JPH08220091A - 活性化状態の活性化タンパク質ｃに対する安定性が増大された凝固ｖ因子を特異的に検出する方法 - Google Patents
活性化状態の活性化タンパク質ｃに対する安定性が増大された凝固ｖ因子を特異的に検出する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 活性プロテアーゼＣａ（ＡＰＣ）による分解
に対する安定性が増大した凝固Ｖ因子を特異的に検出す
る方法が所望されている。 【解決手段】 生物体液試料をＶ因子欠損血漿と混合
し、Ｖ因子活性化試薬と混合し、タンパク分解試薬と混
合し、次にＶａ因子残留活性測定試薬を添加する方法に
よって凝固Ｖ因子が特異的に検出された。
に対する安定性が増大した凝固Ｖ因子を特異的に検出す
る方法が所望されている。 【解決手段】 生物体液試料をＶ因子欠損血漿と混合
し、Ｖ因子活性化試薬と混合し、タンパク分解試薬と混
合し、次にＶａ因子残留活性測定試薬を添加する方法に
よって凝固Ｖ因子が特異的に検出された。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、活性化状態で活性化タ
ンパク質Ｃに対する安定性が増大されている凝固Ｖ因子
を特異的に検出する方法に関する。
ンパク質Ｃに対する安定性が増大されている凝固Ｖ因子
を特異的に検出する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】第一
に、血液中での凝固系は、血流をその供給されるべき組
織に持続させることを確保するものであり；第二に、こ
の系は創傷閉鎖を行って傷害に対して反応し、これによ
って生体の完全な状態を維持することを確保するもので
ある。凝固が活性化されると、段階的にそれ自体活性化
するプロテアーゼのカスケード様系によって、活性プロ
テアーゼトロンビンが最終的に形成される。トロンビン
の形成は初めのうちは極めて低いが、タンパク質分解開
裂により補因子Ｖ因子およびVIII因子をトロンビンが活
性化するので、この形成はトロンビン自体により促進さ
れる。それぞれ、プロテアーゼＸａ因子およびIXａ因子
と共に、これらの活性化補因子はりん脂質表面で活性酵
素／補因子複合体を形成し、しかもこれらの複合体の活
性は個々のプロテアーゼの活性よりも約１０００の係数
で高いものである。
に、血液中での凝固系は、血流をその供給されるべき組
織に持続させることを確保するものであり；第二に、こ
の系は創傷閉鎖を行って傷害に対して反応し、これによ
って生体の完全な状態を維持することを確保するもので
ある。凝固が活性化されると、段階的にそれ自体活性化
するプロテアーゼのカスケード様系によって、活性プロ
テアーゼトロンビンが最終的に形成される。トロンビン
の形成は初めのうちは極めて低いが、タンパク質分解開
裂により補因子Ｖ因子およびVIII因子をトロンビンが活
性化するので、この形成はトロンビン自体により促進さ
れる。それぞれ、プロテアーゼＸａ因子およびIXａ因子
と共に、これらの活性化補因子はりん脂質表面で活性酵
素／補因子複合体を形成し、しかもこれらの複合体の活
性は個々のプロテアーゼの活性よりも約１０００の係数
で高いものである。
【０００３】この正のフィードバック機序はほぼ爆発的
に生じて大量のトロンビンを形成する。トロンビンはフ
ィブリノーゲンをフィブリンに変換し、普通には創傷閉
鎖、創傷治癒が行われる。生命の危険がある凝固の拡
大、ひいては生体の血管系の閉鎖、すなわち血栓症の誘
起を防止するには、活性プロテアーゼの阻害、またプロ
テアーゼ供給阻止が必要である。体内では、活性プロテ
アーゼは共有結合複合体の形成によるプロテアーゼ阻害
剤で作用中性化される。プロテアーゼ供給の阻止はトロ
ンビン自体で開始される。このためには、トロンビンは
膜タンパク質トロンボモジュリンに結合し、酵素前駆体
タンパク質Ｃを活性プロテアーゼＣａ（ＡＰＣ）に変換
する。ＡＰＣはその一部では補因子タンパク質Ｓと共に
複合体を形成し、この複合体は活性補因子VIIIａ因子お
よびＶａ因子をタンパク質分解で開裂し、それによって
不活性化する。このようにしてＡＰＣはこれらの補因子
がもたらす強力な促進効果を阻止する。
に生じて大量のトロンビンを形成する。トロンビンはフ
ィブリノーゲンをフィブリンに変換し、普通には創傷閉
鎖、創傷治癒が行われる。生命の危険がある凝固の拡
大、ひいては生体の血管系の閉鎖、すなわち血栓症の誘
起を防止するには、活性プロテアーゼの阻害、またプロ
テアーゼ供給阻止が必要である。体内では、活性プロテ
アーゼは共有結合複合体の形成によるプロテアーゼ阻害
剤で作用中性化される。プロテアーゼ供給の阻止はトロ
ンビン自体で開始される。このためには、トロンビンは
膜タンパク質トロンボモジュリンに結合し、酵素前駆体
タンパク質Ｃを活性プロテアーゼＣａ（ＡＰＣ）に変換
する。ＡＰＣはその一部では補因子タンパク質Ｓと共に
複合体を形成し、この複合体は活性補因子VIIIａ因子お
よびＶａ因子をタンパク質分解で開裂し、それによって
不活性化する。このようにしてＡＰＣはこれらの補因子
がもたらす強力な促進効果を阻止する。
【０００４】上述したタンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系
は重要な抗凝血機序を表わしている。このことは、遺伝
性または後天性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの欠乏
または欠損を有する人は血栓症、殊に再発性静脈血栓症
に極めて罹りやすいと言う事実によって確認された(Esm
on, C. T. TCM ２：212〜219、1992年)。
は重要な抗凝血機序を表わしている。このことは、遺伝
性または後天性タンパク質Ｃまたはタンパク質Ｓの欠乏
または欠損を有する人は血栓症、殊に再発性静脈血栓症
に極めて罹りやすいと言う事実によって確認された(Esm
on, C. T. TCM ２：212〜219、1992年)。
【０００５】タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓに加え
て、その他の因子も系の活性に対して影響を及ぼすこと
ができる。これらの因子にはフォンビルブラント因子お
よび因子IXａ(Rick, M. E. 等, Clin. Med. 115：415〜
421, 1990年)が含まれ、これらの因子は因子VIIIａをタ
ンパク質分解による分解から防護することができる。後
天性欠損はまたルプス抗凝血剤(Lupus anticoagulants)
の形成に因ることもある。これらは、りん脂質に対向
し、かつプロテアーゼ／補因子複合体のりん脂質表面へ
の結合（適切な機能のために必要である）を阻害する抗
体である(Amer, L.等, Thromb. Res. 57巻, 247〜258
頁, 1990年)。
て、その他の因子も系の活性に対して影響を及ぼすこと
ができる。これらの因子にはフォンビルブラント因子お
よび因子IXａ(Rick, M. E. 等, Clin. Med. 115：415〜
421, 1990年)が含まれ、これらの因子は因子VIIIａをタ
ンパク質分解による分解から防護することができる。後
天性欠損はまたルプス抗凝血剤(Lupus anticoagulants)
の形成に因ることもある。これらは、りん脂質に対向
し、かつプロテアーゼ／補因子複合体のりん脂質表面へ
の結合（適切な機能のために必要である）を阻害する抗
体である(Amer, L.等, Thromb. Res. 57巻, 247〜258
頁, 1990年)。
【０００６】Ｖ因子の変異体はごく最近に報告され、こ
のものは活性化状態（Ｖａ因子）にある場合は最早ＡＰ
Ｃで不活性化され得ないか、または少なくともごく低い
程度で不活性化され得るだけである(Bertina, R. M. 等
Nature 369巻, 64〜67頁, 1994年)。この欠損は「Ｆ.
Ｖ疾患」とも称され、ＡＰＣで開裂される領域において
Ａｒｇ ５０６をＧｌｎで置換することに因るものであ
る。ごく最近に、血栓症の危険が増大する原因としてこ
の変異の重要さがいくつかの研究で確認されている。
のものは活性化状態（Ｖａ因子）にある場合は最早ＡＰ
Ｃで不活性化され得ないか、または少なくともごく低い
程度で不活性化され得るだけである(Bertina, R. M. 等
Nature 369巻, 64〜67頁, 1994年)。この欠損は「Ｆ.
Ｖ疾患」とも称され、ＡＰＣで開裂される領域において
Ａｒｇ ５０６をＧｌｎで置換することに因るものであ
る。ごく最近に、血栓症の危険が増大する原因としてこ
の変異の重要さがいくつかの研究で確認されている。
【０００７】この改変されたＶ因子を検出するのに、従
来から２種の方法が用いられてきた。このうちの一つ
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノム分析
である。周知のとおり、この方法は精巧なものであり、
専門家の実験室でのみ実施可能であり、比較的高価であ
る。更にまた、この方法は、予め知られている変異を検
出するのみである。しかし、その他の部位での変異もＡ
ＰＣによる開裂に対してＶａ因子を安定化することが考
えられる。この理由から、極めて専門家されたＰＣＲ法
を補う機能試験がぜひ必要とされている。
来から２種の方法が用いられてきた。このうちの一つ
は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるゲノム分析
である。周知のとおり、この方法は精巧なものであり、
専門家の実験室でのみ実施可能であり、比較的高価であ
る。更にまた、この方法は、予め知られている変異を検
出するのみである。しかし、その他の部位での変異もＡ
ＰＣによる開裂に対してＶａ因子を安定化することが考
えられる。この理由から、極めて専門家されたＰＣＲ法
を補う機能試験がぜひ必要とされている。
【０００８】この種の機能試験は、凝固研究で通常使用
されているスクリーニング法である活性部分トロンボプ
ラスチン時間（ＡＰＴＴ）の既知の変法（Amer等、１９
９０年）を基とし、すでに報告されている。この試験で
ＡＰＴＴを測定するには、血漿試料を例えば、シリカカ
オリンまたはガラスのような界面活性剤を含む試薬およ
びりん脂質の等容量と接触させる。この混合物を２、３
分間＋３７℃でインキュベートする。この間に、カルシ
ウム依存ではない凝固系の因子（XII因子、XI因子およ
びIX因子）が活性化される。カルシウムイオンを加える
と、凝固カスケードの残りが活性化され、トロンビンが
形成される。得られたトロンビン量を、天然基質フィブ
リノーゲンがクロットに変換されることによるか、また
は色素形成基質からの発色団の遊離により、測定する。
Amer L.等（１９９０年）によるこのＡＰＴＴ変法で
は、活性化タンパク質Ｃをカルシウムイオンと同時に添
加することを伴っている。上述の如く、ＡＰＣはVIIIａ
およびＶａ補因子を破壊するので、タンパク質Ｃ／タン
パク質Ｓ系の機能効率に依存しているトロンビンの形成
の減速が生じてくる。この変法を以下ＡＰＣ時間（ＡＰ
ＣＴ）と称する。
されているスクリーニング法である活性部分トロンボプ
ラスチン時間（ＡＰＴＴ）の既知の変法（Amer等、１９
９０年）を基とし、すでに報告されている。この試験で
ＡＰＴＴを測定するには、血漿試料を例えば、シリカカ
オリンまたはガラスのような界面活性剤を含む試薬およ
びりん脂質の等容量と接触させる。この混合物を２、３
分間＋３７℃でインキュベートする。この間に、カルシ
ウム依存ではない凝固系の因子（XII因子、XI因子およ
びIX因子）が活性化される。カルシウムイオンを加える
と、凝固カスケードの残りが活性化され、トロンビンが
形成される。得られたトロンビン量を、天然基質フィブ
リノーゲンがクロットに変換されることによるか、また
は色素形成基質からの発色団の遊離により、測定する。
Amer L.等（１９９０年）によるこのＡＰＴＴ変法で
は、活性化タンパク質Ｃをカルシウムイオンと同時に添
加することを伴っている。上述の如く、ＡＰＣはVIIIａ
およびＶａ補因子を破壊するので、タンパク質Ｃ／タン
パク質Ｓ系の機能効率に依存しているトロンビンの形成
の減速が生じてくる。この変法を以下ＡＰＣ時間（ＡＰ
ＣＴ）と称する。
【０００９】従来用いられてきた形態では、ＡＰＣＴは
ＡＰＣに対するＶ因子の安定性の増大を特異的に検出す
るのに適当ではない（実施例１参照）。活性化形態で外
因的に加えられるタンパク質Ｃに加えて、タンパク質Ｃ
／タンパク質Ｓの系の機能効率に影響を及ぼす試料から
の他のすべての上述した因子も測定結果に入ってくる。
それ故、Ｖ因子の変異は、特に患者がこの因子について
異型接合である場合、タンパク質Ｓでの欠損または欠陥
と区別することができない。タンパク質Ｓまたはタンパ
ク質Ｃに対する抗体もこの結果を誤って似せるものとす
る。
ＡＰＣに対するＶ因子の安定性の増大を特異的に検出す
るのに適当ではない（実施例１参照）。活性化形態で外
因的に加えられるタンパク質Ｃに加えて、タンパク質Ｃ
／タンパク質Ｓの系の機能効率に影響を及ぼす試料から
の他のすべての上述した因子も測定結果に入ってくる。
それ故、Ｖ因子の変異は、特に患者がこの因子について
異型接合である場合、タンパク質Ｓでの欠損または欠陥
と区別することができない。タンパク質Ｓまたはタンパ
ク質Ｃに対する抗体もこの結果を誤って似せるものとす
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】従って、本発明の基本的
な目的は、ＡＰＣによる分解に対する安定性を増大した
Ｖ因子の検出に使用し得る方法を見い出すことにある。
この目的は特許請求の範囲に記載した実施態様を提供す
ることによって達成される。
な目的は、ＡＰＣによる分解に対する安定性を増大した
Ｖ因子の検出に使用し得る方法を見い出すことにある。
この目的は特許請求の範囲に記載した実施態様を提供す
ることによって達成される。
【００１１】意外にも血漿を、Ｖ因子が乏しく、かつタ
ンパク質Ｓおよび凝固Ｘ因子およびプロトロンビンを含
有する試薬で希釈すると、タンパク質Ｓの影響が除かれ
るが、ＡＰＣに対するＶ因子の改変された安定性は測定
結果に対して常に決定的なものであることが見い出され
た。これに加えて、ヘパリン添加試料およびマーキュラ
ー療法中の患者からの試料を本願方法に使用することが
でき、これらは従来使用されていた機能試験では不可能
だったものである。最も簡単な場合、試料を希釈するの
に用いる試薬はＶ因子を欠いているヒト血漿である。試
料中のＶ因子を活性化した後、この因子を活性化タンパ
ク質Ｃあるいは同様な挙動を示すプロテアーゼで破壊
し、それから残留Ｖａ因子活性を測定する。
ンパク質Ｓおよび凝固Ｘ因子およびプロトロンビンを含
有する試薬で希釈すると、タンパク質Ｓの影響が除かれ
るが、ＡＰＣに対するＶ因子の改変された安定性は測定
結果に対して常に決定的なものであることが見い出され
た。これに加えて、ヘパリン添加試料およびマーキュラ
ー療法中の患者からの試料を本願方法に使用することが
でき、これらは従来使用されていた機能試験では不可能
だったものである。最も簡単な場合、試料を希釈するの
に用いる試薬はＶ因子を欠いているヒト血漿である。試
料中のＶ因子を活性化した後、この因子を活性化タンパ
ク質Ｃあるいは同様な挙動を示すプロテアーゼで破壊
し、それから残留Ｖａ因子活性を測定する。
【００１２】最も簡単な場合、試料中のＶ因子の活性
化、その破壊および検出反応は活性化タンパク質Ｃ（Ａ
ＰＣ）を添加しながら試料の凝固開始を基とするもので
ある。Ｖ因子欠損血漿（Ｆ.Ｖ−ＤＰ）で表わされる試
料容量の割合を特別な試験法に対して最適化しなければ
ならず、この割合は５０〜９５％、好ましくは６０〜８
０％である。このことは、供試混合物合計について、血
漿試料容量の割合は多くとも２０％、好ましくは１０％
またはそれより少ない。それで、新規な方法は、凝固因
子XII、XIおよびIXをまず活性化するＡＰＴＴの変法を
基にすることができる。Ｖ因子を活性化するトロンビン
の形成はＡＰＣおよび塩化カルシウムの混合物を加える
ことにより開始される。ＡＰＣの同時の存在の結果、Ｖ
ａ因子が不活化され、凝血形成の速度の減速を生じる。
Ｖ因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合を増加させ
ると凝固時間の延長（Ｖ因子欠損血漿が原因である）を
生じるが、タンパク質Ｓ欠損による影響の低下をきた
す。それでＶ因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合
が一旦約７０％に達すると、正常血漿およびタンパク質
Ｓ欠損血漿に対する凝固時間は同じであるが、正常血漿
の凝固時間に関連する凝固時間の差異は、ＡＰＣに対す
る安定性が増大する改変Ｖ因子を含む同型接合または異
型接合血漿中であるとすれば、増加することが実施例２
で実証される。このようにして、先行技術を用いる場合
よりも二つの効果を識別することが実質的に一層容易に
なる。
化、その破壊および検出反応は活性化タンパク質Ｃ（Ａ
ＰＣ）を添加しながら試料の凝固開始を基とするもので
ある。Ｖ因子欠損血漿（Ｆ.Ｖ−ＤＰ）で表わされる試
料容量の割合を特別な試験法に対して最適化しなければ
ならず、この割合は５０〜９５％、好ましくは６０〜８
０％である。このことは、供試混合物合計について、血
漿試料容量の割合は多くとも２０％、好ましくは１０％
またはそれより少ない。それで、新規な方法は、凝固因
子XII、XIおよびIXをまず活性化するＡＰＴＴの変法を
基にすることができる。Ｖ因子を活性化するトロンビン
の形成はＡＰＣおよび塩化カルシウムの混合物を加える
ことにより開始される。ＡＰＣの同時の存在の結果、Ｖ
ａ因子が不活化され、凝血形成の速度の減速を生じる。
Ｖ因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合を増加させ
ると凝固時間の延長（Ｖ因子欠損血漿が原因である）を
生じるが、タンパク質Ｓ欠損による影響の低下をきた
す。それでＶ因子欠損血漿で表わされる試料容量の割合
が一旦約７０％に達すると、正常血漿およびタンパク質
Ｓ欠損血漿に対する凝固時間は同じであるが、正常血漿
の凝固時間に関連する凝固時間の差異は、ＡＰＣに対す
る安定性が増大する改変Ｖ因子を含む同型接合または異
型接合血漿中であるとすれば、増加することが実施例２
で実証される。このようにして、先行技術を用いる場合
よりも二つの効果を識別することが実質的に一層容易に
なる。
【００１３】トロンボプラスチン時間（ＰＴ）をＡＰＴ
Ｔの代りに使用することもできる（実施例３）。ＰＴを
測定するのに用いるべき試薬はトロンボプラスチン、膜
結合補因子、りん脂質および塩化カルシウムからなる混
合物を含有する。この混合物を試料に添加すると、VII
因子がまず自触反応で開裂してVIIａ因子を形成する。V
IIａ因子は補因子としてのトロンボプラスチンと共にＸ
因子の活性化の原因となり、次いでＶ因子を活性化す
る。この場合も、活性化タンパク質Ｃをトロンボプラス
チン試薬として同時に加えると、凝固時間が延長され
る。しかし、Ｖａ因子がタンパク分解侵襲に対して更に
抵抗性を有していると、この延長は左程著しいものでは
ない。この短い活性化経路により凝固時間が非常に短い
ので、トロンボプラスチンの内容物を実施例３では希釈
した。得られた凝固時間の延長はＡＰＣの存在下に凝固
時間の更に明瞭な延長をもたらす。これは正常血漿と改
変血漿Ｖとを区別（シグナル／バックグラウンド比）す
る能力を改善する。実施例３では、またタンパク質Ｓ欠
損により呈示される影響が、試料をＶ因子欠損血漿で希
釈する程度を増大することにより作用中性化される。し
かし、変法ＡＰＴＴによる場合よりも大きい程度に試料
を希釈することが必要である。
Ｔの代りに使用することもできる（実施例３）。ＰＴを
測定するのに用いるべき試薬はトロンボプラスチン、膜
結合補因子、りん脂質および塩化カルシウムからなる混
合物を含有する。この混合物を試料に添加すると、VII
因子がまず自触反応で開裂してVIIａ因子を形成する。V
IIａ因子は補因子としてのトロンボプラスチンと共にＸ
因子の活性化の原因となり、次いでＶ因子を活性化す
る。この場合も、活性化タンパク質Ｃをトロンボプラス
チン試薬として同時に加えると、凝固時間が延長され
る。しかし、Ｖａ因子がタンパク分解侵襲に対して更に
抵抗性を有していると、この延長は左程著しいものでは
ない。この短い活性化経路により凝固時間が非常に短い
ので、トロンボプラスチンの内容物を実施例３では希釈
した。得られた凝固時間の延長はＡＰＣの存在下に凝固
時間の更に明瞭な延長をもたらす。これは正常血漿と改
変血漿Ｖとを区別（シグナル／バックグラウンド比）す
る能力を改善する。実施例３では、またタンパク質Ｓ欠
損により呈示される影響が、試料をＶ因子欠損血漿で希
釈する程度を増大することにより作用中性化される。し
かし、変法ＡＰＴＴによる場合よりも大きい程度に試料
を希釈することが必要である。
【００１４】新規な方法はまたＲＶＶＴ（ラッセルクサ
リヘビ毒液時間）の変法にも使用し得る。ＲＶＶＴは蛇
ラッセルクサリヘビの毒液からの酵素を用いることを基
としている。この毒液は、タンパク分解で開裂すること
により、ヒト凝固因子ＸおよびＶを活性化するプロテア
ーゼを含有している。この方法はそれ自体既知であり、
凝結の内外経路を迂回し、そして、ルプス診断およびＸ
因子、Ｖ因子およびプロトロンビンの欠損の検出の両者
に使用される(Thiagarajan, P. 等、１９８６年）。近
年、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系での障害を測定す
るために、ＡＰＴＴを基とする試験と同様に、ＡＰＣと
関連した方法が使用されている。しかし、例えばタンパ
ク質Ｓの欠損のような他の障害は、Ｖ因子の欠損で得ら
れると同様の効果を生じ、その結果これらの異常はこの
試験により相互に区別することができないというのも事
実である。対照的に、実施例４では、異常は新規な方法
を用いると特異的に区別することができ、この場合Ｆ.
Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の割合は好ましくは７５
％であることが実証されている。
リヘビ毒液時間）の変法にも使用し得る。ＲＶＶＴは蛇
ラッセルクサリヘビの毒液からの酵素を用いることを基
としている。この毒液は、タンパク分解で開裂すること
により、ヒト凝固因子ＸおよびＶを活性化するプロテア
ーゼを含有している。この方法はそれ自体既知であり、
凝結の内外経路を迂回し、そして、ルプス診断およびＸ
因子、Ｖ因子およびプロトロンビンの欠損の検出の両者
に使用される(Thiagarajan, P. 等、１９８６年）。近
年、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系での障害を測定す
るために、ＡＰＴＴを基とする試験と同様に、ＡＰＣと
関連した方法が使用されている。しかし、例えばタンパ
ク質Ｓの欠損のような他の障害は、Ｖ因子の欠損で得ら
れると同様の効果を生じ、その結果これらの異常はこの
試験により相互に区別することができないというのも事
実である。対照的に、実施例４では、異常は新規な方法
を用いると特異的に区別することができ、この場合Ｆ.
Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の割合は好ましくは７５
％であることが実証されている。
【００１５】特別な区別を達成することに加えて、実施
例５では、試料中のヘパリンはＦ.Ｖ−ＤＰにヘパリン
作用中和化物質を加えることにより作用中和化し得るこ
とが実証されている。このことは、標準方法（ＡＰＣ
Ｔ）と比較して、この方法の別の重要な利点である。そ
れで、血栓症に罹っている患者に関する条件の関係を定
めるのに特に関心がもたれている。しかし、これらの患
者の大部分は抗凝血薬、通常ヘパリンで処置されてい
る。
例５では、試料中のヘパリンはＦ.Ｖ−ＤＰにヘパリン
作用中和化物質を加えることにより作用中和化し得るこ
とが実証されている。このことは、標準方法（ＡＰＣ
Ｔ）と比較して、この方法の別の重要な利点である。そ
れで、血栓症に罹っている患者に関する条件の関係を定
めるのに特に関心がもたれている。しかし、これらの患
者の大部分は抗凝血薬、通常ヘパリンで処置されてい
る。
【００１６】ヘパリン投与後、血栓症に罹っている多く
の患者にマーキュラー療法を施す。マーキュラー(marcu
rar＝フェンプロクーモン）はビタミンＫ拮抗剤であ
り、この投与により凝固因子の不完全合成が誘起され
る。実施例６に記載の検討により、新規な方法はマーキ
ュラー療法を受けている患者でのＦ.Ｖ欠損を検出する
のに使用できる。
の患者にマーキュラー療法を施す。マーキュラー(marcu
rar＝フェンプロクーモン）はビタミンＫ拮抗剤であ
り、この投与により凝固因子の不完全合成が誘起され
る。実施例６に記載の検討により、新規な方法はマーキ
ュラー療法を受けている患者でのＦ.Ｖ欠損を検出する
のに使用できる。
【００１７】活性化タンパク質Ｃを加える代替案とし
て、タンパク質Ｃを非活性化形態で加えるか、あるいは
Ｖ因子欠損血漿でタンパク質Ｃを用い、次にタンパク質
Ｃが活性化される。この活性化は、ドイツ特許出願Ｐ
４４ ２７ ７８５.７（実施例７参照）にも開示されて
いるように、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られたタ
ンパク質Ｃ活性化剤を加えることによって起こさせるこ
とができる。
て、タンパク質Ｃを非活性化形態で加えるか、あるいは
Ｖ因子欠損血漿でタンパク質Ｃを用い、次にタンパク質
Ｃが活性化される。この活性化は、ドイツ特許出願Ｐ
４４ ２７ ７８５.７（実施例７参照）にも開示されて
いるように、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られたタ
ンパク質Ｃ活性化剤を加えることによって起こさせるこ
とができる。
【００１８】例えばＡＰＴＴ、ＰＴおよびＲＶＶＴのよ
うな伝統的な凝固方法を用いる場合、凝固活性はクロッ
ト形成の機械的、機械光学的または光学的検出により測
定する。新規な方法も例えば色素産生トロンビン基質の
変換を測定することによるより最新の色素産生法と組み
合わせることもできる。
うな伝統的な凝固方法を用いる場合、凝固活性はクロッ
ト形成の機械的、機械光学的または光学的検出により測
定する。新規な方法も例えば色素産生トロンビン基質の
変換を測定することによるより最新の色素産生法と組み
合わせることもできる。
【００１９】精製凝固因子からなる試薬系をＦ.Ｖ−欠
損血漿の代りに使用することができる。第一の変換体と
類似して、方法の原理は、Ｖａ因子がプロトロンビン活
性化での律速因子であることに基づいている。ＡＰＣが
同時に存在していると活性化Ｖ因子が破壊されることと
なり、結果として、凝固時間が延長される。従って、試
料をＶ因子依存プロトロンビン活性化剤と接触させ、そ
して例えばラッセルクサリヘビの毒液から得られたＶ因
子活性化剤と接触させ、そして添加プロトロンビンの活
性化を例えばフィプリノーゲンの変換または色素産生方
法の場合は色素産生トロンビン基質の変換のような凝固
診断で知られている測定法を用いて測定する。
損血漿の代りに使用することができる。第一の変換体と
類似して、方法の原理は、Ｖａ因子がプロトロンビン活
性化での律速因子であることに基づいている。ＡＰＣが
同時に存在していると活性化Ｖ因子が破壊されることと
なり、結果として、凝固時間が延長される。従って、試
料をＶ因子依存プロトロンビン活性化剤と接触させ、そ
して例えばラッセルクサリヘビの毒液から得られたＶ因
子活性化剤と接触させ、そして添加プロトロンビンの活
性化を例えばフィプリノーゲンの変換または色素産生方
法の場合は色素産生トロンビン基質の変換のような凝固
診断で知られている測定法を用いて測定する。
【００２０】例えば塩化カルシウムりん脂質のような凝
固酵素にとって重要な補因子を供試混合物に加えるのが
有用である。血漿中に存在するループス抗凝固剤(lupus
anticoagulant)の効果を除くために、高濃度好ましく
は０.３〜０.００１％、特に好ましくは、０.００１〜
０.０１％でりん脂質を加えるのもまた有用である。更
に、りん脂質は、タンパク質Ｃａ活性が発現するのを確
保するのに、ホスファチジルエタノールアミンをある割
合で含有していなければならない(Horie, S. 等１９９
４年）。試料中のタンパク質Ｓの欠損および（または）
欠損に因るものである測定結果との干渉を避けるため
に、タンパク質Ｓを０.１〜５Ｕ／ml（供試混合物を基
として）の濃度範囲、特に好ましくは１〜２Ｕ／mlの範
囲で含有することも試薬系には有用である。
固酵素にとって重要な補因子を供試混合物に加えるのが
有用である。血漿中に存在するループス抗凝固剤(lupus
anticoagulant)の効果を除くために、高濃度好ましく
は０.３〜０.００１％、特に好ましくは、０.００１〜
０.０１％でりん脂質を加えるのもまた有用である。更
に、りん脂質は、タンパク質Ｃａ活性が発現するのを確
保するのに、ホスファチジルエタノールアミンをある割
合で含有していなければならない(Horie, S. 等１９９
４年）。試料中のタンパク質Ｓの欠損および（または）
欠損に因るものである測定結果との干渉を避けるため
に、タンパク質Ｓを０.１〜５Ｕ／ml（供試混合物を基
として）の濃度範囲、特に好ましくは１〜２Ｕ／mlの範
囲で含有することも試薬系には有用である。
【００２１】最後に、その濃度がつまるところ測定シグ
ナルを調節する活性化タンパク質Ｃを加えることが必要
である。普通、供試混合物中のＡＰＣ濃度は０.０１〜
１Ｕ／mlの範囲にある。それで、この試薬系は少なくと
も成分、Ｘ因子、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、凝固
に必要なりん脂質、塩化カルシウム、活性化タンパク質
Ｃあるいは非活性化タンパク質Ｃならびに、これとは別
に、タンパク質Ｃ活性化剤を包含する。試薬系は単一試
薬として組み合せて使用することもできるし、また、安
定性を増大するために、例えば試薬１（Ｘ因子、タンパ
ク質Ｓ、プロトロンビンおよびりん脂質からなる）およ
び試薬２（活性化タンパク質Ｃおよび塩化カルシウムか
らなる）として別個の形態で使用することもできる。試
料を試薬系と混合する。凝固は、ＡＰＴＴと同様に接触
相の活性化の結果として、あるいはＲＶＶを用いるＸ因
子および（または）Ｖ因子の直接活性化により、あるい
は例えば活性Ｘ因子もしくは蛇カーペットバイパー(Ech
is carinatus）の毒液からのエカリン(ecarin)のような
プロトロンビン開裂酵素の添加によるトロンビンの僅か
な活性化により開始される。ＲＶＶまたはエカリンを用
いて活性化を行った場合、これらの酵素は好ましくは出
発試薬として試薬２でＡＰＣおよび塩化カルシウムと一
緒に使用する。次に、検出は、トロンビン特異的色素形
成基質の変換によるトロンビン形成を測定することによ
って行うのが好ましい。
ナルを調節する活性化タンパク質Ｃを加えることが必要
である。普通、供試混合物中のＡＰＣ濃度は０.０１〜
１Ｕ／mlの範囲にある。それで、この試薬系は少なくと
も成分、Ｘ因子、タンパク質Ｓ、プロトロンビン、凝固
に必要なりん脂質、塩化カルシウム、活性化タンパク質
Ｃあるいは非活性化タンパク質Ｃならびに、これとは別
に、タンパク質Ｃ活性化剤を包含する。試薬系は単一試
薬として組み合せて使用することもできるし、また、安
定性を増大するために、例えば試薬１（Ｘ因子、タンパ
ク質Ｓ、プロトロンビンおよびりん脂質からなる）およ
び試薬２（活性化タンパク質Ｃおよび塩化カルシウムか
らなる）として別個の形態で使用することもできる。試
料を試薬系と混合する。凝固は、ＡＰＴＴと同様に接触
相の活性化の結果として、あるいはＲＶＶを用いるＸ因
子および（または）Ｖ因子の直接活性化により、あるい
は例えば活性Ｘ因子もしくは蛇カーペットバイパー(Ech
is carinatus）の毒液からのエカリン(ecarin)のような
プロトロンビン開裂酵素の添加によるトロンビンの僅か
な活性化により開始される。ＲＶＶまたはエカリンを用
いて活性化を行った場合、これらの酵素は好ましくは出
発試薬として試薬２でＡＰＣおよび塩化カルシウムと一
緒に使用する。次に、検出は、トロンビン特異的色素形
成基質の変換によるトロンビン形成を測定することによ
って行うのが好ましい。
【００２２】更に、活性化タンパク質Ｃを用いる代り
に、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られる活性化剤
（この毒液は商品名ProtacR で商業上入手可能である）
のような適当な活性化剤を用いて供試混合物中でまず活
性化される非活性化タンパク質Ｃを使用することができ
る。それで、このような試薬系は例えば試薬１（タンパ
ク質Ｓ、Ｘ因子、タンパク質Ｃ、プロトロンビンおよび
りん脂質を含有する）および試薬２（ProtacR ＲＶＶ、
塩化カルシウムおよびトロンビン基質を含有する）から
なる。試薬１は単にＶ因子欠損血漿であってもよく、こ
の場合りん脂質は試薬２に含められる。内因性タンパク
質Ｃの効果を拡充するために、試薬２を分割することも
でき、試料および試薬１の混合物を試薬２ａ（ProtacR
およびりん脂質からなる）と共にタンパク質Ｃを活性化
させるためにプレインキュベートした後、ＲＶＶおよび
塩化カルシウムを含む試薬２ｂを加えて凝固反応および
Ｖ因子安定性の検出反応を開始させることができる。こ
の場合、りん脂質の添加は任意であり、そして色素産生
性基質を更に加えるか否かは所望の評価技術にのみかか
っている。
に、例えばマムシ属の蛇の毒液から得られる活性化剤
（この毒液は商品名ProtacR で商業上入手可能である）
のような適当な活性化剤を用いて供試混合物中でまず活
性化される非活性化タンパク質Ｃを使用することができ
る。それで、このような試薬系は例えば試薬１（タンパ
ク質Ｓ、Ｘ因子、タンパク質Ｃ、プロトロンビンおよび
りん脂質を含有する）および試薬２（ProtacR ＲＶＶ、
塩化カルシウムおよびトロンビン基質を含有する）から
なる。試薬１は単にＶ因子欠損血漿であってもよく、こ
の場合りん脂質は試薬２に含められる。内因性タンパク
質Ｃの効果を拡充するために、試薬２を分割することも
でき、試料および試薬１の混合物を試薬２ａ（ProtacR
およびりん脂質からなる）と共にタンパク質Ｃを活性化
させるためにプレインキュベートした後、ＲＶＶおよび
塩化カルシウムを含む試薬２ｂを加えて凝固反応および
Ｖ因子安定性の検出反応を開始させることができる。こ
の場合、りん脂質の添加は任意であり、そして色素産生
性基質を更に加えるか否かは所望の評価技術にのみかか
っている。
【００２３】更にまた、精製因子からなる試薬系におい
て、Ｘ因子は例えば蛇毒液から得られる活性化剤のよう
なヒト以外のＶａ因子依存性プロトロンビン活性化剤
（詳しくは、Rosing, J. およびTans, G. 1991年参照）
で置換することができる。このものは活性化タンパク質
Ｃと組み合せて、または供試混合物で活性化されるタン
パク質Ｃと組み合せて活性化タンパク質Ｃに因るタンパ
ク分解性分解に対する安定性が増大している血漿試料中
のＶ因子を特定して検出するのに適している。それで試
薬系は次の成分からなっていてよい。試薬１はタンパク
質Ｓ、タンパク質Ｃ、プロトロンビンおよびりん脂質か
らなり、また試薬２はProtacR ＲＶＶまたはＲＶＶ−Ｖ
（Ｖ因子のみを活性化するＲＶＶからのプロテアー
ゼ）、Ｖ因子依存性プロトロンビン活性化剤、塩化カル
シウムおよびトロンビン基質からなり、あるいはまた試
薬３としてトロンビン基質からなる。
て、Ｘ因子は例えば蛇毒液から得られる活性化剤のよう
なヒト以外のＶａ因子依存性プロトロンビン活性化剤
（詳しくは、Rosing, J. およびTans, G. 1991年参照）
で置換することができる。このものは活性化タンパク質
Ｃと組み合せて、または供試混合物で活性化されるタン
パク質Ｃと組み合せて活性化タンパク質Ｃに因るタンパ
ク分解性分解に対する安定性が増大している血漿試料中
のＶ因子を特定して検出するのに適している。それで試
薬系は次の成分からなっていてよい。試薬１はタンパク
質Ｓ、タンパク質Ｃ、プロトロンビンおよびりん脂質か
らなり、また試薬２はProtacR ＲＶＶまたはＲＶＶ−Ｖ
（Ｖ因子のみを活性化するＲＶＶからのプロテアー
ゼ）、Ｖ因子依存性プロトロンビン活性化剤、塩化カル
シウムおよびトロンビン基質からなり、あるいはまた試
薬３としてトロンビン基質からなる。
【００２４】ＡＰＴＴを基とする試薬系は実施例８に述
べるように試料中のVIII因子の濃度に依存している。意
外にも、生理学的濃度（０.７〜１.４単位／ml）でVIII
因子を含有しているＶ因子欠損血漿は、VIII因子を含有
していない欠損血漿よりも試料中のVIII因子の濃度に左
程依存していないことが見い出された。これによって、
高含量でVIII因子を有する正常血漿と正常含量でVIII因
子を有するＶ因子疾患血漿とを区別することが一層容易
になる。この理由に因り、Ｖ因子欠損血漿および（また
は）VIII因子を０〜４Ｕ／mlの濃度、特に好ましくは
０.７〜１.３Ｕ／mlの濃度で含有しているか、またはそ
のように補完した試薬を、ＡＰＴＴを基とする試薬系で
使用するのが好ましい。
べるように試料中のVIII因子の濃度に依存している。意
外にも、生理学的濃度（０.７〜１.４単位／ml）でVIII
因子を含有しているＶ因子欠損血漿は、VIII因子を含有
していない欠損血漿よりも試料中のVIII因子の濃度に左
程依存していないことが見い出された。これによって、
高含量でVIII因子を有する正常血漿と正常含量でVIII因
子を有するＶ因子疾患血漿とを区別することが一層容易
になる。この理由に因り、Ｖ因子欠損血漿および（また
は）VIII因子を０〜４Ｕ／mlの濃度、特に好ましくは
０.７〜１.３Ｕ／mlの濃度で含有しているか、またはそ
のように補完した試薬を、ＡＰＴＴを基とする試薬系で
使用するのが好ましい。
【００２５】
【実施例】次の実施例は本発明を具体的に説明するもの
であるが、特許請求の範囲を限定するものではない。次
の略号を使用する。 ＡＰＣＴ 活性化タンパク質Ｃ時間 ＡＰＣＶ Ｖ因子欠損血漿と試料とを混合した時の活
性化タンパク質Ｃ時間 ＡＰＴＴ 活性化部分トロンボプラスチン時間 Ａｒｇ アルギニン Ｆ.Ｖ−ＤＰ ヒトＶ因子欠損血漿 Ｆ.Ｖ疾患 Ｖ因子中の５０６位でのアミノ酸交換Ａｒ
ｇ→Ｇｌｎ Ｇｌｎ グルタミン ＰＣ−ＤＰ ヒトタンパク質Ｃ欠損血漿 ＰＳ−ＤＰ ヒトタンパク質Ｓ欠損血漿 ＲＶＶＴ ラッセルクサリヘビ毒液時間 ＳＨＰ 標準ヒト血漿（正常ヒト血漿のプール） Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
であるが、特許請求の範囲を限定するものではない。次
の略号を使用する。 ＡＰＣＴ 活性化タンパク質Ｃ時間 ＡＰＣＶ Ｖ因子欠損血漿と試料とを混合した時の活
性化タンパク質Ｃ時間 ＡＰＴＴ 活性化部分トロンボプラスチン時間 Ａｒｇ アルギニン Ｆ.Ｖ−ＤＰ ヒトＶ因子欠損血漿 Ｆ.Ｖ疾患 Ｖ因子中の５０６位でのアミノ酸交換Ａｒ
ｇ→Ｇｌｎ Ｇｌｎ グルタミン ＰＣ−ＤＰ ヒトタンパク質Ｃ欠損血漿 ＰＳ−ＤＰ ヒトタンパク質Ｓ欠損血漿 ＲＶＶＴ ラッセルクサリヘビ毒液時間 ＳＨＰ 標準ヒト血漿（正常ヒト血漿のプール） Tris トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
【００２６】実施例１ Ｆ.Ｖ疾患または類似の欠損症の機能的検出に関する先
行技術の限界 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke A.G., Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehrinhwerke AG
から入手した。ＳＨＰを健康供血者からの血漿プールと
して用いた。ＡＰＴＴは次のプロトコールに従って測定
した。ヒト胎盤から得られたりん脂質５mlについて、Pa
thromtinR １バイアルを界面活性剤としてカオリンの懸
濁液５mlに溶解した。塩化カルシウム溶液（２５mM）を
使用前＋３７℃に加温した。次のものを測定管に連続し
て注入した。 PathromtinR １００μｌ 血漿試料 １００μｌ 混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、塩化カル
シウム溶液１００μｌを加えて凝固時間が開始した。凝
固時間を４０５nmで測定した。
行技術の限界 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke A.G., Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehrinhwerke AG
から入手した。ＳＨＰを健康供血者からの血漿プールと
して用いた。ＡＰＴＴは次のプロトコールに従って測定
した。ヒト胎盤から得られたりん脂質５mlについて、Pa
thromtinR １バイアルを界面活性剤としてカオリンの懸
濁液５mlに溶解した。塩化カルシウム溶液（２５mM）を
使用前＋３７℃に加温した。次のものを測定管に連続し
て注入した。 PathromtinR １００μｌ 血漿試料 １００μｌ 混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、塩化カル
シウム溶液１００μｌを加えて凝固時間が開始した。凝
固時間を４０５nmで測定した。
【００２７】ＡＰＣＴは、Behringwerkeから入手したＡ
ＰＣ感作試薬を用いて測定した。ＡＰＴＴのときと同様
にして活性化試薬を調製した。出発試薬は塩化カルシウ
ムおよび活性化タンパク質Ｃからなり、これを蒸留水５
mlに溶解し、使用前に＋３７℃に加温した。次のものを
測定管に連続して注入した。 PathromtinR １００μｌ 血漿試料 １００μｌ 混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、出発試薬
１００μｌを加えて凝固時間が開始した。凝固時間を４
０５nmで測定した。
ＰＣ感作試薬を用いて測定した。ＡＰＴＴのときと同様
にして活性化試薬を調製した。出発試薬は塩化カルシウ
ムおよび活性化タンパク質Ｃからなり、これを蒸留水５
mlに溶解し、使用前に＋３７℃に加温した。次のものを
測定管に連続して注入した。 PathromtinR １００μｌ 血漿試料 １００μｌ 混合物を２分間＋３７℃でインキュベートし、出発試薬
１００μｌを加えて凝固時間が開始した。凝固時間を４
０５nmで測定した。
【００２８】ＡＰＴＴおよびＡＰＣＴは次のとおりのヒ
トクエン酸添加血漿で測定した。すなわち、健康供血者
（ＳＨＰ）からのプール、タンパク質Ｃ欠損血漿（ＰＣ
−ＤＰ）またはタンパク質Ｓ欠損血漿（ＰＳ−ＤＰ）、
および同型接合Ｆ.Ｖ疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠
損、すなわち血漿中のＶ因子の約５０％が無傷の形態で
存在し、約５０％がＦ.Ｖ疾患形態で存在している欠損
に擬するために、同型接合Ｆ.Ｖ疾患血漿をＳＨＰと
１：１で混合した。
トクエン酸添加血漿で測定した。すなわち、健康供血者
（ＳＨＰ）からのプール、タンパク質Ｃ欠損血漿（ＰＣ
−ＤＰ）またはタンパク質Ｓ欠損血漿（ＰＳ−ＤＰ）、
および同型接合Ｆ.Ｖ疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠
損、すなわち血漿中のＶ因子の約５０％が無傷の形態で
存在し、約５０％がＦ.Ｖ疾患形態で存在している欠損
に擬するために、同型接合Ｆ.Ｖ疾患血漿をＳＨＰと
１：１で混合した。
【００２９】得られた凝固時間およびＳＨＰで得られた
凝固時間と比較したＡＰＣＴの差異を表１に示す。ＡＰ
ＴＴについての値はいずれもＡＰＣＴを実施するのに必
須の正常範囲（≦４０）内にある。ＡＰＣＴにおいて、
正常血漿で得られる凝固時間よりも短いこれらの凝固時
間は病的である。このことはタンパク質Ｃ欠損の場合に
は適用されない。ＡＰＣＴでは活性化タンパク質Ｃを外
因で加えるために、試料中のタンパク質Ｃは試験には効
果を有するもとがない。一方、タンパク質Ｓの欠損は凝
固時間の短縮を生じ、この時間はこの場合異型接合Ｆ.
Ｖ疾患欠損の場合よりも更により顕著である。ＡＰＣＴ
の短縮は同型接合Ｆ.Ｖ疾患の場合最も著しい。タンパ
ク質Ｓ欠損の効果と同型接合Ｆ.Ｖ疾患の効果との間に
ごく僅かの差異のみがある。実際のところ、この差異は
更に一層ぼんやりとしてくる。その理由はＶ因子および
VIII因子の連続変性があり、その程度は血液サンプルの
除去と測定との間に経過する時間に左右される。この因
子変性により、観察される凝固時間の短縮を防げるよう
な凝固時間の延長が生じる。従って、従来利用可能な方
法、すなわちＡＰＣＴは活性化タンパク質Ｃに対する安
定性が増大するＦ.Ｖ疾患またはＶ因子中の類似の欠損
を特異的に検出するのに適していない。
凝固時間と比較したＡＰＣＴの差異を表１に示す。ＡＰ
ＴＴについての値はいずれもＡＰＣＴを実施するのに必
須の正常範囲（≦４０）内にある。ＡＰＣＴにおいて、
正常血漿で得られる凝固時間よりも短いこれらの凝固時
間は病的である。このことはタンパク質Ｃ欠損の場合に
は適用されない。ＡＰＣＴでは活性化タンパク質Ｃを外
因で加えるために、試料中のタンパク質Ｃは試験には効
果を有するもとがない。一方、タンパク質Ｓの欠損は凝
固時間の短縮を生じ、この時間はこの場合異型接合Ｆ.
Ｖ疾患欠損の場合よりも更により顕著である。ＡＰＣＴ
の短縮は同型接合Ｆ.Ｖ疾患の場合最も著しい。タンパ
ク質Ｓ欠損の効果と同型接合Ｆ.Ｖ疾患の効果との間に
ごく僅かの差異のみがある。実際のところ、この差異は
更に一層ぼんやりとしてくる。その理由はＶ因子および
VIII因子の連続変性があり、その程度は血液サンプルの
除去と測定との間に経過する時間に左右される。この因
子変性により、観察される凝固時間の短縮を防げるよう
な凝固時間の延長が生じる。従って、従来利用可能な方
法、すなわちＡＰＣＴは活性化タンパク質Ｃに対する安
定性が増大するＦ.Ｖ疾患またはＶ因子中の類似の欠損
を特異的に検出するのに適していない。
【００３０】
【表１】
【００３１】実施例２ 修正ＡＰＴＴに基づく新規な方法の最適化 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke AG，Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。ＳＨＰを健康供血者からの血漿プールと
して用いた。
A, Behringwerke；Behringwerke AG，Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。ＳＨＰを健康供血者からの血漿プールと
して用いた。
【００３２】凝固時間を測定するために、PathromtinR
５ml入りの１バイアルをカオリン懸濁液５mlに溶解し
た。出発試薬はＡＰＣ感受性試薬（塩化カルシウムおよ
び活性化タンパク質Ｃを含有）からなり、蒸留水５mlに
溶解し、使用前＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を
蒸留水１mlに溶解した。次のものを測定管に連続して注
入した。 血漿試料 ｘμｌ Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ PathromtinR １００μｌ
５ml入りの１バイアルをカオリン懸濁液５mlに溶解し
た。出発試薬はＡＰＣ感受性試薬（塩化カルシウムおよ
び活性化タンパク質Ｃを含有）からなり、蒸留水５mlに
溶解し、使用前＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を
蒸留水１mlに溶解した。次のものを測定管に連続して注
入した。 血漿試料 ｘμｌ Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ PathromtinR １００μｌ
【００３３】混合物を次いで＋３７℃で３分間インキュ
ベートし、そして凝固時間は出発試薬１００μｌを加え
て開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。容量ｘお
よびｙを総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるよう
に、選択した。凝固時間は次のとおりのヒトクエン酸添
加血漿で測定した：健康供血者（ＳＨＰ）からのプー
ル、タンパク質Ｃ欠損血漿（ＰＣ−ＤＰ）またはタンパ
ク質Ｓ欠損血漿（ＰＳ−ＤＰ）、および同型接合Ｆ.Ｖ
疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠損、すなわち血漿中の
Ｖ因子の約５０％が無傷の形態で存在し、約５０％が
Ｆ.Ｖ疾患形態で存在する欠損に擬するために、同型接
合Ｆ.Ｖ疾患血漿をＳＨＰと１：１で混合した。
ベートし、そして凝固時間は出発試薬１００μｌを加え
て開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。容量ｘお
よびｙを総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるよう
に、選択した。凝固時間は次のとおりのヒトクエン酸添
加血漿で測定した：健康供血者（ＳＨＰ）からのプー
ル、タンパク質Ｃ欠損血漿（ＰＣ−ＤＰ）またはタンパ
ク質Ｓ欠損血漿（ＰＳ−ＤＰ）、および同型接合Ｆ.Ｖ
疾患欠損を伴う血漿。異型接合欠損、すなわち血漿中の
Ｖ因子の約５０％が無傷の形態で存在し、約５０％が
Ｆ.Ｖ疾患形態で存在する欠損に擬するために、同型接
合Ｆ.Ｖ疾患血漿をＳＨＰと１：１で混合した。
【００３４】得られた凝固時間ならびにＳＨＰで得られ
た凝固時間と関連した凝固時間の差異を表２に列記す
る。Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の比が増大する
につれた、Ｖ因子の欠損が増大するために、凝固時間が
より長くなる。しかしながら、ＳＨＰとＰＣ−ＤＰとの
差異が事実上変わらないままである間、ＳＨＰとＰＣ−
ＤＰとの隔たりは連続して低減し、また供試混合物中の
Ｆ.Ｖ−ＤＰの比が一旦約７０％に達すると、差異は最
早や検知できなくなる。従って、試料中のタンパク質Ｓ
の欠損がＦ.Ｖ−ＤＰ中のタンパク質Ｓで十分になくな
ることになる。しかし、同型接合または（擬似）異型接
合Ｆ.Ｖ疾患欠損を有する血漿は正しく反対の挙動とす
る。これらの場合、ＳＨＰで得られた凝固時間と比較し
た凝固時間の差異が増加する。それ故、新規な方法はＰ
Ｓ欠損の効果をなくするだけでなく、Ｆ.Ｖ疾患によっ
て生じる効果を増巾することが可能である。このことは
また、血漿試料を比較的長期間保存することに因る障害
により、従前の方法を用いた事例の如く（実施例１）Ｐ
Ｓ欠損とＦ.Ｖ欠損との差異が容易にはあいまいなもの
とならないことを意味している。更に、ＰＳ効果が当然
になくなるので、抗−ＰＳ自己抗体がこの方法で作用中
性化されることが期待される。更に、ＰＣまたはＰＣ／
ＰＳりん脂質複合体に対する自己抗体は、試料をＦ.Ｖ
−ＤＰで高度に希釈する場合、希釈の結果としてほとん
ど検出し得るものではない。
た凝固時間と関連した凝固時間の差異を表２に列記す
る。Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の比が増大する
につれた、Ｖ因子の欠損が増大するために、凝固時間が
より長くなる。しかしながら、ＳＨＰとＰＣ−ＤＰとの
差異が事実上変わらないままである間、ＳＨＰとＰＣ−
ＤＰとの隔たりは連続して低減し、また供試混合物中の
Ｆ.Ｖ−ＤＰの比が一旦約７０％に達すると、差異は最
早や検知できなくなる。従って、試料中のタンパク質Ｓ
の欠損がＦ.Ｖ−ＤＰ中のタンパク質Ｓで十分になくな
ることになる。しかし、同型接合または（擬似）異型接
合Ｆ.Ｖ疾患欠損を有する血漿は正しく反対の挙動とす
る。これらの場合、ＳＨＰで得られた凝固時間と比較し
た凝固時間の差異が増加する。それ故、新規な方法はＰ
Ｓ欠損の効果をなくするだけでなく、Ｆ.Ｖ疾患によっ
て生じる効果を増巾することが可能である。このことは
また、血漿試料を比較的長期間保存することに因る障害
により、従前の方法を用いた事例の如く（実施例１）Ｐ
Ｓ欠損とＦ.Ｖ欠損との差異が容易にはあいまいなもの
とならないことを意味している。更に、ＰＳ効果が当然
になくなるので、抗−ＰＳ自己抗体がこの方法で作用中
性化されることが期待される。更に、ＰＣまたはＰＣ／
ＰＳりん脂質複合体に対する自己抗体は、試料をＦ.Ｖ
−ＤＰで高度に希釈する場合、希釈の結果としてほとん
ど検出し得るものではない。
【００３５】
【表２】
【００３６】実施例３ 修正トロンボプラスチン時間に基づく新規な方法の最適
化 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A. Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。ＳＨＰを健康供血者から血漿プールとし
て用いた。凝固時間を測定するために、Thromboplastin
R 、ヒト胎盤からのＰＴ試薬を製造業者の指示に従って
蒸留水に溶解し、この溶液を次に５０mM tris／ＨＣ
ｌ、０.０１％Phospholipon-25（大豆からのりん脂質混
合物）、１０mM塩化カルシウム、０.４Ｕ／ml ＡＰＣか
らなるpH７.４の緩衝液で１：２０００に希釈した。使
用前試薬を＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留
水１mlに溶解した。
化 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A. Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。ＳＨＰを健康供血者から血漿プールとし
て用いた。凝固時間を測定するために、Thromboplastin
R 、ヒト胎盤からのＰＴ試薬を製造業者の指示に従って
蒸留水に溶解し、この溶液を次に５０mM tris／ＨＣ
ｌ、０.０１％Phospholipon-25（大豆からのりん脂質混
合物）、１０mM塩化カルシウム、０.４Ｕ／ml ＡＰＣか
らなるpH７.４の緩衝液で１：２０００に希釈した。使
用前試薬を＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留
水１mlに溶解した。
【００３７】次のものを測定管に連続して注入した。 血漿試料 ｘμｌ Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ ThromboplastinR １：２０００ １００μｌ 混合物を次いで＋３７℃で３分間培養し、そして凝固時
間は出発試薬１００μｌを加えて開始した。凝固時間を
４０５nmで測定した。容量ｘおよびｙを、総量（ｘ＋
ｙ）が正確に１００μｌとなるように、選択した。この
ような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの０μｌを含有する可変
体がトロンボプラスチン時間に基づくＡＰＣＴの可変体
に対応する。凝固時間を実施例２と同じ試料で測定し
た。表３には、得られた凝固時間およびＳＨＰで得られ
た凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記する。
間は出発試薬１００μｌを加えて開始した。凝固時間を
４０５nmで測定した。容量ｘおよびｙを、総量（ｘ＋
ｙ）が正確に１００μｌとなるように、選択した。この
ような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの０μｌを含有する可変
体がトロンボプラスチン時間に基づくＡＰＣＴの可変体
に対応する。凝固時間を実施例２と同じ試料で測定し
た。表３には、得られた凝固時間およびＳＨＰで得られ
た凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記する。
【００３８】Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試料容量の比が
増大するにつれて、Ｖ因子の欠損が増大するために凝固
時間が長くなる。しかし、Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試
料容量の比が７５％となったとしても、タンパク質Ｓの
効果を完全に作用中性化することはできず、その結果更
に高い濃度を使用しなければならなくなる。更に、緩衝
化物質、イオン強度およびりん脂質濃度を適切に選択す
ることによって、反応性を最適化する余地がなお存在す
る。それにも拘らず、ＰＳ−ＤＰおよび同型接合と異型
接合Ｆ.Ｖ疾患双方についての凝固時間の差異が更に大
きくなること、およびそれ故に、新規な方法を用いた場
合、ＰＴを基にしていたとしても、タンパク質Ｃ／ＰＳ
系の２種の障害に差異を生じることがより容易となるこ
とがわかる。
増大するにつれて、Ｖ因子の欠損が増大するために凝固
時間が長くなる。しかし、Ｆ.Ｖ−ＤＰで表わされる試
料容量の比が７５％となったとしても、タンパク質Ｓの
効果を完全に作用中性化することはできず、その結果更
に高い濃度を使用しなければならなくなる。更に、緩衝
化物質、イオン強度およびりん脂質濃度を適切に選択す
ることによって、反応性を最適化する余地がなお存在す
る。それにも拘らず、ＰＳ−ＤＰおよび同型接合と異型
接合Ｆ.Ｖ疾患双方についての凝固時間の差異が更に大
きくなること、およびそれ故に、新規な方法を用いた場
合、ＰＴを基にしていたとしても、タンパク質Ｃ／ＰＳ
系の２種の障害に差異を生じることがより容易となるこ
とがわかる。
【００３９】
【表３】
【００４０】実施例４ 修正ＲＶＶ時間に基づく新規な方法の最適化 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入
手）を用いて測定した。オーストラリア、Gradiporeか
らの試薬LA-ConfirmR をＲＶＶ試薬として用いた。その
他の試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。凝固
時間を測定するために、LA-ConfirmR ２ml入りの１バイ
アルをＡＰＣ感受性試薬（塩化カルシウムおよび活性化
タンパク質Ｃを含有）からの出発物質２mlに溶解し、そ
してこの溶液を使用前＋３７℃に加温した（＝ＲＶＶ／
ＡＰＣ試薬）。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１mlに溶解し
た。
A, Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入
手）を用いて測定した。オーストラリア、Gradiporeか
らの試薬LA-ConfirmR をＲＶＶ試薬として用いた。その
他の試薬はすべてBehringwerke AGから入手した。凝固
時間を測定するために、LA-ConfirmR ２ml入りの１バイ
アルをＡＰＣ感受性試薬（塩化カルシウムおよび活性化
タンパク質Ｃを含有）からの出発物質２mlに溶解し、そ
してこの溶液を使用前＋３７℃に加温した（＝ＲＶＶ／
ＡＰＣ試薬）。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１mlに溶解し
た。
【００４１】次のものを測定管に連続して注入した。 血漿試料 ｘμｌ Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ そして凝固時間はＲＶＶ／ＡＰＣ試薬１００μｌを加え
て開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。容量ｘお
よびｙを、総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるよ
うに、選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの
０μｌを含有する可変体がトロンボプラスチン時間に基
づくＡＰＣＴの可変体に対応する。凝固時間を実施例２
と同じ試料で測定した。
て開始した。凝固時間を４０５nmで測定した。容量ｘお
よびｙを、総量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとなるよ
うに、選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰの
０μｌを含有する可変体がトロンボプラスチン時間に基
づくＡＰＣＴの可変体に対応する。凝固時間を実施例２
と同じ試料で測定した。
【００４２】表４に、得られた凝固時間およびＳＨＰで
得られた凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記す
る。その他の試験可変体の如く（実施例２および３）、
試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が増加するらにつれ
て、凝固時間が更に長くなる。タンパク質Ｃ欠損血漿は
常にＳＨＰと比べると長くなっている。ＳＨＰとタンパ
ク質Ｓ欠損血漿との差異はＦ.Ｖ−ＤＰの割合の増加に
伴って小さくなるけれどもＦ.Ｖ疾患の効果はより大と
なる。ＰＴに基づく試験可変体（実施例３）と同様に、
タンパク質Ｓ欠損はここに列記されているＦ.Ｖ−ＤＰ
の割合を用いては完全に作用中性化されず、その結果
Ｆ.Ｖ−ＤＰの割合は７０％よりも大であるように選択
されなければならない。しかし、Ｆ.Ｖ疾患（同型接合
または異型接合のいずれでも）を有する血漿とタンパク
質Ｓ欠損または欠陥を有する血漿との差異は更に顕著な
ものとなり、その結果更にＲＶＶＴを基として新規な方
法により、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の他の障害
から活性化タンパク質Ｃに対してより安定なＶ因子を識
別する能力が増大される。
得られた凝固時間に関連する凝固時間の差異を列記す
る。その他の試験可変体の如く（実施例２および３）、
試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が増加するらにつれ
て、凝固時間が更に長くなる。タンパク質Ｃ欠損血漿は
常にＳＨＰと比べると長くなっている。ＳＨＰとタンパ
ク質Ｓ欠損血漿との差異はＦ.Ｖ−ＤＰの割合の増加に
伴って小さくなるけれどもＦ.Ｖ疾患の効果はより大と
なる。ＰＴに基づく試験可変体（実施例３）と同様に、
タンパク質Ｓ欠損はここに列記されているＦ.Ｖ−ＤＰ
の割合を用いては完全に作用中性化されず、その結果
Ｆ.Ｖ−ＤＰの割合は７０％よりも大であるように選択
されなければならない。しかし、Ｆ.Ｖ疾患（同型接合
または異型接合のいずれでも）を有する血漿とタンパク
質Ｓ欠損または欠陥を有する血漿との差異は更に顕著な
ものとなり、その結果更にＲＶＶＴを基として新規な方
法により、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓの系の他の障害
から活性化タンパク質Ｃに対してより安定なＶ因子を識
別する能力が増大される。
【００４３】
【表４】
【００４４】実施例５ Ｖ因子欠損血漿に添加することによるヘパリンの作用中
性化 ヘパリンはHoffman-La Roche, Grenzach-Wyhlen, (Liqu
emineR 25000)から入手し、PolybreneはEga-Chemie, St
einheimから入手した。その他の試薬および装置はBehri
ngwerke AGから入手した。
性化 ヘパリンはHoffman-La Roche, Grenzach-Wyhlen, (Liqu
emineR 25000)から入手し、PolybreneはEga-Chemie, St
einheimから入手した。その他の試薬および装置はBehri
ngwerke AGから入手した。
【００４５】ヘパリンを標準ヒト血漿およびＶ因子疾患
欠損を有する血漿に加え、試料容量中７５％のＦ.Ｖ−
ＤＰ割合を用いて、実施例２に記載の如く、凝固時間を
新規な方法で測定した。更に、Polybreneを１０μｇ／m
lの比で試料中のヘパリンの作用中性化のためにＶ因子
欠損血漿に加えた。表４には、ヘパリン０〜２Ｕ／mlの
存在下様々の試験可変体で得られた凝固時間を列記す
る。Ｆ.Ｖ−ＤＰがヘパリン作用中性化添加物を含有し
ていない場合、ヘパリンが０.２Ｕ／mlより高い濃度で
存在すると、凝固時間はヘパリン無しの試料の時間より
も著しくはずれたものとなる。Ｆ.Ｖ−ＤＰにPolybrene
１０μｌ／mlを添加すると、２Ｕ／mlまでのヘパリン
の存在下でもＶ因子欠陥を測定することが可能となる。
このことは、先行技術とは対照的に、ヘパリン添加試料
中でも、Ｆ.Ｖ疾患欠損が測定可能となることを証する
ものである。
欠損を有する血漿に加え、試料容量中７５％のＦ.Ｖ−
ＤＰ割合を用いて、実施例２に記載の如く、凝固時間を
新規な方法で測定した。更に、Polybreneを１０μｇ／m
lの比で試料中のヘパリンの作用中性化のためにＶ因子
欠損血漿に加えた。表４には、ヘパリン０〜２Ｕ／mlの
存在下様々の試験可変体で得られた凝固時間を列記す
る。Ｆ.Ｖ−ＤＰがヘパリン作用中性化添加物を含有し
ていない場合、ヘパリンが０.２Ｕ／mlより高い濃度で
存在すると、凝固時間はヘパリン無しの試料の時間より
も著しくはずれたものとなる。Ｆ.Ｖ−ＤＰにPolybrene
１０μｌ／mlを添加すると、２Ｕ／mlまでのヘパリン
の存在下でもＶ因子欠陥を測定することが可能となる。
このことは、先行技術とは対照的に、ヘパリン添加試料
中でも、Ｆ.Ｖ疾患欠損が測定可能となることを証する
ものである。
【００４６】
【表５】
【００４７】実施例６ マーキュマー（＝フェンプロクーモン）療法を受けてい
る患者の血漿中のＦ.Ｖ欠損の測定 マーキュマーまたはヘパリンを投与されていない患者か
らの９本の血漿および血栓症に伴うマーキュマー療法を
受けている患者からの６本の血漿のＡＰＣＴを、実施例
２による血漿試料のＡＰＣＶの如く、７５％の試料容量
中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合を用いて、実施例１に従って測
定した。
る患者の血漿中のＦ.Ｖ欠損の測定 マーキュマーまたはヘパリンを投与されていない患者か
らの９本の血漿および血栓症に伴うマーキュマー療法を
受けている患者からの６本の血漿のＡＰＣＴを、実施例
２による血漿試料のＡＰＣＶの如く、７５％の試料容量
中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合を用いて、実施例１に従って測
定した。
【００４８】得られた凝固時間を表６に列記する。結果
をＳＨＰで得られた凝固時間（＝１００％）に関連して
％に換算した。両方の試験で、１００％限界以下にある
試料は正である。両方の試験で、非マーキュマー投与血
漿は正であった。すなわち、１００％限界より下にある
ことがわかった；対照的に、マーキュマー投与血漿はい
ずれもＡＰＣＴで負であったが、６本のうち５本の血漿
は新規な方法（ＡＰＣＶ）ではこの限界よりも明らかに
下であった。Ｆ.Ｖ−ＤＰと混合した結果、マーキュマ
ー投与血漿中のすべての欠損、ビタミンＫ依存性酵素を
置換する。これらの血漿を正常の血漿と混合した場合に
も、凝固時間が短縮された（表６）。しかし、このよう
にして置換が行われている試料を用いるＡＰＣＴで正の
試料を同定可能とするのには、これは十分ではない。従
って新規な方法は従来の方法よりもすぐれている。
をＳＨＰで得られた凝固時間（＝１００％）に関連して
％に換算した。両方の試験で、１００％限界以下にある
試料は正である。両方の試験で、非マーキュマー投与血
漿は正であった。すなわち、１００％限界より下にある
ことがわかった；対照的に、マーキュマー投与血漿はい
ずれもＡＰＣＴで負であったが、６本のうち５本の血漿
は新規な方法（ＡＰＣＶ）ではこの限界よりも明らかに
下であった。Ｆ.Ｖ−ＤＰと混合した結果、マーキュマ
ー投与血漿中のすべての欠損、ビタミンＫ依存性酵素を
置換する。これらの血漿を正常の血漿と混合した場合に
も、凝固時間が短縮された（表６）。しかし、このよう
にして置換が行われている試料を用いるＡＰＣＴで正の
試料を同定可能とするのには、これは十分ではない。従
って新規な方法は従来の方法よりもすぐれている。
【００４９】
【表６】
【００５０】実施例７ 添加Ｖ因子欠損血漿中タンパク質Ｃの活性化によるＦ.
Ｖ欠損の測定 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke A.G., Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。凝固時間を測定するために、Behringwer
keからのタンパク質Ｃ試薬用のタンパク質活性化物質試
薬１バイアルをPathromtinR SL（シリカをベースとする
ＡＰＴＴ試薬；５.５ml）１バイアルの内容物に溶解し
た。この試薬および塩化カルシウム溶液（２５mM）を使
用前に＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１
mlに溶解した。次のものを測定管に連続して注入した。 血漿試料 ｘμｌ Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ タンパク質Ｃ活性化物質／PathromtinR SL混合物１００
μｌ
Ｖ欠損の測定 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke A.G., Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。凝固時間を測定するために、Behringwer
keからのタンパク質Ｃ試薬用のタンパク質活性化物質試
薬１バイアルをPathromtinR SL（シリカをベースとする
ＡＰＴＴ試薬；５.５ml）１バイアルの内容物に溶解し
た。この試薬および塩化カルシウム溶液（２５mM）を使
用前に＋３７℃に加温した。Ｖ因子欠損血漿を蒸留水１
mlに溶解した。次のものを測定管に連続して注入した。 血漿試料 ｘμｌ Ｆ.Ｖ−ＤＰ ｙμｌ タンパク質Ｃ活性化物質／PathromtinR SL混合物１００
μｌ
【００５１】次に混合物全体を３分間＋３７℃でインキ
ュベートし、そして出発試薬１００μｌを加えて凝固時
間を開始させた。凝固時間を４０５nmで測定した。容量
ｘおよびｙを総容量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとな
るように選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰ
の０μｌを含む可変体は、ドイツ特許出願Ｐ ４４ ２７
７８５.７に記載の如く、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ
の系の障害についての新規なスクリーニング試験に相当
する。凝固時間は実施例２と同じ試料で測定した。
ュベートし、そして出発試薬１００μｌを加えて凝固時
間を開始させた。凝固時間を４０５nmで測定した。容量
ｘおよびｙを総容量（ｘ＋ｙ）が正確に１００μｌとな
るように選択した。このような状態では、Ｆ.Ｖ−ＤＰ
の０μｌを含む可変体は、ドイツ特許出願Ｐ ４４ ２７
７８５.７に記載の如く、タンパク質Ｃ／タンパク質Ｓ
の系の障害についての新規なスクリーニング試験に相当
する。凝固時間は実施例２と同じ試料で測定した。
【００５２】表７には、得られた凝固時間およびＳＨＰ
で得られた凝固時間に関連した凝固時間の差異を列記す
る。その他の試験可変体の如く（実施例２〜４）、試料
容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が増大するにつれて、凝固
時間が更に長くなった。Ｆ.Ｖ−ＤＰの割合が増大する
につれてＳＨＰとタンパク質Ｓ欠損血漿との差異がより
小さくなるが、Ｆ.Ｖ疾患の効果はより大となる。タン
パク質Ｓの不足の効果は、試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの
割合が７０％であるときに、作用中性化される。これら
の結果は、実施例２〜４で実証した新規な方法の適用と
同等の状態にあるが、この場合活性化タンパク質Ｃを添
加しなかったけれども、代りに非活性化タンパク質Ｃを
加え、次に供試混合物中で活性化した。
で得られた凝固時間に関連した凝固時間の差異を列記す
る。その他の試験可変体の如く（実施例２〜４）、試料
容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの割合が増大するにつれて、凝固
時間が更に長くなった。Ｆ.Ｖ−ＤＰの割合が増大する
につれてＳＨＰとタンパク質Ｓ欠損血漿との差異がより
小さくなるが、Ｆ.Ｖ疾患の効果はより大となる。タン
パク質Ｓの不足の効果は、試料容量中のＦ.Ｖ−ＤＰの
割合が７０％であるときに、作用中性化される。これら
の結果は、実施例２〜４で実証した新規な方法の適用と
同等の状態にあるが、この場合活性化タンパク質Ｃを添
加しなかったけれども、代りに非活性化タンパク質Ｃを
加え、次に供試混合物中で活性化した。
【００５３】
【表７】
【００５４】実施例８ VIII因子をＶ因子欠損血漿に添加することによるＡＰＴ
Ｔ依存法での試料中のVIII因子の効果の低減 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。BeriateR、すなわちBehringwerkeからの
ヒトVIII因子の濃縮物をVIII因子の源として用いた。試
験は、試料とＶ因子欠損血漿とを２５：７５の比で混合
して、実施例２に記載の方法で実施した。加熱不活性化
ヒト血漿をＶ因子欠損血漿として用いた。Ｖ因子および
VIII因子共にこの不活性化で破壊された。比較のため
に、この血漿を溶解後BeriateR を用いて１単位／mlの
濃度にVIII因子を補完した。更に、ＳＨＰをBeriateR
からVIII因子を補完し、その結果ＳＨＰ中のVIII因子の
含量は１〜４単位／mlとなった。異型接合Ｖ因子疾患欠
損を伴うヒト血漿を比較のために新規な方法で測定し
た。
Ｔ依存法での試料中のVIII因子の効果の低減 凝固時間は自動式コアグロメータ(Behring Fibrintimer
A, Behringwerke；Behringwerke AG Marburgから入
手）を用いて測定した。試薬はすべてBehringwerke AG
から入手した。BeriateR、すなわちBehringwerkeからの
ヒトVIII因子の濃縮物をVIII因子の源として用いた。試
験は、試料とＶ因子欠損血漿とを２５：７５の比で混合
して、実施例２に記載の方法で実施した。加熱不活性化
ヒト血漿をＶ因子欠損血漿として用いた。Ｖ因子および
VIII因子共にこの不活性化で破壊された。比較のため
に、この血漿を溶解後BeriateR を用いて１単位／mlの
濃度にVIII因子を補完した。更に、ＳＨＰをBeriateR
からVIII因子を補完し、その結果ＳＨＰ中のVIII因子の
含量は１〜４単位／mlとなった。異型接合Ｖ因子疾患欠
損を伴うヒト血漿を比較のために新規な方法で測定し
た。
【００５５】表８には、凝固時間およびVIII因子補完を
伴うかまたは伴わないＶ因子欠損血漿を用いて得られ
た、VIII因子１単位／ml含有ＳＨＰで得られた凝固時間
に関連して凝固時間の差異を列記する。VIII因子を含有
しない欠損血漿を用いると、正常血漿での凝固時間は血
漿中のVIII因子の含量が増加するにつれて短くなり、Ｖ
因子疾患欠損を伴うが、VIII因子の正常な含量を有する
血漿で得られる凝固時間に近くなる。一方、Ｖ因子欠損
血漿がすでにVIII因子１Ｕ／mlを含有していると、試料
中のVIII因子の含量に因る凝固時間の短縮は無視してよ
いものとなる。このことは、ＡＰＴＴを基とする試験デ
ザインでは、VIII因子の添加によるか、あるいはVIII因
子含有試薬の使用によるVIII因子のレベルの上昇に因っ
て試料が誤って正と同定されるのを防止し得ることを実
証するものである。
伴うかまたは伴わないＶ因子欠損血漿を用いて得られ
た、VIII因子１単位／ml含有ＳＨＰで得られた凝固時間
に関連して凝固時間の差異を列記する。VIII因子を含有
しない欠損血漿を用いると、正常血漿での凝固時間は血
漿中のVIII因子の含量が増加するにつれて短くなり、Ｖ
因子疾患欠損を伴うが、VIII因子の正常な含量を有する
血漿で得られる凝固時間に近くなる。一方、Ｖ因子欠損
血漿がすでにVIII因子１Ｕ／mlを含有していると、試料
中のVIII因子の含量に因る凝固時間の短縮は無視してよ
いものとなる。このことは、ＡＰＴＴを基とする試験デ
ザインでは、VIII因子の添加によるか、あるいはVIII因
子含有試薬の使用によるVIII因子のレベルの上昇に因っ
て試料が誤って正と同定されるのを防止し得ることを実
証するものである。
【００５６】
【表８】
Claims (42)
- 【請求項１】 生物体液の試料でタンパク分解性分解に
対する活性化凝固Ｖ因子の安定性を定性検出し、また定
量測定する方法において、次の工程 ａ） 試料を、正常ヒト血漿と比較して機能性Ｖ因子の
含量が減少している試薬Ａと混合し、 ｂ） 試料のＶ因子活性化のための試薬Ｂを添加し、 ｃ） 試料の活性化Ｖ因子をタンパク分解性分解のため
の試薬Ｃを添加し、 ｄ） Ｖａ因子残留活性を測定するための試薬を添加
し、 而して試料容量で表わされる総試験容量の割合が多くと
も２０％、好ましくは１０％に等しいかまたはそれ以下
であるものとする、を包含することを特徴とする上記方
法。 - 【請求項２】 試薬Ａがヒトまたは動物由来、好ましく
はヒト由来のＶ因子欠損血漿である請求項１記載の方
法。 - 【請求項３】 Ｖ因子の欠損が機能欠損と解され、これ
により実際に減少しているＶ因子の含量を有する血漿お
よびＶ因子を含有するものの、そのＶ因子が使用される
活性化操作で活性化されない血漿の両者が可能となる請
求項１または２の少なくとも一項記載の方法。 - 【請求項４】 血漿中のＶ因子の含量の減少が供給者の
遺伝上の欠損または欠陥に因る請求項３記載の方法。 - 【請求項５】 血漿中のＶ因子の含量の減少が、適当な
高親和性の結合パートナー、好ましくはＶ因子に対する
抗体で被覆した支持材料への吸着により、特に好ましく
はＶ因子に対するモノクローナル抗体を用いる免疫吸着
により生じる請求項３記載の方法。 - 【請求項６】 使用する血漿のＶ因子が前処理により不
活性化し、特に好ましくはＶ因子を変性する熱処理を使
用する請求項３記載の方法。 - 【請求項７】 使用する血漿の機能性Ｖ因子が、Ｖ因子
前処理Ｖａ因子を特異的に不活性化するタンパク分解酵
素による処理によって減少されている請求項３記載の方
法。 - 【請求項８】 血漿中に存在するＶ因子が試薬Ｂにより
活性化されない請求項３記載の方法。 - 【請求項９】 Ｖ因子の活性化可能な機能含量がヒト血
漿の＜１と５０％との間にあり、好ましくは１０％未満
である請求項２記載の方法。 - 【請求項１０】 試料と混合後のＶ因子欠損血漿の割合
が５０〜９０％、好ましくは６０〜８０％の範囲にある
請求項１および２記載の方法。 - 【請求項１１】 Ｖ因子欠損血漿がヘパリンの作用中性
化のための添加物を含有することができ、好ましくはPo
lybreneを２〜５０mg／リットルの濃度、特に好ましく
は１０〜２０mg／リットルの範囲で使用する請求項１お
よび２記載の方法。 - 【請求項１２】 試料と混合する試薬が水、生理食塩
水、適当な緩衝液および（または）Ｖ因子と同一ではな
い個々の酵素または補助因子あるいはこれらの酵素およ
び補助因子のいくつかである請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 反応試薬がタンパク質Ｓの適当な濃縮
物を、好ましくは試料と混合後の濃度を基にして０.２
〜５Ｕ／mlの濃度範囲、特に好ましくは０.５〜２Ｕ／m
lの濃度範囲で含有する請求項１２記載の方法。 - 【請求項１４】 反応試薬がＸ因子の適当な濃縮物を、
好ましくは試料と混合後の濃度を基にして０.２〜５Ｕ
／mlの濃度範囲、特に好ましくは０.５〜２Ｕ／mlの濃
度範囲で含有する請求項１２記載の方法。 - 【請求項１５】 反応試薬が適当な濃度のプロトロンビ
ンを、好ましくは試料と混合後の濃度を基にして０.５
〜１０Ｕ／mlの濃度範囲、特に好ましくは、１.０〜２
Ｕ／mlの濃度範囲で含有する請求項１２記載の方法。 - 【請求項１６】 試薬がりん脂質、好ましくは、ホスフ
ァチジルコリン、ホスファチジルセリンおよびホスファ
チジルエタノールアミンの混合物を、試料と混合後の濃
度を基にした濃度が０.３〜０.００１％好ましくは０.
０１〜０.１％の範囲で含有する請求項１２記載の方
法。 - 【請求項１７】 試料と混合する試薬が請求項１３〜１
６記載の添加物の１種またはそれより多くを含有する請
求項１および１２〜１６のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項１８】 試料のＶ因子を直接または間接に活性
化することができる請求項１記載の方法。 - 【請求項１９】 Ｖ因子をヒトまたは動物由来の適当に
活性化する酵素を添加することにより直接活性化するこ
とができる請求項１８記載の方法。 - 【請求項２０】 トロンビンを好ましくはヒト由来の酵
素として使用する請求項１９記載の方法。 - 【請求項２１】 蛇毒液からのＶ因子活性化剤、特に好
ましくはラッセルクサリヘビ(Vipera russellii)の毒液
からのＶ因子活性化剤をヒト以外の由来の酵素として使
用する請求項１９記載の方法。 - 【請求項２２】 試料のＶ因子を、活性化部分トロンボ
プラスチン時間の原理に従って、界面活性剤、りん脂質
およびカルシウムイオンを用いて接触相を活性化するこ
とによって凝固カスケードを作動させることにより、間
接的に活性化することができる請求項１８記載の方法。 - 【請求項２３】 試料のＶ因子を、トロンボプラスチン
時間の原理に従って、トロンボプラスチン、りん脂質お
よびカルシウムイオンの添加により凝固カスケードを作
動させることにより間接的に活性化することができる請
求項１８記載の方法。 - 【請求項２４】 試料のＶ因子を、例えば蛇カーペット
・バイパー(Echis carinatus)の毒液から得られるトロ
ンビン活性化物質の添加によりプロトロンビンを活性化
することによって間接的に活性化することができる請求
項１８記載の方法。 - 【請求項２５】 試料中の活性化Ｖ因子をヒトまたは動
物由来のタンパク分解酵素の添加により分解する請求項
１記載の方法。 - 【請求項２６】 活性化Ｖ因子をヒトタンパク質Ｃによ
り分解する請求項２５記載の方法。 - 【請求項２７】 ヒトタンパク質Ｃを、すでに活性化さ
れた形態であるとき、供試混合物に供試混合物を基にし
て好ましくは０.０２〜１Ｕ／ml、特に好ましくは０.０
５〜０.１５Ｕ／mlの濃度で添加する請求項２７記載の
方法。 - 【請求項２８】 ヒトタンパク質Ｃを非活性化形態で加
えるか、またはＶ因子欠損血漿中のタンパク質Ｃを供試
混合物で最初に活性化する請求項２および２６の少なく
とも一項記載の方法。 - 【請求項２９】 試薬の少なくとも１種がタンパク質Ｃ
活性化酵素を含有し、この酵素が試料およびヒト、非活
性タンパク質Ｃと接触し、後者を活性化する請求項１ま
たは２８の少なくとも一項記載の方法。 - 【請求項３０】 マムシ(Agkistrodon)属の蛇の毒液か
らの酵素をタンパク質Ｃの活性化に好ましく使用する請
求項２９記載の方法。 - 【請求項３１】 供試混合物中のＶａ残留活性を、トロ
ンビンを形成するプロトロンビンの活性化を測定するこ
とにより測定する請求項１記載の方法。 - 【請求項３２】 トロンビン活性を機械的、光学的また
は光学機械的方法を用いてフィブリノーゲンの変換を測
定することによって測定し、そしてフィブリノーゲンは
好ましくは試料から由来し、特に好ましくは試料を混合
する試薬から由来する請求項１および３１の少なくとも
一項記載の方法。 - 【請求項３３】 トロンビン活性を、トロンビン特異性
で色素産生基質の変換を光学的検出により測定すること
によって測定する請求項３３記載の方法。 - 【請求項３４】 プロトロンビンを、Ｖａ因子により刺
激されることができるプロトロンビン活性化剤によって
開裂する請求項１、１２〜１７および３１の少なくとも
一項記載の方法。 - 【請求項３５】 使用されるプロトロンビン活性化剤が
ヒトおよびヒト以外の由来であることができる請求項３
４記載の方法。 - 【請求項３６】 Ｘ因子がヒトプロトロンビン活性化剤
として使用する請求項３５記載の方法。 - 【請求項３７】 ウシプロトロンビン活性化剤をヒト以
外のプロトロンビン活性化剤として使用する請求項３５
記載の方法。 - 【請求項３８】 請求項１記載の工程を得られた混合物
をインキュベートする期間中断するか、あるいはインキ
ュベーション相が工程内で生じることができる請求項１
記載の方法。 - 【請求項３９】 試薬を結合することにより、試料がご
く僅かの試薬、好ましくは僅か２種の試薬、特に好まし
くは必要成分全てを含有する唯１種の試薬と接触する請
求項１記載の方法。 - 【請求項４０】 蛇毒液、好ましくはトラヘビ(Notechi
s scutatus scutatus)の毒液からのプロトロンビン活性
化剤をヒト以外のプロトロンビン活性化剤として使用す
る請求項３５記載の方法。 - 【請求項４１】 請求項３〜７のいずれか一項記載の方
法に従って調製されたＶ因子欠損血漿がVIII因子を０〜
４Ｕ／mlの濃度、特に好ましくは０.７〜１.３Ｕ／mlの
濃度範囲で含有するか、あるいは精製VIII因子を添加す
ることによってかかる濃度が得られるよう補完する請求
項３〜７のいずれか一項記載の方法。 - 【請求項４２】 試薬が、試料と混合後０.０１〜２単
位／ml、好ましくは０.７〜１.３単位／mlの濃度範囲に
ある濃度でVIII因子を含有し、ここで１単位とは正常ヒ
ト血漿１ml中に存在する量と定義される請求項１２記載
の方法。
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