FI91777C - Menetelmä plasmiiniaktiivisuuden määrittämiseksi - Google Patents

Description

91777

MENETELMA PLASMIΙΝΙΑΚΉIVISUUDEN MAARITTÅMISEKSI -FORFARANDE FOR BESTÅMNING AV PLASMINAKTIVITETEN

Keksinto koskee menetelmåå plasmiiniaktivitee-5 tin kvantitatiiviseksi mååritykseksi kehon nesteestå kuten on måaritelty patenttivaatimuksissa.

Lisåksi keksinnon kohteena on diagnostinen valine plasmiiniaktiviteetin kvantitatiiviseen mååri-tykseen kehon nesteistå, erityisesti kyynelnesteesta.

10 Normaali kyynelneste sisåltaå plasminogeeniak- tivaattoriaktiviteettia (Thorig et al.,1983/ Hayashi and Suieishi, 1988), mutta plasmiiniaktiviteetti on hyvin matala tai sitå ei ole ollenkaan (Salonen et al., 1987, Tervo et al., 1989, van Setten et al.,1990).

15 Fibriinin ja fibronektiinin hajoaminen plasmiinin vai-kutuksesta nåyttåå myotavaikuttavan sarveiskalvon haa-vaumien muodostukseen tai niiden epånormaalin hitaaseen paranemiseen (Berman et al., 1983). Sarveiskalvon epi-teelin ja pinnallisen strooman kokeellista haavaa (ke-20 ratektomia) seuraa lyhytaikainen plasmiinin kohoaminen kyynelnesteessa ja samanaikaisesti plasminogeeniakti-vaattoriaktiviteetti laskee. Kyynelnesteen plasmiiniaktiviteetti laskee nopeasti ja epiteeli paranee 1-2 vuorokaudessa (van Setten et al., 1990). Toisaalta 25 potilailla, joilla on huonosti parantuva sarveiskalvon haavauma, on lisaåntynyt kyynelnesteen plasmiiniaktiviteetti jopa 10 viikkoa (Salonen et al., 1987). Plas-miini-inhibiittorin, aprotiniinin (TrasylolR, Bayer) paikallista annostusta seuraa seka kyynelnesteen plas-30 miiniaktiviteetin normalisoituminen ja haavautuman parantuminen (Salonen et al., 1987). Åskettain on ra- portoitu onnistunut sarveiskalvon epiteelihaavaumien hoitotutkimus, misså on kåytetty plasmiinin estoterapi-aa (Tervo and van Setten, 1989) (US 4,849,406, July 18, 35 1989).

Aprotiniinihoidon aloittamisen pitåå perustua plasmiiniaktiviteetin osoittamiseen kyynelnesteessa 777 2 (Salonen 1987). Kaikki sarveiskalvon pinnan paranemis-ongelmat eivåt kuitenkaan valttamatta liity plas-miiniaktiviteetin kohoamiseen kyynelnesteessa (Tervo et al.,1988, Toezer et al., 1989). Salonen et al., (1987) 5 kaytti alunperin Sakselan (1981) modifikaatiota radiaa-likaseinolyysimåårityksesta plasmiiniaktiivisuuden mittaamiseen (Renunert and Cohen 1949). Tama menetelma ei kuitenkaan ole sopiva kliiniseen kayttoon, koska useilla proteolyyttisilla entsyymeilla on kaseinolyyt-10 tistå aktiviteettia (vrt. Cawston and Murphy 1981) Spesifisyys voidaan tarkistaa kayttaen kaseinolyysin estoa anti-plasmiini-vasta-aineilla tai aprotiniinilla tai kayttaen natrium-dodesyylisulfaattipolyakryyliami-digeelielektroforeesia. Viimeksi mainittu menetelma 15 (Salonen et al./ 1987) on kallis, aikaa vievå ja taval-lisesti vaikea toteuttaa johtuen hyvin pienista kyynel-nesteen maaristå. Liuenneiden alueiden muodostuminen kaseiiniagarilla kestaå 24 - 48 h, ja reaktio ei ole lineaarinen suhteessa inkubointiaikaan. Tasta johtuen 20 kaseinolyyttinen menetelmS ei sovellu avohoitoon/ jossa oftalmologiset potilaat useimmiten ovat. Menetelmå on lisaksi vain semikvantitatiivinen.

Piilolasien, etenkin pehmeiden, kåytto johtaa myos kyynelnesteen plasmiiniaktiviteetin nousuun osalla 25 potilaista. Arvojen normalisoituminen tapahtuu piilolasien kåyton lopettamisen jålkeen (Tervo et al.,1989). Kyynelnesteen plasmiiniaktiviteetin seuranta voisi myos olla keino/ jolla voitaisiin selvittåa piilolasien sopivuutta, normaalin silman pinnan patologisia muutok-30 sia tai sarveiskalvon haavauman hoitoa (Tervo and van Setten 1989). Korkeat arvot antavat aihetta epåilla sarveiskalvon vauriota, allergiaa, huonosti sopivia piilolaseja tai mikrobeista johtuvaa tulehdusta.

Proteolyyttisen aktiviteeetin hairioita, jotka 35 ovat analoogisia niille, joita edella on kuvattu sarveiskalvon vaurion yhteydessa (Berman et al.,1980, Salonen et al./ 1987, Tervo et al., 1989, Toezer et 3 91 7 7 7 al., 1989) ilmenee myos iho- ja limakalvovaurioissa, jol ta tapaturmat, tulehdukset tal muut patologiset tilat aiheuttavat (Dano et al., 1985, Reich et al., 1975, Barret et al., 1980, Vaheri and Salonen 1988).

5 Sepelvaltimotukoksia hoidetaan nykyaan las- kimonsisåisesti annettavalla streptokinaasilla (ISIS-2 1988, Chesbro et al., 1987), kudosplasmonogeeniakti-vaattorilla (Fox et al., 1987, Magnani 1989, Wilcox et al., 1988) ja urokinaasilla (Chesebro et al., 1987, 10 PRIMI Trial Study Group 1989). Sepelvaltimotukkeuman trombolyyttinen hoito toteutetaan tavallisesti ilman, etta seerumin fibrinolyyttistå systeemiå, ja erityises-ti seerumin plasmiiniaktiviteettia seurataan. Tåmå olisi kuitenkin tårkeåa, koska tukoksen liukeneminen 15 saadaan aikaan aktivoimalla siinå oleva plasminogeeni plasmiiniksi, joka hajoittaa tukoksessa olevan fibrii-nin ja fibronektiinin muodostaman matriksin (Bergman et al., 1983, Fox et al., 1984). Ihmisen seerumi sisaltåa useita plasmiini-inhibiittoreita (serpins) (Linjen and 20 Collen 1986), jotka muodostavat komplekseja plasmiinin kanssa inaktivoiden sen. Collen ja Verstraete (1979) osoittivat etta trombolyyttisen hoidon aikana streptokinaasilla esiintyy systeemista fibrinogenolyysia vain kiertavån alfa-2-antiplasmiinipitoisuuden vahentyesså.

25 Trombolyyttisen hoidon yhteydessa esiintyvat komplikaa-tiot (esim. aivoverenvuodot) ovat harvinaisia, mutta vaarallisia. Hoito voitaisiin mahdollisesti optimoida, jos fibrinolyyttisen systeemin komponentteja, erityi-sesti plasmiinia, ja alfa-2-antiplasmiinia tai naiden 30 komplekseja voitaisiin seurata hoidon kuluessa (Linjen . and Collen 1986).

Keuhkoastmaa sairastavilla potilailla on haa-vaumia keuhkoputkien limakalvoilla (Laitinen et al., 1985). Niiden morfologia ja fibronektiinin paikantumi-35 nen ovat hyvin samankaltaisia kuin sarveiskalvon haa-vaumissa (Laitinen et al., tekeillå). Naiden potilaiden yskosnaytteet sisåltavåt kaseinolyyttisella menetelmal- 91777 4 la mitattavaa proteolyyttista aktiivisuutta usein. Koska moni bakteeriperåinen proteaasi voi inaktivoida serpiineja (Catanase and Kress, 1984, Kress 1986), sep-tisilla tulehduksilla saattaa olla yhteys korkeisiin 5 plasmiinitasoihin seerumissa tai eraissa elimissa, kuten aivolssa. Sopivalla seurantasysteemilla tåmå epatasapaino voidaan havalta ja hoito aloittaa. Fib-rinolyysin aktivoitumista on raportoitu tapahtuvan eraissa munuais- ja maksasairauksissa, artriitissa ja 10 Bechet'in taudissa (Linjen and Collen 1988).

Paikallisen fibrinolyysin periaatetta esim. kudos-plasminogeeni aktivaattorin hyvåksikayttoa, joka sisåltaa natriumhyaluronaattia, on ehdotettu kSytet-tåvåksi leikkauksen jalkeisen arpi- ja kiinnikemuodos-15 tuksen eståmiseen ja suojaamaan pehmytkudossiirrånnai-siå. Taman tapaisia hoitomenetelmia on tutkittu ja kaytetty, ei ainoastaan silmansisaisessa kirurgiassa, vaan myos nivelsairauksissa, vatsaontelon kirurgiassa ja vammoissa.

20 Nopea diagnostinen menetelma fibrinolyyttisen jårjestelmån komponenttien seuraamiseksi saattaisi auttaa tallaisten hoitomenetelmien seurantaa; esim. koholla oleva plasmiiniaktiviteetti silman etukammio-nesteessa voisi liuottaa silmaleikkauksen jalkeisia 25 fibriinihyytymia, mutta olla - samaan aikaan - vahin-gollinen huonosti paranevalle sarveiskalvoendotee-lisolukolle aiheuttaen sen irtoamista alustastaan.

Kun plasmiinista johtuva korkea proteolyytti-nen aktiviteetti voidaan todeta, spesifinen hoito plas-30 miini-inhibiittorilla tai sen ja esim. hyaluroonihapon ja/tai tiettyjen kasvutekijoiden yhdistelmållå voidaan aloittaa.

Kaseinolyyttistå menetelmåa (Saksela 1981, selostettu myds US 4,849,406) on kaytetty kyynelnesteen 35 plasmiiniaktiviteetin mittaamiseen. Taman tekniikan varjopuolia on selostettu edellå. Kromogeenisia subst-raatteja voidaan kåyttåa seka plasminogeeniaktivaatto- l! 91777 5 rin ettå plasminogeenista riippumattoman amidolyyttisen aktiviteetin mittaamiseen (Karlan et al./ 1987, Toe2er et al., 1989). Plasmiini-alfa-2-antiplasmiini komplek-sia voidaan osoittaa entsyymiin sidotulla immuunimååri-5 tyksellå (Holvoet et al., 1986) ja radioimmunokemialli-sella analyysilla (Plow et al., 1980) seka Latex agglu-tionaatiotestillå (Collen et al., 1977).

Emåksisten aminohappojen estereitå ja amideja voidaan kayttåå plasmiinin synteettisinå substraatteina 10 (esim. Bell et al., 1974). Useimmiten kåytetyt johdan-naiset ovat olleet 4-metoksi-2-na£tyyliamiini (Clavin et al., 1977 ja patenttijulkaisu DK 155051 B) ja p-nit-roanilidi (Soria et al., 1978). Valitsemalla sopiva aminohapposekvenssi on loydetty hyvin spesifisiå subst-15 raatteja tietyille proteinaaseille. Spesifisin subst-raaatti plasmiinille on ollut aminohappotripletti D-Val-L-Leu-L-Lys-johdannainen (Soria et al., 1978). Hydrolyysisså syntynyt reaktiotuote voidaan mitata fotometrisesti suoraan (Soria et al., 1978) tai epasuo-20 rasti kytkemallå se yhteen tiettyjen våriaineiden kans-sa tai fluorometrisesti perustuen tuotteen omaan fluo-resenssiin (Clavin et al 1977). Eråillå kumariineilla on jopa voimakkaampi fluoresenssi kuin 4-metoksi-2-naf-tyyliamiinilla. Kytkettyna sopivaan aminohappotriplet-25 tiin ne voivat toimia erittSin herkkina ja spesifisina plasmiinisubstraatteina (Smith et al., 1980 ja patent-tijulkaisu US 4237047, Sakakibara).

Keksinnon tarkoituksena on myos kuvata uusi kvantitatiivinen menetelma kehon nesteisså olevan plas-30 miiniaktiviteetin måaritysta vårten.

Keksinnon tarkoituksena on myos kuvata diag-nostinen valine, kitti, jonka avulla tamå mååritys voidaan tehdå.

Keksinnolle tunnusomaisten seikkojen osalta 35 viitataan patenttivaatimuksiin.

Keksinto kuvaa nopean ja korkean spesifiteetin omaavan kliinisesti kaytettåvån mene'telman fibrinolyyt- 91777 6 tisen systeemin komponenttien, erityisesti plasmiinin, kvantitatiiviseksi måårittåmiseksi kehon nesteistå. Menetelmå on potentiaalisesti tarkea ehkåistaessa plasmiinin aiheuttamaa kudostuhoa monissa patologisissa 5 tiloissa, kuten edellå on kuvattu. TSllaisia tiloja ovat esim. sarveiskalvon epiteelin hidastunut paran-tuminen tai muu ihon tai limakalvon haavauma tai syd-pymå. Keksinnon ansiosta esim. fibrinolyyttista jårjes-telmaM voidaan seurata kaytettSessa trombolyyttista 10 hoitoa sepelvaltimo-, aivo-, ja åSreislaskimotukoksessa tai silmansisåisen kirurgian jålkeen. Menetelmåå voidaan kayttaa myos systeemisen fibrinolyysin kaynnisty-misen toteamiseen. Tåma voi johtua paitsi em. hoidosta myos septisista tiloista, vaikeasta sokista, traumasta 15 tai tulehduksesta.

Esillå olevassa keksinnossa on tutkittu tietyn 7-amino-4-metyylikumariinin (AMC) peptidijohdannaisen ominaispiirteitå sopivana substraattina plasmiiniakti-viteetin maaraåmiseen kehon nesteistå, esim. kyynelnes-20 teestå erilaisissa fysiologisissa ja patofysiologisissa tiloissa. Peptidi on aminohappotripletti.

Keksinnon kohteena oleva menetelmå perustuu plasmiininaytteen reaktioon 7-amino-4-metyylikumariinin (AMC) peptidijohdannaisen kanssa, jolloin hydrolyysisså 25 syntyy reaktiotuote, joka maåritetaMn fluorometrisesti.

Sopiva AMC:hen kytketty peptidi on aminohappotripletti D-Val-L-Leu-L-Lys.

Plasmiiniaktiviteetti voidaan måarittaa eri-laisista kehon nesteistå, mm. kyynelnesteesta diagnos-30 tisessa tarkoituksessa tai haavauman hoidon seurannas-sa, etukammionesteestå silmånsisaisten leikkausten ja tulehdusten yhteydessa, lasiaisesta leikkausten ja tulehdusten yhteydessa, nivelnesteestå tulehdusten aikana, yskosnåytteesta tulehduksissa ja bronkiaaliast-35 massa, ihovaurioissa tulehdusten ja palovammojen yhteydessa, seerumista fibrinolyyttisen hoidon seurannas-sa, sepsiksessa ja erilaisissa vammoissa ja selkaydin- t: 7 91777 nesteesta vaikeissa tulehduksissa tai vammoissa seka trombolyyttisen hoidon seurannassa.

Keksintoå selostetaan seuraavassa yksityiskoh-taisesti suoritusesimerkein viitaten oheisiin taulukoi-5 hin.

Esimerkki 1, plasmiiniaktiviteetin mååritys kyynelnesteestå.

50 μΐ reagenssiliuosta, jossa on 250 mmol/1 Tris-HCl-puskuria, pH 8.0, ja 1,5 mmol/1 D-Val-L-Leu-L-10 Lys-AMC jåådytyskuivataan pieniin kyvetteihin. Tåmåm jalkeen kyvetit suljetaan ja såilytetåån valolta suo-jattuna (såilyy esim. huoneen låmpotilassa pitkiå aiko-ja). Plasmiiniaktiviteetin maaraamiseksi 10 μΐ kyynel-nestettå pipetoidaan yhdesså 500 μΐ Millipore-suodate-15 tun veden kanssa kyvettiin. 10 μΐ plasmiinistandardia (10 IU/1 plasmiinia, Human plasmin, National Institute for Biological Standards and Controls, London, England) lisåtåån kalibrointikyvettiin yhdessa 500 μΐ veden kanssa. Taman jalkeen otetaan alkulukema, ja 10 min in-20 kuboinnin jalkeen huoneenlåmmossa otetaan toinen luke-ma, ja plasmiiniaktiviteetti lasketaan vertaamalla toisen ja ensimmåisen lukeman erotusta vastaavaan plas-miinistandardin lukemaan. Substraatin spontaani hydro-lyysi on niin minimaalinen 10 min inkuboinnin aikana, 25 etta ei ole aihetta sen vahentamiseen. Jos plasmiinin aktiviteetti nåytteessa on suurempi kuin 125 IU/1, nayte laimennetaan 1 : 10 50 mmol/1 Tris-HCl-pusku- rilla, pH 8.0 ja aktiviteetti mååritetaån uudestaan. Plasmiiniaktiviteetin maaritys on fluorometrinen mSari-30 tys, mika tehtiin Transcon 102 FN analysaattorilla. Tulokset on esitetty taulukoissa 1 - 5. Taulukko 1 esittaå D-Val-L-Leu-L-Lys-AMC substraatin ominaisuuksia plasmiiniaktiviteettimåårityksesså. Taulukko 2 esittåa plasmiiniaktiviteettia kyynelnesteessa terveilla henki-35 loilla, taulukko 3 esittåa plasmiiniaktiviteettia pa-rantumisen aikana sarveiskalvohaavaumapotilailla, taulukko 4 esittåa plasmiiniaktiviteettia kanin silmån 91777 8 etukammionesteessa vårikalvon mekaanisen arsytyksen aikana, ja taulukko 5 esittaa plasmiiniaktiviteettia kanin etukammionesteessa etukammioon tehdyn kapsasiini-injektion aiheuttamassa hermoperåisesså tulehdusreak-5 tiossa (aksonirefleksi).

Taulukko 1. 7-Amino-4-metyylikumariinin (AMC) D-Val-L-Leu-L-Lys-johdannaisen ominaisuudet mååritet-taessa plasmiiniaktiivisuutta, 25 °C, fluorometri

Transcon 102 FN

10

Heråtevalon aallonpituus, max 377 nm

Emissiovalon aallonpituus, max 440 nm

Valittu heratevalon aallonpituus 380 nm (Cornig filter 7-54, 15 cut-off 370 nm)

Valittu emissiovalon aallonpituus 480 nm (490 nm, cut-off 420 nm) pH optimi 7.85

Km 0.25 mmol/1 20 Havaitsemisraja 0.3 IU/1

Lineaarialue 1-125 IU/1

Taulukko 2. Kyynelnesteen plasmiiniaktiivisuus (IU/1)terveillå ihmisilla. Substraattina D-Val-L-Leu-L-25 Lys-AMC, 25 °C ja fluorometrina Transcon 102 FN

«

Koehenkilo Sukupuoli Ika (v) Plasmiini- nro aktiivisuus 1 N 35 < 0.3 30 2 N 28 < 0.3 3 N 50 < 0.3 4 N 59 <0.3 5 M 29 < 0.3 35 Havaitsemisraja = 0.3 IU/1 N = nainen M = mies i.

91777 9

Taulukko 3. Plasmiiniaktiivisuus (IU/1) paran-tumisen aikana sarveiskalvohaavaumapotilailla paikalli-sen aprotiniinihoidon jålkeen. Aktiivisuus on mitattu D-Val-L-Leu-L-Lys-AMC-substraatilla fluorometrisesså 5 menetelmåsså, fluorometri Transcon 102 FN, 25 °C.

Poti- Suku- Ikå Diagnoosi Mikrobi Kåsittely las puoli nro 10 1 N 23 Sarveiskalvon - Antibiootit eroosio, diabetes ja aprotiniini 2 M 19 Sarveiskalvon Staph.aureus Systeeminen haavauma, kevåt- corticosteroidi- konjuktiviitti hoito, antibioo- 15 (vernal conjuc- tit ja aprotiniini tivitis) paikallisesti 3 M 29 Kemiallinen sar- - Antibiootit ja veiskalvon kor- aprotiniini pai- roosio kallisesti 20 4 M 25 Uusiva sarveiskal- Abraasio, antibioo- von eroosio tit ja aprotiniini paikallisesti

Plasmiiniaktiivisuus (IU/1)

Poti- Pv 1 Pv 2 Pv 3 Pv 4 Pv 22 Pv 26-28 25 las

nro FA CA FA CA FA CA FA CA FA CA FA CA

1 8,9 22,0 2,5 20,0 ND 0 2 2,7 6,2 1,8 2,0 0 0 3 15,5 ND 7,0 20,0 2,4 3,0 0 3,8" 20,5' 30 4 8,9 56,0 8,7 ND 5,7 56,0 ND = ei måaritetty = oireita yha jåljellå FA = fluorometrinen menetelmå 35 CA = kaseiinolyyttinen menetelmå 91 777 10

Taulukko 4. Plasmiiniaktiviteetti (IU/1) kanin etukam-mionesteesså vårikalvon mekaanisen årsytyksen jålkeen

Kani Ennen 20 min årsytyk- 60 min årsytyk- 5 nro årsytystå sen jalkeen sen jålkeen

CA CA FA CA FA

1 <0,5 <0,5 <0,3 7 8 2 <0,5 <0,5 <0,5 30 10 10 3 <0,5 11 2 35 9 4 <0,5 18 N.D. 20 N.D.

5 <0,5 35 7,5 60 19 CA = kaseiinolyyttinen menetelmå 15 FA = fluorometrinen menetelmå (D-Val-L-Leu-L-Lys-AMC, 25 °C) N.D. = ei måaritetty

Kaseiinolyyttinen ja fluorometrinen menetelmå toteutet-tiin vålittomåsti nåytteenoton jålkeen.

20

Taulukko 5. Plasmiiniaktiviteetti (IU/1) kanin kammio-nesteesså etukammionsisåisen kapsasiini-injektion ai-heuttaman hermoperåisen tulehduksen jålkeen 25 Kani Ennen injektiota 30 min injektion jålkeen

nro CA CA FA

1 <0,5 16 7,1 2 <0,5 21 9,5 3 <0,5 25 4,5 30 4 <0,5 9 1,2 t CA = kaseiinolyyttinen menetelmå FA = fluorometrinen menetelmå (D-Val-L-Leu-L-Lys-AMC, 25 °C) li 35 91777 11

Viitejulkaisut

Bell PH, Dziobkowski, CT ja Englert, ME: A sensitive fluorometric assay for plasminogen, plas-5 min, and streptokinase

Anal Biochem. 61:200-208, 1974

Bermann SR, Fox KA, Ter-Pogossian MM, Sobel BE, Collen D: 10 Clot-selective coronary thrombolysis with tissue-type plasminogen activator Science 220:1181-1183, 1983

Berman MB: 15 Collagenase and corneal ulceration

Collagenase in normal and pathological connective tissues

John Wiley & Sons Ltd New York, NY, 1980 20 Berman M, Manseau E, Law M & Aiken D:

Ulceration is correlated with degradation of fibrin and fibronectin at the corneal surface

Invest Ophthamol Vis Sci 24:1358-1366, 1983 25 Catanese J & Kress LJ:

Enzymatic inactivation of human plasma Cl-inhibitor and a^-antichymotrypsin by Pseudomonas aeruginosa proteinase and elastase

Biochem Biophys Acta 789:37-43, 1984 30

Caustoa TE & Murphy G:

Mammalion collagenases

Methods Enzymol 80, pt C:711-722, 1981 35 Chesebro JH, Knatterud G, Roberts R et al:

Thrombolysis in myocardial infarction (TIMI) trial, phase 1: a comparison between intravenous tissue plas- 91777 12 minogen activator and intravenous streptokinase Circulation 76:142-154, 1987

Clavin SA, Bobbit JL, Schuman RT ja Smithwick EL 5 Use of peptidyl-4-methoxy-2-nepthylamides to assay plasmin.

Anal. Biochem 80:355-365, 1977 Collen D & Verstraete M: 10 a2-antiplasmin consumption and fibrinogen breakdown during thrombolytic therapy Thromb. Res. 14:631-639, 1979

Dano/ K, Andreasen PA, Gro/ndahl-Hansen J, Kristensen 15 P, Nielsen LS, Skriver L:

Plasminogen activators and cancer Adv. Cancer Res. 44:139-266, 1985

Fox KA, Bergmann SR, Sobel BE: 20 Coronary thrombolysis: pharmacological considerations? with emphasis on tissue-type plasminogen activator (t-PA)

Biochem Pharmacol 33 (12):1831-1838, 1984 25 Hayashi, K & Sueishi K:

Fibrinolytic activity and species of plasminogen activator in human tears Exp. Eye Res. 46:131-137, 1988 30 Holvoet P, de Boer A, Verstreken M & Collen D:

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the measurement of plasmin-a2-antiplasmin complex in human plasma-application to the detection of in vivo activation of the fibrinolytic system.

35 Thrombosis and Haemostasis, 56 (2):124-127, 1986 ISIS-2 (Second International Study of Infarct Survival) i.

91777 13 collaborative group: Randomised trial of intravenous streptokinase, oral aspirin, both, or neither among 17187 cases of suspected acute myocardial infarction?: ISIS-2 5 Lancet 2:349-360, 1988

Joutsimo L, van Setten G-B, Renkonen OV, Tarkkanen A, Påivarinta H, Tervo T:

On the proteolytic activity of contact lenses and bac-10 teria

Acta Ophthalmol (Kbh), (in press)

Karlamo BY, Clark AS, Littlefield BA: A highly sensitive chromogenic microtiter plate assay 15 for plasminogen activators which quantitatively discriminates between the urokinase and tissue-type activators

Biochem. Biophys. Res. Commun. 142:147-154, 1987 20 Kress LJ:

Inactivation of human plasma serine proteinase inhibitors (serpins) by limited proteolysis of the reactive site loop with snake venom and bacterial metallopro-teinases 25 J Cell Biochem 32:51-58, 1986

Laitinen LA, Heino M, Kava T & Haahtela T:

Damage of the airway epithelium and bronchial reactivity in patients with asthma 30 Am. Rev. Resp. Dis. 131:599-606, 1985

Lijnen HR & Collen D:

Alpha-2-antiplasmin J Med. 16:225-84, 1985 35

Magnani, B:

Plasminogen Activator Italian Multicenter Study (PAIMS): 91777 14

Comparison of intravenous recombinant single-chain human tissue-type plasminogen activator (rt-PA) with intravenous streptokinase in acute myocardial infarction 5 J Am. Coll. Cardiol 43:19-26, 1989 Plow EF, Wiman B & Collen D:

Changes in antigenic structure and conformation of a2~ antiplasmin induced by interaction with plasmin.

10 J. Biol. Chem. 255:2902-2906, 1980

Reich E, Rifkin DB, Shaw E (eds.):

Proteases and biological control p. 1021 Cold Spring Harbor Laboratory, 1975 15

Remmert O., LeMar F & Chen PP:

Partial purifiction and properties of a proteolytic enzyme of human serum J biol Chem. 181:432-448, 1949 20

Saksela 0:

Radial caseinolysis in agarose: a simple method for detection of plasminogen activator in the presence of inhibitory substance and serum.

25 Ann. Biochem. 111:276-282, 1981

Salonen EM, Tervo T, Torma E, Tarkkanen A & Vaheri A: Plasmin in tear fluid of patients with corneal ulcers: basis for new therapy 30 Acta Ophthalmol. 65:3-12, 1987

Sherry S, Alkjaersig N & Fletcher AP:

Comparative activity of thrombin on substituted arginine and lysine éslers 35 Am. J Physiol 209:577-583, 1965 I; 91777 15

Smith RE, Bisseil ER, Mitchell AB ja Pearson KW:

Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluromethyl-coumarin 5 Trombos. Res. 17:393-402, 1980 Soria J, Soria C ja Samama C:

A Plasminogen assay using chromogenic synthetic substrate: Results from clinical work and from studies of 10 thrombolysis in progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis Vol 3 ed. Davidson JF, Rowan RM, Samama MM ja Desnoyers PC

Raven Press, New York 1978, 337-346.

15 Tervo T, Salonen EM, Vaheri A, Immonen I, van Setten GB, Himberg JJ, Tarkkanen A:

Elevation of tear fluid plasmin in corneal disease Acta Ophthalmol (Copenh.) 66:393-399, 1988 20 Tervo T, van Setten GB:

Aprotinin for inhibition of plasmin on the ocular surface: principles and clinical observations In: Healing of the processes of the cornea Beuermann RW, Crosson CE & Kaufman HE (eds.), 25 Portfolio Publishing Company of Texas, Inc., The Woodlands, Texas, ss. 151-163, 1989

Tervo T, van Setten G-B, Andersson R, Salonen E-M, Vaheri A, Immonen I, Tarkkanen A: 30 Contact lens wear is associated with the appearance of . plasmin in the tear fluid-preliminary results

Graefe’s Arch Clin Exp Ophthalmol 227:42-44, 1989

Thorig L, Wijngaards G, van Haeringen NJ: 35 Immunological characterization and possible origin of plasminogen activator in human tear fluid Ophthalmol Res. 15:268-276, 1983 16 91 777

Tozser J, Berta A & Punyiczki M:

Plasminogen activator activity and plasminogen indepen^-dent amidolytic activity in tear fluid from healthy persons and patients with anterior segment inflammation 5 Clinica Chimica Acta 183:323-332, 1989

Vaheri A & Salonen E-M:

Fibronectin and regulation of proteolysis in cancer and tissue destruction 10 Proc. Finn Dent. Soc. 84:13-18, 1988 van Setten G-B, Salonen E-M, Vaheri A, Beuerman RW, Hietanen J, Tarkkanen A & Tervo T:

Plasmin and plasminogen activator activities in tear 15 fluid during corneal wound healing after anterior keratectomy

Curr. Eye Res. 8:1293-1298, 1989 van Setten G-B, Tervo T, Andersson R, Perheentupa J, 20 Tarkkanen A: Effects of contact lens wear on the concentrations of plasmin and EGF in human tear fluid Ophthalmic Res. (In press)

Wilcox RG, Olsson CG, Skene AM, von der Lippe G, Jensen 25 G, Hampton JR:

Trial of tissue plasminogen activator for mortality reduction in acute myocardial infarction Anglo-Scandinavian Study of Early Thrombolysis (ASSET), Lancet, 11:525-530, 1988 30 1,

Claims (5)

91777

1. Menetelmå plasmiiniaktiviteetin måårittåmisek-si kvantitatiivisesti kehon nesteesta, jolloin plas-5 miininayte saatetaan reagolmaan 7-amino-4-metyylikuma-rilnin (AMC) peptidijohdannaisen kanssa ja muodostamaan hydrolyysin kautta reaktiotuote, joka mååritetåån fluo-rometrisesti, tunnettu siitå, ettå peptidi on aminohappotripletti D-Val-L-Leu-L-Lys.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå, tunnettu siita, ettå måårityksesså kåytetåån peptidi-AMC-reagenssia, joka on puskuroitu plasmiiniak-tiviteettimittaukseen sopivalla puskurilla, erityisesti Tris-HCl-puskurilla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetel må, tunnettu siitå, reagenssi seostetaan pakas-tekuivatussa muodossa laimennetun kehon nesteen kanssa.

4. Reagenssi plasmiiniaktiviteetin kvantitatiivi-seksi måårittåmiseksi kehon nesteestå, joka reagenssi 20 on peptidi, johon on liitetty 7-amino-4-metyyli-kuma-riini (AMC), tunnettu siitå, ettå peptidi on aminohappotripletti D-Val-L-Leu-L-Lys.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen reagenssi, tunnettu siitå, ettå reagenssi on puskuroitu 25 plasmiiniaktiviteettimittaukseen sopivalla puskurilla, erityisesti Tris-HCl-puskurilla. 917 77