KR101159516B1

KR101159516B1 - 동맥 혈전증에 대한 위험 인자로서 인자 ⅶ-활성화프로테아제(ｆｓａｐ)의 마르부르그 ⅰ 돌연변이체

Info

Publication number: KR101159516B1
Application number: KR1020030016844A
Authority: KR
Inventors: 키흘스테판; 빌라이트요한; 비데르만크리스티안요세프; 로에미슈유에르겐; 바이머토마스; 포이쓰너아네테; 스토에르한스-아르놀트; 도에르삼볼커
Original assignee: 체에스엘 베링 게엠베하
Priority date: 2002-03-19
Filing date: 2003-03-18
Publication date: 2012-06-25
Also published as: DK1348761T3; DE10238429A1; DE50308573D1; AU2003201328B2; CA2422583C; KR20030076342A; EP1348761B1; AU2003201328A1; JP2003304873A; ES2295475T3; ATE378401T1; JP4348097B2; EP1348761A1; CA2422583A1

Abstract

특히, 응고 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP)의 확인된 돌연변이체 중 하나로 이루어진 신규한 동맥 혈전증 위험 인자가 기술된다. 또한, 위험 인자로서 확인된 이러한 돌연변이체를 검출하기 위한 진단적 측정 방법이 기술된다.

응고 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP), 죽상경화증, 동맥 혈전증, 돌연변이체, 프로유로키나제

Description

동맥 혈전증에 대한 위험 인자로서 인자 Ⅶ-활성화 프로테아제(ＦＳＡＰ)의 마르부르그 Ⅰ 돌연변이체{Marburg I mutant of factor VII-activating protease(FSAP) as risk factor for arterial thrombosis}

도 1: 도 1은 개개인에 존재하는 혈관 위험 인자의 작용으로 진행된 죽종형성의 회귀-조정 위험 요소(인자 VII-활성화 프로테아제의 마르부르그 I 돌연변이체, IGT/당뇨병, 0.32g/ℓ를 초과하는 지단백질 농도, 흡연, 인자 V의 레이덴(Leiden) 돌연변이, 섬유소 농도(Q₅ > 3.2g/ℓ) 및 안티트롬빈 농도(Q₁ < 84%))를 나타낸 것이다.

본 발명은 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP)의 돌연변이체, 및 죽상경화증 및 이로부터 야기하는 병태생리학적 후유증의 발병 및 진행에 대한 위험 증가 지시자로서 혈장 FSAP의 수준 감소에 관한 것이다.

죽상경화증은, 특히 동맥의 경화, 비후 및 탄성력 손실과 관련된 동맥의 병리학적 변화로 심근경색, 뇌졸중 및 기타 다른 질환의 주된 요인으로 간주되고 있다. 예를 들어, 고혈압, 과지질혈증, 당뇨병, 독소, 니코틴, 알콜 과다 소비 및 염증과 같은 다양한 외인성 및 내인성 인자가 죽상경화증의 개시 및 진행의 원인으로 여겨지고 있다. 이러한 영향력은 위험 인자로 지칭된다. 그러나, 연구수가 증가되고 분석방법이 개선됨에 따라, 죽상경화증에 대한 추가의 위험 인자가 최근에 밝혀졌다.

위험 인자는 본 분야의 전문가들 사이에서는 익히 공지되어 있는 브루네크(Bruneck) 연구와 같은 역학적 연구에서 조사되었다. 본 연구를 위해 1990년 이탈리아 브루네크 지방의 1000명의 거주자들을 선발하였다. 경동맥의 초음파 조사 및 다수의 혈액 매개변수 분석과 피검체 문진으로, 죽상경화증의 발병 및 진행의 추적 조사를 위한 방대한 데이타 베이스를 구축할 수 있었다. 동일 피검체에서 계속 조사를 실시하였고 5년 간격으로 분석하였다. 죽상경화증 발병 및 진행 모델은 이로부터 유래된 것이다. 당해 연구의 첫번째 결과로서, 죽상경화증의 발병과 공지된 전통적인 위험 인자(예: 상기한 과지질혈증 및 기타 인자)간의 연관성이 밝혀졌다. 그러나, 죽상경화성 플라크가 혈관의 40%를 차지할 정도로 확대되면, 다른 위험 인자가 중요하게 되고 죽상경화증의 추가 진행 및 혈관 폐색에 심각한 영향을 미칠 수 있다. 이러한 인자에는 특히 울혈을 중재하는 혈장 단백질을 포함한다. 응고 억제 잠재능 감소는, 예를 들어 안티트롬빈 또는 단백질 C 수준 감소 또는 소위 APC 내성(활성화된 단백질 C)에 영향을 미친다. 따라서 섬유소용해 잠재능 감소는, 예를 들어 혈관내 지단백질 수준이 증가되는 경우에 관찰된 바와 같이, 혈관 폐색 진행에 결정적 영향을 미칠 수 있다.

지금까지, 특히 APC 내성(FV 레이덴)과 같은 정맥성 폐색 질환에 대한 위험 인자가 확인되었는데, 이는 APC 내성이 없는 피검체와 비교하여 이형접합체에서 상기한 돌연변이에 대한 확률비, 즉 위험 증가 수치가 "8"이다. 반면 동맥 부위에서는 이러한 위험 인자가 단지 약 "2"의 확률비를 갖는다.

따라서, 브루네크 연구에서 피검체로부터 입수한 혈장 샘플 및 DNA로, 죽상경화증에 대한 다른 위험 인자의 존재 여부, 특히 최근에 발견된 응고 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP)의 돌연변이체(이하, FSAP 마르부르그 I 돌연변이로 지칭)에 대해 집중적으로 다시 한번 조사하게 되었다.

독일 특허원 제199 03 693.4호에는, 혈장으로부터 분리할 수 있으며 응고 인자 VII를 활성화시킬 수 있는 프로테아제가 기술되어 있다. 이 프로테아제는 또한 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP)(또는 혈장 하이알루론산-결합(세린) 프로테아제에 상응하는 PHBP 또는 PHBSP)로서 언급된다. 따라서 FSAP는 응혈촉진성을 갖는다. FSAP의 특성은 단일쇄 플라스미노겐 활성화 인자(예: 프로유로키나제) 또는 단일쇄 조직 플라스미노겐 활성화 인자(sct-PA)를 활성화시키는데 있다. 그러나, FSAP는 또한 단독 또는 플라스미노겐 활성화 인자와 결합하여, 예를 들어 혈전증 합병증에서 섬유소 용해를 돕는데 상응하게 사용될 수도 있다.

입수가능하고 독일 특허원 제199 03 693.4호 및 제199 26 531.3호에 기술되어 있는 시험 시스템으로는 FSAP의 검출 뿐만 아니라 FSAP 항원의 정량과 혈장내 이의 활성 측정이 가능하다. 항원 측정은 바람직하게는 ELISA 시험에 의해 수행된다. 반면, 활성은 원칙적으로는 프로유로키나제를 유로키나제로 활성화시키는 과정, 색원체 기질의 전환 과정 및 후속의 흡광차 측정 과정을 통해 측정할 수 있다.

독일 특허원 제100 52 319.6호는, 건강한 혈액 공여자 조사에서 상기한 시험 시스템을 사용하여 평균 FSAP 항원량을 갖지만 프로유로키나제 활성 잠재능이 현저하게 감소된 5 내지 10%의 피검체의 확인이 가능함을 기술하고 있다. 이는 또한 분리된 개별적인 프로테아제에도 적용할 수 있기 때문에, 혈액 세포의 추가 조사에서는 상응하는 DNA가 분석되었다. 놀랍게도 상기한 경우에는, 특히 돌연변이(단일 뉴클레오타이드 다형성; SNP; 1601번 위치의 G/A)를 확인할 수 있었다. 이러한 변형은 성숙한 단백질의 511번 위치 또는 시그날 펩타이드를 포함하는 FSAP 전구효소의 아미노산 534번 위치에서 Gly/Glu 아미노산 치환을 야기한다. 이러한 아미노산 치환은 프로유로키나제를 유로키나제로 활성화시키는 FSAP의 능력을 상실시키거나 적어도 활성을 상당히 감소시킨다. FSAP 마르부르그 I로 불리는 상기한 돌연변이는 지금까지 평균 항원량을 갖지만 프로유로키나제로부터 유로키나제 형성시키는 활성이 감소된 모든 샘플에서 발견되었다.

브루네크 연구를 위해 선발된 피검체의 DNA를 조사하는데는 상기한 돌연변이에 대해 정립된 PCR 시험법을 사용한다. FSAP 마르부르그 I 돌연변이는 분석된 모든 샘플의 4.5%에서 발견되었다. 이러한 발견은 이어서 죽상경화증의 발병 및 진행을 평가하기 위한 연구 과정 동안에 수집된 개별적인 데이타를 사용하여 평가하였다. 이로부터 FSAP 마르부르그 I 돌연변이가 동맥 혈전증 및 죽상경화증의 진행에 대한 위험 인자인 것으로 나타났다.

따라서, 본 발명은 응고 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP)의 돌연변이체로 이루어진 죽상경화증 위험 인자에 관한 것이다. 이와 관련하여, 특히 중요한 위험 인자는 분명하게는 시그날 펩타이드를 포함한 FSAP 전구효소가 아미노산 534번 위치에서 Gly/Glu 치환된 돌연변이체이다.

상기한 경우에서, 시그날 펩타이드를 포함하는 FSAP 전구효소의 상응하는 DNA 서열은 뉴클레오타이드 1601번 위치에서 G/A 염기 치환을 나타낸다.

놀랍게도, 상기 돌연변이는 특히 동맥 혈전증 발병 위험 증가와 상호연관이 있다. 이러한 경우에서는, 정맥부에서 APC 내성의 위험성과 비교하여 동맥부의 위험성인 확률비가 "6.6"으로 계산되었다. 이와 관련하여, 상기한 돌연변이가 이전에 공지된 모든 위험 인자를 참작한 후에 독립적인 위험 인자를 나타내어 죽상경화증의 발병 및 진행에 대해 자체적으로 현저하게 영향을 미친다는 점이 특히 놀랍다. 따라서, 이러한 깨달음, 및 특히 FSAP 마르부르그 I 돌연변이의 측정은 죽상경화증에 의해 유발되는 심장 질환 및 혈관 질환의 진단 및 치료에 대한 전망을 밝게한다. 따라서, 죽상경화증은 예를 들어 협심증과 이에 따른 빈번한 심근경색을 유발한다. 영향받는 혈관에 따라 공급 기관이 연루될 수 있다. 경동맥의 경우, 상기 결과는 뇌에서 양분 및 산소 부족을 일으키고, 최악의 경우에는 뇌졸중까지 유발할 수 있다. 그러나 죽상경화증의 영향을 받는 다른 기관 및 혈관 폐색 질환의 위험이 있는 피검체, 및 이로부터 발병되는 후유증 또한 FSAP 마르부르그 I 돌연변이체의 영향을 받는다. 이는 신장, 간, 폐 질환 및 기타 질환의 문제를 일으킬 수 있다.

FSAP 마르부르그 I 돌연변이체를 측정하는 방법은 상기한 독일 특허원, 특히 독일 특허원 제100 52 319.6호에 기술되어 있다. 이러한 방법에는 바람직하게는 FSAP 항원 시험법과 결합하여 프로테아제 활성을 측정하는 방법 및 적합한 시험 방법에 의해 돌연변이된 영역의 뉴클레오타이드 서열을 측정하는 방법이 포함된다.

따라서 본 발명의 죽상경화증 위험 인자는 단일쇄 플라스미노겐 활성화 인자를 활성화시키는 능력을 상실하였거나 이 능력이 적어도 손상된 FSAP 돌연변이체로 기술할 수 있다. 위험 인자는 프로유로키나제를 활성화시키는 능력을 상실하였거나 이 능력이 감소된 FSAP 돌연변이체인 것으로 특징지워진다. 따라서, 상기 FSAP 돌연변이체를 검출하여 죽상경화증의 발병에 대한 유전적 소인을 확인할 수 있다. 또한 상기 FSAP 돌연변이체 검출은, 특히 동맥 혈전증의 발병에 대한 소인 및 죽상경화성 또는 혈전성 질환 및 이의 후유증(예: 동맥 및 정맥 폐색성 질환) 발병에 대한 소인을 나타낸다. 기관 기능의 죽상경화성 또는 혈전성 제한 발병에 대한 소인은 협심증, 심근경색 또는 뇌졸중을 빈번히 유발한다. 전형적으로 모든 경우에서, 단일쇄 플라스미노겐 활성화 인자의 활성화 잠재능, 특히 프로유로키나제의 활성화 잠재능이 감소된다. 이러한 활성화 잠재능의 감소는 혈액, 특히 혈장에서 검출될 수 있다.

죽상경화증 위험 인자로서 FSAP 돌연변이체가 중요하다는 측면에서는 이를 검출하는 진단방법이 매우 중요하다. 이러한 방법은 공여자의 체액, 특히 혈장중 FSAP 항원 농도 감소 및/또는 FSAP 활성 감소를 측정하는 것을 기본으로 한다. 이는 상기 체액에서 단일쇄 플라스미노겐 활성화 인자의 활성화 잠재능, 특히 프로유로키나제의 활성화 잠재능을 측정하는 것을 수반한다.

특히 신뢰할 만한 방법은 공여자의 게놈 DNA 또는 이로부터 유래된 mRNA를 분석함으로써 뉴클레오타이드 1601번 위치에서 G/A 염기 치환된 FSAP 전구효소 유전자의 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이체를 측정하는 것으로 이루어져 있다.

그러나, 단백질 수준에서 상기 FSAP 돌연변이체를 또한 측정할 수도 있다. 특이적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용이 이러한 목적에 특히 적합하다. 그러나, 최종적으로는 조직상에서 또는 조직으로부터 추출한 용액중에서 조직학적 조사 방법을 또한 실시할 수도 있다.

신뢰할 만한 진단방법은 FSAP 돌연변이체(들)을 함유할 수 있는 샘플을, 고체 지지체상에 고정화된 제1 항체와 함께 항온처리한 다음, 세척하고 후속적으로 표지된 제2 항체 또는 야생형에 대해 반응성인 표지 항체를 부가한 다음, 다시 세척하고 제2 항체에 의해 유도되는 시그날을 측정하는 것으로 이루어져 있다.

또다른 방법은 FSAP 돌연변이체(들)을 함유할 수 있는 샘플을, 고체 지지체상에 고정화된, 야생형에 대한 제1 항체와 함께 항온처리한 다음, 세척하고 후속적으로 표지된 제2 항체를 부가한 다음, 다시 세척하고 제2 항체에 의해 유도되는 시그날을 측정하는 것으로 이루어져 있다.

가능한 또다른 방법은 FSAP 돌연변이체(들)의 존재여부를 조사할 샘플을 지지체상에 고정화시키고 표지된 항체 단독으로 이를 검출하거나, 표지되지 않은 항체와 혼합한 다음 표지된 항체를 검출하는 것이다.

최종적으로는 표지된 돌연변이체(들)의 존재하에 FSAP 돌연변이체의 존재여부를 조사할 샘플을, 지지체상에 고정화된 항체와 혼합하고 표지에 의해 유도되는 시그날을 측정할 수도 있다.

프로테아제에 대해 반응성인 항체가 이미 커플링되어 있는 고체 지지체상에서 프로테아제 함유 샘플을 항온처리한 다음, 유리 지지체를 세척하고 이에 고정화된 프로테아제를 활성 측정 시약과 함께 항온처리함으로써 FSAP의 활성을 측정하는 진단방법도 유용한 것으로 입증되었다.

항체를 사용하여 면역조직학용 웨스턴 블롯, 형광 활성화된 세포 분류법(FACS) 또는 이에 필적할 만한 방법에 의거, 돌연변이체를 검출하는 진단방법도 또한 유용하다.

본 발명의 진단방법은 바람직하게는 ELISA 기술에 의해 수행한다. 이는 매트릭스, 예를 들어 미세역가 플레이트에 FSAP 및/또는 FSAP 돌연변이체를 결합시키는 것을 수반한다. FSAP 및/또는 FSAP 돌연변이체의 최적 제시를 위해, 플레이트를 모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 이의 F(ab')₂ 또는 Fab' 단편으로 미리 피복시킨 다음, FSAP 및/또는 FSAP 돌연변이체를 로딩할 수 있다. FSAP 및 돌연변이체는 덱스트란 설페이트, 헤파린 및 유사 물질에 잘 결합하기 때문에, FSAP를 결 합시키기 위해서 이러한 시약을 미리 피복시킬 수도 있다. 지지체 또는 미세역가 플레이트를 세척한 다음, 경우에 따라 본 목적에 공지된 적절한 시약(예: 세제 또는 알부민)으로 차단시키고 세척한 다음, 시험할 용액과 함께 항온처리한다. FSAP 항체를 함유하는 용액은 혈청, 혈장 및 기타 체액 뿐만 아니라 윤활액, CSF, 타액, 눈물, 정액장 또는 다른 세포 용해물일 수도 있다.

지지체의 항온처리 및 세척은 적합한 검출 시약을 사용하여 수행한다. 다양한 항체 부류(예: IgG, IgM, IgA, IgE 및 관련 아부류)를 검출하는데 필요한 시험 물질은 표지된 시약으로서 시판중이다. 이어서, 항체 역가의 검출 및 정량은 항-사람 항체에 커플링되어 있는 효소에 의해 색원성 기질이 절단되어 발생되는 흡광치를 측정하는 광도 측정에 의해 수행할 수 있다. 그러나, 검출에 사용되는 항체에 연결된 형광성 그룹에 의해 발산되는 형광을 측정할 수도 있다. 최종적으로는 검출에 사용되는 물질이 방사능 그룹으로 표지된 경우에는 방사분석 측정법을 사용하여 검출할 수도 있다. 다수의 경우에서, 결합된 사람 항체를 표지된 항-사람 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 표지된 단백질 A 또는 단백질 G와 함께 항온처리하고, 결합된 표지 물질에 의해 발산되는 시그날을 측정하는 진단방법이 매우 적합한 것으로 이미 입증되었다.

항체는, 효소 커플링된 항-사람 항체 또는 이의 단편 또는 단백질 A 또는 단백질 G에 의해 적합한 색원성 또는 형광발생성 기질이 절단됨으로써 유발되는 흡광 광도 측정에 의해 검출할 수 있다. 형광성 그룹으로 표지된 결합 물질에 의해 유발되는 형광을 측정함으로써 항체를 검출하는 진단방법도 적합하다.

브루네크 연구

연구 목적: 브루네크 연구는 경동맥 죽상경화증의 역학 및 병인학을 규명하는 것이 목표인 장기적인 집단 연구이다(1 내지 6). 연구 집단은 성별 및 연령에 따라 계층화한 샘플로서 1990년에 선발하였고, 40세에서 79세까지의 모든 브루네크 거주자(연령대별로 50대에서 80대까지 각각 여성 125명 및 남성 125명, n=1000)이다. 전체적으로 93.6%가 참여하였고 919명의 데이타 입수를 완료하였다. 1990년 여름부터 1995년 사이의 추적 기간 동안(5년₁-Q₁), 62명의 아그룹이 사망하였고 한명은 이사를 갔다. 나머지 집단의 추적 결과 96.5%가 연구를 완료하였다(n=826)(1 내지 3). 연구에 들어가기 전에, 모든 참여자들에게 연구에 대한 알려준 후 동의를 받았다. 1995년 추적 연구의 일부로서, DNA를 입수하기 위해 혈액을 채취하였다. 16가지 경우에서 만족스럽지 못한 PCR 산물을 수득하였는데, 810명의 남성 및 여성은 주요 연구를 위해 남겨두었다. 이들중 94명은 1995년 여름부터 2000년 사이에 사망하였다(5년₂-Q₂). 총 675명의 피검체가 2000년에 다시 초음파조사를 받았다(생존자중 추적 조사률은 94.3%)(6).

임상 내력 및 조사: 연구 프로토콜에는 심장학적 및 신경학적 항목에 우선순위가 있는 임상 조사서 및 잠재적인 혈관 위험 인자에 인한 현재 또는 과거의 민감성과 관련된 표준화된 질문서가 포함된다(3 내지 5). 흡연자 또는 이전 흡연자의 경우, 매일 흡연하였던 담배 개피의 평균수 및 담배곽의 수를 기록하였다. 알콜 소비량은 1일당 그램으로 정량하고 4개의 범주로 분류하였다(3). 수축기성 및 확장기 혈압은 3회 측정 평균으로, 각각의 경우에 10분 이상 휴식한 후 측정하였다. 고혈압은 혈압이 160/95 이상인 것으로 정의하거나 혈압강하제를 복용하는 경우로 정의하였다(WHO 기준). 표준화된 경구 글루코스 허용 시험은 당뇨병이 있는 것으로 이미 공지된 경우를 제외하고는 모든 피검체에서 실시하였다. 공복 혈액 글루코스 수준이 140㎎/㎗(7.8mmol) 이상이고/거나 2시간 수준(경구 글루코스 허용 시험)이 200㎎/㎗(11.0mmol/ℓ) 이상인 피검체의 경우 진성당뇨병에 포함되었다.

실험 방법: 피검체를 금식시키고 12시간 이상 금연시킨 후, 주전 정맥으로부터 혈액을 채취하였다(3 내지 6). 고밀도 지단백질이 있는 콜레스테롤 및 전체 콜레스테롤을 효소적으로 측정(CHOD-PAP 방법; Merck, Darmstadt, Germany)하였고, ELISA(Immuno, Vienna, Austria)를 사용하여 지단백질(a) 농도를 측정하였다. 저밀도 지단백질이 있는 콜레스테롤은 프리드왈드(Freidewald) 방정식으로부터 계산하였다. 섬유소는 클라우스(Clauss) 방법에 의해 측정하고 안티트롬빈 III은 색원체 검정을 사용하여 측정하였다. 인자 V의 레이덴 돌연변이는 대립유전자 특이적 PCR 증폭법으로 검출하였다(3).

FSAP 항원 농도 및 scuPA-활성화 영향은 최근 발표된 바와 같이 측정하였다(7 및 8). 간단히 언급하면, 항원 정량의 경우 FSAP에 대한 모노클로날 항체(mAb)를 이용하는 ELISA를 사용하였다. 활성 검정은, 항체로 피복된 미세역가 플레이트상에서 면역흡착을 실시하고 세척한 다음, FSAP에 의해 프로유로키나제를 활성화시키고 유로키나제에 대한 색원성 기질의 아미노분해를 광도 측정법으로 관찰하여 정량하는 것을 포함하였다. 200명 이상의 건강한 혈액 공여자로부터 수집한 항체를 상기한 두가지 검정에 대한 독자적 표준으로서 사용하였다. 혈장 당량 단위(PEU)는 수집된 혈장 1㎖에 존재하는 FSAP 항원 활성으로서 정의하는데 평균 12㎍/㎖에 상응하였다(8).

DNA 추출 및 FSAP 유전자형 결정: GenomicPrep Blood DNA Isolation Kit(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 냉동시킨 전혈로부터 고품질의 DNA를 수득하였다. 추출한 DNA 10㎖는 상응하는 엑손-특이적 전방향 및 역방향 프라이머 50pmol, 1.5mM MgCl₂, 0.2mM dNTP 및 Taq DNA 폴리머라제(Perkin Elmer, Langen, Germany) 2.5단위가 있는 1 ×PCR 표준 반응 완충액 100㎕중에서 증폭시키는데, 처음 2분 동안에는 94℃에서 변성시킨 후, 94℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 40초 동안 35회 열 주기를 실시한 후, 72℃에서 5분 동안 최종 신장 단계를 실시하였다. 사용된 프라이머쌍은 최근 상세하게 기술되어 있다.

스캐닝 프로토콜 및 초음파 종료점의 정의: 초음파 조사에서, 양쪽에 있는 내부 경동맥(구상 및 원위부) 및 일반적인 경동맥(근위부 및 원위부)은 10㎒ 프로브 및 5㎒ 도플러를 사용하여 스캐닝하였다(1 및 2). 죽상경화증 병변은 다음의 2 개의 초음파 범주로 정의되었다: 1) 벽 표면(루멘내 돌출) 및 2) 벽 조직(반사성). 플라크 축의 최대 직경은 각각 16개의 혈관부에서 측정하였다(혈관부에 따라 관찰내 편차 계수는 10% 또는 15%). 맥관내막 중간 두께는 일반적인 경동맥의 먼거리에 있는 벽에서 측정하였다(관찰내 편차 계수는 7.9%(n=100)). 1990년, 1995년 및 2000년에 동일한 실험 초음파 전문가에 의해 스캐닝을 실시하였는데 피검체의 임상 결과 및 실험실 수치가 초음파 전문가에게 공지되지 않은 것이었다.

죽상경화증의 발병은 이전에 정상이었던 부위에서 새로운 플라크가 등장하는 것으로 특징지워졌다. 죽상경화증 발병의 정의에서 플라크의 직경과 관련하여 최소 요구치로서 0.7㎜(일반적인 경동맥) 및 1.0㎜(내부 경동맥)의 한계치를 도입하였는데, 왜냐하면 이보다 작은 병변은 병소/범발성 벽 비후와 구별하기가 어렵기 때문이었다(1). 비협착성 병변의 진행은 본 방법의 측정 오차보다 플라크 직경의 비교 확장치가 2배 이상 높은 것으로 정의하였다. 현재의 분석에서, 발표된 대부분의 위험 인자에서 이러한 과정이 일반적이기 때문에, 상기한 두가지 과정은 보다 용이한 제시를 위해 "초기 죽종형성"으로 지칭되는 단일 결과 범주로 합하였다. 진행 기준에 부합되고 루멘이 40%를 초과해 협소해지는 경우에는 "진행된 죽종형성"으로 간주하였다. 상기한 바와 같이(1 내지 5) 40%의 컷오프는 본 집단에서 현저한 생물학적 한계치에 상응하는 것으로 나타나며, 플라크의 성장 동력학(연속적이고 느리며 범발성인 성장 대 두드러진 병소의 우연적이고 국소적인 확장), 위험 측면(통상의 위험 인자 대 응혈촉진성 위험 인자) 및 혈관 재생 과정(보충 또는 과보충 대 불충분하거나 심지어는 부재)에서의 현저한 변화가 발생하는데, 이는 진행중인 병인 기전이 통상적인 죽종형성에서 죽상경화성 혈전증으로 전환됨을 나타내었다.

초음파 범주의 재현성은 "거의 완벽"하였다(재현성 샘플(n=100)에서 동일 초음파 전문가에 의해 실시된 2개의 독립적인 측정치로부터 수득한 카파 계수 > 0.8)(1 내지 3).

통계적 분석: FSAP 돌연변이와 다양한 죽종형성 단계간에 가능한 연관성은 논리적 회귀 분석에 의해 조사하였다. 기본 모델은 연령 및 성별에 따라서만 조정하였다. 다변수 방정식은 이미 공지되어 있는 단계별 진행 선별 방법에 의해 보정하였다(포함 및 배제에 대한 p 수치는 각각 0.10 및 0.15이다)(3 및 10). 집단 샘플의 연령 및 성별 구조를 설명하기 위해 연령 및 성별을 상기한 모델에 추가하였다. 주요 분석은 1990년 및 1995년 기간 사이에 집중되었다(Q₁). 진행된 죽종형성의 분석은 연구 개시시 죽상경화증으로 이미 고통받고 있는 피검체로 제한하였다(n=326).

회귀-표준화 죽종형성 위험은 위험 인자 수로 계산하였다. 희귀병 가설을 기본으로 하지 않으므로 회귀 조정 과정의 한계방법을 사용하였다(11).

결과

브루네크 연구 집단에서(n=810), 36명의 피검체는 FSAP의 마르부르그 I 돌연 변이체에 대해 이형접합성(남성 17명 및 여성 20명)이고 한명의 피검체는 동형접합성인데 이는 일반적인 집단에서 4.4%(3.0 내지 5.8%)의 총 보유자 비율(95% CI)에 상응하였다. FSAP의 마르부르그 II 돌연변이체(E370Q)의 공동분리가 37명의 개체중 16명에서 관찰되었고(43%, 남성 8명 및 여성 8명), 마르부르그 I 돌연변이체는 나머지 21명의 피검체에서 분리되었다(57%, 남성 9명 및 여성 12명).

아집단(n=82)의 혈장 샘플로는 FSAP 항원 농도 및 상응하는 프로유로키나제 활성화 효과에 대해 조사하였다. 야생형 FSAP가 있는 76명의 피검체에서, 평균(±2 ×SD) 항원 농도, 활성 농도 및 활성/항원 비는 각각 0.991(0.552 내지 1.430) PEU/㎖, 1.036(0.614 내지 1.458) PEU/㎖ 및 1.07(0.63 내지 1.51) PEU/㎖였다. 이와는 반대로, 본 아그룹에서 6명의 모든 마르부르그 I 돌연변이체 보유자는 프로유로키나제를 활성화시키는 시험관내 능력이 상당히 감소된 것으로 나타났고(0.150 내지 0.626 미만) 활성/항원 비는 0.38 내지 0.58이었다. 2개의 유전 집단에서 이러한 매개변수의 분포는 거의 중복되지 않았다.

1990년부터 1995년 사이의 5년간의 추적 기간 동안, 본 연구에서는 810명의 피검체중 384명(47.4%)에서 새로운 죽상경화증 병변이 발병하거나 비협착성 병변 확장(초기 죽종형성)이 나타났고, 이미 플라크가 존재하였던 326명의 개체중 92명(28.2%)에서는 협착성 변형(진행된 죽종형성)이 나타났다. 예상한 바와 같이, 마르부르그 I 돌연변이체와 초기 죽종형성간에는 연관성이 발견되지 않았다(연령/성별이 조정된 다변성 확률비(95% CI) 0.6(0.3 내지 1.4) 및 0.7(0.3 내지 1.7)). 이와 일치하게 야생형 FSAP 및 FSAP의 마르부르그 I 돌연변이체 보유자간에는 일반적인 경동맥의 맥관내막 중간 비후가 차이나지 않았다(각각 0.95㎜ 및 94㎜; P=0.853 차이). 그러나, 돌연변이체는 죽종형성과정중 진행된 추정 죽상경화성 혈전증 단계에서는 강력한 위험 인자인 것으로 나타났다(연령/성별이 조정된 확률비(95% CI) 3.5(1.1 내지 11.4), P=0.036). 연관성은 다른 관련 위험 인자에 대한 논리적 회귀 모델의 조정에 있어서 통계학적으로 중요하다(표 1). 진행된 협착성 죽상경화증에 대한 위험 측면에는 또한 당뇨병, 섬유소 고농도, 안티트롬빈 저농도, 높은 혈소판 수, 흡연, 알콜 소비(소량 보호성), 0.32g/ℓ를 초과하는 Lp(a) 및 인자 V의 레이덴 돌연변이가 포함된다. 위험 인자에서 성별 특이적인 차이는 없었으며, 연령, 위험 수준 및 생활 방식에 따라 분류된 아집단에서 마르부르그 I 돌연변이체의 차별 효과에 대한 증거는 발견되지 않았다. 아스피린, 혈압강하제, 당뇨병치료제 또는 지질저하제 등을 복용한 피검체를 배제한 것이 결과에 영향을 미치지 않는다. 다수의 주요 위험 인자(마르부르그 I 돌연변이체, IGT/당뇨병, 지단백질 고농도, 흡연, 인자 V 돌연변이, 섬유소 고농도 및 안티트롬빈 저농도)의 경우 진행된 죽종형성의 회귀-표준화 인자는 표 2에 나타내었다. 위험 인자가 없는 피검체는 동맥 협착증의 발병/진행 위험이 낮았으나 2개 이상의 인자를 갖는 피검체는 거의 불가피하게 진행된 죽종형성을 경험하였다.

마르부르그 II 돌연변이체는 FSAP에 의해 단일쇄 플라스미노겐 활성화 인자의 시험관내 활성에서 효과가 없었다. 따라서, 본 분석에서 이 돌연변이와 죽종형성간에 관계가 없음을 예측할 수 있었다. 야생형 FSAP가 있는 피검체를 마르부르그 II 돌연변이체 보유자, 마르부르그 I 돌연변이체 보유자 및 양쪽 유전적 변형이 있는 보유자와 비교시, 진행된 죽상경화증에 대한 다변성 확률비(95% CI)가 1.6(0.2 내지 13.7, P=0.669), 6.2(1.1 내지 36.0, P=0.048) 및 7.1(1.1 내지 45.1, P=0.037)이었다

보다 장기간에 걸쳐서도 이러한 결과가 일치한다는 것을 입증하기 위해, 1990년부터 2000년 사이의 10년의 추적 기간에 수득한 데이타를 가지고 반복 계산하였다(Q₁₊₂). 이러한 방정식에서, FSAP의 마르부르그 I 돌연변이체와 진행된 죽상경화증 사이의 다변성 관계(본래의 분석과 동일하게 조정)도 통계적으로 유의적인 것으로 나타났다(다변성 확률비(95%) 4.1(1.1 내지 14.8), P=0.045).

연령, 성별, FSAP의 마르부르그 I 돌연변이체 및 다른 잠재적 혈관 위험 인자에 따른 진행된 죽종형성의 다변성 논리적 회귀 분석

변수	평균±표준편차(%)		확률비(95% CI)	P 수치	단계
변수	AS- (n=234)	AS+ (n=92)	확률비(95% CI)	P 수치	단계
연령(년)	64.9 ±9.2	67.8 ±8.0	1.87(1.19-2.92)	0.0064	0
여성	109(46.6%)	32(34.8%)	0.56(0.25-1.25)	0.1555	0
글루코스 내성 IGT DM	20(8.5%) 10(8.1%)	16(17.4%) 21(22.8%)	3.31(1.37-7.99) 6.38(2.71-14.99)	< 0.0001 0.0081 <0.0001	1
담배수/1일	3.2 ±7.2	6.6 ±9.6	1.77(1.30-2.40)	0.0003	2
Lp(a) > 0.32g/ℓ	36(15.4%)	25(27.2%)	4.06(1.83-8.96)	0.0005	3
알콜 소비 < 1g/d 1-50g/d 51-99g/d ≥100g/d	114(48.7%) 60(25.7%) 37(15.8%) 23(9.8%)	42(45.6%) 15(16.3%) 17(18.5%) 18(19.6%)	1.00 0.26(0.10-0.66) 1.03(0.40-2.70) 1.90(0.63-5.69)	0.0043 0.0046 0.9475 0.2535	4
섬유소, g/ℓ	2.7 ±0.6	2.9 ±0.6	1.53(1.12-2.09)	0.0083	5
마르부르그 I FSAP 돌연변이	5(2.1%)	8(8.7%)	6.63(1.58-27.72)	0.0099	6
인자 V 돌연변이	5(2.1%)	7(7.6%)	4.70(1.19-18.55)	0.0291	7
안티트롬빈 III, %	96.3 ±13.0	92.8 ±16.4	0.74(0.55-1.00)	0.0500	8
혈소판 수, ×10⁹/ℓ	217.4 ±56.5	230.3 ±56.6	1.32(0.98-1.77)	0.0769	9

확률비(OR), 95% 신뢰 구간(95% CI) 및 P 수치(P)는 연령, 성별 및 혈관 위험 인자와 관련하여 진행된 죽상경화증(협착성 경동맥 죽상경화증의 발병/진행)의 논리적 회귀 분석으로부터 유도된 것이다. 모델은 단계적 진행 선별 과정에 의해 조정될었다(단계...도입 단계). OR은 주어진 변수의 1-SD 단위로 계산하였다.

AS-: 진행된 죽종형성이 없는 그룹, AS+: 진행된 죽종형성이 있는 그룹

본 분석은 1990년 연구 개시시시 죽상경화증으로 이미 고통받는 326명의 피검체에 집중되었다.

참고 문헌

본 발명의 방법에 의해 죽상경화증에 대한 또다른 위험 인자인 인자 VII-활성화 프로테아제의 마르부르그 I 돌연변이가 확인되었다.

Claims

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죽상경화증의 발병 또는 동맥 혈전증에 대한 유전적 소인을 확인하기 위하여, 공여자의 체액으로부터 시그날 펩타이드를 포함하는 FSAP 전구효소의 아미노산 서열의 534번 위치에서 Gly가 Glu로 치환된 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP) 돌연변이체의 이형접합성 또는 동형접합성 변이를 검출하는 방법.
제13항에 있어서, 단일쇄 플라스미노겐 활성화 인자를 활성화시키는 능력을 공여자의 체액에서 측정하는, 검출 방법.
제14항에 있어서, 프로유로키나제를 활성화시키는 능력을 공여자의 체액에서 측정하는, 검출 방법.
제13항에 있어서, 뉴클레오타이드 1601번 위치에서 염기 G가 A로 치환된 FSAP 전구효소 유전자의 이형접합성 또는 동형접합성 돌연변이체를 공여자의 게놈 DNA 또는 이로부터 유래된 mRNA에서 분석하여 검출하는 방법.
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제13항에 있어서, 돌연변이체를 특이적 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 사용하여 검출하는 방법.
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제13항에 있어서,

a) 위험 인자를 함유할 수 있는 샘플을 고체 지지체상에 고정화된 제1 항체와 함께 항온처리한 다음 세척하고, 후속적으로, 표지된 제2 항체 또는 야생형에 대해 반응성인 표지된 항체를 부가한 다음 다시 세척하고, 제2 항체에 의해 유도되는 시그날을 측정하거나,

b) 위험 인자를 함유할 수 있는 샘플을 고체 지지체상에 고정화된, 야생형에 대해 반응성인 제1 항체와 함께 항온처리한 다음 세척하고, 후속적으로, 표지된 제2 항체를 부가한 다음 다시 세척하고, 제2 항체에 의해 유도되는 시그날을 측정하거나,

c) 위험 인자의 존재여부가 조사될 샘플을 지지체상에 고정화시키고 표지된 항체 단독으로 이를 검출하거나, 표지되지 않은 항체와 혼합한 다음, 후속적으로, 표지된 항체를 검출하거나, 또는

d) 위험 인자의 존재여부가 조사될 샘플을 지지체상에 고정화된 항체와 표지된 돌연변이체의 존재하에 혼합하고 표지에 의해 유도되는 시그날을 측정하는 검출 방법으로서, 이때 위험인자가 시그날 펩타이드를 포함하는 FSAP 전구효소의 아미노산 서열의 534번 위치에서 Gly가 Glu로 치환된 인자 VII-활성화 프로테아제(FSAP) 돌연변이체인 것인, 검출 방법.
제13항에 있어서, FSAP의 활성을, 프로테아제에 대해 반응성인 항체가 미리 커플링되어 있는 고체 지지체상에서 프로테아제-함유 샘플을 항온처리한 다음, 유리된 지지체를 세척한 후 지지체에 고정화된 프로테아제와 프로테아제의 활성 측정 시약을 함께 항온처리하여 측정하는, 검출 방법.
제13항 내지 제16항, 제18항, 제20항 및 제21항 중의 어느 한 항에 있어서, 항체를 면역조직학용 웨스턴 블롯 또는 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)에 의거하여 돌연변이체를 검출하는데 사용하는, 검출 방법.
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