KR20010049517A - 단백질 용액으로부터 인자 ⅶ을 활성화하는 프로테아제의활성을 측정하기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은
프로테아제 및/또는 이의 전효소를 포함하는 단백질 용액이, 프로테아제로 향하는 항체가 앞서 연결되어진 고체 상으로 항온처리되고,
고체 상을 세정한 후에 이에 고정된 프로테아제 및/또는 이의 전효소가 이들의 활성을 측정하도록 하는 시약으로 항온처리되는, 단백질 용액으로부터 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 용액으로부터 인자 Ⅶ을 활성화하는 프로테아제의 활성을 측정하기 위한 방법{Procedure for the determination of the activity of the protease which activates factor VII from protein solutions}
본 발명은 혈장과 같은 복합 단백질 용액에서 인자 VII을 활성화하는 프로테아제를 정성적 및 정량적으로 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
독일 특허원 제199 03 693.4호에는, 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제를 정성적 및 정량적으로 검출하기 위한 방법 및 시험 시스템이 이미 기재되어 있다. 여기에는 표지된 저분자량 펩타이드 기질의 분해와 이러한 경우에 발생하는 흡광도의 광도 측정을 기본으로 하는 색소원 시험 방법과 상술한 프로테아제의 생물학적 특성이 사용되는 시험 방법이 포함된다. 이들 방법에서, 프로테아제 또는 이의 전효소는
a) 응혈 인자 VIII/VIIIa 또는 V/Va를 불활성화하는 작용,
b) 총체적 응집 시험에서의 응혈 횟수를 감소시키는 작용,
c) 플라스미노겐 활성체를 활성화하는 작용 또는
d) FVII을 활성화하는 작용을 갖는다는 점에서 감지될 수 있다.
그러나, 앞서 사용한 측정 방법에서, FVII 활성체의 활성 측정은 단지 프로테아제가 정제되거나 풍부한 상태로 존재하는 경우에 믿을 만한 결과를 가져올 뿐이고 불순물의 간섭 효과는 측정 결과를 뒤흔들지 못 한다. 그러나, 특히 매우 복잡한 단백질 혼합물, 예를 들어, 혈장 또는 조직액은 인자 VII 활성체의 특이적 측정을 불가능하게 하거나 적어도 방해할 수 있는 다수의 단백질을 함유한다. 더욱이, 현 지식 수준에 따르면, 프로테아제는 특히 전효소로서 혈장에 존재하므로, 활성 프로테아제를 제공하기 위한 활성화는 후속적인 활성 측정을 위해 필요하다.
인자 VII-활성화 프로테아제는 특히 응집과 섬유소융해에서의 협력으로 지혈의 조절에 관여하는 혈장 단백질이다. 따라서, 프로테아제의 작용과 생물학적 활성에 대한 연구는 매우 흥미롭다. 따라서, 예를 들면, 유전자 돌연변이로 인한, 예를 들어, 감소된 항원 함량 및/또는 생물학적 활성의 파괴는 혈전증의 증가된 위험을 가리킬 수 있다.
따라서, 본 목적은 인자 VII-활성화 프로테아제의 하나 이상의 생물학적 활성을 가능한한 간단하고 특이적인 방식으로 측정할 수 있도록 하는 방법을 개발하는 것이다. 당해 프로테아제의 생리학적 역할은 여전히 불투명하므로, 이 방법은 원칙상 다수의 활성을 측정하도록 해야 한다.
도 1은 연구한 건강한 남성의 프로테아제 활성(A)과 여성의 프로테아제 활성(B)을 나타낸 것이다.
도 2는 연구 결과를 요약한 것이다.
본 발명에 이르러, 이러한 요구사항이 단백질 용액에서 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제의 활성을 측정하는 방법으로 충족됨이 밝혀졌는데, 여기서
프로테아제 및/또는 이의 전효소를 포함하는 단백질 용액은, 프로테아제로 향하는 항체가 앞서 연결되어진 고체 상으로 항온처리되고,
고체 상을 세정한 후에 이에 고정된 프로테아제 및/또는 이의 전효소는 이들의 활성을 측정하도록 하는 시약으로 항온처리된다.
놀랍게도, 당해 측정 방법은 활성화 형태의 프로테아제에서만 사용될 수 있다. 앞서의 연구 결과를 통해 프로테아제가 주로 전효소로서 혈장에서 순환하는 것으로 추정되고, 이로써 상술한 고체 상에 결합한 후에 이것이 여전히 먼저 활성화되어 그 생물학적 활성을 나타낼 수 있어야 하는 것으로 기대됨에도 불구하고, 본 발명에 이르러 놀랍게도 이러한 활성은 필요치 않으나 혈장으로부터 고체 상에 결합된 전효소가 활성 효소와 동일한 방식으로 고정된 형태로 생물학적 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이로써, 별도의 활성 단계는 필요하지 않으며 훨씬 더 신속하고 간섭받지 않는 측정이 가능하게 되었다.
그러나, 전효소의 특이적 활성화는 여전히 확실히 첨가되어 결합된 전효소가 완전히 활성화되어지도록 할 수 있다.
적합한 고체 상은 당해 기술 분야의 숙련인들에게 알려진 매트릭스, 예를 들어, 활성화 세파로즈(Sepharose)R또는 프락토겔(Fraktogel)R이다. 미세역가 플레이트는 바람직하게는 프로테아제로 향하는 항체로 도포되는데, 이는 다클론성 또는 단클론성 기원일 수 있다. 또한, F(ab) 또는 F(ab)2와 같은 항체 단편들이 사용될 수 있다. 표지된 제2 항체가 감지용으로 사용된 후에 또한 동정용으로 사용되는 항원 시험과는 달리, 본 발명에 따라 색소원 기질은 첨가되어 프로테아제의 활성을 측정하도록 한다. 특히 바람직한 색소원 기질은 크로모게닉스 에이비(Chromogenix AB)사의 S2288(H-D-이소루실-L-프롤릴-L-아르기닌-pNA×2 HCl)로, 이는 유사 화합물과 같이 기질의 아미도분해로 인한 흡수에서의 현저한 농도 의존적 증가와 시간 의존적 증가를 나타낸다. 놀랍게도, 프로테아제는 심지어는 항체에 결합한 후에도 생물학적 활성과 특성, 즉 FVII과 플라스미노겐 활성체를 활성화할 수 있는 능력을 보유한다. 이로써, 복합 단백질 용액으로부터의 프로테아제의 작용능의 특이적 측정이 가능하다.
색소원 기질 외에, 독일 특허원 제199 03 693.4호에 언급된 다른 기질이 또한 활성 측정, 즉 응혈 인자 VIII/VIIIa 또는 V/Va의 불활성화 및 또한 FVII과 플라스미노겐 활성체의 활성화를 위해 제공된다. 당해 측정에서, 예를 들어, 이렇게 활성화된 인자 VII의 비율은 FVII에 대해 특이적인 색소원 기질의 직접 아미도분해에 의하거나 소위 FVIIa-rTF 시험과 같은 연결 반응으로 측정될 수 있다. 단쇄 플라스미노겐 활성체(scuPA, 단쇄 우로키나제 플라스미노겐 활성체 또는 sctPA, 단쇄 조직 플라스미노겐 활성체)의 활성화는, 예를 들어, S2444(pyroGlu-Gly-Arg-pNA×HCl)의 기질 반응으로 간단하게 관찰될 수 있다. 독일 특허원 제199 03 693.4호에 기재되어 있는 바와 같이, 프로테아제의 활성을 자극하는 물질, 예를 들어, 가용성 칼슘 염 및/또는 헤파린 또는 헤파린에 관련된 물질, 예를 들어, 덱스트란 설페이트가 또한 감지를 위해 첨가될 수 있다.
상술한 방법의 도움으로 용액, 체액 및 세포 또는 조직 추출액에 대한 추가의 연구는 FVII 활성화 프로테아제의 감지 또는 정량화에 대한 적합성을 보여준다. 이 중에서, 재조합 발현에 적합한 세포의 발효에서 또한 수득되는, 당해 프로테아제를 함유하는 용액으로 간주되는 것은, 예를 들어, 프로테아제와 세포 배양 상층액의 제조의 중간체이다. 이 중에서, 프로테아제 또는 전효소의 유전자전이 제조에서 수득되는 용액으로 간주되는 것은, 예를 들어, 우유이다.
당해 공정은 또한 조직 또는 세포의 추출액에서 FVII-활성화 프로테아제의 활성을 측정하는 데 적합하며, 이는 프로테아제 활성의 존재에 대한 영향 또는 당해 단백질의 과다발현 또는 저발현의 경우에서의 잠재적인 병리학상 상태에 대한 영향을 제공한다.
체액, 예를 들어, 혈액과 혈장, 정액성 혈장, 뇨, 중추 신경계액, 기관지 세정액, 양막 유액, 타액 또는 눈물에서의 프로테아제 활성의 감지에 특별한 관심이 모아진다. 본원에서의 활성 시험에 대한 가치있는 보충사항은 독일 특허원 제199 03 693.4호에 언급된 항원 측정 시스템(예를 들어, ELISA)으로, 두 개의 매개변수의 도움으로 보다 이해하기 쉬운 화상을, 예를 들어, 질병의 경우에 수득할 수 있다.
건강한 혈액 공급자에 대한 연구에서, 연구한 혈장의 약 5 내지 10%가, 실시예 1에 보다 상세히 기술된 바와 같이, 기준치(풀 혈장)와 비교하여 현저히 낮은 프로테아제 활성('평균치'의 약 30 내지 50%)을 가짐이 명백하다. 이러한 정보는 이들 공급자들 중 거의 모두가 정상 범위에 속하는 항원 함량을 가진다는 사실로 보충된다. 이는, 예를 들어, 혈장 샘플의 활성에 상응하게 영향을 미칠 수 있으나 항원 함량에는 영향을 미칠 수 없는 (이형접합자) 돌연변이(들)를 가리킬 수 있다. 결과적으로, 이들 공급자들은 특정 질병에 대한 위험한 그룹일 수 있으며, 필요한 경우, 예방 조치를 용이하게 받을 수 있다. 이는 활성 정도가 증가되거나 감소된 사람들에게도 적용된다. 본 발명자들은 건강한 공급자들의 그룹과 비교하여 안정한 협심증과 불안정한 협심증 및 심근 경색을 앓는 환자들의 혈장(실시예 2 참조)에서 (일부 경우에 항원 함량이 정상이거나 약간 증가된) 당해 프로테아제의 활성이 현저하게 증가됨을 발견하였다. 그러나, 프로테아제 활성에서의 증가가 이러한 상태의 원인으로 평가될 수 있는지 또는 이것이 증가된 혈전용해의 의미에서 신체의 역반응에 가능한한 보다 더 반응하는지는 여전히 확실하지 않다.
증가된 프로테아제 활성의 생리학적 관련성과는 별도로, 이러한 매개변수는 초기 감지를 가져올 수 있으며 증상에서의 변화 기준으로 사용될 수 있다. 이는 추가의 심장 관련 합병증의 진단을 포함한다.
이들 증후 외에, 상술한 시험 시스템(또한, 항원 측정과 병행하여)은 또한 악성 질환, 염증, 자가면역 질환, 맥관염, 호흡 장애의 경우에서의 진단과 치료 관찰에 사용될 수 있거나 지혈(응집과 섬유소융해)의 진단에 사용될 수 있고, 또한 패혈증 및 관련 반응, 예를 들어, 흩어진 맥관 응집의 경우에 사용될 수 있다. 추가의 적용 분야에는 기관 결손, 예를 들어, 심장, 호흡기 및 신장 질환의 진단이 포함된다. 간 경화증을 앓는 환자에 있어서, 본 발명자들은 프로테아제의 활성이 현저하게 감소되면 대부분의 경우에 항원 수치가 감소함을 발견하였다.
추가의 연구는 건강한 임산부의 혈장 속의 항원 수치에서의 완만한 증가 외에, 프로테아제 활성의 현저한 증가가 임신 중에 관찰될 수 있으며 세 번째 삼개월 동안 최고치임을 보여준다. 프로테아제에서의 이러한 증가의 부재는 임신 중의 모체와 아이에 대한 위험, 예를 들어, 혈전색전 합병증 등과 미숙아 출산 및 태아의 유산 또는 기형을 포함한 위험과 관련될 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예로 예증된다.
실시예 1
10㎍/ml를 포함하는 용액 150㎕를 각각의 구멍에 피펫팅시켜 미세역가 플레이트(96개의 웰)를 FVII 활성체에 대한 단클론성 항체로 도포시킨다. 실온에서 16시간 동안 항온처리시킨 후, 플레이트를 수 회 세척한다. 농도가 증가한 정제된 프로테아제 또는 표준 사람 혈장(SHPL)의 각종 희석액 100㎕를 각각의 경우에 구멍에 피펫팅시킨다. 37℃에서 항온처리시킨 후, 수 회 세척하여 용액을 제거하고 활성을 측정한다.
CaCl230mM와 헤파린 100IU/ml를 함유하는 완충액 50㎕와 마찬가지로, 프로우로키나제 용액 50㎕[10㎍/ml, 미국 아메리칸 다이아그노스티카(American Diagnostica)]를 각각의 구멍에 피펫팅시킨다. 2분 후, 추가의 완충액 100㎕와 기질 S2444(3mM) 25㎕를 가한다. 1분당 405nm에서의 흡수의 증가를 측정한다.
정제된 프로테아제(㎍/ml) △mOD/분 SHPL(희석) △mOD/분
0 0.4 완충액 0.4
0.1 7 1:200 0.4
0.2 12 1:100 0.9
0.4 18 1:50 7.5
0.6 22 1:33.3 8.4
0.8 24 1:25 15.2
1.0 27 1:20 24.8
2.0 34 1:10 31.2
실시예 2
미세역가 플레이트의 도포와 샘플 용액을 사용한 항온처리를 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행한다. 프로우로키나제의 활성화 대신에, 인자 VII의 활성화를 측정한다. 최종적으로, 각각의 경우에 CaCl230mM와 헤파린 100IU/ml을 포함하는 완충액 50㎕를 실온에서 2분 동안 플레이트의 구멍에 가한다. 추가의 완충액 100㎕와 스펙트로자임(Spectrozym)RVIIa(3mM, 미국 아메리칸 다이아그노스티카) 25㎕를 가한 후, △mOD/분을 측정한다.
정제된 프로테아제(㎍/ml) △mOD/분 SHPL(희석) △mOD/분
0 0.3 완충액 0.3
0.2 1.8 1:100 0.3
0.4 2.8 1:50 0.3
0.6 3.0 1:33.3 0.8
0.8 3.6 1:25 3.2
1.0 4.7 1:20 7.2
1.5 7.1 1:13.3 8.4
2.0 7.9 1:10 11.5
이들 희석 시리즈의 도움으로, 개별 혈장을 비교하고 프로테아제의 작용능을 측정할 수 있다. 수 백개의 개별 혈장의 풀(pool)을 나타내는 표준 사람 혈장과의 비교로, 표준으로부터 현저한 편차가 감지될 수 있다. 이로써 발견한 활성은, 예를 들어, ELISA로 측정될 수 있는 항원 함량에 대한 비로 이상적으로 설정되어야 한다.
프로테아제의 양이 공지된 경우, 프로테아제의 특이적 활성과 단백질 용액에 함유된 이의 전효소를 측정할 수 있다.
실시예 3
건강한 공급자의 190개의 혈장에서의 프로테아제 활성의 측정
140명이 남성이고 50명이 여성인 건강한 사람의 190개의 시트레이트 혈장을 상술한 활성 시험의 도움으로 연구한다. 활성이 프로테아제 항원 수치에서의 상응하는 변화를 수반하는 모든 연구된 혈장의 평균치와 잠재적으로 상이한 지 측정하기 위해, ELISA를 독일 특허원 제199 03 693.4호에 기재되어 있는 바와 같이 사용한다. 항원으로서의 프로테아제의 감지를 위한 이러한 ELISA는 당해 프로테아제에 대한 단클론성 또는 다클론성의 특이적 항체의 도움으로 가능하다.
도 1은 연구한 건강한 남성의 프로테아제 활성(A)과 여성의 프로테아제 활성(B)을 나타낸 것이다. 남성과 여성 둘 다에서 5 내지 10%가 평균치와 비교하여 현저하게 감소된 활성을 보임이 명백하다.
프로테아제 활성(y축)과 이에 속하는 상응하는 사람의 항원 수치(x축)가 도면에서 보여진다. 항원과 활성 정도의 미정의 '정상 범위'가 각각의 경우에 매개변수의 상한선과 하한선으로서의 수평선과 수직선으로 보여진다. 따라서, 이로부터 수득한 직사각형(각각의 경우, 도면의 중심)은 건강한 공급자의 '정상 범위'를 나타낸다. 활성이 감소한 샘플의 대부분이 항원 수치의 상응하는 감소를 동반하지 않음이 본원에서 또한 특히 명백하다. 이는 한 번의 이형 접합자 돌연변이(또는 수 회), 즉, 예를 들어, 프로테아제 분자의 약 50%가 1회 이상의 돌연변이로 개질되어 생물학적 기질과의 반응이 더 이상 확실할 수 없음을 가리킬 수 있다. 프로테아제의 섬유소융해 중요성의 경우, 소수의 연구된 샘플에서 감소된 항원 함량과 매우 잘 함께 하는 감소된 프로테아제 활성의 수치가 상당히 흥미있는 것으로 평가됨에도 불구하고, 이는 여전히 '건강한' 이러한 현 집단의 혈전증(또는, 다른 질환 등)의 위험과 관련될 수 있고, 명백하게 프로테아제의 혈장 유용성의 조절불량이 존재하므로 이는 상술한 바와 같은 상당한 위험과 관련될 수 있다.
따라서, 또한 항원 측정과 관련하여 프로테아제 활성의 감지는 초기 인식과 예방/치료 조절을 위한 매개변수로서 보여질 수 있다.
실시예 4
임산부의 혈장에서의 프로테아제 활성의 측정
임산부의 시트레이트 혈장을 실시예 3에 기재된 바와 같이 시험한다. 샘플을 임신 중에 수 회 수득한 다음, 연구한다.
두 번의 문제가 되지 않은 임신의 경과를 표 3에 나타내었다. 임신 기간과 함께 프로테아제 활성에서의 명백한 증가가 감지될 수 있으며, 이는 프로테아제의 항원 함량이 완만한 증가에 대해 전혀 증가하지 않음을 나타냄과 비교된다. 이러한 증가된 활성의 부재는 모체와 태아에 대한 문제점과 관련될 수 있다.
한편, 건강한 (임신하지 않은) 여성은 상응하는 관찰 기간(도시되지 않음) 동안 프로테아제 활성의 연속 경로(시험 변형의 내용에서, 증가되거나 감소되지 않음)를 보여준다.
임신기 중 3개월 임산부 항원(%) 임산부 항원(%)
1 2 1 2
I 103 105 110 115
II 118 123 158 176
III 126 143 215 280
실시예 5
심근 경색 혈장에서의 프로테아제 활성의 측정
급성 심근 경색을 앓는 54명의 환자로부터의 혈장을 응급상황에 대한 대처(집중 치료 전)로 수득하고 지속적인 분석을 위해 사용한다. 후에, 혈장 잔사(해동시키지 않은 분취량)를 프로테아제 활성(및 항원 함량)의 정량화를 위해 사용한다.
도 2는 연구 결과를 요약한 것이다. 건강한 공급자들의 그룹(B)과 비교하여, 현저하게 높은 프로테아제 활성(또한, 항원 함량)이 급성 심근 경색을 앓는 환자(A)의 혈장에서 측정될 수 있다.
따라서, 이들 매개변수는 경색의 초기 감지, 즉 심지어는 안정한 협심증과 불안정한 협심증의 경우에도 사용될 수 있다. 이러한 관상동맥 심장 질환을 앓는 환자에 있어서, 본 발명자들은 또한 평균치에서 현저하게 증가한 활성을 발견하였다. 측정치의 높이는 질환의 중증도의 평가를 가능하게 할 수 있거나 경색과 협심증의 예방 및 치료 중인 환자의 상태에 대한 가치있는 증후를 제공할 수 있다. 더욱이, 이들 매개변수는 심혈관 계통과 관련한 다른 합병증의 평가에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 인자 VII-활성화 프로테아제의 하나 이상의 생물학적 활성을 가능한한 간단하고 특이적인 방식으로 측정할 수 있도록 하여 별도의 활성 단계가 필요하지 않으며 훨씬 더 신속하고 간섭받지 않는 측정을 가능하게 한다.

Claims (9)

  1. 프로테아제 및/또는 이의 전효소를 포함하는 단백질 용액이, 프로테아제로 향하는 항체가 앞서 연결되어진 고체 상으로 항온처리되고,
    고체 상을 세정한 후에 이에 고정된 프로테아제 및/또는 이의 전효소가 이들의 활성을 측정하도록 하는 시약으로 항온처리됨을 특징으로 하는, 단백질 용액으로부터 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제의 활성을 측정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 프로테아제의 활성이 색소원 기질에 대한 작용 중에 발생하는 흡광도의 광도 측정으로 측정되는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 프로테아제의 활성이
    응혈 인자 VIII/VIIIa 또는 V/Va를 불활성화하는 작용,
    총체적 응집 시험에서의 응혈 횟수를 감소시키는 작용,
    플라스미노겐 활성체를 활성화하는 작용 또는
    FVII을 활성화하는 작용으로 측정되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 프로테아제로 향하는 항체가 다클론성 또는 단클론성 항체 또는 F(ab) 또는 F(ab)2항체 단편인 방법.
  5. 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제를 측정하기 위한 키트(kit).
  6. 측정한 매개변수가 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제인, 경색 또는 안정하거나 불안정한 협심증을 초기에 감지하기 위한 방법.
  7. 측정한 매개변수가 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제인, 경색의 중증 경로 또는 정도 또는 협심증의 경우에서의 예방 및/또는 치료의 결과를 진단하기 위한 방법.
  8. 측정한 매개변수가 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제인, 임신을 관찰하기 위한 방법.
  9. 측정한 매개변수가 응혈 인자 VII을 활성화하는 프로테아제인, 혈전증의 위험을 초기에 감지하기 위한 방법.
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