JP5355658B2 - カスパーゼ−14中間体による皮膚疾患の検出 - Google Patents
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Description
カスパーゼ−14の活性化は角質細胞の形成の際に起こることまでは知られるが、その正確な活性化機構までは理解されていない。本発明者は角質細胞からカスパーゼ−14を精製し、そして活性化のための切断部位がD146であることまでは突き止めている(特許文献2)。この情報に基づき、本発明者は活性化カスパーゼ−14のみを認識する切断部位特異的抗体(C14D146Ab)を調製した。また、カスパーゼ−14の活性化機構を解明するため、まずカスパーゼ−14がカスパーゼ−1〜10により活性化されるかどうかも試験した。しかしながら、どのカスパーゼもカスパーゼ−14をプロセシングする能力をもたなかった。次にトリプシン様酵素、キモトリプシン様酵素、カルパインI、KLK7などの表皮プロテイナーゼの作用について調べてみた。その結果、キモトリプシンやKLK7がカスパーゼ−14をY178で切断し、大サブユニット(20kDa)及び小サブユニット(8kDa)から構成される中間体を生成することがわかった(特願2011-039978)。したがって、この切断部位Y178を認識する抗体(h14Y178Ab)を調製した(特許文献3)。
なお、本願ではC14-Y178L及びrevC14-Y178SLを以下において「カスパーゼ−14中間体」と称する場合がある。興味深いことに、revC14-Y178SLやC14-Y178Lの基質特異性は精製された活性化カスパーゼ−14とは全く異なり、しかもその酵素活性には、通常カスパーゼなら必要なコスモトロピックイオンを必要としなかった。さらに、活性化カスパーゼ−14の生成は、プロカスパーゼ−14をキモトリプシン又はKLK7で処理したカスパーゼ−14とのインキュベーションと同様、revC14-Y178SLとのインキュベーションでも認められた。
カスパーゼ−14のY178での切断部位に特異的なh14Y178Abを用いた免疫染色分析は、C14-Y178Lが正常なヒト表皮の顆粒細胞と角質細胞との間の限定された部位に局在することが示されたが、アトピー皮膚炎や乾癬に罹患したヒト表皮の対応の部分ではこれ以下の層の広い範囲で存在しており、これらの患者患部の角層抽出液中にもその存在が認められたが、正常で認められる最終活性化体が消失していた(図7)。以上により、カスパーゼ−14の活性化は、カスパーゼ−14の中間体の形成が重要な役割を果たすことで関与する固有な機構によるものであることが解明された。
したがって、カスパーゼ−14中間体がフィラグリンの分解異常を原因とする皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患のマーカーとして利用できることがわかった。
(1)表皮中のカスパーゼ−14のアミノ酸1位〜178位からなるポリペプチド(C14-Y178L)であるカスパーゼ−14中間体又は1もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失し、かつプロカスパーゼのD146を切断する活性を有するその変異体を、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患のマーカーとして、検出することを含む方法。
(2)前記皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、乾癬脂漏性皮膚炎、日光性角化症、紅色粃糠疹及び全身性エリテマトーデスの不全角化を示す疾患群から選ばれるである、(1)の方法。
(3)前記検出を、カスパーゼの178位での切断部位を特異的に認識する抗体を用いて行うことを特徴とする、(1)又は(2)の方法。
(4)前記検出方法が免疫染色方法である、(3)の方法。
(5)前記検出方法がELISA法である、(3)の方法
(6)C14-Y178Lがカスパーゼ−14のアミノ酸179位〜242位からなるポリペプチドと二量体を形成する、(1)〜(5)のいずれかの方法。
2種類のカスパーゼ−14中間体又はその変異体に特異的な抗体の一方を一次抗体として担体に固定化する。担体としては固体担体が好ましく、例えば固体担体として免疫測定法において常用される任意のものを使用してよく、例えば任意の大きさ、形状に成形されたスチレンやポリスチレンなどの高分子担体のほか、これらの適当な材料で成形した反応容器、例えばELISAプレートのウェルの内壁などが挙げられる。
組換プロカスパーゼ−14は、特表2002-500049号公報に記載の方法に従い、作成した。簡単には、所定のPCRプライマーを用いてRT−PCR増幅したヒトカスパーゼ−14全長コード配列をプラスミドpQE−100(Qiagen, Co.)にクローニングし、大腸菌DH5αに形質転換し、発現させることで作製した。発現したプロカスパーゼ−14はNi−NTAアフィニティーカラム(Qiagen, Co.)、MonoQ FPLCシステム(アマシャム社)、Superdex−75 FPLCシステム(アマシャム)によるクロマトグラフィーにかけることで精製した。組換プロカスパーゼ−14はルゼート1リッター当たり2〜3mgの収量で得られた。
切断部位である、Y178までの大サブユニット(p20)(C14-Y178L)と、その後続配列からなる小サブユニット(p8)を逆転させ、p8-p20の構造体(revC14-Y178SL)を、以下のプライマーを用いて作製した。
P8-foward primer :ggaattccatatgcgacatgatcagaaaggctcatgc(配列番号1)
P8-reverse primer : ccgctcgagctgcagatacagccgtttccggag(配列番号2)
P20-forward primer : ccgctcgagatgagcaatccgcggtctttggaa(配列番号3)
P20-reverse primer: cgggatccctagtaggcgatgtatccctctaccgt(配列番号4)
P8をPCRで増幅後、得られた産物をNde IおよびXho Iで消化した。また、p20についてもPCR増幅後、Xho I/Bam HIで消化した。これらの2つのDNA断片をNde I/Bam HIで消化した、pET15b ベクターにligationし、得られたクローンの大量培養から、通常の方法で、Ni-agroseカラムを用いてリコンビナント蛋白を精製した。図3にカスパーゼ−14中間体の作成の模式図を示す。
カスパーゼのそれぞれの基質は、Bio Vision, Inc(Mountain View, CA)より購入した。
C14 Assay Buffer(Na citrate(-),(+))+ DTT 80μlに、revC14-Y178SL、C14-Y178L及び 各種カスパーゼ(それぞれ、0.47mg/mlをPBSで10倍希釈したもの)15μlを加え、混合した。これに1mMの各基質を加え、37℃で10分置いた後、excitation:355 nm、emission:460 nmで蛍光強度の変化を測定した。測定には、フルオロスキャンアセントFL(Labsystems)を用いた。その結果を図4に示す。
revC14-Y17SL8及びC14-Y178Lは、ほぼ同様の基質特異性を示し、また活性化カスパーゼ−14が特異性を示す基質WEHDに対しては全く酵素活性を示さなかった。またその酵素活性には、通常カスパーゼなら必要なコスモトロピックイオンを必要としなかった。
4)revC14-Y178SL、C14-Y178Lによる活性化カスパ−ゼ-14の生成
pCMV-HAベクターにrevC14-Y178SLを導入したコンストラクトを作製した。培養ケラチノサイト(増殖期)に、FuGENE HD(Roche, Mannheim, Germany)を用いてトランスフェクションした。コンフルエント時に1.2 mMのカルシウムを添加し内在性のカスパーゼ-14の産生を誘導した。細胞を冷メタノールで固定後、抗HA抗体およびh14D146抗体(カスパーゼ-14の活性化体のみを認識)を用いて、通常の方法で免疫染色した。Alexa Fluor 455(緑)555(赤)の蛍光二次抗体を用いて二重染色を行った。あわせて、DAPIを用いて核の染色を行った。その結果を図5に示す。
Y178中間体を発現している細胞は、緑の蛍光を発している(→で表示)。これらの細胞は、二重染色でカスパーゼ-14活性化体のみを認識するh14D146抗体陽性であり、中間体により、カスパーゼ-14の活性化体が生成されることが示された。
したがって、活性化カスパーゼ−14の生成は、プロカスパーゼ−14をrevC14-Y178SLとインキュベーションすることで認められた。
ヒト健常皮膚、アトピー性皮膚疾患を罹患した患者の皮疹部及び無疹部の皮膚凍結切片をそれぞれ4%のPFA(パラホルムアルデヒド)で室温、20分固定し、ブリーチ(10%のメタノール、3%の過酸化水素/蒸留水)により、内因性のペルオキシダーゼを除去した後、ENVISIONキット(ダコ)を用いて染色を行った。具体的には、10%のヤギ正常血清(ニチレイ社製)にて室温、2時間ブロッキング処理し、revC14-Y178SL、C14-Y178のY178部位を特異的に認識するh14Y178抗体(1/200)と4℃、一晩反応させた後、PBSで室温にて15分×3回、余剰抗体を洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体(ダコ)と室温で1時間反応させ、再度PBSで室温にて15分×3回洗浄し、余剰抗体を洗浄し、DABを用いて発色させた。最後にヘマトキシニンを用いて核染色を行った。その結果を図6及び7に示す。
Claims (5)
- 表皮中のカスパーゼ−14のアミノ酸1位〜178位からなるポリペプチド(C14-Y178L)であるカスパーゼ−14中間体又は1もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失し、かつプロカスパーゼのD146を切断する活性を有するその変異体を、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患のマーカーとして測定して、アトピー性皮膚炎及び乾癬の不全角化を示す疾患群から選ばれる皮膚疾患を検出することを含む方法。
- 前記検出を、カスパーゼの178位での切断部位を特異的に認識する抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 前記検出方法が免疫染色方法である、請求項2記載の方法。
- 前記検出方法がELISAである、請求項2記載の方法。
- C14-Y178Lがカスパーゼ−14のアミノ酸179位〜242位からなるポリペプチドと二量体を形成する、請求項1〜4のいずれ1項記載の方法。
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