.２５ｍＭ）の存在下には、ＦVI
IIはプロテアーゼにより、インキュベーションの長さに
依存した様式で不活性化された。ｖＷＦは、プロテアー
ゼによる不活性化からＦVIIIを保護しなかった。ＦVIII
と接触させる前にアプロチニンでプロテアーゼを阻害す
ると、前者の不活性化は防止された。
IIはプロテアーゼにより、インキュベーションの長さに
依存した様式で不活性化された。ｖＷＦは、プロテアー
ゼによる不活性化からＦVIIIを保護しなかった。ＦVIII
と接触させる前にアプロチニンでプロテアーゼを阻害す
ると、前者の不活性化は防止された。
【００７１】実施例９ このシリーズの実験では、実施例１／アッセイ１を実施
したが、この場合は、プロテアーゼとＦVIIIの混合物中
のカルシウム濃度を変動させた。このためには、ＣaＣl
2をカルシウム保存溶液から図３に示す最終濃度まで添
加した。 結果：アッセイ中のカルシウム濃度を１ｍＭ未満に低下
させると、これらの条件下に約５０％のＦVIIIが残留す
る。０.５ｍＭ未満のカルシウムでは残留百分率は６０
％以上である（図１）。
したが、この場合は、プロテアーゼとＦVIIIの混合物中
のカルシウム濃度を変動させた。このためには、ＣaＣl
2をカルシウム保存溶液から図３に示す最終濃度まで添
加した。 結果：アッセイ中のカルシウム濃度を１ｍＭ未満に低下
させると、これらの条件下に約５０％のＦVIIIが残留す
る。０.５ｍＭ未満のカルシウムでは残留百分率は６０
％以上である（図１）。
【００７２】実施例１０ 「ＦVIIアクティベーター」のいわゆる包括的試験にお
ける血液凝固時間に対する影響を血栓弾性記録法によっ
て検討した。関連血餅の剪断弾性または強度の変化を、
Hilgard TEGメーター（Helligeより）を用いて連続的に
記録した。いわゆるｒおよびｋ値、それぞれ血液の停止
の開始からおよび血液凝固反応の開始からの時間であ
り、加クエン酸血漿の場合にはＴＥＧ曲線までの再カル
シウム沈殿の時間は１mmまで広がり、ｒ値の終点から曲
線までの時間は２０mmに広がった（血餅形成時間）。
ける血液凝固時間に対する影響を血栓弾性記録法によっ
て検討した。関連血餅の剪断弾性または強度の変化を、
Hilgard TEGメーター（Helligeより）を用いて連続的に
記録した。いわゆるｒおよびｋ値、それぞれ血液の停止
の開始からおよび血液凝固反応の開始からの時間であ
り、加クエン酸血漿の場合にはＴＥＧ曲線までの再カル
シウム沈殿の時間は１mmまで広がり、ｒ値の終点から曲
線までの時間は２０mmに広がった（血餅形成時間）。
【００７３】このためには、５例のドナーからの血液ま
たは血漿の１５０μlのアリコートを各場合、測定キュ
ーベット中３７℃で２分間インキュベートし、ついで５
０μlのサンプル（プロテアーゼ）を加え混合した。１
００μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、反応を開始させ
た。アッセイ中「ＦVIIアクティベーター」の終濃度は
１５μg／mlであった。ｒ時間の短縮をサンプルに代え
て緩衝液を含有するアッセイに関して測定した。 結果：
たは血漿の１５０μlのアリコートを各場合、測定キュ
ーベット中３７℃で２分間インキュベートし、ついで５
０μlのサンプル（プロテアーゼ）を加え混合した。１
００μlの２５ｍＭ ＣaＣl2を加え、反応を開始させ
た。アッセイ中「ＦVIIアクティベーター」の終濃度は
１５μg／mlであった。ｒ時間の短縮をサンプルに代え
て緩衝液を含有するアッセイに関して測定した。 結果：
【表１１】
【００７４】この実施例は、ほとんどすべての場合、プ
ロテアーゼの添加は血液凝固時間の著しい短縮を起こす
ことを明らかにするものである。ここに示した例では
「ＦVIIアクティベーター」のフィブリン溶解作用はバ
ックグランド中に隠れてしまっていた。この理由は「正
常対象」では血漿中のプラスミノーゲンアクティベータ
ーの濃度がナノグラムの領域にあり、インビトロでの血
液凝固試験には全く影響しないからである。
ロテアーゼの添加は血液凝固時間の著しい短縮を起こす
ことを明らかにするものである。ここに示した例では
「ＦVIIアクティベーター」のフィブリン溶解作用はバ
ックグランド中に隠れてしまっていた。この理由は「正
常対象」では血漿中のプラスミノーゲンアクティベータ
ーの濃度がナノグラムの領域にあり、インビトロでの血
液凝固試験には全く影響しないからである。
【００７５】実施例１１ プロテアーゼのＦVIII副経路活性は以下の実験的アッセ
イによって証明された。すなわち、測定技術として血栓
弾性記録法を用いた。ｒ時間を評価した（実施例１０参
照）。全血サンプルを、天然のＦVIIIインヒビターの存
在を刺激するために、そのＦVIII活性阻害作用が分かっ
ているモノクローナル抗体（ＦVIIIに対する抗体）とイ
ンキュベートした。サンプルを全血サンプル対照（Ｍａ
ｂに代えて緩衝液）と比較した。プロテアーゼのＦＥＩ
Ｂ活性を、Ｍａｂによって阻害された全血サンプルにプ
ロテアーゼ（終濃度１７μg／ml）を加えて試験した。
さらにサンプルにプロテアーゼを加え、プロテアーゼ自
体のｒ時間に対する影響を測定した。
イによって証明された。すなわち、測定技術として血栓
弾性記録法を用いた。ｒ時間を評価した（実施例１０参
照）。全血サンプルを、天然のＦVIIIインヒビターの存
在を刺激するために、そのＦVIII活性阻害作用が分かっ
ているモノクローナル抗体（ＦVIIIに対する抗体）とイ
ンキュベートした。サンプルを全血サンプル対照（Ｍａ
ｂに代えて緩衝液）と比較した。プロテアーゼのＦＥＩ
Ｂ活性を、Ｍａｂによって阻害された全血サンプルにプ
ロテアーゼ（終濃度１７μg／ml）を加えて試験した。
さらにサンプルにプロテアーゼを加え、プロテアーゼ自
体のｒ時間に対する影響を測定した。
【００７６】結果：
【表１２】 抗−ＦVIII ｍＡｂによって引き起こされるｒ時間の延
長はこの場合もプロテアーゼの存在により正常化され、
これはプロテアーゼのＦＥＩＢ活性を例示するものであ
る。既に上に証明したように、プロテアーゼそれ自体は
血液凝固時間を短縮した。
長はこの場合もプロテアーゼの存在により正常化され、
これはプロテアーゼのＦＥＩＢ活性を例示するものであ
る。既に上に証明したように、プロテアーゼそれ自体は
血液凝固時間を短縮した。
【００７７】実施例１２ ５０μg／mlのＦVII活性化プロテアーゼを含有する溶液
に、以下の物質を相当する終濃度になるように加えた。 ２５ｍＭ クエン酸ナトリウム ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ １００ｍＭ アルギニン ０.７５ｇ／ml スクロース この溶液を部分に分割し、各場合、アリコートを５.０
〜８.６の様々なｐＨ値に調製し、ついで６０℃に１０
時間加熱した。加熱したプロテアーゼ溶液の活性は色素
原試験により測定し色素原基質Ｓ２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉ
le−Ｐro−Ａrg−pＨＡ×２ＨＣl、Chromogenix AB，Sw
eden）の経時的なアミド分解を記録した。この活性は加
熱しないで平行して測定されたアリコートの百分率とし
て表示した。
に、以下の物質を相当する終濃度になるように加えた。 ２５ｍＭ クエン酸ナトリウム ２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ １００ｍＭ アルギニン ０.７５ｇ／ml スクロース この溶液を部分に分割し、各場合、アリコートを５.０
〜８.６の様々なｐＨ値に調製し、ついで６０℃に１０
時間加熱した。加熱したプロテアーゼ溶液の活性は色素
原試験により測定し色素原基質Ｓ２２８８（Ｈ−Ｄ−Ｉ
le−Ｐro−Ａrg−pＨＡ×２ＨＣl、Chromogenix AB，Sw
eden）の経時的なアミド分解を記録した。この活性は加
熱しないで平行して測定されたアリコートの百分率とし
て表示した。
【００７８】結果：
【表１３】 この一連の実験は、特に酸性のｐＨ範囲における安定化
はプロテアーゼの不活性化を著しく低下させた。ｐＨ
５.５におけるわずかな「ブレークスルー」はこの範囲
にプロテアーゼの等電点があるという事実によって説明
できる。クエン酸ナトリウムは好ましいｐＨ範囲で起こ
る＞５０％の活性の喪失を防止する。
はプロテアーゼの不活性化を著しく低下させた。ｐＨ
５.５におけるわずかな「ブレークスルー」はこの範囲
にプロテアーゼの等電点があるという事実によって説明
できる。クエン酸ナトリウムは好ましいｐＨ範囲で起こ
る＞５０％の活性の喪失を防止する。
【００７９】実施例１３ ｐＨ６.１におけるアッセイ（実施例１）はプロテアー
ゼの最良の安定化を示した。したがって、様々な活性を
実施例１に記載のようにｐＨ６.０で試験して評価し
た。以下の終濃度をセットし、プロテアーゼの濃度は５
０μg／mlとした。 ５０ｍＭ クエン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮaＣl、ｐＨ
６.０ ０.７５ｇ／mlのスクロース １００ｍＭのグリシン １００ｍＭのアルギニン
ゼの最良の安定化を示した。したがって、様々な活性を
実施例１に記載のようにｐＨ６.０で試験して評価し
た。以下の終濃度をセットし、プロテアーゼの濃度は５
０μg／mlとした。 ５０ｍＭ クエン酸ナトリウム／５０ｍＭ ＮaＣl、ｐＨ
６.０ ０.７５ｇ／mlのスクロース １００ｍＭのグリシン １００ｍＭのアルギニン
【００８０】結果：
【表１４】 スクロースおよび各場合１種のアミノ酸の添加によって
プロテアーゼの著しい安定化が証明された。
プロテアーゼの著しい安定化が証明された。
【図１】プロテアーゼとＦVIIIを一定時間インキュベー
トした場合のプロテアーゼ濃度とＦVIIIの不活性化を示
す。
トした場合のプロテアーゼ濃度とＦVIIIの不活性化を示
す。
【図２】プロテアーゼ濃度を一定とし、ＦVIIIを様々な
時間インキュベートした場合のＦVIIIの不活性化を示
す。
時間インキュベートした場合のＦVIIIの不活性化を示
す。
【図３】プロテアーゼとＦVIIIを混合物中におけるカル
シウム濃度を変動させインキュベートした場合のＦVIII
の不活性化を示す。
シウム濃度を変動させインキュベートした場合のＦVIII
の不活性化を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/573 Ａ 33/573 Ａ６１Ｋ 37/54 (31)優先権主張番号 １９８５１３３６：４ (32)優先日 平成10年11月６日(1998．11．6) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９８２７７３４：２ (32)優先日 平成10年６月22日(1998．6．22) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (31)優先権主張番号 １９９０３６９３：４ (32)優先日 平成11年２月１日(1999．2．1) (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (72)発明者 ハンス−アルノルト・シュテーア ドイツ連邦共和国デー−35083ヴェター. シュールシュトラーセ66 (72)発明者 アネッテ・フォイスナー ドイツ連邦共和国デー−35043マルブルク. ランゲヴィーゼンヴェーク10
Claims (27)
- 【請求項１】 ａ）アプロチニンの存在によって阻害さ
れ、ｂ）カルシウムイオンおよび／またはヘパリンもし
くはヘパリン関連物質によりその活性は上昇し、ｃ）Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、それに続く非還元状態での染
色により分子量５０〜７５ｋＤａの範囲の１個もしくは
２個以上のバンドを示し、還元状態では分子量４０〜５
５ｋＤａに１個のバンドおよび分子量１０〜３５ｋＤａ
の範囲の１個または２個以上のバンドを示す血液凝固第
VII因子を活性化するプロテアーゼ。 - 【請求項２】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で分
子量６０〜６５ｋＤａおよび４０〜５５ｋＤａの範囲に
得られるバンドはアミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰを有
し、分子量１０〜３５ｋＤａの範囲に得られるバンドは
アミノ酸配列：ＩＹＧＧＦＫＳＴＡＧＫを有する請求項
１記載のプロテアーゼ。 - 【請求項３】 血漿またはプロトロンビン複合体（ＰＰ
ＳＢ）濃縮物の分画によって得られる請求項１または２
に記載のプロテアーゼ。 - 【請求項４】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて還元状態で得
られるバンドは６０〜６５ｋＤａの範囲の分子量を有
し、アミノ酸配列：ＬＬＥＳＬＤＰおよびＩＹＧＧＦＫ
ＳＴＡＧＫを含有する請求項１〜３のいずれかに記載の
プロテアーゼのプロ酵素。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれかに記載のプロテ
アーゼもしくは請求項４に記載のプロ酵素を取得または
除去する方法において、それを血漿またはプロトロンビ
ン（ＰＰＳＢ）濃縮物から、それを前もって陰イオン交
換クロマトグラフィーに付したのち、ヘパリンもしくは
ヘパリン関連物質またはデキストラン硫酸を用いる親和
性クロマトグラフィーによって得る方法。 - 【請求項６】 請求項１〜３のいずれかに記載のプロテ
アーゼもしくは請求項４に記載のプロ酵素を免疫学的に
検出するための試薬において、プロテアーゼまたはプロ
酵素に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体を含有する試薬。 - 【請求項７】 診断／分析の目的での試薬において、請
求項１〜３のいずれかに記載のプロテアーゼおよび／ま
たは請求項４に記載のプロ酵素を、所望によりプロ酵素
のアクティベーターとともに含有する試薬。 - 【請求項８】 第VII因子の検出のための試薬におい
て、請求項１〜４に記載のプロテアーゼ／プロ酵素を、
所望によりプロテアーゼ活性増強化合物とともに含有す
る試薬。 - 【請求項９】 請求項１に記載のプロテアーゼまたは請
求項４に記載のそのプロ酵素の定性的および定量的検出
のための試験システムにおいて、そのプロテアーゼ活性
は、 ａ）血液凝固第VIII／VIIIａ因子もしくは第V／Vａ因子
を不活性化するその活性または ｂ）包括的血液凝固試験における血液凝固時間を低下さ
せるその活性または ｃ）プラスミノーゲンアクティベーターを活性化するそ
の活性または ｄ）ＦVIIを活性化するその活性によって測定する試験
システム。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の試験システムにおい
て、血液凝固時間を低下させる活性は、 ａ）非活性化部分トロンボプラスチン時間（ＮＡＰＴ
Ｔ）または ｂ）プロトロンビン時間（ＰＴ）または ｃ）血漿カルシウム再沈着時間または ｄ）活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に
よって測定する試験システム。 - 【請求項１１】 請求項９および１０に記載の試験シス
テムにおいて、プラスミノーゲンアクティベーターを活
性化および／または増強する活性は、 ａ）一本鎖ウロキナーゼＰＡ（scuＰＡ、一本鎖ウロキ
ナーゼプラスミノーゲンアクティベーター）または ｂ）一本鎖 ｔＰＡ（sctＰＡ、一本鎖組織プラスミノー
ゲンアクティベーター）の活性化により測定する試験シ
ステム。 - 【請求項１２】 請求項９〜１１に記載の試験システム
においてカルシウムイオン０.００１ｍＭ以上の量、好
ましくは０.００５ｍＭ以上の量を含む試験システム。 - 【請求項１３】 プロテアーゼおよび／またはプロ酵素
と適当なプロ酵素アクティベーターの混合物をプロトロ
ンビン時間置換組織因子／トロンボプラスチンの試験に
使用するアッセイシステム。 - 【請求項１４】 プロテアーゼおよび／またはプロ酵素
と適当なプロ酵素アクティベーターの混合物を、プラス
ミノーゲンアクティベーターの機能性の試験ならびに一
本鎖プラスミノーゲンアクティベーター型の定量に使用
するアッセイシステム。 - 【請求項１５】 請求項９〜１４に記載の試験システム
において、プラスミノーゲンアクティベーターを増強す
る活性は、 ａ）色素原試験を用いて測定するかまたは ｂ）プラスミノーゲンの存在下におけるカップリング反
応でプラスミン自体の形成もしくはプラスミンによって
もたらされるフィブリン凝血の溶解で測定する試験シス
テム。 - 【請求項１６】 血液凝固第VII因子を活性化するプロ
テアーゼの阻害の結果としての蛋白分解により形成され
る不活性な第VIII因子および第V因子フラグメントを含
まない安定化第V因子および安定化第VIII因子プレパレ
ーション。 - 【請求項１７】 血液凝固第VII因子を活性化するプロ
テアーゼを阻害するために、第VIII因子または第V因子
プレパレーション中のカルシウムイオン濃度を１.０ｍ
Ｍ未満、好ましくは０.５ｍＭ未満とする請求項１６記
載の安定化プレパレーション。 - 【請求項１８】 ＦVIIIまたはＦＶ含有溶液を固定化ヘ
パリン、固定化ヘパリン様物質または固定化デキストラ
ン硫酸と接触させ、結果として完全にまたは部分的にプ
ロテアーゼ／プロ酵素を含まない溶液を得る請求項１７
に記載の安定化プレパレーション。 - 【請求項１９】 天然または合成プロテアーゼインヒビ
ターの添加によって血液凝固第VII因子を活性化するプ
ロテアーゼによる蛋白分解から保護された請求項１７お
よび１８に記載の安定化プレパレーション。 - 【請求項２０】 緩衝溶液の添加によりｐＨを４.０〜
９.０に調整し、および／またはエチレングリコールも
しくはグリセロール５〜８０重量％を含有する請求項１
〜４に記載のプロテアーゼまたはプロ酵素の安定化溶
液。 - 【請求項２１】 フィブリン含有血栓の溶解に適当な量
の、血液凝固第VII因子を活性化するプロテアーゼおよ
び／またはそのプロ酵素を含有する医薬製剤。 - 【請求項２２】 血液凝固第VII因子を活性化するプロ
テアーゼおよび／またはそのプロ酵素のほかに、一本鎖
または二本鎖プラスミノーゲンアクティベーター（Ｐ
Ａ）および／または抗血液凝固剤を含有する請求項２１
記載の医薬製剤。 - 【請求項２３】 さらに可溶性カルシウム塩および／ま
たはヘパリンもしくはヘパリン様物質を含有する請求項
２１または２２に記載の医薬製剤。 - 【請求項２４】 請求項１〜４に記載のプロテアーゼお
よび／またはそのプロ酵素の阻害のために、プロテアー
ゼインヒビターたとえばアプロチニンおよび／またはＣ
1−インヒビターおよび／またはα2−アンチプラスミン
および／またはインターα−トリプシンインヒビターお
よび／またはＡＴIII／ヘパリンを含有する血液の凝固
性を低下させるための医薬製剤。 - 【請求項２５】 請求項１〜４に記載のプロテアーゼお
よび／またはそのプロ酵素からなる医薬製剤の製造方法
において、滅菌条件下で、 ａ）ｐＨ範囲は３.５〜８.０とし、 ｂ）１種または２種以上のアミノ酸＞０.０１mol／L量
を加え、および／または ｃ）糖もしくは多数の糖の組合せ総量＞０.０５ｇ／ml
量を加え、および／または ｄ）カルシウムイオンと錯体を形成できる物質１種また
は２種以上を加えることからなる方法。 - 【請求項２６】 請求項２５に記載の方法によって得ら
れる医薬製剤。 - 【請求項２７】 請求項１〜４に記載のように血漿もし
くはプロトロンビン複合体（ＰＰＳＢ）濃縮物から調製
されるかまたは組換えもしくは遺伝子導入によって発現
させたプロテアーゼまたはそのプロ酵素の、所望により
プロ酵素アクティベーターとともに、フィブリンに基づ
く迅速な創傷閉鎖に適当なフィブリン接着もしくは被覆
または他の放出系の添加物として創傷治癒および止血の
促進のため、このプロテアーゼまたはそのプロ酵素の先
天的または後天的欠損状態の置換のため、血液凝固第VI
II因子に対する抗体の存在下、または血液凝固第VII因
子のインビトロ活性化のための使用。
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