WO2013065754A1 - カスパーゼ－１４中間体による皮膚疾患の検出 - Google Patents

カスパーゼ－１４中間体による皮膚疾患の検出 Download PDF

Info

Publication number
WO2013065754A1
WO2013065754A1 PCT/JP2012/078209 JP2012078209W WO2013065754A1 WO 2013065754 A1 WO2013065754 A1 WO 2013065754A1 JP 2012078209 W JP2012078209 W JP 2012078209W WO 2013065754 A1 WO2013065754 A1 WO 2013065754A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
caspase
antibody
skin
filaggrin
amino acids
Prior art date
Application number
PCT/JP2012/078209
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
利彦 日比野
真実 山本
Original Assignee
株式会社資生堂
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社資生堂 filed Critical 株式会社資生堂
Publication of WO2013065754A1 publication Critical patent/WO2013065754A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/202—Dermatitis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/20—Dermatological disorders
    • G01N2800/205—Scaling palpular diseases, e.g. psoriasis, pytiriasis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease

Definitions

  • the present invention relates to a skin disease caused by keratinization due to abnormal degradation of filaggrin, for example, atopic dermatitis, using as an index a caspase-14 intermediate comprising a polypeptide consisting of amino acids 1 to 178 of caspase-14. It is to provide a novel method effective for detection of skin diseases such as psoriasis and prediction of onset.
  • Caspase a cysteine protease, is involved in protein processing in vertebrate programmed cell death and secretion from cells, and to date there are about 14 types of proteins, including those derived from humans and mice.
  • Common features of caspases are: 1) they are cysteine proteases with Asp-X bonds (where “X” is an amino acid) substrate cleavage properties; 2) they are conserved within the active site And 3) they may be synthesized as proenzymes that require proteolytic cleavage at specific aspartic acid residues for activation of protease activity.
  • Cleavage of the proenzyme generates two polypeptide protease subunits that are non-covalently bound to form a tetramer composed of two heterodimers. These proteases generally induce apoptosis when expressed in cells.
  • Caspase-14 is the latest caspase found in humans and belongs to the cysteine enzyme superfamily. Unlike other caspases, it is specifically expressed in the skin and its appendages, and is known not to participate in apoptosis. Recently, a caspase-14 knockout mouse was produced, and it was shown that there was an abnormality in the degradation of filaggrin (Non-patent Document 1).
  • the precursor of filaggrin is called profilagrin and is stored in keratohyaline granules in the granule layer.
  • Profilagrin has a structure in which ten to twelve filaggrin molecules are connected in series, and these are cut out together with keratinization to form individual filaggrins, which are eventually decomposed to form natural moisturizing factor (NMF).
  • NMF natural moisturizing factor
  • NMF is an essential factor for moisturizing the skin, and it has been known that amino acids and their derivatives are the main components. It has been estimated that NMF is made from filaggrin nearly 30 years ago.
  • Non-patent Document 2 We have clarified the process by which filaggrin is decomposed and becomes NMF (Non-patent Document 2). It has also been elucidated that caspase-14 initially acts on filaggrin and breaks down into several peptides. Calpain I acts on the filaggrin peptide, and further, bleomycin hydrolase (BH) acts on these degradation products, so that they are degraded to the amino acid level (Patent Document 1).
  • BH bleomycin hydrolase
  • Non-patent Document 3 The discovery that filaggrin genetic abnormalities are the cause of ichthyosis and some atopic dermatitis was greeted with great surprise (Non-patent Document 3). It was shown that the abnormality of filaggrin not only reduces the water retention capacity of the stratum corneum resulting from a decrease in NMF, but also directly affects the barrier function. Subsequent studies have reported that filaggrin genetic abnormalities can reach 40% in some parts of Europe, but only about 20% in Japan. From this point, it is well understood that atopic dermatitis is a multifactorial disease. In fact, we have shown that caspase-14 and BH are extremely reduced in atopic dermatitis.
  • BH knockout mice have been reported to show fish phosphatid-like and atopy-like skin symptoms.
  • Caspase-14 knockout mice have increased TEWL values and are known to have reduced barrier function.
  • Our recent findings also revealed that caspase-14 was significantly decreased in both the rash and non-rash areas of the skin of atopic patients, similar to BH (Non-patent Document 4).
  • caspase-14 has been reported to be a caspase that is specifically expressed in the skin, it is not clear with respect to the mechanism and function of activation that acts on filaggrin to become degraded. Although caspase-14 activation is known to occur during keratinocyte formation, the exact activation mechanism is not understood.
  • the present inventor has purified caspase-14 from keratinocytes and has found that the cleavage site for activation is D146 (Patent Document 2). Based on this information, the present inventors prepared a cleavage site-specific antibody (C14D146Ab) that recognizes only activated caspase-14.
  • caspase-14 was activated by caspase-1-10. However, none of the caspases had the ability to process caspase-14.
  • epidermal proteinases such as trypsin-like enzyme, chymotrypsin-like enzyme, calpain I, and KLK7 was examined. As a result, it was found that chymotrypsin and KLK7 cleave caspase-14 with Y178 to produce an intermediate composed of a large subunit (20 kDa) and a small subunit (8 kDa) (Japanese Patent Application No. 2011-039978). Therefore, an antibody (h14Y178Ab) that recognizes this cleavage site Y178 was prepared (Patent Document 3).
  • the present invention is to provide a novel method effective for detecting and predicting skin diseases caused by abnormal decomposition of filaggrin, such as skin diseases such as atopic dermatitis and psoriasis.
  • C14-Y178L C14-Y178L and a small subunit (8 kDa) produced by cleaving caspase-14 with Y178, and arranging the above subunits in natural caspase-14.
  • revC14-Y178SL was created by inverting it.
  • C14-Y178L and revC14-Y178SL may be hereinafter referred to as “caspase-14 intermediate”.
  • the substrate specificities of revC14-Y178SL and C14-Y178L were completely different from purified activated caspase-14, and their enzymatic activity did not require the necessary kosmotropic ions that are normally required for caspases.
  • a caspase-14 intermediate which is a polypeptide consisting of amino acids 1 to 178 of caspase-14 in the epidermis (C14-Y178L) or one or several amino acids are substituted, added or deleted, and A method comprising detecting a mutant having the activity of cleaving D146 of caspase as a marker for skin diseases caused by aberrant keratinization due to abnormal degradation of filaggrin.
  • the skin disease is selected from a group of diseases showing atopic keratitis, psoriatic seborrheic dermatitis, actinic keratosis, red rash, and systemic lupus erythematosus, (1) the method of.
  • the detection method is an immunostaining method.
  • the detection method is an ELISA method, the method of (3) (6) C14-Y178L forms a dimer with a polypeptide comprising amino acids 179 to 242 of caspase-14, (1) to Either method of (5).
  • skin diseases caused by aberrant keratinization due to abnormal degradation of filaggrin such as atopic dermatitis, psoriatic seborrheic dermatitis, actinic keratosis, red rash, and systemic lupus erythematosus Detection of skin diseases such as a disease group showing full keratinization and prediction of onset are possible.
  • FIG. 2 illustrates the mechanism of caspase-14 activation.
  • the primary structure of caspase-14 is shown.
  • a schematic diagram of the preparation of a caspase-14 intermediate is shown.
  • the enzyme activity of the caspase-14 intermediate is shown.
  • FIG. 4 shows the activation of procaspase-14 by a caspase-14 intermediate.
  • the result of immunostaining of healthy skin with caspase-14 intermediate is shown.
  • the result of immunostaining of atopic dermatitis skin with caspase-14 intermediate is shown.
  • the activated caspase-14 referred to in the present invention means a mature caspase-14 that can act on filaggrin and decompose to produce NMF.
  • Activated caspase-14 is a dimer composed of a 17 kDa subunit and an 11 kDa subunit generated by cleavage of procaspase-14 at position D146.
  • the cleavage of procaspase-14 at position D146 is an intermediate of caspase-14 produced by cleavage of procaspase-14 at position Y178 by kallikrein 7 (KLK7). It was found to be catalyzed by the body, ie C14-Y178L or revC14-Y178SL.
  • FIG. 2 shows the primary structure of caspase-14 and its cleavage site.
  • the caspase-14 intermediate referred to in the present invention is a 20 kDa subunit (C14-Y178L) produced by cleavage of procaspase-14 at position Y178, or a 20 kDa large subunit and the 178 position of procaspase-14. It may be a dimer composed of a small subunit of 8 kDa generated simultaneously by cleavage at a recC14-Y178SL, for example. Further, the 20 kDa large subunit C14-Y178L is a mutant in which one or several amino acids are substituted, added, or deleted, as long as it has the ability to catalyze the cleavage of D146 position of procaspase-14. Alternatively, it may be a variant thereof having sequence identity of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more with the amino acid sequence of C14-Y178L.
  • the measurement of the caspase-14 intermediate or variant thereof according to the present invention can be carried out quantitatively or qualitatively according to any method capable of measuring the caspase-14 intermediate or variant thereof.
  • a caspase-14 intermediate or a mutant thereof can be performed by immunostaining a caspase-14 intermediate or a mutant thereof.
  • An antibody specific for a caspase-14 intermediate or a variant thereof used in the immunostaining method is a pentapeptide corresponding to amino acids 174 to 178 of procaspase-14 as described in, for example, JP-A-2006-117594 Can be synthesized and used as a hapten for immunization of rabbits.
  • the caspase-14 intermediate is localized at a limited site between granule cells and keratinocytes, but skin diseases caused by aberrant keratinization due to abnormal degradation of filaggrin, such as atopic dermatitis and
  • skin diseases caused by aberrant keratinization due to abnormal degradation of filaggrin such as atopic dermatitis
  • filaggrin atopic dermatitis
  • psoriasis skin diseases caused by aberrant keratinization due to abnormal degradation of filaggrin
  • the above-mentioned antibody is fixed with an appropriate immobilizing reagent, and is preferably brought into contact with a human epidermis slice subjected to blocking treatment.
  • the antibody can be used as a primary antibody for immunostaining.
  • a “direct method” in which a label that can be visually grasped is applied to the primary antibody and the caspase-14 intermediate existing directly in the epidermis is used as a label, and the caspase-14 intermediate is applied to the caspase-14 intermediate. It is roughly classified into the “indirect method” in which a labeled secondary antibody or a secondary antibody and a labeled tertiary antibody are allowed to act on the bound unlabeled primary antibody.
  • it is preferable to perform an indirect method using a primary antibody and a secondary antibody which has both sensitivity and simplicity, but is not limited thereto.
  • the indirect method used can be used to carry out the specific method of the present invention.
  • the label applied to the antibody described above is a labeling substance that provides a detectable signal by reacting the labeling substance alone or by reacting the labeling substance with another substance, and is not particularly limited as long as it is used.
  • Specific examples include enzymes such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase, glucose oxidase, and luciferase. Each of these enzymes is colored by contacting the corresponding substrate.
  • fluorescent materials such as fluorescein isothiocyanate, phycobiliprotein, rare earth metal chelate, dansyl chloride or tetramethylrhodamine isothiocyanate, and GFP can be used.
  • biotin-avidin streptavidin
  • a biotin-labeled antibody is contacted with avidin (streptavidin) labeled with the above enzyme label or fluorescent label to form a bond between biotin and avidin (streptavidin).
  • Coloring and fluorescence can be revealed by applying the substrate and excitation light again.
  • an enzyme-labeled polymer method in which a high molecular polymer to which a large number of the coloring substances are bound is labeled on an antibody.
  • radioactive isotopes such as 125 I, 14 C, and 3 H can be labeled and visualized with photographic paper.
  • the visual identification of the stained image is performed with a microscope, but the microscope to be used is preferably selected according to the type of the label described above.
  • the microscope to be used is preferably selected according to the type of the label described above.
  • immunoassay methods using antibodies specific for caspase-14 intermediates or mutants thereof, such as ELISA methods using enzyme labels, immunoturbidimetric methods, Western blotting methods, latex agglutination methods, and latex agglutination methods.
  • ELISA methods using enzyme labels
  • immunoturbidimetric methods Western blotting methods
  • latex agglutination methods Various methods such as the method and the hemagglutination method can be mentioned.
  • immunoassay methods include competitive methods and sandwich methods.
  • C14-Y178 or a variant thereof is measured by an immunoassay method such as ELISA.
  • the antibody specific for the caspase-14 intermediate or variant thereof used in the ELISA may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody.
  • procaspase-14 Can be prepared by chemically synthesizing the pentapeptide corresponding to amino acid positions 174 to 178 and using it as a hapten for rabbit immunization.
  • no intermediate is detected in the normal stratum corneum, and a significant amount is present in the state of presenting or at risk of developing a skin disease caused by aberrant keratinization such as psoriasis or atopic dermatitis.
  • Intermediates, specifically, intermediates in the normal stratum corneum are detected in a statistically significant amount of intermediates (for example, by t-test, etc.). Simple determination of whether or not there is a risk of being present.
  • the tape stripping method is preferred from the viewpoint of simplicity and non-invasiveness.
  • Tape stripping is a method of collecting a stratum corneum sample by applying a piece of adhesive tape to the skin surface layer, peeling it off, and attaching the skin stratum corneum to the peeled adhesive tape.
  • the tape stripping method it is possible to measure the caspase-14 intermediate or its variant by simply collecting a single stratum corneum, and it is possible to evaluate the skin disease group using C14-Y178 or its variant as an index. It becomes possible.
  • the preferred method of tape stripping is to first clean the surface of the skin with, for example, ethanol to remove sebum, dirt, etc., and lightly place an adhesive tape piece cut to an appropriate size (for example, 5 ⁇ 5 cm) on the skin surface, This is done by applying a uniform force to the entire tape and pressing it flat, and then peeling off the adhesive tape with a uniform force.
  • the adhesive tape may be a commercially available cellophane tape or the like.
  • Scotch Superstrength3Mailing3Tape manufactured by 3M
  • cellophane tape cello tape (registered trademark); Nichiban Co., Ltd.) or the like can be used.
  • a suitable extract such as Tris-buffer (pH 8.0) (0.1 M Tris-HCl, 0.14 M NaCl, 0.1% Tween-20).
  • Tris-buffer pH 8.0
  • the stratum corneum can be extracted and isolated from the tape.
  • a sandwich immunoassay method is also preferable, which can be carried out as follows, for example.
  • One of the two types of caspase-14 intermediate or an antibody specific for the mutant is immobilized as a primary antibody on a carrier.
  • a carrier a solid carrier is preferable.
  • any solid carrier commonly used in immunoassays may be used.
  • a polymer carrier such as styrene or polystyrene formed into an arbitrary size and shape
  • Examples include reaction vessels formed of these appropriate materials, such as the inner wall of wells of ELISA plates.
  • the primary antibody can be immobilized on a carrier according to a conventional method.
  • the primary antibody is dissolved in a buffer solution such as phosphate buffered saline (PBS) or borate buffer, and adsorbed on the carrier.
  • PBS phosphate buffered saline
  • an antibody that binds to the primary antibody or another protein, such as protein C may be immobilized on a carrier in advance and then contacted with the primary antibody.
  • Blocking is preferably performed by incubation at 4 to 40 ° C., preferably 20 to 37 ° C., for 5 minutes to several days, preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 10 minutes to 3 hours.
  • the other antibody which is specific for the above two types of caspase-14 intermediates or variants thereof, is used as a secondary antibody and labeled.
  • the label include enzyme labels, radiation labels, fluorescent labels, and the like.
  • the enzyme can be directly bound to the secondary antibody for labeling, or indirectly labeled with an enzyme via an interactive protein such as avidin-biotin.
  • the enzyme can be bound to the antibody or the like by, for example, introducing a thiol group into each of the enzyme and the antibody to be labeled using a commercially available thiol-introducing group reagent and then bonding them to each other through an SS bond. .
  • the enzyme examples include horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase and the like.
  • the enzyme can be detected using a substrate specific for the enzyme.
  • TMB 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine
  • ABTS 2,2′-azine-di [3-ethylbenzthiazolinesulfonate]
  • Such immunoassay is carried out by mixing the carrier immobilized with the primary antibody, the labeled secondary antibody, and the test sample, and incubating the primary antibody immobilized on the carrier to the caspase-14 intermediate in the test sample. Or a mutant thereof, and a labeled secondary antibody is bound to the caspase-14 intermediate or a mutant molecule thereof.
  • the labeled antibody is a caspase-14 intermediate derived from the primary antibody immobilized on the carrier and the sample in an amount reflecting the amount of the caspase-14 intermediate or variant thereof in the sample. Immobilized on the carrier via the mutant.
  • a suitable buffer eg, PBS, at about 4-40 ° C., preferably 20-37 ° C., for 5 minutes to several days, preferably 10 minutes to 24 hours, more preferably 10 minutes to 3 hours.
  • an operation of separating unbound labeled antibody from the carrier is performed.
  • the carrier is a solid carrier
  • this separation operation can be easily performed by solid-liquid separation.
  • the label bound to the carrier and / or unbound label can be measured.
  • an arbitrary labeled antibody is used, the label bound to the carrier is detected and measured.
  • detection is preferably performed after washing the carrier with a washing solution, for example, a buffer containing an appropriate surfactant, for example, PBS-Tween 20, to remove unbound labeled antibody. .
  • Detection can be performed according to a conventional method depending on the type of label.
  • Recombinant procaspase-14 was prepared according to the method described in JP-T-2002-500049. Briefly, a human caspase-14 full-length coding sequence obtained by RT-PCR amplification using a predetermined PCR primer is cloned into a plasmid pQE-100 (Qiagen, Co.), transformed into E. coli DH5 ⁇ , and expressed. did. The expressed procaspase-14 was purified by chromatography on a Ni-NTA affinity column (Qiagen, Co.), MonoQ FPLC system (Amersham), and Superdex-75 FPLC system (Amersham). Recombinant procaspase-14 was obtained in a yield of 2-3 mg per liter of Ruzet.
  • revC14-Y178SL The large subunit (p20) (C14-Y178L) up to Y178, which is the cleavage site, and the small subunit (p8) consisting of the subsequent sequence are reversed, and the structure of p8-p20 ( revC14-Y178SL) was prepared using the following primers.
  • P8-foward primer ggaattccatatgcgacatgatcagaaaggctcatgc (SEQ ID NO: 1)
  • P8-reverse primer ccgctcgagctgcagatacagccgtttccggag
  • P20-forward primer ccgctcgagatgagcaatccgcggtctttggaa
  • P20-reverse primer cgggatccctagtaggcgatgtatccctctaccgt (SEQ ID NO: 4)
  • FIG. 3 shows a schematic diagram of the preparation of the caspase-14 intermediate.
  • revC14-Y17SL8 and C14-Y178L showed almost the same substrate specificity, and showed no enzyme activity against the substrate WEHD for which activated caspase-14 showed specificity. In addition, the enzyme activity did not require the necessary kosmotropic ions for normal caspases.
  • 4) Generation of activated caspase-14 by revC14-Y178SL and C14-Y178L A construct was prepared by introducing revC14-Y178SL into the pCMV-HA vector. Cultured keratinocytes (growth phase) were transfected using FuGENE HD (Roche, Mannheim, Germany). At confluence, 1.2 mM calcium was added to induce endogenous caspase-14 production.
  • the cells were fixed with cold methanol, and then immunostained by an ordinary method using an anti-HA antibody and an h14D146 antibody (recognizing only an activated form of caspase-14). Double staining was performed using a fluorescent secondary antibody of Alexa Fluor 455 (green) 555 (red). In addition, nuclei were stained using DAPI. The result (confluent at day 3) is shown in FIG. Cells expressing the Y178 intermediate emit green fluorescence (indicated by ⁇ ). These cells were positive for the h14D146 antibody that recognizes only the caspase-14 activator by double staining, and it was shown that an activated form of caspase-14 was produced by the intermediate. Thus, production of activated caspase-14 was observed upon incubation of procaspase-14 with revC14-Y178SL.
  • H14Y 178 antibodies unlike antibody, i.e. recognizing the cut portion of the position D146 of caspase-14 C14D146Ab to stain normal active caspase-14 is believed to be easily recognize the abnormal keratinocyte .

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

　本発明は、表皮中のカスパーゼ－１４のアミノ酸１位～178位からなるポリペプチド（C14-Y178L）又は１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失し、かつプロカスパーゼのD146を切断する活性を有するその変異体を、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患のマーカーとして、検出することを含む方法を提供する。

Description

カスパーゼ－１４中間体による皮膚疾患の検出
　本発明は、カスパーゼ－１４のアミノ酸１位から178位からなるポリペプチドを含むカスパーゼ－１４中間体を指標とする、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患の検出や発症の予知に有効な新規な方法の提供にある。
　システインプロテアーゼであるカスパーゼは脊椎動物のプログラム細胞死や細胞からの分泌におけるタンパク質のプロセッシングに関与しており、現在までにヒト、マウスに由来のものを含め、約１４種類の存在が知られている。カスパーゼの共通の特徴には、１）これらが、Ａｓｐ－Ｘ結合（ここで「Ｘ」はアミノ酸である）基質切断特性を有するシステインプロテアーゼであること；２）これらが、活性部位内の保存されたペンタペプチド配列を共有すること；及び３）これらが、プロテアーゼ活性の活性化のために特異的アスパラギン酸残基でのタンパク質分解切断を必要とするプロ酵素として合成されることがある。プロ酵素の切断は、２つのポリペプチドプロテアーゼサブユニットを生成し、これらは、非共有結合して２つのヘテロダイマーから構成されるテトラマーを形成する。これらのプロテアーゼは、細胞で発現される場合、一般にアポトーシスを誘導する。
　カスパーゼ－１４は、ヒトでは、最も遅く見出されたカスパーゼであり、システイン酵素スーパーファミリーに属する。他のカスパーゼと異なり、皮膚およびその付属器に特異的に発現しており、アポトーシスには関与しないことが知られている。最近カスパーゼ－１４のノックアウトマウスが作製され、このマウスでは、フィラグリンの分解に異常があることが示された（非特許文献１）。
　フィラグリンの前駆物質は、プロフィラグリンと呼ばれ、顆粒層のケラトヒアリン顆粒に蓄えられている。プロフィラグリンはフィラグリン分子が10個から12個連続してつながった構造をしており、角化とともにこれらが切り出されて、個々のフィラグリンとなり、最終的にこれが分解されて、天然保湿因子（ＮＭＦ）が作られる。ＮＭＦは皮膚の保湿に必須の因子であり、アミノ酸とその派生物が主な成分であるということが知られていた。ＮＭＦがフィラグリンから作られるという事は今から30年近く前にすでに推測されていた。
　我々は、これまでに、フィラグリンが分解されて、ＮＭＦになる過程について明らかにしている（非特許文献２）。カスパーゼ－１４が最初にフィラグリンに作用し、いくつかのペプチドに分解することも解明されている。そして、カルパインＩがフィラグリン・ペプチドに作用し、さらにこれらの分解産物にブレオマイシンヒドロラーゼ（ＢＨ）が働くことにより、アミノ酸レベルまで、分解される（（特許文献１）。
　フィラグリンの遺伝子異常が、魚燐癬や一部アトピー性皮膚炎の原因であるという発見は、大きな驚きをもって迎えられた（非特許文献３）。フィラグリンの異常が単にＮＭＦの低下からくる角層の保水能力の低下ばかりではなく、バリアー機能にも直接の影響を与えるということが示された訳である。その後の研究では、フィラグリンの遺伝子異常は、ヨーロッパのある地域においては40％～に達するという報告もなされているが、日本では、約20％程度にとどまっているようである。この点からも、アトピー性皮膚炎が多因性の疾患であることは十分に理解される。実際、我々は、アトピー性皮膚炎では、カスパーゼ－１４および、ＢＨが極度に低下していることを明らかにしている。アトピー患者皮膚におけるBHの極度の発現低下は、フィラグリンの遺伝子異常のみならず、分解系の異常もバリアー傷害の重要な要因となり得ることを示している。実際、ＢＨのノックアウトマウスは、魚燐癬様、アトピー様の皮膚症状を示すことが報告されている。カスパーゼ-14のノックアウトマウスは、TEWL値が亢進しており、バリアー機能が低下していることがわかっている。我々の最近の知見でも、カスパーゼ－１４がＢＨと同様にアトピー患者皮膚の皮疹部および無疹部の両方で有意に低下していることが明らかになった（非特許文献４）。
　このように、フィラグリンからＮＭＦ産生に至る過程は、バリアー機能を考える上で極めて重要である。カスパーゼ－１４は皮膚に特異的に発現するカスパーゼであることが報告されているが、それがフィラグリンに作用して分解するようになる活性化の機構及び機能に関しては明らかではない。
　カスパーゼ－１４の活性化は角質細胞の形成の際に起こることまでは知られるが、その正確な活性化機構までは理解されていない。本発明者は角質細胞からカスパーゼ－１４を精製し、そして活性化のための切断部位がD146であることまでは突き止めている（特許文献２）。この情報に基づき、本発明者は活性化カスパーゼ－１４のみを認識する切断部位特異的抗体（C14D146Ab）を調製した。また、カスパーゼ－１４の活性化機構を解明するため、まずカスパーゼ－１４がカスパーゼ－１～１０により活性化されるかどうかも試験した。しかしながら、どのカスパーゼもカスパーゼ－１４をプロセシングする能力をもたなかった。次にトリプシン様酵素、キモトリプシン様酵素、カルパインI、ＫＬＫ７などの表皮プロテイナーゼの作用について調べてみた。その結果、キモトリプシンやＫＬＫ７がカスパーゼ－１４をY178で切断し、大サブユニット（２０ｋＤａ）及び小サブユニット（８ｋＤａ）から構成される中間体を生成することがわかった（特願2011-039978）。したがって、この切断部位Y178を認識する抗体（h14Y178Ab）を調製した（特許文献３）。
WO2009/142268 特開2003-171400号公報 特開2006-117594号公報
Denecker G, Hoste E, Gilbert B, et al. Nat Cell Biol. 2007; 9: 666-674 Kamata　Y, Taniguchi A, Yamamoto Y, et al. J Biol Chem. 2009; 284: 12829-12836 Sandilands A, Terron-Kwiatkowski A, Hull PR, et al. Nat Genet 2007 ; 39 : 650-654 Yamamoto M, Kamata Y, Iida T, et al. J Dermatol Sci. 2011 ; 61 : 110-117
　本発明は、フィラグリンの分解異常を原因とする皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患の検出や発症の予知に有効な新規な方法の提供にある。
　本発明者は、カスパーゼ－１４をY178で切断することで生成される大サブユニット（２０ｋＤａ）（C14-Y178L）及び小サブユニット（８ｋＤａ）を生成し、天然カスパーゼ－１４における上記サブユニットの並びに対し反転させることで「revC14-Y178SL」を作成した。
　なお、本願ではC14-Y178L及びrevC14-Y178SLを以下において「カスパーゼ－１４中間体」と称する場合がある。興味深いことに、revC14-Y178SLやC14-Y178Lの基質特異性は精製された活性化カスパーゼ－１４とは全く異なり、しかもその酵素活性には、通常カスパーゼなら必要なコスモトロピックイオンを必要としなかった。さらに、活性化カスパーゼ－１４の生成は、プロカスパーゼ－１４をキモトリプシン又はKLK7で処理したカスパーゼ－１４とのインキュベーションと同様、revC14-Y178SLとのインキュベーションでも認められた。
　カスパーゼ－１４のY178での切断部位に特異的なh14Y178Abを用いた免疫染色分析は、C14-Y178Lが正常なヒト表皮の顆粒細胞と角質細胞との間の限定された部位に局在することが示されたが、アトピー皮膚炎や乾癬に罹患したヒト表皮の対応の部分ではこれ以下の層の広い範囲で存在しており、これらの患者患部の角層抽出液中にもその存在が認められたが、正常で認められる最終活性化体が消失していた（図７）。以上により、カスパーゼ－１４の活性化は、カスパーゼ－１４の中間体の形成が重要な役割を果たすことで関与する固有な機構によるものであることが解明された。
　したがって、カスパーゼ－１４中間体がフィラグリンの分解異常を原因とする皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患のマーカーとして利用できることがわかった。
　したがって、本願は以下の発明を提供する。
（１）表皮中のカスパーゼ－１４のアミノ酸１位～178位からなるポリペプチド（C14-Y178L）であるカスパーゼ－１４中間体又は１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失し、かつプロカスパーゼのD146を切断する活性を有するその変異体を、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患のマーカーとして、検出することを含む方法。
（２）前記皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、乾癬脂漏性皮膚炎、日光性角化症、紅色粃糠疹及び全身性エリテマトーデスの不全角化を示す疾患群から選ばれるである、（１）の方法。
（３）前記検出を、カスパーゼの178位での切断部位を特異的に認識する抗体を用いて行うことを特徴とする、（１）又は（２）の方法。
（４）前記検出方法が免疫染色方法である、（３）の方法。
（５）前記検出方法がＥＬＩＳＡ法である、（３）の方法
（６）C14-Y178Lがカスパーゼ－１４のアミノ酸179位～242位からなるポリペプチドと二量体を形成する、（１）～（５）のいずれかの方法。
　本発明の方法により、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎、乾癬脂漏性皮膚炎、日光性角化症、紅色粃糠疹及び全身性エリテマトーデスの不全角化を示す疾患群といった皮膚疾患の検出や発症の予知が可能となる。
カスパーゼ－１４の活性化のメカニズムを図示する。 カスパーゼ－１４の一次構造を示す。 カスパーゼ－１４中間体の作成の模式図を示す。 カスパーゼ－１４中間体の酵素活性を示す。 カスパーゼ－１４中間体によるプロカスパーゼ－１４の活性化を示す。 カスパーゼ－１４中間体による健常皮膚の免疫染色結果を示す。 カスパーゼ－１４中間体によるアトピー性皮膚炎皮膚の免疫染色結果を示す。
　本発明でいう活性化カスパーゼ－１４とは、フィラグリンに作用し分解し、ＮＭＦを生成することのできるカスパーゼ－１４成熟体を意味する。活性化カスパーゼ－１４はプロカスパーゼ－１４のD146位での切断により生成される17ｋＤａサブユニットと11ｋＤａサブユニットとから構成される二量体である。本発明者によれば、かかるプロカスパーゼ－１４のD146位での切断は、図１に示すとおり、カリクレイン７（KLK7）によるプロカスパーゼ－１４のY178位での切断により生成されるカスパーゼ－１４中間体、即ちC14-Y178L又はrevC14-Y178SLにより触媒されることがわかった。図２にはカスパーゼ－１４の一次構造及びその切断部位を示す。
　本発明でいうカスパーゼ－１４中間体は、プロカスパーゼ－１４のY178位での切断により生成された20ｋＤａのサブユニット（C14-Y178L）、又は20ｋＤaの大サブユニットと、プロカスパーゼ－１４のY178位での切断により同時に生成された8ｋＤａの小サブユニットとから構成される二量体、例えばrecC14-Y178SLであってよい。また、20ｋＤａの大サブユニットC14-Y178Lは、プロカスパーゼ－１４のD146位の切断を触媒する能力を有する限り、１又は数個のアミノ酸が置換、付加又は欠失したその変異体であるか、あるいはC14-Y178Lのアミノ酸配列と70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、特に好ましくは95％以上の配列同一性を有するその変異体であってもよい。
　本発明に係るカスパーゼ－１４中間体又はその変異体の測定は、カスパーゼ－１４中間体又はその変異体を測定することのできる任意の方法に従い、定量的又は定性的に実施することができる。
　好ましくはカスパーゼ－１４中間体又はその変異体の免疫染色により行うことができる。免疫染色方法に使用するカスパーゼ－１４中間体又はその変異体に特異的な抗体は、例えば特開2006-117594号公報に記載のとおり、プロカスパーゼ－14のアミノ酸174～178位に相当するペンタペプチドを化学合成してハプテンとしてウサギの免疫に用いることで作成できる。健常な表皮においてカスパーゼ－１４中間体は顆粒細胞と角質細胞との間の限定された部位に局在するが、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎や乾癬といった皮膚疾患を罹患した患者表皮の場合、顆粒細胞や角質細胞の層よりも下層の広い範囲で存在していることから、カスパーゼ－１４中間体の存在位置を観察することで、表皮がフィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患を呈している又は呈するおそれがあるか簡易に判断できることとなる。
　上記の抗体は、適当な固定化試薬で固定させ、好ましくはブロッキング処理を施したヒト表皮切片と接触させる。この際、当該抗体は、免疫染色の一次抗体として用いることができる。免疫染色は、この一次抗体において視覚的に把握可能な標識を施して、その標識を直接的に表皮に存在するカスパーゼ－１４中間体を標識とする「直接法」と、カスパーゼ－１４中間体に結合した無標識の一次抗体に対して、標識を施した二次抗体、あるいは、二次抗体及び標識を施した三次抗体、を作用させる「間接法」に大別される。本発明においては、一次抗体と二次抗体を用いる間接法を行うことが、鋭敏性と簡便性を兼ね備えており、好適であるが、これに限定されるものではなく、直接法や三次抗体を用いる間接法を用いて本発明の特定方法を行うことができる。
　上述した抗体に施す標識は、当該標識物質単独で又は当該標識物質と他の物質とを反応させることにより、検出可能なシグナルをもたらす標識物質であり、その限りにおいて、特に限定されるものではない。具体的には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ルシフェラーゼ等の酵素が挙げられる。これらの酵素は、それぞれ対応する基質を接触させることによって、発色が認められる。また、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド若しくはテトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＧＦＰ等の蛍光物質が挙げられる。これらの蛍光物質は、励起光を照射することにより、特徴的な蛍光が認められる。また、ビオチン－アビジン（ストレプトアビジン）系を用いることができる。この系では、例えば、ビオチン標識を行った抗体に、上記の酵素標識や蛍光標識が施されたアビジン（ストレプトアビジン）を接触させて、ビオチンとアビジン（ストレプトアビジン）の結合を形成させ、そこに改めて基質や励起光を施すことで、発色や蛍光を顕すことができる。さらに、上記の発色物質を多数結合させた高分子ポリマーを抗体に標識する酵素標識ポリマー法を行うことも可能である。その他、125Ｉ，14Ｃ，3Ｈ等の放射性同位体を標識して、印画紙で可視化することも可能である。
　また、染色像の視覚的な特定は、顕微鏡で行うが、用いる顕微鏡は、上述した標識の種類に応じて選択することが好ましい。蛍光を伴わない染色標識の場合には、通常の明視野顕微鏡を用いることが好適であり、蛍光標識の場合には、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡を用いることが好適である。
　他の具体的な方法には、カスパーゼ－１４中間体又はその変異体に特異的な抗体を利用する免疫測定方法、例えば酵素ラベルを利用するＥＬＩＳＡ法、免疫比濁法、ウェスタンブロット法、ラテックス凝集法、赤血球凝集法等、様々な方法が挙げられる。免疫測定法の方式には競合法やサンドイッチ法が挙げられる。本発明の好ましい態様においては、C14-Y178又はその変異体は免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡにより測定する。ＥＬＩＳＡにおいて使用するカスパーゼ－１４中間体又はその変異体に特異的な抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、免疫染色方法と同様、例えば特開2006-117594号公報に記載のとおり、プロカスパーゼ－14のアミノ酸174～178位に相当するペンタペプチドを化学合成してハプテンとしてウサギの免疫に用いることで作成できる。これらの方法の場合、正常角層においては中間体は検出できず、乾癬やアトピー性皮膚炎などの不全角化を原因とする皮膚疾患を呈している又は呈するおそれがあるか状態では有意な量の中間体、具体的には正常角層中に含まれる中間体よりも統計学的（例えばｔ検定などにより）に有意な量の中間体が検出されることで、そのような状態を呈している又は呈するおそれがあるか否かの簡易な判断ができる。
　被検体となる皮膚角層試料の採取は任意の方法で実施することができるが、簡便性かつ非侵襲性の観点からテープストリッピング法が好ましい。テープストリッピングとは、皮膚表層に粘着テープ片を貼付し、剥がし、皮膚角層をその剥がした粘着テープに付着させることで角層試料を採取する方法である。テープストリッピング法を利用すれば、角層をテープ一枚採取するだけでカスパーゼ－１４中間体又はその変異体の測定が可能となり、C14-Y178又はその変異体を指標とした皮膚疾患群の評価が可能となる。テープストリッピングの好ましい方法は、まず皮膚の表層を例えばエタノールなどで浄化して皮脂、汚れ等を取り除き、適当なサイズ（例えば5×5cm）に切った粘着テープ片を皮膚表面の上に軽く載せ、テープ全体に均等な力を加えて平たく押さえ付け、その後均等な力で粘着テープを剥ぎ取ることで行われる。粘着テープは市販のセロファンテープなどであってよく、例えばScotch Superstrength Mailing Tape（3M社製）、セロファンテープ（セロテープ（登録商標）；ニチバン株式会社）等が使用できる。粘着テープに付着した皮膚角層試料中のＳＣＣＡは、テープ片を適当な抽出液、例えばTris-buffer（pH 8.0）（0.1M Tris-HCl, 0.14M NaCl, 0.1% Tween-20）に浸漬し、角層を抽出することでテープから単離・抽出させることができる。
　本発明に係る方法においては、サンドイッチ免疫測定法も好ましく、それは例えば下記の通りに実施できる。
　２種類のカスパーゼ－１４中間体又はその変異体に特異的な抗体の一方を一次抗体として担体に固定化する。担体としては固体担体が好ましく、例えば固体担体として免疫測定法において常用される任意のものを使用してよく、例えば任意の大きさ、形状に成形されたスチレンやポリスチレンなどの高分子担体のほか、これらの適当な材料で成形した反応容器、例えばＥＬＩＳＡプレートのウェルの内壁などが挙げられる。
　上記一次抗体の担体への固定化は常法に従って行うことができ、例えば上記一次抗体を緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ホウ酸緩衝液などに溶解して担体に吸着させることにより固定化することができる。また、例えば上記一次抗体に結合する抗体やその他のタンパク質、例えばプロテインＣをあらかじめ担体に固定化し、これを上記一次抗体と接触させる等してもよい。更に、非特異的な結合を抑えるため、このようにして一次抗体を固定化した担体に適当なブロッキング剤、例えばＰＢＳ－ＢＳＡや市販のブロッキング剤、例えばブロックエース（大日本製薬）を加え、約４～４０℃、好ましくは２０～３７℃で、５分から数日、好ましくは１０分から２４時間、より好ましくは１０分～３時間インキュベーションすることによりブロッキングするのが好ましい。
　上記２種類のカスパーゼ－１４中間体又はその変異体に特異的な抗体の他方の抗体は二次抗体として使用し、標識する。標識としては、酵素標識、放射線標識、蛍光標識、などが挙げられる。酵素標識する場合、酵素を二次抗体に直接結合させて標識するか、または例えばアビジンービオチンのような相互反応性蛋白質を介して間接的に酵素で標識することもできる。酵素の抗体などへの結合は、例えば市販のチオール導入基試薬を利用して酵素及び標識すべき抗体などのそれぞれにチオール基を導入してから両者をＳ－Ｓ結合させることで行うことができる。酵素としては、ホースラディッシュパーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β－Ｄ－ガラクトシダーゼなどが挙げられる。酵素の検出は、その酵素に特異的な基質を用いて行うことができる。例えばホースラディッシュパーオキシダーゼを利用する場合、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジンジン）やＡＢＴＳ（２,２’－アジン‐ジ［３－エチルベンズチアゾリンスルホネート］）などが利用できる。
　かかる免疫測定は、前記一次抗体を固定した担体、前記標識した二次抗体、被検試料を混合し、インキュベーションすることにより、担体に固定化された一次抗体に被検試料中のカスパーゼ－１４中間体又はその変異体を結合せしめ、このカスパーゼ－１４中間体又はその変異体分子に標識二次抗体を結合せしめる。
　このようにして、標識化抗体は、試料中のカスパーゼ－１４中間体又はその変異体の量を反映した量において、担体に固定化された一次抗体と試料に由来するカスパーゼ－１４中間体又はその変異体を介して担体上に固定される。かかるインキュベーションは、適当な緩衝液、例えばＰＢＳ中で約４～40℃、好ましくは20～37℃で、５分から数日、好ましくは10分から24時間、より好ましくは10分～３時間行う。
　次に、上記担体から未結合の標識化抗体を分離する操作を行う。担体が固体担体である場合、この分離操作は固液分離により簡単に行うことができる。一定の既知量の標識二次抗体を使用した場合、担体に結合した標識もしくは未結合の標識又はこの両者を測定することができる。他方、任意の標識抗体を使用した場合、担体に結合した標識を検出、測定する。担体に結合した標識を検出するには、好ましくは担体を洗浄液、例えば適当な界面活性剤の入った緩衝液、例えばＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄して未結合の標識化抗体を除去した後に検出を行う。検出は標識の種類に依存して常法に従って行うことができる。
　以下に本発明の限定でない実施例を提供する。
１）組換プロカスパーゼ－１４の作成
　組換プロカスパーゼ－１４は、特表2002-500049号公報に記載の方法に従い、作成した。簡単には、所定のＰＣＲプライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲ増幅したヒトカスパーゼ－１４全長コード配列をプラスミドｐＱＥ－１００（Qiagen, Co.）にクローニングし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、発現させることで作製した。発現したプロカスパーゼ－１４はＮｉ－ＮＴＡアフィニティーカラム（Qiagen, Co.）、ＭｏｎｏＱ ＦＰＬＣシステム（アマシャム社）、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－７５ ＦＰＬＣシステム（アマシャム）によるクロマトグラフィーにかけることで精製した。組換プロカスパーゼ－１４はルゼート１リッター当たり２～３ｍｇの収量で得られた。
２）revC14-Y178SLの作製
　切断部位である、Y178までの大サブユニット（p20）（C14-Y178L）と、その後続配列からなる小サブユニット（p8）を逆転させ、p8-p20の構造体（revC14-Y178SL）を、以下のプライマーを用いて作製した。
　　　 P8-foward primer :ggaattccatatgcgacatgatcagaaaggctcatgc（配列番号１）
　　　 P8-reverse primer : ccgctcgagctgcagatacagccgtttccggag（配列番号２）
　　　 P20-forward primer : ccgctcgagatgagcaatccgcggtctttggaa（配列番号３）
　　　 P20-reverse primer: cgggatccctagtaggcgatgtatccctctaccgt（配列番号４）
　P8をPCRで増幅後、得られた産物をNde IおよびXho Iで消化した。また、p20についてもPCR増幅後、Xho I/Bam HIで消化した。これらの２つのDNA断片をNde I/Bam HIで消化した、pET15b　ベクターにligationし、得られたクローンの大量培養から、通常の方法で、Ni-agroseカラムを用いてリコンビナント蛋白を精製した。図３にカスパーゼ－１４中間体の作成の模式図を示す。
３）revC14-Y178SL、C14-Y178L及び各種カスパ－ゼの酵素活性の測定
　カスパーゼのそれぞれの基質は、Bio Vision, Inc（Mountain View, CA）より購入した。
　C14 Assay Buffer（Na citrate（-）,（+））+ DTT 80μｌに、revC14-Y178SL、C14-Y178L及び 各種カスパーゼ（それぞれ、0.47mg/mlをPBSで10倍希釈したもの）15μlを加え、混合した。これに１mＭの各基質を加え、37℃で10分置いた後、excitation:355 nm、emission:460 nmで蛍光強度の変化を測定した。測定には、フルオロスキャンアセントFL（Labsystems）を用いた。その結果を図４に示す。
　revC14-Y17SL8及びC14-Y178Lは、ほぼ同様の基質特異性を示し、また活性化カスパーゼ－１４が特異性を示す基質WEHDに対しては全く酵素活性を示さなかった。またその酵素活性には、通常カスパーゼなら必要なコスモトロピックイオンを必要としなかった。
４）revC14-Y178SL、C14-Y178Lによる活性化カスパ－ゼ-14の生成
　pCMV-HAベクターにrevC14-Y178SLを導入したコンストラクトを作製した。培養ケラチノサイト（増殖期）に、FuGENE HD（Roche, Mannheim, Germany）を用いてトランスフェクションした。コンフルエント時に1.2 mMのカルシウムを添加し内在性のカスパーゼ-14の産生を誘導した。細胞を冷メタノールで固定後、抗HA抗体およびh14D146抗体（カスパーゼ-14の活性化体のみを認識）を用いて、通常の方法で免疫染色した。Alexa Fluor 455（緑）555（赤）の蛍光二次抗体を用いて二重染色を行った。あわせて、DAPIを用いて核の染色を行った。その結果（コンフルエントで３日目）を図５に示す。
　Y１７８中間体を発現している細胞は、緑の蛍光を発している（→で表示）。これらの細胞は、二重染色でカスパーゼ-14活性化体のみを認識するh14D146抗体陽性であり、中間体により、カスパーゼ-14の活性化体が生成されることが示された。
　したがって、活性化カスパーゼ－１４の生成は、プロカスパーゼ－１４をrevC14-Y178SLとインキュベーションすることで認められた。
５）ｈ14Ｙ178抗体によるヒト表皮の免疫組織化学染色方法
　ヒト健常皮膚、アトピー性皮膚疾患を罹患した患者の皮疹部及び無疹部の皮膚凍結切片をそれぞれ４％のＰＦＡ（パラホルムアルデヒド）で室温、２０分固定し、ブリーチ（10％のメタノール、３％の過酸化水素／蒸留水）により、内因性のペルオキシダーゼを除去した後、ＥＮＶＩＳＩＯＮキット（ダコ）を用いて染色を行った。具体的には、10％のヤギ正常血清（ニチレイ社製）にて室温、２時間ブロッキング処理し、revC14-Y178SL、C14-Y178のY178部位を特異的に認識するｈ14Ｙ178抗体（1/200）と４℃、一晩反応させた後、ＰＢＳで室温にて15分×３回、余剰抗体を洗浄した。次に、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギ二次抗体（ダコ）と室温で１時間反応させ、再度ＰＢＳで室温にて15分×３回洗浄し、余剰抗体を洗浄し、DABを用いて発色させた。最後にヘマトキシニンを用いて核染色を行った。その結果を図６及び７に示す。
　ｈ14Ｙ178抗体による免疫染色では、アトピー性皮膚疾患を罹患した患者の皮疹部において、基底層直上から顆粒層まで、広範に染色されていることがわかる（図中の→で示した部分がｈ14Ｙ178抗体により特異的に染色された部分）。従って、ｈ14Ｙ178抗体は、正常な活性型カスパーゼ-14を染色する抗体、即ちカスパーゼ－１４のＤ１４６位の切断部を認識するC14D146Abとは異なり、角化の異常を簡単に認識できるものと考えられる。

Claims (6)

  1. 　表皮中のカスパーゼ－１４のアミノ酸１位～178位からなるポリペプチド（C14-Y178L）であるカスパーゼ－１４中間体又は１もしくは数個のアミノ酸が置換、付加もしくは欠失し、かつプロカスパーゼのD146を切断する活性を有するその変異体を、フィラグリンの分解異常による不全角化を原因とする皮膚疾患のマーカーとして、検出することを含む方法。
  2. 　前記皮膚疾患がアトピー性皮膚炎、乾癬脂漏性皮膚炎、日光性角化症、紅色粃糠疹及び全身性エリテマトーデスの不全角化を示す疾患群から選ばれるである、請求項１記載の方法。
  3. 　前記検出を、カスパーゼの178位での切断部位を特異的に認識する抗体を用いて行うことを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
  4. 　前記検出方法が免疫染色方法である、請求項３記載の方法。
  5. 　前記検出方法がＥＬＩＳＡである、請求項３記載の方法。
  6. 　C14-Y178Lがカスパーゼ－１４のアミノ酸179位～242位からなるポリペプチドと二量体を形成する、請求項１～５のいずれ１項記載の方法。
PCT/JP2012/078209 2011-10-31 2012-10-31 カスパーゼ－１４中間体による皮膚疾患の検出 WO2013065754A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011239577A JP5355658B2 (ja) 2011-10-31 2011-10-31 カスパーゼ−１４中間体による皮膚疾患の検出
JP2011-239577 2011-10-31

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013065754A1 true WO2013065754A1 (ja) 2013-05-10

Family

ID=48192095

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2012/078209 WO2013065754A1 (ja) 2011-10-31 2012-10-31 カスパーゼ－１４中間体による皮膚疾患の検出

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP5355658B2 (ja)
WO (1) WO2013065754A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003171400A (ja) * 2001-12-07 2003-06-20 Shiseido Co Ltd 活性型カスパーゼ−１４特異的抗体及びその作成方法
JP2006117594A (ja) * 2004-10-22 2006-05-11 Shiseido Co Ltd 活性型カスパーゼ−１４特異的抗体及びその作成方法
WO2009142268A1 (ja) * 2008-05-23 2009-11-26 株式会社資生堂 ブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした天然保湿因子による皮膚バリアー機能状態の評価方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003171400A (ja) * 2001-12-07 2003-06-20 Shiseido Co Ltd 活性型カスパーゼ−１４特異的抗体及びその作成方法
JP2006117594A (ja) * 2004-10-22 2006-05-11 Shiseido Co Ltd 活性型カスパーゼ−１４特異的抗体及びその作成方法
WO2009142268A1 (ja) * 2008-05-23 2009-11-26 株式会社資生堂 ブレオマイシン水解酵素の活性を指標とした天然保湿因子による皮膚バリアー機能状態の評価方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FISCHER H. ET AL.: "Stratum corneum-derived caspase-14 is catalytically active", FEBS LETT., vol. 577, no. 3, 19 November 2004 (2004-11-19), pages 446 - 450, XP004647178 *
YAMAMOTO MAMI ET AL.: "Quantification of activated and total caspase-14 with newly developed ELISA systems in normal and atopic skin", J. DERMATOL. SCI., vol. 61, no. 2, February 2011 (2011-02-01), pages 110 - 117, XP028128162 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013096826A (ja) 2013-05-20
JP5355658B2 (ja) 2013-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9880177B2 (en) Fibrosis biomarker assay
JP5059600B2 (ja) 扁平上皮細胞癌関連抗原を指標とする皮膚性状の評価方法
Barascuk et al. Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of a specific MMP-9 mediated degradation fragment of type III collagen—A novel biomarker of atherosclerotic plaque remodeling
JPH0417640B2 (ja)
US20090075298A1 (en) Method of analyzing enzyme
Larrauri et al. sgp120 and the contact system in hereditary angioedema: a diagnostic tool in HAE with normal C1 inhibitor
EP2443148A1 (en) Diagnostical use of peroxiredoxin 4
Cummings et al. Serum leucine-rich alpha-2-glycoprotein-1 binds cytochrome c and inhibits antibody detection of this apoptotic marker in enzyme-linked immunosorbent assay
Nägler et al. An enzyme-linked immunosorbent assay for human cathepsin X, a potential new inflammatory marker
KR100884487B1 (ko) 인자 ⅶ-활성화 프로테아제의 돌연변이체 및 특이적 항체를 포함하는 진단학적 조성물
US20150160201A1 (en) Compositions and Methods for Detecting Unstable Arteriosclerotic Plaques
JP5355658B2 (ja) カスパーゼ−１４中間体による皮膚疾患の検出
Hernández-Aguilera et al. Assessment of extracellular matrix-related biomarkers in patients with lower extremity artery disease
Yasuda et al. A new selective substrate for cathepsin E based on the cleavage site sequence of α2-macroglobulin
Deguchi et al. Plasma skeletal muscle myosin phenotypes identified by immunoblotting are associated with pulmonary embolism occurrence in young adults
JP2012510614A (ja) オピオルフィン等の塩基性プロリンリッチ涙液遺伝子産物のバイオマーカーとしての使用
KR101159516B1 (ko) 동맥 혈전증에 대한 위험 인자로서 인자 ⅶ-활성화프로테아제(ｆｓａｐ)의 마르부르그 ⅰ 돌연변이체
ES2348397T3 (es) Metodos para medir la actividad de adamts13 en la superficie de las plaquetas.
JP2011254815A (ja) 酵素反応を測定するための均質な活性試験
US20230408528A1 (en) Peptide quantitation assay for differentiating full-length high molecular weight kininogen (hmwk) andcleaved hmwk
JP4726031B2 (ja) Ｘ型ホスホリパーゼａ２の免疫測定方法
CN114981661A (zh) 用于诊断与嗜中性粒细胞胞外陷阱相关的纤溶功能不全的方法
CA2814583A1 (en) Quantitation of urinary tissue factor for the diagnosis and screening of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 12845911

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 12845911

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1