JPH0417640B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プラスミノゲン、組織プラスミノゲ
ンアクチベーター（tissue plasminogen
activator）によりプラスミノゲンをプラスミン
に転化するための刺戟物質（stimulator）、及び
プラミンと反応して検出可能な反応生成物を与え
るプラスミン基質と共に試料をインキユベートす
ることにより成る、試料における組織プラスミノ
ゲンアクチベーターの活性を検定する（assay）
方法に関する。更に、本発明はこの方法を行なう
のに好適な試薬が存在する容器を含んで成るキツ
ト（kit）に関する。

プラスミノゲンアクチベーターはプラスミンへ
のプラスミノゲンの転化を触媒作用する。プラス
ミンは血餅中に存在するフイブリンを分解するこ
とによつて血餅を溶解することができる。種々の
プラスミノゲンアクチベーターが知られている
が、その最も重要なものはウロキナーゼ（UK）
及び組織型プラスミノゲンアクチベーター
（TA）である。特に、TAは、最も確からしくは
フイブリンに対するその特異的親和性の結果とし
て、生体内におけるフイブリノリシスに関与する
ように見える。故に、健康な人々及び反復性血栓
症（recurrent thrombosis）又は予期しない出血
の如き或る種の疾患を有する患者の体液、特に、
血漿におけるTAの活性を評価するための信頼性
のある簡単な方法の必要は大きい。

３種の異なつた種類のTA検定、即ち、免疫学
的検定、直接の機能的検定及び間接の機能的検定
は区別することができる。免疫学的検定において
は、プラスミノゲンアクチベーター抗原の存在は
検出されるが、これらの方法は酵素の活性に関し
て情報を与えない。直接の機能的検定において
は、基質、たとえば（ラベルされた）プラスミノ
ゲン又は合成の発色原性（chromogenic）もしく
は発螢光原性（fluorogenic）ペプチド基質のプ
ラスミノゲンアクチベーターによる加水分解が測
定される。間接的機能的検定（indirect
functional assays）においてはプラスミノゲン
はプラスミノゲンアクチベーターの影響下にプラ
スミンに転化され、そして形成されたプラスミン
の量はプラスミン基質を使用することによつて検
定される。関与する２つの反応、即ち、プラスミ
ノゲンの活性化及び基質の加水分解は同時に又は
引き続いて行なうことができる。間接的機能的検
定の重要な例は、フイブリンプレート法及びフイ
ブリンクロツト溶解に必要な時間を測定する種々
の方法である。これらの方法のすべてにおいて、
天然のプラスミン基質、即ちフイブリンが使用さ
れる。TAに対する鋭敏な免疫学的検定は現在で
は利用可能ではない。直接的機能的検定は、十分
に鋭敏ではないか又は煩雑である。種々の鋭敏な
間接的検定が使用可能である。フイブリンプレー
ト法及びクロツト溶解時間法（clot lysis time
method）は、関与する反応の経路が速度論的に
不明確であるという欠点を有する。これは、特に
抑制物質が存在するとき、血漿においてそうであ
るが、これらの方法により得られる結果の解釈が
何故困難であるかという理由である。

本発明は、プラスミノゲン、組織プラスミノゲ
ンアクチベーターによりプラスミノゲンをプラス
ミンに転化するための刺戟物質（stimulator）、
及びプラスミンと反応して検出可能な反応生成物
を与えるプラスミン基質と共に試料をインキユベ
ートすることより成る、試料における組織型のプ
ラスミノゲンアクチベーターの活性の間接検定方
法に関する。

かかる方法は、M.Ranby and P.Walle´n、
Progress in Fibrinolysis Vol.V、Editors：J.F.
Davidson、J.M.Nilsson、B.Astedt；Chuchill
Liuingstone、Edinburgh 1981. に記載されている。この方法において、TAの活
性を検定されるべき試料はプラスミノゲンと共に
インキユベートされる。形成されたプラスミンは
ペプチド基質Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNA（こ
こで、pNAはｐ−ニトロアニリンを表わす）の
加水分解を触媒作用し、それによつて着色した化
合物、ｐ−ニトロアニリン（pNA）を放出する。
この化合物の形成は分光測光により測定すること
ができる。この方法の原理は第１図において略図
で示される。ランバイ（Ranby）及びウオーレン
（Walle´n）は組織プラスミノゲンアクチベーター
によりプラスミノゲンをプラスミンに転化するた
めの刺戟物質としてフイブリンモノマーを使用す
る。これはプラスミン形成速度の非常に高い増加
をもたらす。しかしながら、この方法の欠点は、
フイブリンモノマーが僅かに可溶性であり、その
ことがなかでも濁度によつてその方法を複雑にす
る。即ち、混合物はインキユベーシヨンの後過
されなければならず、その後で分光測光評価を行
なうことができる。

公知の検定方法におけるフイブリンモノマーの
低い溶解性の欠点は、少なくとも部分的にフイブ
リノゲン又はフイブリン分子のＤ−領域（Ｄ−
domains）を含有して成りそしてフラグメントＸ
より小さい水溶性フイブリノゲン又はフイブリン
フラグメントを組織プラスミノゲンアクチベータ
ーの作用下にプラスミノゲンをプラスミンに転化
するための刺戟物質として使用することによつて
回避することができる。

少なくとも部分的にフイブリノゲン又はフイブ
リン分子のＤ−領域を含有して成り且つフラグメ
ントＸより小さい水溶性フイブリノゲン及びフイ
ブリンフラグメントは知られている。それらはフ
イブリノゲン又はフイブリンの酵素による分解、
化学的もしくは機械的分解により得ることができ
る。

フイブリン又はフイブリン又はフイブリノゲン
の酵素による｛蛋白分解酵素による
（proteolytic）｝分解は普通はプラスミンにより
行なわれる。この分解は多数の中間生成物を経由
して進行する。最初にフイブリノゲンと比較して
Aα−鎖のＣ−末端端部（Ｃ−terminal ends）の
重要な部分が欠如しているフラグメントＸが形成
される。次いでフラグメントＸはフラグメントＹ
及びフラグメントＤに分解され、次いでフラグメ
ントＹはフラグメントＤ及びフラグメントＥに分
解される。Ｄ−フラグメントは、フイブリノゲン
分子の中間鎖及びＣ−末端領域（Ｃ−terminal
regions）から生じそしてＥ−フラグメントは６
個のフイブリノゲン鎖のすべてのＮ−末端領域の
残余から成る。Ｄ−フラグメントの均一性、構造
及び性質は、プラスミンによる分解が行なわれる
媒体に依存する。たとえば、カルシウムイオンの
存在下の分解はＤ−cate−フラグメントと呼ば
れ、そしてγ−鎖のそのままのＣ−末端端部を含
有する均一なＤ−フラグメントを生じる
〔Tromb.Res、10803−812（1977）〕EGTA又は同
様な化合物の存在下ではＤ EGTAと呼ばれる
他のＤ−フラグメントが形成される。Ｄ−cateと
比較して、このフラグメントはそのγ−鎖残余の
Ｃ−末端端部において13000の分子量を有する部
分に欠けている〔Biochim.Biophys.Acta 667、
321−327（1981）〕。架橋したフイブリンをカルシ
ウムイオンを含有する媒体中でプラスミンにより
分解するとＤ−二量体−フラグメント＋Ｅ−フラ
グメントを生じる〔J.Biol.Chem.248、4584−
4590（1973）〕。Ｄ−二量体はそれらのγ−鎖のＣ
−末端部分を介してイソペプチド結合した２つの
Ｄ−cateフラグメントから成るものと考えること
ができる。

フイブリン又はフイブリノゲンの酵素により得
られたフラグメントの中では、該フラグメントが
少なくとも部分的にフイブリン又はフイブリノゲ
ン分子のＤ−領域を含有して成りそしてフラグメ
ントＸより小さいとの条件下に、刺戟性フラグメ
ントの何れも本検定方法において使用することが
できる。フラグメントＸはフイブリン（フイブリ
ノゲン）分子のＤ−領域を含有して成るけれど
も、フラグメントＸは組織プラスミノゲンアクチ
ベーターの影響下にプラスミノゲンをプラスミン
に転化することに対して刺戟活性を殆んど及ぼさ
ないことが見出された。フラグメントＹ及びＤ−
フラグメント、Ｄ EGTA及びＤ−二量体は刺
戟物質として優れて好適であり、そしてＤ−cate
は刺戟物質として幾分少なく好適である。フラグ
メントＹは最も好ましい。Ｄ−二量体はTAによ
るプラスミンへのプラスミノゲンの転化に対する
刺戟活性を持つのみならずプラスミンの蛋白分解
活性に対する抑制作用も有するので最大刺戟を誘
発しない。記載された他のフラグメントはこの性
質をもたない。Ｅ−フラグメントは本検定方法に
対しては適当ではない。何故ならばそれらは所望
の刺戟活性を示さないからである。

フイブリン又はフイブリノゲンの分解に対する
公知の化学的方法はCNBrによる処理である。

CNBrによるフイブリノゲンの分解は、たとえ
ば、Nature 218（1968）、130−134頁においてB.
Blomba¨ck et al.により記載されている。この分
解はフイブリノゲンの構造の解明と関連して実施
された。この方法に従えば、70％ギ酸中１％フイ
ブリノゲン溶液を70％ギ酸に対して５℃で一夜透
析する。次いで溶液100ml当りCNBr1.3ｇを加え
て、そし溶液を室温で20−25時間放置する。
CNBrによる分解により得られるフラグメントは
更に分離することなく、本検定方法における刺戟
物質として優れて有用である。所望ならば、混合
物は個々のフラグメントに分割することができ、
そして少なくとも部分的にフイブリン（フイブリ
ノゲン）のＤ−領域を含有して成る活性フラグメ
ントを本検定方法において使用することができ
る。しかしながら、CNBrとの反応により得られ
るフラグメント混合物をそのままで使用し、それ
により時間のかかる分離を回避することは好まし
い。CNBrとの反応により得られるフラグメンの
混合物のそのままの使用は完全に再現可能な結果
を与えることが見出された。CNBr処理の反応生
成物から使用される試薬及び低分子生成物たとえ
ば、安定化の目的でフイブリノゲン調製物中に存
在し得る塩及び糖を除去することは望ましい。こ
れは約10000の分子量を有する化合物の通過を許
容するセロハン膜を使用する蒸留水に対する透析
により最も容易に達成される。透析後に得られる
フラグメントの溶液は凍結乾燥することができ又
は凍結した状態で溶液として貯蔵することができ
る。

CNBrとの反応によるフラグメントの製造はフ
イブリンを用いて実施して同じ良好な結果を得る
ことができる。

本方法に使用されるプラスミノゲンはできる限
り純粋であるべきであり、特にできるだけ少ない
量のプラスミンを含有するべきである。何故なら
ば、プラスミンはアクチベーター（TA）の影響
下に形成されるプラスミンと同様に基質と反応す
るからである。

プラスミンと反応して検出可能な反応生成物を
与えるプラスミン基質として、他のペプチド基
質、たとえばＨ−Val−シクロヘキシルアラニン
−Arg−pNAも使用することができるけれども
前記したＨ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNAが好ま
しい。

一般に、適当な基質は、ｐ−ニトロアニリン又
は他の発色原性もしくは発螢光原性基が結合して
いるアミノ酸がLys又はArgであり、そしてLys
又はArgに結合したアミノ酸が無極性（apolar）
アミノ酸である基質である。

以下において、フイブリノゲンフラグメントな
る用語は、対応するフイブリンフラグメントも意
味する。

試験は、プラスミノゲン及びフイブリノゲンフ
ラグメントは、形成されたプラスミンの量（従つ
てｐ−ニトロアニリンの量）と存在するTAの量
との間の良好な相関を得るために或る最小値以上
の濃度で存在しなければならないことを示した。
かくして、フイブリノゲンフラグメントは少なく
とも120μｇ／ml（第２図参照）の濃度で存在す
るべきでありそしてプラスミノゲン濃度は少なく
とも0.06μM（第５図）であるべきである。

本検定方法の基礎をなす反応において、光学密
度の変化として測定されるｐ−ニトロアニリンの
形成は、或る条件を満足するとき時間の自乗にほ
ぼ比例している。これはパラボラ系（parabolic
system）と呼ばれる。第３図において、光学密
度の変化は時間（hrs）での時間の自乗に対して
プロツトされている。これは実質的に１次関係を
示す。

この系はPHに依存している（第４Ａ図参照）。
最適値は８の値にあるが、生物学的液体における
測定を簡単にするためにたとえばより生理的な、
7.5のPHを選ぶことができる。

上記系は約37℃（第４Ｂ図）の温度最適値を示
す。しかしながら、長いインキユベーシヨン期間
中の蒸発を回避するためにより低い温度、たとえ
ば25℃を十分使用することができる。

プラスミノゲン濃度が変ると（第５図）約0.06
−0.07μMのプラスミノゲン濃度で高原部に到達
するけれど、プラスミノゲン濃度の差が小さいこ
とによる試験結果変動を最小とするように幾分高
いプラスミノゲン濃度を使用することが好まし
い。良好な結果は0.13μMのプラスミノゲン濃度
を使用して得られた。

一般に、インキユベーシヨン時間は２時間より
長くする必要はない。しかしながら、非常に少な
い量のアクチベーター（TA）を検定するために
より高い感度が必要な場合には、インキユベーシ
ヨンは長時間行なうことができる。しかしなが
ら、最大感度及び検出限界はプラスミノゲン調製
物における痕跡量のプラスミンの存在によつて制
限される。

標準条件下に行なう場合には、或るインキユベ
ーシヨン時間の後405nｍにおける光学密度の変
化はアクチベーター濃度に正比例する。かくして
第６Ａ図は、加えられた精製されたTAの濃度に
対して２時間のインキユベーシヨンの後405nｍ
における光学密度変化の標準曲線を示す。第６Ｂ
図においては、17時間のインキユベーシヨンの後
の標準曲線が与えられている。両方の場合におい
て、一次性は広い範囲にわたつて優れている。

本分光測光検定方法を公知のフイブリンプレー
ト法と比較した。両方法の相関関係は良好であ
る。しかしながら、本方法の感度及び精度はフイ
ブリンプレート法のそれより良好である。しかし
ながら、本方法の大きい利点はその簡単であるこ
と及び結果を得るために必要な時間が短いことで
ある。フイブリンプレート法は17時間を必要とす
るが、これに対して、本方法の結果は１〜２時間
で知ることができる。この点から、本方法は精製
操作の進行を決定するためにTA調整物の純度を
チエツクするためにも好適である。その場合に、
TAの存在又は不存在を定性的に検出すれば十分
であることがしばしばである。試料のTA活性に
依存して、結果は２〜10分で知られる。本検定方
法は、たとえ調製物が不純であるとしてもTAの
みに限つて検出するのには十分に特異的である。

本方法は、血漿中のTA活性を検定するために
使用することができる。本方法は、血漿中の検定
においても、非常に特異的であるようにみえる。
即ち、抗−TA−IgGが加えられたとき、TAは殆
んど検出可能であるようには見えない。これは血
漿中の他の蛋白分解酵素の存在においてすら、こ
れらの酵素は本検定システムにより検定されない
ことを示す。

血漿中の非常に低いTA活性の検定は、抑制
剤、多分、α₂−抗プラスミン及びα₂−マクログロ
ブリンの存在によつて強く影響される。血漿中の
低いTA活性の検定のために、たとえば、真性グ
ロブリンフラクシヨン（euglobulin fractions）
による検定を遂行することによりこれらの抑制剤
を除去すること又は不活性化することが必要であ
る。真性グロブリンフラクシヨンによる検定にお
いても、本方法とフイブリンプレート法間の良好
な相関関係を見出すことができる。

本検定方法における刺戟物質として使用される
フイブリン又はフイブリノゲンフラグメントは、
プラスミノゲンアクチベーターウロキナーゼが刺
戟されないのでTAに対する特異性を有する。

本方法は、より短い時間を必要とし、そしてフ
イブリンプレート又はクロツト溶解時間方法より
も更に鋭敏である。本方法は、他の方法とは対照
的に、TAによるプラスミノゲン活性化の速度論
的実験に対しても好適である。使用される試薬の
すべては可溶性であり、試験は行なうのが容易で
あり、そして特別な装置を必要としない。

多数の試料の通常の測定のために、検定は、ミ
クロタイタープレート（microtiter plates）にお
いて行なうことができ、そして特定の多量チヤン
ネル分光光度計を精度が少々失なわれるだけで使
用することができる。

インキユベーシヨンは、正しく閉じた管が蒸発
を防止するために使用されるとき25℃の代わりに
37℃で行なうことができる。これは約３の換算係
数だけ反応速度を促進する。

濁つた試料を検定しなければならないとき、再
現性は種々のインキユベーシヨン時間で測定する
ことにより増加させることができ、そして一定時
間後△Ａ（光学密度の変化）の代わりに時間の自
乗に対して△Ａの勾配を活性に対する目安として
採用することができる。種々のインキユベーシヨ
ン時間後の測定はミクロタイタープレート及び適
当なミクロタイター分光光度形により容易に行な
うことができる。

本方法の他の使用は、組織及び細胞培養倍地に
おける組織型アクチベーターの活性の分析であ
る。フイブリノゲンフラグメントはウロキナーゼ
（UK）の活性に対して影響しないので、刺戟物
質の存在下及び不存在下に検定することにより
TAとUKの間で区別することが可能である。し
かしながら、もし、UK及びTAが同時に存在し
そしてUKの量がTAの量よりはるかに大きいな
らば刺戟物質の不存在及び存在下の測定は問題を
解決しない。その場合に、抗−UK−IgG（anti−
UK−IgG）及び抗−TA−IgG（anti−TA−IgG）
の存在及び不存在下の測定は所望の結果を与える
であろう。

本発明は、前記した検出方法を達成するための
キツト型の組合せにも関する。かかる組合せは、
少なくとも下記構成部品を含んで成る： ａ プラスミンと反応して検定可能な反応生成物
を与えるプラスミンのための測定された量の基
質、特にＨ−Ｄ−Val−Leu−Lys−pNAを有
する容器、 ｂ 測定された量のプラスミノゲンを有する容器
及び ｃ 少なくとも部分的にフイブリノゲン又はフイ
ブリン分子のＤ−領域を含有して成りそしてフ
ラグメントＸより小さい測定された量の水溶性
フイブリノゲン又はフイブリンフラグメント、
好ましくはフイブリノゲン又はフイブリンを
CNBrと反応させ、反応生成物から低分子量成
分を除去しそして得られる溶液を凍結乾燥する
ことにより得われたフイブリノゲン又はフイブ
リンフラグメントを有する容器。

本発明に従う好ましいキツトは、12−20：１：
10−20、特に14−15：１：10の重量比におけるプ
ラスミンのための好ましい基質、プラスミノゲン
及び好ましい凍結乾燥したフイブリノゲンフラグ
メントを有する容器を具備する。

本発明に従うキツトは、場合により表面活性
剤、好ましくはTween80を含有する緩衝剤溶液
を有する容器を具備することもできる。好ましく
は緩衝剤溶液は7.5のPHを有する0.1Mトリス−
HCl（Tris−HCl）緩衝液である。

場合により、本発明に従うキツトは、１つ又は
それより多くの操作使用説明書、たとえば下記実
施例11に記載された如き使用説明書を含んで成
る。

他方、本発明に従うキツトは測定を制御せしめ
るように測定された量の組織型プラスミノゲンア
クチベーター（TA）を有する容器を具備するこ
ともできる。

本発明に従うキツトは測定された量の抗−TA
−IgG及び抗−UK−IgGを有する容器を具備す
ることもできる。

下記実施例により本発明を説明する。

実施例 １ 刺戟物質の調製 凍結乾燥した人間のフイブリノゲン（１ｇ；
Kabi；銘柄Ｌ）を70％（ｖ／ｖ）ギ酸100ml中に
溶解する。次いで1.3ｇCNBrを加え、そして混
合物を室温で24時間放置する。次いで得られる溶
液を室温で16−24時間蒸留水４×２に対して透
析する。溶液の凍結乾燥は本検定方法における刺
戟物質として使用することができるフイブリノゲ
ンフラグメント約700mgを生じる。

下記実施例において、下記物質を使用する： プラスミノゲン。人間のプラスミノゲン、リジ
ン−オイパーギツト（lysine−eupergit）に対す
るアフイニテイ−クロマトグラフイーによつてコ
ーン（Cohn）に従つてフラクシヨンから単離
されたリジン−プラスミノゲン（Lys−
plasminogen）から主として成る混合物、プラス
ミノゲンアクチベーター。これはRijken等の方
法により人間の子宮から単離された〔Biochem.
Biophys.Acta 580（1979）、140−153〕。

発色原性プラスミン基質。この基質は式Ｈ−Ｄ
−Val−Leu−Lys−ｐ−ニトロアニリン、2HCl
を有しそしてKabi社から得られた。

実施例 ２ プラスミノゲンアクチベーター（TA：
0.052IE）を、プラスミノゲン0.13μM、Tween80
0.1％（ｖ／ｖ）及び発色原性プラスミン基質
0.30ｍＭを含有するトリス−HCl緩衝液（0.10M、
PH7.5）１ml中で25℃でインキユベートする。イ
ンキユベーシヨンは実施例１に従つて得られる
種々の量のフイブリノゲンフラグメントの存在下
に行なわれ、そして２時間後、405nｍにおける
光学密度を、アクチベータを使用しない平行試験
において得られる混合物の光学密度と比較する。

結果は、光学密度（△Ａ（405）2h）の変化が
添加されたフイブリノゲンフラグメントの量に対
してプロツトされている第２図に与えられる。第
２図は光学密度の最大変化は約120μｇのフイブ
リノゲンフラグメントの量で到達することを示
す。

実施例 ３ プラスミノゲンアクチベーター（0.052IE）を、
プラスミノゲン0.13μM、Tween80 0.1％（ｖ／
ｖ）、フイブリノゲンフラグメント0.12mg／ml及
び発色原性プラスミン基質0.30ｍＭを含有するト
リス−HCl乾燥液（0.10M、PH7.5）１ml中で25℃
でインキユベートする。種々のインキユベーシヨ
ン時間後405nｍにおける光学密度を測定しそし
て同時に対照試験をアクチベーターなしで行な
う。第３図において、アクチベーターのある場合
とない場合の対応する試験間の光学密度の差をイ
ンキユベーシヨン時間の自乗に対してプロツトす
る。第３図はこれらの値の間にかなりの一次性が
あることを示す。

実施例 ４ (A) プラスミノゲンアクチベーター（0.052IE）
を種々のPHのトリス−HCl緩衝液（0.10M）１
ml中で25℃でインキユベートする。プラスミノ
ゲン、発色原性プラスミン基質及びフイブリノ
ゲンフラグメントの濃度は実施例３におけると
同じである。試験されるPH−値の各々において
ブランクを行なう。第４Ａ図はPH−値に対して
プロツトされた２時間後における405nｍにお
ける光学密度の変化を示す。最適値は約PH＝８
にある。

(B) 実施例３に記載の試験を種々の温度で行な
う。各温度でブランクを行なう。結果は第４Ｂ
図に与えられる。温度最適値は約37℃である。

実施例 ５ 実施例３に記載の試験を、プラスミノゲン濃度
を変えて行なう。プラスミノゲン濃度の各々にお
いて同時的ブランクを行なう。第５図において２
時間のインキユベーシヨンの後光学密度の変化
を、μMでのプラスミノゲン濃度に対してプロツ
トする。第５図は約0.07μMのプラスミノゲン濃
度で高原部に到達することを示す。

実施例 ６ (A) プラスミノゲンアクチベーターの量を変えて
実施例３に記載の条件下に試験を行なう。第６
Ａ図は、広範な濃度範囲において、２時間のイ
ンキユベーシヨン後の光学密度の変化とプラス
ミノゲンアクチベーターの濃度との間に一次関
係があることを示す。

(B) 光学密度を17時間のインキユベーシヨンの光
学密度を測定して(A)における如くして試験を行
なう。更に0.1％（ｗ／ｖ）のゼラチンを緩衝
液に加える。第６Ｂ図はこの場合にも良好な一
次性が得られることを示す。

実施例 ７ 本方法によつて得られる結果を、本方法及びフ
イブリンプレート方法により種々の量のプラスミ
ノゲンアクチベーターを検定することによつて、
フイブリンプレート法により得られた結果と比較
する。本方法は、実施例３に記載の如くして行な
うが、測定は４時間のインキユベーシヨンの後に
行なう。フイブリンプレート法は、Haverkate
et al.in“Progress in chemical Fibrinolysis
and Thrombolysis”Vol.1（1975）、pages 151−
159（Raven Press、New York）．により記載さ
れた如くして行なう。インキユベーシヨンは37℃
で18時間行なう。

第７図は両方法間に良好な相関関係があること
を示す。

実施例 ８ 人間の子宮の抽出物をRijken等（前記参照）
により記載の方法によつて亜鉛キレート／セフア
ロースによるクロマトグラフイーにより精製す
る。フラクシヨンの各々の5μの試料を本方法
（実施例３）によつて及びフイブリンプレート法
に従つてTA−活性に対して検定する。この場合
も、両方法間の良好な相関が第８図により示され
る。

実施例 ９ 前以つてDDAVPで処理された人の血漿（0.10
ml）（この処理は血漿中のTA濃度を増加させる
のに役立つ）を0.1％（ｖ／ｖ）のTween80及び
種々の量の抗−TA−ラビツト−IgGを含有する
トリス−HCl緩衝液（0.1M、PH7.5）0.4ml中で30
分間インキユベートする。次いで、発色原性プラ
スミン基質フイブリノゲンフラグメント及びプラ
スミノゲンを実施例３に従つて加え、そしてプラ
スミノゲンアクチベーターの残留活性を実施例３
の方法に従つて２時間のインキユベーシヨンによ
り検定する。光学密度の変化を正常な血漿に関し
て平行試験と比較して測定した。

第９図において、残留活性の百分率を抗−TA
−IgG濃度に対してプロツトする。これは、本検
定方法がTAに対して特異的であることを示す。

実施例 10 真性グロブリンフラクシヨンをKluft
〔Thrombos.Haemostas.41（1979）、363−
383and“Progress in Fibrinolysis”（1981）、24
−30；Churchill Livingstone、Edinburgh〕．の
方法に従つて調製する。フラクシヨン（0.10ml）
を実施例３に従う方法によつて及びKluftによつ
ても述べられているフイブリンプレート方法によ
つて（0.03ml）検定する。第１０図において、本
方法の結果をフイブリンプレート法により得られ
た結果に対してプロツトする（任意の単位）。や
はり、両方法間の良好な相関が存在する。第１０
Ａ図は、第１０図のグラフの最初の部分を拡大し
た形で示す。相関は低いTA活性に関しても優れ
ているように見える。

実施例 11 標準方法 Ａ 試験管に0.1％（ｖ／ｖ）のTween80を含有
するトリス−HCl緩衝液、PH7.5（0.48−ｖ）ml
を仕込む。蒸留水（0.02ml；６mg／ml）中のフ
イブノゲンフラグメントの溶液を加え、そして
注意深く混合する。次いでプラスミノゲンアク
チベーター活性に対して検定されるべき試料ｖ
mlを加える（５−55ｍIE；ｖ0.1ml）。注意深
く混合した後、前記したトリス緩衝液中のＤ−
Val−Leu−Lys−pNAの0.75ｍＭ溶液0.40mlを
加える。最後に反応を同じトリス緩衝液中の
1.3μMプラスミノゲン溶液0.10mlの添加によつ
て開始する。25℃で２時間のインキユベーシヨ
ンの後、405nｍにおける光学密度を蒸留水に
対して測定する。プラスミノゲンアクチベータ
ー溶液の代わりにトリス緩衝液ｖmlを加えるブ
ランク試験を同時に行なう。プラスミノゲンア
クチベーターがある場合とない場合の対応する
検定間の光学密度の差は、試料中の活性なプラ
スミノゲンアクチベーターの量に対する殆んど
一次の依存性を示す。

Ｂ Ａに記載の標準方法を無色プラスチツクのミ
クロタイタープレートにおいて行なうこともで
きる。その場合に、記載した条件下に検定を行
なうが、記載した容量の1/4のみを使用する。
２時間のインキユベーシヨンの後405nｍにお
ける光学密度を特定の多重チヤンネル分光光度
計で測定する。

実施例 12 実施例11Aに従う25の検定又は実施例11Bに従
う100の検定のためのキツトは下記のものを具備
する：0.1％（ｖ／ｖ）のTween80を有する容器、 乾燥形態のＨ−Ｄ−Val−Leu−Lys−
pNA7.7μモルを有する容器、これにはトリス緩
衝液10mlを使用前に加えなければならない。

乾燥形態にあるプラスミノゲン0.3mgを有する
容器、これにはトリス緩衝液2.5mlを使用前に加
えなければならない。

乾燥形態にある実施例１に従つて調製されたフ
イブリノゲンフラグメント３mgを有する容器、こ
れには蒸留化0.5mlを使用前に加えなければなら
ない。

実施例11A及び11Bに従う操作使用説明書、及
び Kluftの方法（前記参照）に従う真性グロブリ
ンフラクシヨンの調製のための使用説明書。

実施例 13 他のキツトは、実施例12の構成部品と同じ構成
部品を具備するが、更に、対照測定を行なうため
の無菌トリス緩衝液約0.10ml中のプラスミノゲン
アクチベーター（TA）0.5IEを有する容器を具備
する。

実施例 14 第３のキツトは実施例12又は13のキツトの構成
部品を具備するが、更に、対応する操作使用説明
書と共にTA及びUKに対して凍結乾燥された好
適な量の免疫グロブリンを有する容器を具備す
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の原理を示す略図であ
る。第２図は実施例２における、添加されたフイ
ブリノゲンフラグメントの量に対して光学密度の
変化（△Ａ（405）／2h）をプロツトした図であ
る。第３図は、実施例３における、アクチベータ
ーのある場合とない場合の対応する試験間の光学
密度の差をインキユベーシヨン時間の自乗に対し
てプロツトした図である。第４Ａ図は実施例４の
Ａにおける２時間のインキユベーシヨン時間の後
の405nｍにおける光学密度の変化を種々のPH値
に対してプロツトした図である。第４Ｂ図は実施
例４のＢにおける種々のインキユベーシヨン温度
に対して光学密度の変化をプロツトした図であ
る。第５図は実施例５における、２時間のインキ
ユベーシヨンの後の光学密度の変化を種々のプラ
スミノゲン濃度に対してプロツトした図である。
第６Ａ図は実施例6Aにおける２時間のインキユ
ベーシヨンの後の光学密度の変化をプラスミノゲ
ンアクチベーターの種々の濃度に対してプロツト
した図である。第６Ｂ図は実施例6Bにおける、
光学密度の変化をプラスミノゲンアクチベーター
の種々の濃度に対してプロツトした図である。第
７図は実施例７における本発明の方法とフイブリ
ンプレート法の比較を示す図である。第８図は実
施例８における本発明の方法とフイブリンプレー
ト法の比較を示す図である。第９図は実施例９に
おけるプラスミノゲンアクチベーターの残留活性
を種々の抗−TA−IgG濃度に対してプロツトし
た図である。第１０図は実施例10における本発明
の方法とフイブリンプレート法の比較を示す図で
ある。第１０Ａ図は第１０図の始めの部分の拡大
図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ プラスミノゲン、組織プラスミノゲンアクチ
   ベーター（TA）によりプラスミノゲンをプラス
   ミンに転化するための刺戟物質、及びプラスミン
   と反応して検出可能な反応生成物を与えるプラス
   ミンのための基質と共に試料をインキユベート
   し、そして形成される該反応生成物の量を測定す
   ることより成る試料中の組織プラスミノゲンアク
   チベーターの活性を検定する方法において、少な
   くとも部分的にフイブリノゲン又はフイブリン分
   子のＤ−領域を含有し且つフラグメントＸより小
   さい水溶性のフイブリノゲン又はフイブリンフラ
   グメントを、組織プラスミノゲンアクチベーター
   によりプラスミノゲンをプラスミンに転化するた
   めの刺戟物質として使用することを特徴とする試
   料中の組織プラスミノゲンアクチベーターの検定
   方法。 ２ フイブリノゲン又はフイブリンをCNBrと反
   応させそして反応生成物から低分子成分を除去す
   ることにより得られるフイブリノゲン又はフイブ
   リンフラグメントを使用する特許請求の範囲第１
   項記載の方法。 ３ 少なくとも下記の構成部品： ａ プラスミンと反応して検出可能な反応生成物
   を与えるプラスミンのための測定された量の基
   質を有する容器、 ｂ 測定された量のプラスミノゲンを有する容
   器、及び ｃ 少なくとも部分的にフイブリノゲン又はフイ
   ブリン分子のＤ−領域を含有し且つフラグメン
   トＸより小さい測定された量の水溶性のフイブ
   リノゲン又はフイブリンフラグメントを有する
   容器 から成ることを特徴とする、プラスミノゲン、組
   織プラスミノゲンアクチベーター（TA）により
   プラスミノゲンをプラスミンに転化するための刺
   戟物質、及びプラスミンと反応して検出可能な反
   応生成物を与えるプラスミンのための基質と共に
   試料をインキユベートし、そして形成される該反
   応生成物の量を測定することにより試料中の組織
   プラスミノゲンアクチベーターの活性を検定する
   方法を実施するためのキツト。 ４ フイブリノゲン又はフイブリンフラグメント
   がフイブリノゲン又はフイブリンをCNBrと反応
   させそして反応生成物から低分子成分を除去する
   ことにより得られたものである特許請求の範囲第
   ３項記載のキツト。 ５ プラスミンのための基質がＨ−Ｄ−Val−
   Leu−Lys−ｐ−NA（ここで、NAはニトロアニ
   リンを表わす）である特許請求の範囲第３項又は
   第４項記載のキツト。 ６ フイブリン又はフイブリノゲンフラグメント
   が、フイブリン又はフイブリノゲンをCNBrと反
   応させ、反応生成物から低分子成分を除去しそし
   て生じる溶液を凍結乾燥することにより得られた
   ものである特許請求の範囲第３〜５項のいずれか
   に記載のキツト。 ７ (a) Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−ｐ−NA（こ
   こで、NAはニトロアニリンを表わす）を有す
   る容器、 (b) プラスミノゲンを有する容器、及び (c) 特許請求の範囲第５項記載のフイブリノゲン
   フラグメントを有する容器 から成り、該Ｈ−Ｄ−Val−Leu−Lys−ｐ−NA
   対該プラスミノゲン対該フイブリノゲンフラグメ
   ントの重量比が12〜20：１：10〜20、特に14〜
   15：１：10である特許請求の範囲第３〜６項のい
   ずれかに記載のキツト。 ８ 場合により表面活性剤を含有していてもよい
   緩衝剤溶液を有する容器を更に具備する特許請求
   の範囲第３〜７項のいずれかに記載のキツト。 ９ 該緩衝剤溶液が0.1Mトリス−HCl緩衝液PH
   7.5である特許請求の範囲第８項記載のキツト。 １０ 表面活性剤がTween80である特許請求の
   範囲第８項又は第９項記載のキツト。 １１ １種又はそれ以上の操作説明書を更に具備
   する特許請求の範囲第３〜１０項のいずれかに記
   載のキツト。 １２ 測定された量の組織プラスミノゲンアクチ
   ベーター（TA）を有する容器を更に具備する特
   許請求の範囲第３〜１１項のいずれかに記載のキ
   ツト。 １３ 測定された量の抗−TA−IgG及び抗−UK
   −IgGを有する容器を更に具備する特許請求の範
   囲第３〜１２項のいずれかに記載のキツト。