ES2295475T3 - Mutantes marburg i de la proteasa activante del factor vii (fsap) como factor de riesgo de trombosis arterial. - Google Patents

Abstract

Procedimientos para reconocer un elevado riesgo para el origen y la progresión de trombosis arteriales y enfermedades ateroscleróticas y sus enfermedades a ellas unidas tales como, por ejemplo, angina de pecho, infarto cardiaco y ataque de apoplejía, caracterizados porque en muestras de líquidos corporales de un donante, especialmente en el plasma sanguíneo, o bien f) se detecta la presencia heterozigótica u homozigótica de un mutante de la proenzima de FSAP con un intercambio de bases G/A en la posición nucleotídica 1601 por análisis del ADN genómico del donante o de un mARN derivado de aquel y/o g) se detecta la presencia de un mutante de FSAP a nivel proteico, el cual ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, o en el cual al menos se ha perjudicado esta capacidad y/o h) se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra un mutante de FSAP, el cual ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, o en el cual al menos se ha perjudicado esta capacidad y/o i) se detecta un reducido potencial de FSAP para la activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena y/o j) se detecta una reducida concentración de antígeno de FSAP.

Description

Mutantes Marburg I de la proteasa activante del factor VII (FSAP) como factor de riesgo de trombosis arterial.

La invención se refiere a procedimientos para la detección de mutantes de la proteasa (FSAP) activante del factor VII, así como de reducidos niveles de FSAP en el plasma sanguíneo como indicadores de un elevado riesgo para el desarrollo y la progresión de aterosclerosis y de las manifestaciones consecutivas que de ello resultan.

La aterosclerosis es una modificación patológica de las arterias que entre otras cosas conlleva a su endurecimiento, engrosamiento y a su pérdida de elasticidad y que se puede considerar como la causa principal del infarto cardíaco y cerebral, así como de otras enfermedades. Para el desencadenamiento y potenciación de la aterosclerosis se responsabilizan numerosos factores exógenos y endógenos, por ejemplo hipertensión, diabetes, toxinas, nicotina, excesivo consumo de alcohol e inflamaciones. Estas influencias se denominan factores de riesgo. Sin embargo, por medio del creciente número de estudios y de mejores métodos analíticos se han encontrado en los últimos años todavía más factores de riesgo para la aterosclerosis.

Se examinan factores de riesgo en estudios epidemiológicos tales como el estudio Bruneck que se ha dado a conocer en círculos de especialistas en la materia. En el año 1990 se incluyeron en este estudio 1.000 habitantes de Bruneck/Italia. Exámenes por ultrasonidos de la arteria carótida, así como análisis de numerosos parámetros de la sangre y el interrogatorio de las personas de ensayo hizo posible el establecimiento de una amplia base de datos para el posterior seguimiento de la aparición y progresión de la aterosclerosis. En espacios de 5 años se continuaron y analizaron estos exámenes en las mismas personas de ensayo. A partir de esto se derivó un modelo para el origen de la aterosclerosis y de su progresión. Como un primer resultado de este estudio se comprobó una relación entre el origen de aterosclerosis con los factores de riesgo tradicionales conocidos tales como la hiperlipidemia y demás factores anteriormente citados. Sin embargo, si la placa aterosclerótica alcanza ya una extensión que cierre el vaso sanguíneo hasta un 40% aparecen en primer término otros factores de riesgo que pueden influir de modo significativo sobre el siguiente transcurso de la aterosclerosis y de la oclusión de vasos sanguíneos. A estos factores pertenecen sobre todo las proteínas plasmáticas que actúan sobre la hemostasis. A ello contribuye un reducido potencial inhibidor de la coagulación, por ejemplo reducidos niveles de antitrombina o de proteína C o también la denominada resistencia a la PCA (proteína C activada). Por ello, la disminución del potencial fibrinolítico puede tener una influencia decisiva sobre la progresión de la oclusión de los vasos, como se observa, por ejemplo, en el caso de elevados niveles de la lipoproteína (a).

Hasta el momento, se han identificado sobre todo factores de riesgo de enfermedades oclusivas venosas, tales como la resistencia a la PCA (factor V de Leiden "FV - Leiden"), que tiene una denominada "Odds-Ratio" (riesgo relativo) en heterozigotos para esta mutación, es decir una medida para el incremento del riesgo, de "8", comparado con las personas de ensayo sin esta resistencia a la PCA. Por el contrario, en el sector arterial este factor de riesgo tiene un riesgo relativo de tan sólo "2".

Por eso, las muestras de plasma y ADN existentes de las personas de ensayo del estudio Bruneck, dispuestas para su aplazamiento, se examinaron de nuevo en cuanto a la presencia de otros factores de riesgo de aterosclerosis dirigiendo especialmente el punto de mira a los mutantes de las proteasas activantes del factor de coagulación VII (= FSAP) descubiertos recientemente, los cuales en los sucesivo se denominarán como mutación Marburg I de FSAP.

A partir de la solicitud de patente alemana 199 03 693.4 se conoce una proteasa aislable del plasma sanguíneo, la cual puede activar el factor VII de la coagulación sanguínea. Esta proteasa se denomina también proteasa activante del factor siete I (FSAP) (o PHBP o PHBSP o, respectivamente, (serina) proteasa ligante de ácido hialurónico del plasma. Por eso, FSAP tiene propiedades que fomentan la coagulación. FSAP tiene especialmente la propiedad de activar los activadores de plasminógenos de una sola cadena tales como la prouroquinasa o el activador de tejidos de plasminógenos de una sola cadena (sct-PA). Solos o en combinación con activadores de plasminógenos, FSAP se puede aplicar también de forma correspondiente para apoyar la fibrinolisis, por ejemplo en el caso de complicaciones trombóticas.

Los sistemas de ensayos disponibles entre tanto y descritos en las solicitudes de patente alemanas 199 03 693.4 y 199 26 531.3 hacen posible no sólo la detección de FSAP, sino también la cuantificación del contenido de antígeno de FSAP, así como la determinación de su actividad en el plasma. En este caso, la detección del antígeno se lleva a cabo preferentemente mediante un ensayo ELISA. Por el contrario, la actividad se puede medir en principio por activación de prouroquinasa a uroquinasa y por la reacción de un sustrato cromogénico con subsiguiente medición de la diferencia de extinción.

A partir de la solicitud de patente alemana 100 52 319.6 se sabe que por aplicación de estos sistemas de ensayo en el caso de estudios en donantes de sangre sanos se pudieron identificar 5 a 10% de las personas de ensayo que, en un contenido medio de antígeno de FSAP, presentaban un potencial de activación de prouroquinasa, claramente disminuido. Puesto que esta propiedad atañe también a las proteasas individuales aisladas, se analizaron los respectivos ADN de células sanguíneas para su ulterior estudio. De manera sorprendente se pudo identificar en este caso una mutación (single nucleotide polymorphism; SNP; G/A en posición 1601). Esta modificación conduce en la proteína a un intercambio de aminoácidos Gly/Glu en la posición 511 de la proteína madura o en la posición del aminoácido 534 de la proenzima FSAP incluido el péptido de señal. Este intercambio de aminoácidos tiene como consecuencia que FSAP pierde la capacidad de activación de la prouroquinasa a uroquinasa o sufre al menos una considerable merma de actividad. La mutación anteriormente citada, denominada Marburg I de FSAP, se encontró hasta el momento en todas las muestras que, en el caso de un contenido medio de antígeno, presentaban una disminución de actividad en la formación de uroquinasa a partir de prouroquinasa.

Con ayuda de un ensayo PCR establecido para esta mutación se examinaron los ADN de las personas de ensayo incluidas en el estudio Bruneck. En este caso, en 4,5% de todas las muestras analizadas se encontró la mutación Marburg I de FSAP. Estos hallazgos se evaluaron después con los datos individuales recogidos en el marco del estudio para la evaluación del origen y progresión de la aterosclerosis. Se encontró en este caso que la mutación Marburg I de FSAP representa un factor de riesgo para la evolución y progresión de la trombosis arterial y de la aterosclerosis.

Por ello, es objeto de la invención un factor de riesgo de aterosclerosis que se compone de un mutante de la proteasa activante del factor VII de coagulación sanguínea (=FSAP). Evidentemente, un factor de riesgo particularmente importante es en este caso el mutante, en el cual la proenzima de FSAP, incluido el péptido de señal en la posición de aminoácido 534, presenta un intercambio Gly/Glu.

La correspondiente secuencia de ADN de la proenzima de FSAP incluido el péptido de señal muestra en este caso en la posición nucleotídica 1601 un intercambio de bases G/A.

De manera sorprendente, esta mutación guarda relación con un riesgo incrementado de desarrollar particularmente trombosis arteriales. En este caso se calculó un riesgo relativo (Odds-Ratio) de "6,6", es decir un riesgo que desde el punto de vista arterial es comparable con el riesgo de la resistencia de PCA en el sector venoso. Particularmente sorprendente es en este caso que esta mutación representa un factor de riesgo independiente, es decir que después de descontar todos los factores de riesgo conocidos hasta el momento ejerce una clara contribución, propia, para el origen y progresión de la ateriosclerosis. Este conocimiento y particularmente la determinación de la mutación Marburg I de FSAP pueden mejorar las oportunidades de reconocer y tratar enfermedades cardiacas y enfermedades vasculares condicionadas por aterosclerosis. Así, como consecuencia de la aterosclerosis aparece, por ejemplo, angina de pecho, frecuentemente seguida de infartos cardíacos. Dependiendo de los vasos que estén atacados, el órgano alimentado por éstos se ve afectado conjuntamente. En el caso de la arteria carótida, esto tiene como consecuencia una infraalimentación del cerebro con nutrientes y oxígeno y en el peor de los casos puede llevar a un ataque cerebral. Pero también otros órganos afectados por aterosclerosis que sufren el riesgo de una enfermedad vascular oclusiva y de las consecuencias que de ello resultan, están afectados por el mutante Marburg I de FSAP. A partir de ello pueden surgir problemas en enfermedades renales, pulmonares o otras enfermedades.

Métodos para la determinación del mutante Marbug I de FSAP se describen ya en las solicitudes de patente alemanas anteriormente citadas, sobre todo en la solicitud de patente alemana 100 52 319.6. Estos métodos incluyen la medición de la actividad de las proteasas, preferentemente en combinación con un ensayo del antígeno de FSAP, así como la determinación de la secuencia de nucleótidos en la zona mutada mediante adecuados sistemas de ensayo.

Por consiguiente, el factor de riesgo de la aterosclerosis conforme a la invención se puede describir como un mutante del FSAP que ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena o en los que esta capacidad al menos está perjudicada. El factor de riesgo se caracteriza especialmente por un mutante que ha perdido la capacidad de activación de la prouroquinasa o en el cual ha disminuido esta capacidad. Por consiguiente, una predisposición condicionada genéticamente para el origen de aterosclerosis se puede reconocer por la detección del mutante de FSAP anteriormente citado. También especialmente la predisposición para el origen de particularmente trombosis arteriales, así como la predisposición para el origen de enfermedades ateroscleróticas o trombóticas y sus consecuencias, tales como enfermedades oclusivas arteriales y venosas se denuncian a través de la detección de los citados mutantes de FSAP. La predisposición para el origen de las restricciones de funciones de órganos condicionadas por aterosclerosis o trombosis es frecuentemente la causa de angina de pecho, infarto cardiaco o ataques cerebrales. En todos los casos es típico que el potencial para la activación de activadores de plasminógenos de una sola cadena, especialmente el potencial para la activación de prouroquinasa, se encuentre reducido. La reducción de este potencial de activación se puede determinar en sangre, pero sobre todo en suero.

En vista de la gran importancia de los mutantes de FSAP como factores de riesgo de aterotrombosis, adquieren gran importancia los procedimientos diagnósticos para su detección. Se basan en que en los líquidos corporales del donante, especialmente en el plasma sanguíneo, se determina una reducida concentración de antígeno de FSAP y/o una reducida actividad de FSAP. En este caso, en los líquidos corporales citados se determina el potencial de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, especialmente el potencial de activación de la prouroquinasa.

Un procedimiento especialmente fiable consiste en detectar mutantes hetero- u homozigóticos de la proenzima de FSAP con un intercambio de bases G/A en la posición del nucleótido 1601 por análisis del ADN genómico del donante o en un mARN derivado de aquel.

Pero también es igualmente posible detectar a nivel de proteínas los citados mutantes de FSAP. Para ello, es adecuado sobre todo la aplicación de anticuerpos monoclonales o policlonales específicos. Finalmente, se dispone también de métodos de ensayo histológicos en tejidos o en soluciones extraídas de tejidos.

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Un procedimiento diagnóstico fiable consiste en incubar una muestra que podría contener el o los mutantes de FSAP, con un primer anticuerpo fijado sobre un soporte fijo, y luego lavar, añadir después un segundo anticuerpo marcado, o un anticuerpo marcado dirigido contra el tipo salvaje, lavar de nuevo, y medir la señal producida por el segundo anticuerpo.

Otro método consiste en que una muestra, que podría contener el o los mutantes de FSAP, se incuba con un primer anticuerpo contra el tipo salvaje fijado sobre un soporte sólido, y después se lava, después se añade un segundo anticuerpo marcado, se lava de nuevo y se mide la señal provocada por el segundo anticuerpo.

Además, se encuentra disponible un procedimiento según el cual la muestra a examinar en cuanto a la presencia del o de los mutantes de FSAP se fija sobre un soporte y se los detecta con un anticuerpo marcado, solo o mezclado con un anticuerpo no marcado, y detectando a continuación el anticuerpo marcado.

Finalmente, también se puede poner en contacto un anticuerpo fijado sobre un soporte con un muestra a examinar en cuanto a la presencia del o de los mutantes de FSAP, en presencia de un mutante marcado y medir la señal provocada por la marcación.

Se ha acreditado también un procedimiento diagnóstico, en el cual se mide la actividad de FSAP incubando la muestra que contiene la proteasa sobre un soporte fijo, sobre el cual con anterioridad se acopló un anticuerpo dirigido contra la proteasa y luego, después de lavar el soporte libre, la proteasa fijada a él se incuba con reactivos que permiten la determinación de su actividad.

Además de esto, se dispone de procedimientos diagnósticos, en los cuales se utilizan anticuerpos para la detección de los mutantes sobre "westernblots" para la inmunohistología o para la citometría de flujo de fluorescencia activada (FACS).

El procedimiento diagnóstico conforme a la invención se lleva a cabo preferentemente con la técnica ELISA. Para ello, FSAP y/o el mutante de FSAP se une a una matriz, por ejemplo a una placa para microtitulación. Para la presentación óptima del FSAP y/o del mutante de FSAP se puede efectuar antes un recubrimiento de la placa con anticuerpos monoclonales o policlonales o con sus F(ab')_{2} o Fab', para ser cargada después con FSAP y/o el mutante de FSAP. Puesto que FSAP y el mutante se unen muy bien a sulfato de dextrano, heparina y sustancias análogas, también es posible el recubrimiento previo con estos agentes para la unión de FSAP. Después de lavar el soporte o la placa para microtitulación, ésta se bloquea eventualmente con los agentes conocidos para ello tales como detergente o albúmina, se lava y, a continuación, se incuba con la solución a ensayar. En el caso de las soluciones que contienen anticuerpos de FSAP se puede tratar de suero sanguíneo, plasma y otros líquidos corporales, así como también de líquidos sinoviales, líquido defalorraquídeo, saliva, lágrimas, plasma seminal o también lisados
celulares.

Después de la incubación y del lavado del soporte se utiliza un reactivo de detección adecuado. Las sustancias de ensayo necesarias para la detección de las diferentes clases de anticuerpos tales como IgG, IgM, IgA, IgE y las correspondientes subclases se pueden obtener comercialmente como reactivos marcados. La detección y cuantificación del título de los anticuerpos puede tener lugar, después, por una determinación fotométrica, en la cual se mide la extinción provocada por la separación de un sustrato cromogénico por una enzima acoplada al anticuerpo anti-humano. Pero también es posible medir la fluorescencia irradiada por el grupo fluorescente unido al anticuerpo utilizado para la detección. Finalmente, también es posible llevar a cabo la detección por medio de una medición radiométrica, cuando la sustancia utilizada para la detección está marcada con un grupo radioactivo. Los procedimientos diagnósticos en los cuales los anticuerpos humanos ligados se incuban con una inmunoglobulina anti-humana marcada o con sus fragmentos o su proteína A o proteína G marcadas, y en los cuales se determina la señal emitida por la sustancia marcada, ligada, se han acreditado ya muchas veces como bien adecuados.

Igualmente es posible detectar los anticuerpos por una medición fotométrica de la extinción provocada por el anticuerpo anti-humano acoplado con una enzima, o de sus fragmentos o de su proteína A o proteína G, por separación de un sustrato cromogénico o fluorogénico adecuado. También son adecuados los procedimientos diagnósticos, en los cuales se detectan los anticuerpos por medición de la fluorescencia provocada por la sustancia ligada, marcada con grupos fluorescentes.

Por lo tanto, especialmente son objeto de la presente invención los procedimientos para reconocer un elevado riesgo para el origen y la progresión de trombosis arteriales y enfermedades ateroscleróticas y sus enfermedades a ellas unidas tales como, por ejemplo, angina de pecho, infarto cardiaco y ataque de apoplejía, caracterizados porque en muestras de líquidos corporales de un donante, especialmente en el plasma sanguíneo, o bien

a)

se detecta la presencia hetero- u homo-zigótica de un mutante de la proenzima de FSAP con un intercambio de bases G/A en la posición nucleotídica 1601 por análisis del ADN genómico del donante o de un mARN derivado de aquel

y/o

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b)

se detecta la presencia de un mutante de FSAP a nivel proteico, el cual ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, o en el cual al menos se ha perjudicado esta capacidad

y/o

c)

se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra un mutante de FSAP, el cual ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, o en el cual al menos se ha perjudicado esta capacidad

y/o

d)

se detecta un reducido potencial de FSAP para la activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena

y/o

e)

se detecta una reducida concentración de antígeno de FSAP.

Estudio Bruneck

Personas de ensayo del estudio: en el caso del estudio Bruneck se trata de un examen prospectivo de población que apunta a la aclaración de la epidemiología y etiología de la aterosclerosis carotídea (1-6). La población a examinar se reclutó en 1990 como muestra al azar clasificada según sexo y edad entre todos los habitantes de Bruneck en edad de 40 a 79 años (de las décadas de edad 5 a 8, en cada caso 125 mujeres y 125 hombres, n=1000). En total participaron 93,6%, de los que 919 superaron la recogida de datos. Durante el periodo de revisión entre el verano de 1990 y 1995 (quinquenio_{1} - Q_{1}) murió un subgrupo de 62 individuos, mientras que una persona de ensayo se trasladó de lugar. El seguimiento de la población restante era completo en el 96,5% (n=826) (1-3). Antes de ser aceptados en el estudio todos los participantes dieron su aprobación, después de haber sido informados sobre el estudio. Como parte de la revisión en 1995 se tomaron muestras de sangre para la obtención de ADN. En 16 casos no se obtuvieron productos de PCR satisfactorios, es decir que para el análisis principal quedaron 810 hombres y mujeres. De estas personas de ensayo, entre el verano de 1995 y 2000 (quinquenio_{2} - Q_{2}) murieron 94. En el 2000 se examinaron de nuevo por ultrasonidos un total de 675 personas de ensayo (cuota de seguimiento de los supervivientes 94,3%) (6).

Anamnesis clínica y exploración: al protocolo del estudio pertenecía una exploración clínica con puntos de peso cardiológicos y neurológicos y pliegos de preguntas estandarizados en relación a riesgos presentes o pasados por potenciales factores de riesgo vasculares (3-5). En el caso de fumadores o antiguos fumadores se anotó el número de cigarrillos fumados por término medio al día y las cajetillas por año. El consumo de alcohol se cuantificó como gramos por día y se distribuyó en cuatro categorías (3). La presión sanguínea sistólica y diastólica eran los valores medios de tres medidas, que se midieron respectivamente después de \geq 10 minutos de reposo. La hipertensión sanguínea se definió como una presión sanguínea de \geq 160/95 o, respectivamente, por la ingesta de agentes hipodepresores (definición WHO). En todas las personas de ensayo a excepción de los diabéticos previamente conocidos se llevó a cabo un ensayo oral, estandarizado, de tolerancia a la glucosa. La diabetes mellitus se registró como existente en aquellas personas de ensayo que presentaban en ayunas niveles de azúcar en sangre \geq 140 mg/dl (7,8 mmol/l) y/o un valor de 2 horas (ensayo de tolerancia a la glucosa) \geq 200 mg/dl (11,0 mmol/l).

Métodos de laboratorio: después de que las personas de ensayo hayan estado al menos 12 horas sin tomar alimento alguno y sin haber fumado, se extrajo sangre de la vena antecubital (3-6). El colesterol total y el colesterol con lipoproteínas de alta densidad se determinaron enzimáticamente (método CHOD-PAP, Merck, Darmstadt, Alemania) y las concentraciones de lipoproteína (a) se midieron con un ELISA (Immuno, Viena, Austria). El colesterol con lipoproteínas de baja densidad se calculó a través de la fórmula de Friedewald. El fibrinógeno se midió conforme al método de Clauss y la antitrombina III, con un ensayo cromogénico. La mutación Leiden del factor V se detectó por amplificación inespecífica de PCR (3).

Las concentraciones de antígenos de FSAP y el efecto activante de scuPA se determinaron tal como se describió recientemente (7, 8). En pocas palabras, se utilizó un ELISA con anticuerpos monoclonales (mAb) contra FSAP para la cuantificación de antígenos. El ensayo de actividad comprendía una inmunoadsorción en placas para microtitulación recubiertas con anticuerpos, una etapa de lavado y la subsiguiente activación de prouroquinasa por FSAP, la cual se cuantificó por seguimiento fotométrico de la amidolisis de un sustrato cromogénico para uroquinasa. Como estándar arbitrario para ambos ensayos servía un volumen almacenado de plasma (plasmapool) de más de 200 donantes de sangre sanos. Una unidad de equivalencia de plasma (PÄE) se definió como la actividad antigénica de FSAP contenida en un mililitro del plasmapool, la cual por termino medio corresponde a 12 \mug/ml (8).

La extracción de ADN y el tipificado del genoma (genotiping) de FSAP: ADN de alto valor cualitativo se obtuvo con un equipo (kit) para el aislamiento de ADN GenomicPrep Blood (Amersham Pharmacia Biotech) a partir de sangre entera congelada. Diez \mul de ADN extraído se amplificaron en 100 \mul 1x tampón estándar de reacción de PCR con 50 pmol del correspondiente iniciador (primer) de sentido y antisentido específico de exones, MgCl_{2} 1,5 mM, dNTP 0,2 mM y 2,5 unidades de Taq-ADN-polimerasa (Perkin Eimer, Langen, Alemania); a una primera desnaturalización a 94ºC durante 2 minutos seguían 35 termociclos durante respectivamente 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC y 40 segundos a 72ºC, a los que siguió una etapa de elongación final de 5 minutos a 72ºC. Los pares de iniciadores se describieron hace poco de forma detallada.

Protocolo de escaneado y definición de los puntos finales por ultrasonidos: en el caso del examen por ultrasonidos se escanearon la arteria carótida interna (secciones bulbosas y distales) y la arteria carótida común (secciones próximas y distales) de los dos lados con una cabezal de ultrasonidos de 10 MHz y un "Doppler" de 5 MHz (1,2). Las lesiones ateroscleróticas se definieron mediante dos criterios de ultrasonidos: 1) superficie de la pared (sobresalir en el lumen) y 2) estructura de la pared (ecogeneidad). En 16 secciones del vaso se determinó en cada caso el diámetro máximo axial de la placa (coeficiente de intraobservación de la variación según la sección del vaso 10% o, respectivamente, 15%). El grosor de la capa intima-media se midió en las paredes alejadas de la arteria carótida común (coeficiente de intraobservación de la variación 7,9% (n=100)) (2). Los escaneos se llevaron a cabo en los años 1990, 1995 y 2000 por el mismo experto en ultrasonidos, no conociendo el experto en ultrasonidos los resultados clínicos ni los valores de laboratorio de las personas de ensayo.

El origen de la aterosclerosis se caracterizaba por la aparición de nuevas placas en sectores anteriormente normales. En la definición de aterosclerosis en vías de formación se introdujeron valores umbral de 0,7 mm (a. carótida común) y, respectivamente, 1,0 mm (a. carótida interna) como requisitos mínimos en lo referente al diámetro de placa, puesto que lesiones más pequeñas se diferenciaban difícilmente de engrosamientos focales/difusos de la pared (1). Una progresión de las lesiones no estenóticas se ha definido como el aumento relativo del diámetro de la placa en más de dos veces el error de medida del método (1). En el presente análisis los dos procesos se recopilaron en una sola categoría de resultados, la cual, para su representación más sencilla y en base al hecho de que en estos procesos la mayoría de los factores de riesgo descritos se presentaban conjuntamente, se designó como "aterogénesis temprana". Una "aterogénesis avanzada" fue aceptada siempre que se cumpliera el criterio de progresión y el lumen se hubiera estrechado en > 40%. Tal como se describe en otro lugar (1-5), el corte a 40% parecía corresponder a un valor umbral biológico en nuestra población, en el cual aparecían claras variaciones en la cinética del crecimiento de las placas (crecimiento continuo, lento y difuso en contra de expansiones eventuales y focales de lesiones prominentes), en los perfiles de riesgo (factores de riesgo corrientes contra factores de riesgo de procoagulación) y en el proceso de renovación en los vasos (compensantes o supercompensantes contra insuficientes o incluso ausentes), que eran indicativos de un cambio de los mecanismos patógenos de base de la aterogénesis común a atero-
trombosis.

La reproducibilidad de las categorías de ultrasonidos era "casi perfecta" (coeficientes kappa > 0,8, obtenidos a partir de dos mediciones independientes que fueron llevadas a cabo por el mismo experto de ultrasonidos en un ensayo al azar de reproducibilidad de n = 100 (1-3)).

Análisis estadístico: se examinaron las posibles asociaciones entre mutaciones de FSAP y los diferentes estados de aterosclerosis mediante análisis de regresión logísticos. Un modelo de base se equiparó únicamente en cuanto a edad y sexo. Las ecuaciones con múltiples variables se ajustaron por un proceso de selección que progresa paso a paso, tal como ya se ha descrito (valores p para admisión y exclusión 0,10 y, respectivamente 0,15) (3-10). Adicionalmente se incluyeron en estos modelos la edad y el sexo, para tener en cuenta la estructura de edad y sexo de la muestra elegida al azar de la población. El análisis principal se concentró en el espacio de tiempo entre 1990 y 1995 (Q_{1}). El análisis en el caso de una aterogénesis avanzada se limitó a personas de ensayo que al comienzo del estudio padecían ya de aterosclerosis (n=326).

Los riesgos de aterogénesis estandarizados en cuanto a la regresión se calcularon para una serie de factores de riesgo. Se aplicó el método randomizado del procedimiento de igualación de la regresión, puesto que en este caso no se parte de la suposición de enfermedades extrañas (11).

Resultados

Del conjunto del estudio Bruneck (n=810) 36 personas de ensayo eran heterozigóticos para el mutante Marburg I de FSAP (17 hombres y 20 mujeres) y una persona era homozigótico, lo que corresponde a una cuota total de portadores [95% VI (intervalo de fiabilidad)] en la población general de 4,4% [3,0% a 5,8%]. Una co-segregación del mutante Marburg II (E370Q) de FSAP se observó en 16 de los 37 individuos (43 por cien, 8 hombres y 8 mujeres), mientras que en las restantes personas de ensayo (57 por cien, 9 hombres y 12 mujeres) el mutante Marburg I apareció de forma aislada.

Se examinaron muestras de plasma de una población parcial (n=82) en cuanto a las concentraciones de antígeno de FSAP y a los correspondientes efectos activantes de prouroquinasa. En 76 personas de ensayo con FSAP tipo salvaje las concentraciones medias (\pm2xSD) de antígeno, concentraciones de actividad y relaciones actividad/antígeno eran 0,991 (0,552 a 1,430) PÄE/ml, 1,036 (0,614 a 1,458) PÄE/ml y, respectivamente, 1,07 (0,63 a 1,51). En con-
traposición con esto, los seis portadores del mutante Marburg I de este subgrupo presentaban todos una capacidad para la activación in vitro de prouroquinasa, claramente reducida (<0,150 a 0,626) y relaciones actividad/antí-
geno de 0,38 a 0,58. En la distribución de estos parámetros entre los dos grupos genéticos apenas hubo una inter-
sección.

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Durante el periodo de revisión de cinco años entre 1990 y 1995 (Q_{1}), en un total de 384 de las 810 personas de ensayo en el estudio (47,4%) se llegó a la aparición de nuevas lesiones ateroscleróticas o, respectivamente, a una expansión de las lesiones no estenóticas (aterogénesis temprana), y en 92 de 326 individuos (28,2%) con placas ya existentes se pusieron de manifiesto transformaciones estenóticas (aterogénesis avanzada). Tal como era de esperar, no se encontró relación alguna entre mutante Marburg I y aterogénesis temprana (relaciones de probabilidad de múltiples variables adaptadas a edad/sexo [95% VI] de 0,6 [0,3 a 1,4 o, respectivamente, 0,7 [0,3 a 1,7]. En consonancia con esto, entre los portadores de FSAP tipo salvaje (0,95 mm) y el mutante de FSAP Marburg I (0,94 mm; P=0,853 para la diferencia) no había diferencias algunas en el espesor de la capa intima-media de la arteria carótida común. Sin embargo, se puso de manifiesto que el mutante es un fuerte factor de riesgo para el estado putativo avanzado de la aterotrombosis en el caso de aterogénesis (relación de probabilidad adaptada a edad/sexo [95% VI] 3,5 [1,1 a 11,4], P=0,036). En el caso de la adaptación del modelo de regresión logístico a otros factores de riesgo relevantes, la relación siguió siendo estadísticamente significativa (Tabla 1). Al perfil de riesgo de la aterosclerosis estenótica avanzada pertenecían además diabetes, una elevada concentración de fibrinógenos, una baja concentración de antitrombina, un elevado número de trombocitos, fumar, consumo de alcohol (protectivo en pequeñas cantidades), Lp(a)>0,32 g/l y mutación Leiden del factor V. En los factores de riesgo no había diferencias específicas del sexo y no se encontraron confirmaciones de efectos diferenciales del mutante Marburg I en poblaciones parciales clasificadas según edad, grado de riesgo y costumbres vitales. Una exclusión de personas de ensayo que tomaban aspirina, agentes hipotensores, antidiabéticos o reductores de lípidos tampoco influían sobre los resultados. Los riesgos estandarizados de regresión de la aterogénesis avanzada para una serie de factores de riesgo principales (mutante Marburg I, IGT/diabetes, alta concentración de lipoproteína(a), fumar, mutación del factor V, alta concentración de fibrinógeno y baja concentración de antitrombina) se indican en la Tabla 2. En las personas de ensayo con ninguno de los factores de riesgo había un pequeño riesgo para la aparición/avance de estenosis carotídea, mientras que en el caso de personas de ensayo con un conjunto de más de dos factores se llegó casi forzosamente a una aterogénesis avanzada.

El mutante Marburg II no tenía efecto alguno sobre la activación in vitro de activadores de plasminógeno de una sola cadena por FSAP. Por consiguiente, no fue inesperado que en nuestros análisis no se pudiera encontrar relación alguna entre esta mutación y la aterogénesis. En la comparación de personas de ensayo con FSAP tipo salvaje y portadores del mutante Marburg II, el mutante Marburg I y los portadores de las dos desviaciones genéticas tenían las relaciones de probabilidad de múltiples variables [95% VI] para aterosclerosis avanzada 1,6 [0,2 a 19,7]. P=0,669, 6,2 [1,1 a 36,0]. P=0,048 o, respectivamente, 7,1 [1,1 a 45,1]. P=0,037.

Para confirmar que nuestros resultados son consistentes aún después de largos espacios de tiempo, se repitieron los cálculos con los datos del periodo de revisión de diez años entre 1990 y 2000 (Q_{1+2}). En estas ecuaciones la relación de múltiples variables entre el mutante Marburg I de FSAP y la aterosclerosis avanzada (iguales adaptaciones que en el análisis original) era nuevamente estadísticamente significativa (relación de probabilidad de múltiples variables [95% VI] 4,1 [1,1 a 14,8], P=0,045).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1

1

Las relaciones de probabilidad (CV), 95% de intervalo de fiabilidad (95% VI) y los valores p (P) se derivaron del análisis de regresión logístico de aterosclerosis avanzada (origen/avance de aterosclerosis carotídica estenótica en referencia a edad, sexo y factores de riesgo vasculares. El modelo se ajustó por un proceso de selección progresivo paso a paso (etapa... etapa de entrada). Las CV (relaciones de probabilidad) se calcularon para una variación de la unidad 1-SD de variables conocidas. AS-: grupo sin aterogénesis avanzada, AS+: grupo con aterogénesis avanzada. Este análisis se concentró a 326 personas de ensayo, las cuales en 1990 al comienzo del estudio padecían ya aterosclerosis.

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Leyenda de la figura

Figura 1: la figura muestra los riesgos de aterogénesis avanzada adaptados a la regresión como función de los factores de riesgo vasculares en un individuo (mutante Marburg I de la proteasa activante del factor VII, IGT/diabetes, concentración de lipoproteína (a) >0,32 g/l, fumar, mutación Leiden del factor V, concentración de fibrinógeno (Q_{5} >3,3 g/l) y concentración de antitrombina (Q_{1}<0,84%)).

Claims (16)

1. Procedimientos para reconocer un elevado riesgo para el origen y la progresión de trombosis arteriales y enfermedades ateroscleróticas y sus enfermedades a ellas unidas tales como, por ejemplo, angina de pecho, infarto cardiaco y ataque de apoplejía, caracterizados porque en muestras de líquidos corporales de un donante, especialmente en el plasma sanguíneo, o bien

f)

se detecta la presencia heterozigótica u homozigótica de un mutante de la proenzima de FSAP con un intercambio de bases G/A en la posición nucleotídica 1601 por análisis del ADN genómico del donante o de un mARN derivado de aquel

y/o

g)

se detecta la presencia de un mutante de FSAP a nivel proteico, el cual ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, o en el cual al menos se ha perjudicado esta capacidad

y/o

h)

se detecta la presencia de anticuerpos específicos contra un mutante de FSAP, el cual ha perdido la capacidad de activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena, o en el cual al menos se ha perjudicado esta capacidad

y/o

i)

se detecta un reducido potencial de FSAP para la activación de los activadores de plasminógenos de una sola cadena

y/o

j)

se detecta una reducida concentración de antígeno de FSAP.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se detecta una presencia heterozigótica u homozigótica de un mutante de FSAP, manifestando el mutante de FSAP un intercambio de los aminoácidos glicina por ácido glutámico en la posición 534 de la secuencia de aminoácidos de la proenzima de FSAP, incluido el péptido de señal.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque la presencia heterozigótica u homozigótica del mutante se detecta por análisis de la secuencia del ADN genómico de un donante o del mARN derivado de aquel en líquidos corporales, teniendo lugar una amplificación con ayuda de la Polymerase Chain Reaction (PCR) (reacción en cadena de la polimerasa).

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se detecta una presencia heterozigótica u homozigótica de un mutante de FSAP, el cual ha perdido la capacidad de activación de prouroquinasa o en el cual al menos de ha perjudicado esta capacidad.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los mutantes de FSAP se detectan a nivel proteico por aplicación de anticuerpos monoclonales o policlonales.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado porque los mutantes de FSAP se detectan a nivel proteico por aplicación de anticuerpos monoclonales o policlonales, los cuales son específicos para el mutante.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 5 y 6, caracterizado porque los mutantes se detectan por exámenes histológicos en tejidos o en soluciones extraídas de tejidos.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la detección de una reducida concentración de antígeno de FSAP se lleva a cabo mediante un procedimiento ELISA, ligando a una fase sólida el FSAP procedente de líquidos corporales, como proteína, directa o indirectamente, a través de sustancias que ligan FSAP fijadas a una fase sólida, tales como anticuerpos monoclonales o poli-clonales, así como sus fragmentos F(ab')_{2} o Fab', como también sulfato de dextrano o heparina, y efectuándose la detección de FSAP o bien por determinación de la actividad del FSAP ligado o por detección de la unión de otros partícipes de unión específicos de FSAP.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la detección del mutante de FSAP tiene lugar mediante un anticuerpo unido a una fase sólida, a la cual se aplica una muestra que se ha de examinar en cuanto a la existencia del factor de riesgo, en presencia de un mutante de FSAP marcado, y midiendo la señal provocada por la marcación.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque para la detección de un reducido potencial de FSAP para la activación de activadores de plasminógenos de una sola cadena se mide la actividad de FSAP incubando la muestra que contiene proteasa sobre un soporte sólido, al cual previamente se acopló un anticuerpo dirigido contra la proteasa y, después de lavar el soporte libre, la proteasa a él fijada se incuba con reactivos que permiten la determinación de su actividad.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque para la detección de la presencia de los mutantes de FSAP se utilizan anticuerpos sobre "Western Blots" para la inmunohistología o para la citometría de flujo de fluorescencia activada (FACS).

12. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque para la detección de anticuerpos contra un mutante de FSAP se deja actuar una muestra, que podría contener los anticuerpos contra el mutante de FSAP, sobre un mutante de FSAP fijado a un soporte sólido, después se lava y se detectan los anticuerpos ligados a la o a las proteasas.

13. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque los anticuerpos humanos ligados se incuban con una inmunoglobulina anti-humana marcada o con sus fragmentos o su proteína A o proteína G marcadas, y se determina la señal emitida por la sustancia marcada, ligada.

14. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque los anticuerpos se detectan por medición fotométrica de la extinción provocada por el anticuerpo anti-humano acoplado con una enzima, o de sus fragmentos o de su proteína A o proteína G, por separación de un sustrato cromogénico o fluorogénico adecuado.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque los anticuerpos se detectan por medición de la fluorescencia provocada por la sustancia ligada, marcada con un grupo fluorescente.

16. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque los anticuerpos se detectan por medición radiométrica de la sustancia ligada, marcada con un grupo radioactivo.