NO156067B

NO156067B - Substrat for bestemmelse av plasminogenaktivatorer.

Info

Publication number: NO156067B
Application number: NO771869A
Authority: NO
Inventors: Lars Gundro Svendsen
Original assignee: Pentapharm Ag
Priority date: 1976-05-28
Filing date: 1977-05-27
Publication date: 1987-04-06
Also published as: DK149215C; FR2353063A1; NO156067C; SE7706275L; IL52124A0; JPS5624520B2; CH634662A5; DK235577A; DE2724211C2; FR2353063B1; NL7705891A; DK149215B; ATA375877A; NO771869L; IT1084992B; AU517375B2; IL52124A; CA1086614A; SE444173B; AT368550B

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører tri- eller tetrapeptidderivater eller salter derav med mineralsyrer eller organiske sy-

rer for anvendelse som substrater for den kvantitative bestemmelse av plasminogenaktivatorer, inhibitorer for disse og plasminogen-preaktivatorer i legemsvæske fra mennesker og pattedyr og i vevsekstrakter.

Den mennesleLige organisme frembringer flere aktivatorer som bevirker omvandlingen av proenzymet plasminogen til den aktive.pro-teasen plasmin. Til denne gruppen av aktivatorer hører for eksempel vevs- og blodkinase og urokinase. Disse aktivatorene spiller en viktig rolle i mekanismen for blodkoagulasjonen. Ved en abnormt stor utskillelse av disse aktivatorene består fare for en forhøyet fibrinolyseaktivitet og dermed en øket blødnings-tendens eller hemori. Omvendt bevirker en for svak utsondring av disse aktivatorene en forstyrrelse av likevekten mellom koagu-lasjonsevne og fibrinolyse og følgelig en øket trombosefare. Bestemmelsen av plasminogen-aktivatorer i kroppsvæsker og vevsekstrakter har derfor en stor betydning i klinisk praksis, slik det for eksempel angis av I. Witt i "Biochemie der Blutgerinnung und Fibrinolyse", Verlag Chemi, Weinheim, 197 5, s. 119, som følger: "Bestemmelsen av fibrinolytisk aktivitet i plasma eller serum tjener for det første til påvirkning av hyperfibrinolytiske tilstander som opptrer ved forskjellige sykdomstilstander. Dessuten er det i de senere år ofte oppnådd gode resultater ved spaltning av intravaskulære tromber ved anvendelse av plasminogen-aktivatorer. For kontroll av denne trombolytiske terapien er likeledes målinger av den fibrinolytiske aktiviteten nødvendig". F.E. Smyrniotis et al. [Thromb. Diath. et Haemorrh. Bd. III, 257-70 (1959)] angir blant annet følgende: "Utskillelse av urokinase er hos normale personer uavhengig av alder, slekt og urinmengde. Urokinaseutskillelsen er øket etter at et myokardinfarkt er opptrått og etter et anfall av koronarinsuffisiens. Utskillelsen er nedsatt hos pasienter med karsinose, kardial oppsamling og uremi. Disse forskjellene gjør det nærliggende at signifikante endringer i det fibrinolytiske plasmasystemet kan forekomme som en følge av disse sykdommer."

Det finnes hittil ingen virkelig tilforlatelige metode for bestemmelse av plasminogen-aktivatorer i kroppsvæsker og organ-ekstrakter. Man kjenner prinsipielt tre metoder. 1. Spontanspaltning av et blodkoagulat. Man lar blod renne spontant eller ved tilsetting av trombin og betrakter spontan-spaltningen av koagulatet ved 37°C. En spaltning finner normalt først sted etter 24 timer. Denne metoden er uspesifik, da aktivator-virkningen ikke måles direkte, men indirekt over spaltningsenzymet plasmin (se I. Witt "Biochemie der Blutgerinnung und Fibrinolyse", Verlag Chemie, Weinheim, 1975, s. 119). 2. Hydrolyse av kasein. Ved denne metoden utnyttes plasminets egenskap til hydrolytisk å nedbryte kaseinen. Kasein inkluberes med prøven som skal undersøkes. På begynnelsen og slutten blandes en alikvot del av inkubasjonsblandingen med triklor-eddiksyre. I supernatanten bestemmes tyrosininnholdet ved 280

nm ved spektrofotometrisk måling hvorav aktivatorvirkningen lar seg beregne omtrentlig indirekte [L.F. Remmert et al., J. Biol. Chem. 181, 431 (1949)].

3. Esterolytisk metode (for urokinase). Ved denne metoden utnyttes urokinasens evne til direkte og katalysere hydrolysen av lS^-acetyl-L-lysin-metylester. Denne metoden er også kjent

for oppstilling av den såkalte CTA-urokinase-enhet (CTA =■ Committe on Thrombolytic Agents of the National Heart Institute, USA). En CTA-enhet er den mengde urokinase, som fra Na -acetyl-L-lysin-metylester f rigjør 46.2 x 10~<3>^iM metanol i en time ved 37°C (se N.U. Bang et al., "Thrombosis and Bleeding Disorders", George Thieme Verlag, Stuttgart, 1971, s. 377). Denne metoden kan bare anvendes for bestemmelse av rene urokinasepreparater men egner seg ikke for bestemmelse av urokinase i kroppsvæsker eller vevsekstrakter, da den nevnte ester spaltes raskere av andre proteolytiske enzymer som foreligger deri (f.eks. plasmin,

plasmakallikrin, etc.) enn ved urokinase.

Den er forsøkt å utvikle syntetiske amid- og peptidsubstrater for bestemmelsen av urokinase. Disse forsøkene er dog ikke ført til resultater [se f.'.eks. W. Troll et al., Journal of Biological Chemistry 208,85 ( 954)].

I NO uti.skrift 142.074 er det omtalt tri- og tetrapeptidderivater som spesiellt er egnet for bestemmelse av faktor Xa. I disse derivater inngår aminosyrene Glu, Gin, Asp eller Asn, altså aminosyrer som har en fri eller substituert beta- eller gamma-karboksylgruppe i sidekjeden.

Således er disse tripeptidderivatene sure og hydrofile,

og egner seg spesiellt for bestemmelse av faktor Xa (protrombinaktivator i koaguleringssystemet) på grunn av

sin særegne struktur, men er uegnet for bestemmelse av plasminogenaktivatorer. Foreliggende oppfinnelse omfatter derimot tripeptidderivater med aminosyrer som har alkyl-, cykloheksyl- eller cykloheksylmetyl-grupper i sidekjeden,

er således hydrofobe, virker ikke inn på koaguleringssystemet, men er derimot egnet til bestemmelser av det fibrinolytiske system.

I NO uti.skrift 142.576 er det omtalt tripeptidderivater

til bestemmelse av trombin eller trombinlignende enzymer. Strukturen til disse tripeptidderivater er imidlertid forskjellig fra strukturen til tripeptidderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse, idet aminosyrene i tripeptidderivatene ifølge foreliggende oppfinnelse er åpenkjedede mens tilsvarende aminosyre i angitte uti.skrift er cykliske. I tillegg er de aminosyrer som i foreliggende oppfinnelse er angitt til å være hydrofobe alkyl-, cykloheksyl- eller cykloheksylmetyl-sidekjedede, i det angitte NO uti.skrift med tilsvarende aromatiske sidekjeder.

I NO uti. skrift nrtl42812 er det omtalt tripeptidderivater som generelt er ment til bestemmelse av serinprotease. Forskjellen mellom foreliggende oppfinnelse og dette skrift er imidlertid at den N-terminale aminosyre i det norske utlegningsskrift skal være av D-konfigurasjon, mens tilsvarende aminosyre i foreliggende oppfinnelse skal ha L-konfigurasjon. I tillegg vil tripeptidderivatene ifølge det angitte uti.skrift være egnet til bestemmelse av trombin, men dårlig egnet til bestemmelse av urokinase, idet dette spaltes av urinkallikrein som er tilstede i urinet.

I US patent 3.886.136 er det omtalt tripeptidderivater

som kan anvendes for bestemmelse av trombin-, plasmin-

og trypsinaktivitet. I dette patent er det imidlertid ikke nevnt plasminogenaktivatorer idet de angitte tripeptidderivater er dårlig eller uegnet for slik bestemmelse da de ikke spaltes av plasminogenaktivatorene. De samme ulemper vedrører også tripeptidderivater anført i US

patent 3.884.896.

Ved forsøk på å utvikle et syntetisk substrat for bestemmelse av kallikrin ble ut fra teoretiske betraktninger de følgende tripeptid-p-nitroanilider med formlene

syntetisert. Disse tripepidene inneholder de 3 siste C-terminale aminosyrene som opptrer som spaltningsprodukter ved innvirkning av kallikrein på kininogen. Det kunne derfor ventes at begge disse substratene ble hydrolysert av kallikrein hvilket dog bare viste seg å gjelde for substrater med formel A. Dog har overraskende vist seg at substratet med formel B som over hodet ikke var spaltbart med kallikrein spaltes raskt av urokinase og andre plasminogen-aktivatorer amidolytisk.

På grunn av dette resultatet ble ifølge oppfinnelsen substratet med formelen:

hvori R er hydrogen, en alkanoylgruppe med 2-18 karbonatomer som eventuelt har en aminogruppe i UJ-stilling,

en fenylalkanoylgruppe hvis alkanoylrest inneholder 2-6 karbonatomer og hvis fenylrest eventuelt er substituert med en aminogruppe, en cykloheksylkarbonylgruppe som eventuelt er substituert med en amino- eller aminometylgruppe,

en benzoylgruppe som eventuelt er substituert med en metyl-, amino- eller aminometylgruppe, en benzyloksykarbonylgruppe eller en metyl-, etyl-, fenyl-, metylfenyl- eller naftyl-sulfonylgruppe, R 3 er en rettkjedet eller forgrenet alkyl-rest med 1-7 karbonatomer eller en cykloheksyl- eller . cykloheksylmetylrest, Y er en glycyl- eller serylgruppe og R 2 er en p-nitrofenylamino-, 2-naftylamino- eller 4-metoksy-2-naftylaminogruppe.

Oppfinnelsen kan anvendes i en fremgangsmåte for bestemmelse av plasminogen-aktivatorer, f.eks. urokinase, inhibitorer for denne og plasminogen-preaktivatorer i kroppsvæsker hos mennesker og pattedyr og i vevsekstrakter. Man bringer de nevnte kroppsvæsker eller vevsekstrakter til reaksjonen med et av de ovenfor definerte substrater og bestemmer mengden av de ved hydrolytisk virkning av nevnte biolo-giske aktive faktorer på substratet dannede spaltningsprodukt NH2R 2 ved fotometriske, spektrofotometriske eller fluoresensfotometriske metoder.

Fremstilling av substratet ifølge oppfinnelsen kan skje ved forskjellige, til dels kjente metoder:

1) Ved den første metoden henges de kromofore gruppene (R

i formelen I) på den C-terminale aminosyren. Disse gruppene har samtidig funksjon som C-terminale karboksylbeskyttelses-grupper under den trinnvis sairmenknytning av aminosyrer til den ønskede peptidkjeden. De øvrige beskyttelsesgrupper avspaltes selektivt fra sluttproduktet uten at den kromofore gruppen blir berørt.

Denne metode er f.eks. beskrevet i "Peptide Synthesis" av

Miklos Bondanszky et al., Interscience Publishers, 1966, side 163-1965. 2) Ved den andre metoden henges den kromofore gruppen på den ferdig oppbygde peptidkjeden, og da slik at etter fullført, trinnvis oppbygning av den ønskede peptidkjeden settes først en C-terminale karboksylgruppen fri ved alkalisk hydrolyse av esteren, hvorpå den kromofore gruppen henges på karboksylgruppen. De øvrige beskyttelsesgruppene avspaltes til slutt selektivt under betingelser hvorved den kromofore gruppen forblir intakt. Denne metoden er beskrevet i "Peptide Synthesis", se ovenfor, side 43 og 44.

For beskyttelse av Na<->aminogruppene under den trinnvise oppbygning av peptidkjeden kan det anvendes vanlige kjente amino-beskyttelsesgruppe som kan avspaltes selektivt. Det dreier seg i første rekke om Cbo, MeOCbo, N02Cbo, MCbo, BOC, TFA

eller formyl, hvor forkortelsene er angitt på side 8. °~karboksylgruppen til aminosyrene kan gjøres reaktiv ifølge forskjellige kjente metoder, f.eks. ved fremstilling av p-nitro-fenylesterderivater, triklorfenylesterderivater, pentaklor-fenylesterderivater, N-hydroksy-succinimidesterderivater og isolering av disse derivatene eller ved fremstilling in situ av syreazider eller syreanhydrider som enten kan være symmetriske eller asymmetriske.

Aktiveringen av karboksylgruppen kan skje ved hjelp av et karbod-iimid som N,N<1> -dicykloheksylkarbodiimid.

Karboksylgruppen som står terminalt i peptidderivatene beskyttes enten ved hjelp av den hjelp av den kromofore amidgruppen eller også som metyl-, etyl- eller isopropylester under den trinnvise oppbygning av den ønskede peptidkjede.

De øvrige fri-reaktive grupper som ikke deltar i oppbygningen av peptidkjeder kan blokkeres ved følgende spesiellt forholdsregler: <5-guanidinogruppen i arginin beskyttes ved N02, Tos eller ved enke] protonisering, hvor forkortelsene er angitt på side fi.

Ved syntesen av tripeptidkjede kan man først forsyne den N-terminale aminosyre eller dipeptidsyre med blokkeringsgruppen (acyl- eller sulfongruppen), så aktivere karboksylgruppen til den blokkerte aminosyre eller dipeptidsyre og til slutt henge det således erholdte aktiverte aminosyrederivat eller dipeptidsyrederivat til det nødvendige dipeptidsyrederivat for avslutt-ing av peptidkjeden.

Fremstillingen av substratet ifølge oppfinnelsen ifølge den oven-fornevnte metode er beskrevet mer utførlig i de følgende eksem-pler .

Analysen av eluatene og produktene som erholdes ifølge eksemplene ble utført med tynnsjiktkromatografi. For dette formål ble det anvendt glassplater overtrukket med kiselgel F 254 (Merck). For utvikling av tynnskiktkromatogrammene ble følgende løsnings-middelsystemer anvendt:

A Kloroform/metanol (9 : 1)

B n-propanol/eddiksyreetylester/vann (7 : 1 :2)

C n-buntanol/eddiksyre/vann (3 : 1 : 1)

Kromatogrammene ble først fremkalt i UV-lys og så ved reaksjon med klor/toluidin (se G. Pataki, "Diinnschichtchromatographi in der Aminosaure- und Peptid-Chemie", Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, s.125).

I den foreliggende beskrivelse (inklusive patentkravene) anvendes følgende forkortelser:

Ala = L-alanin

Arg = L- arginin

But = L-2-aminosmørsyre

CHA = L-cykloheksylalanin

Gly = glycin

Ile = L-isoleucin

Leu = leucin

NLeu = L-norleucin

Phe = L-fenylalanin

Pro = L-prolin

Ser = L-serin

Val = L-valin

Ac = acetyl

AcOH = eddiksyre

BOC = tert.-butoksykarbonyl Bz = benzoyl

Bzl = benzyl

Bz20 = benzosyreanhydrid Cbo = karbobenzoksy

DMF = dimetylformamid

DSC = tynhsjiktskromatogram Et^N = trietylamin

HMPTA = N,N,N',N',N",N"-heksaetyl-fosforsyretriamid LMS = løsningsmiddelsystem MCbo = p-metoksyfenylazokarbobenzoksy MeOH = metanol NA naftylamid

OMe = metoksy

OpNP = p-nitrofenoksy

OSu = N-succinimidoksy

pNA = p-nitroanilld Smp = smeltepunkt TFA = trifluoracetyl THF = tetrahydrofuran Tos = p-toluolsulfonyl

EKSEMPEL 1

I. N^-Bz-Val-Gly-Arg-pNA.HCl

Ia) N^-Cbo-Arg-(N02)-pNA

1) I en 500 1 trehalsrundkolbe ble 32.55 g (92.1 mMol) godt tørket Cbo-Arg(N02)-OH løst i 200 ml N,N,N',N',N",N"-heksa-metylfosforsyretriamid som var tørket over P20^ og nettopp destillert under utelukkelse av fuktighet véd 20°C. Til denne løsningen ble først satt 9.3 2 g (92.1 mMol/ Et^N og deretter 18.90 g (115.1 mMol) p-nitrofenylisocyanat i 25% overskudd i porsjoner. Etter 24 timers reaksjonstid ved romtemperatur ble reaksjonsløsningen under røring dryppet til 1.5 liter 2% NaHCO^-løsning. Det utfelte produkt ble frafiltrert og vasket tre ganger med 0.7 liter 2% NaHCO^-løsning, tre ganger med 0.7'-liter destillert vann, tre ganger med 0.5 liter 0.5-n HC1 og til slutt tre ganger med 0.5 liter destillert vann. Det således erholdte produkt ble tørket i vakuum ved 40°C og deretter ekstrahert to ganger med.200 ml kokende metanol, hvorved hoved-mengden av N^-Cbo-w-nitroargininlactam som var dannet som biprodukt var oppløst ved siden av bare små mengder av det ønskede produkt. Det på denne måte erholdte,foru rensede råproduktet ble etter tørking ekstrahert to ganger med 50 ml DMF

til 70°C, hvor det ønskede produkt ble fullstendig utløst, mens biproduktet, nemlig N,N'-bis-p-nitrofenylurea ble tilbake uløst. DMF-løsningen ble inndampet i vakuumet 40°C. Etter tilsetting av MeOH utkrystalliserte en substans som var kromatografisk enhetlig i løsningsmiddelsystemene A og B og hadde et smeltepunkt på 186 - 188.5°C.

Utbyttet: 29.75g (68.2% av teoretisk). Ved elementæranalyse

og beregning av bruttoformelen C2q<H>22<N>7<0>7 ble følgende verdier funnet ( verdiene for bruttoformel er satt i parentes): C = 50.42% (50.74%); H = 4.98% (4,908); N = 20,90% (20,71%).

22

K] D = 1.27° (c = 1.0; AcOH) .

2) I en 500 ml trehalsrundkolbe ble 17.7 g (50 mMol) tørket Cbo-Arg(N02)-OH løst i 350 ml THF:DMF (1:1), hvorpå 5.05 g

(50mMol) Et^N ble tilsatt under utelukkelse av fuktighet.

Etter avkjøling av reaksjonløsningen til -10°C ble så 6.85 g

(50 mMol) klormaursyreisobutylester løst i 30 ml THF tildryppet i løpet av 15 minutter, hvorved en temperatur på -10° til -5°C ble holdt. Etter ca. 10 minutter ble 8.2 g (50mMol) p-Nitroanilin, løst i 15 ml DMF tildryppet, hvorved atter en temperatur på -10°C til -5°C ble overholdt. Etter 2 timer ble kjølingen avbrutt og reaksjonsblandingen fikk stå ved romtemperatur i 24 timer. Etter avdestillasjonen av løsningsmiddelet i vakuum ble resten behandlet tre ganger med dest. vann, tre ganger med 5% NaHCO^-løsning og igjen tre ganger med dest. vann etter hverandre. Etter tørkningen i vakuum ble råproduktet løst i metanol og latt løpe over en søyle av "Sephadex LH-20" (fornettet dekstrangel) ekvibriert med metanol. Fra en fraksjon av eluatet fikk man 7.67 g substans (32.4% av teoretisk) med de samme fysikalske egenskaper som det ifølge avsnitt I) erholdte sluttprodukt. 3) 17.7 g (50mMol) Cbo-Arg(N02)-OH ble løst i 75 ml DMF. Etter avkjøling til -10°C ble løsningen tilsatt 10.3 g (50 mMol) DCCI og 8.2 g (50 mMol) p-nitroanilin etter hverandre.

Etter 4 timer ved -10°C og 20 timer ved 20°C ble det dannede

DCH avfiltrert og filtratet inndampet til tørrhet. Råproduktet ble oppløst i MeOH og latt løpe over ensøyle av "Sephadex LH-20". Ved siden av mye biprodukt, nemlig N-Cbo-Arg-(N02)-N.N'-dicyklo-heksylurea, ble 4.3 2 g substans (17.9% av teoretisk) erholdt fra en fraksjon av eluatet, som hadde de sammen fysikalske egenskaper som sluttproduktet som ble fremstilt ifølge avsnitt I) oppviste.

lb) N<D<>'-Cbo-Gly-Arg(N02)-pNA

Under utelukkelse av fuktighet ble 9.5 g (20 mMol) N^-Cbo-Arg (N02)-pNA (se eksempel la) behandlet i en kolbe med 80 ml 2-n HBr i iseddik under røring en time ved 20°C, hvorved denne substansen løste seg under C02~utvikling. Reaksjonsløsningen ble langsomt under sterk røring dryppet til 600 ml tørket eter, hvorved HBr*H-Arg(N02)-pNA ble utfelt. Eterfasen ble avsuget med en filterstav. Den tilbakeblivende fellingen ble behandlet ennå 4 ganger med 150 ml tørreter, for å fjerne det dannede benzylbromidet og overskudd HBr samt eddiksyre. Etter tørking i vakuum over NaOH-stykker ble det avblokkerte produktet erholdt i kvantitativt utbytte. Det tørkede hydrobromidderivat ble løst i 50 ml DMF, kjølt i -10°C og blandet med 4.16 ml (30 mMol) Et3N for å frigjøre H-Arg(N02)-pNA fra hydrobromidet. Det dannede Et^N-HBr-saltet ble frafiltrert, ettervasket med litt kaldt DMF og filtratet ble tilsatt 6.94 g (21 mMol) Cbo-Gly-OpNP ved -10°C. Etter noen timer hadde reaksjonsløsningen antatt romtemperatur. Den ble igjen kjølt til -10°C og buffret med 1.4 ml (10 mMol) Et3N. Etter 5 timer ble igjen 1.4 ml Et^N tilsatt. Etter videre 24 timer ble reaksjonsløsningen inndampet i vakuum ved 40°C til tørrhet. Resten ble behandlet tre ganger med 100

ml dest. H20 og igjen tørket i vakuum ved 40°C over NaOH-stykker. Det tørkede produktet ble omkrystallisert fra metanol hvorved 6.77 g substans som var kromatografisk enhetlig i løsnings-middelsystemene A og B ble erholdt. Fra moderluten ble ved gel-filtrasjon ennå 4.29 g substans erholdt over en søyle av "Sephadex LH-20". Totalt ble således 11.06 g (87.7% av teoretisk) enhetlig substans med et smeltepunkt på 159-161°C oppnådd. Elementæranalyse og beregninger av bruttoformelen C22H26N8°8 ga de følgende verdier (de verdier som er beregnet fra bruttoformelen er satt i parentes): C = 50.07% (C = 49.81%); H = 4.99% (H = 4,94%; N =.21.48% (N = 21.12%).

lc) KK- Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA

10.6 g (20 mMol) N^-Cbo-Gly-Arg(N02)-pNA (se eksempel lb) ble behandlet med 120 ml 2-n HBr i iseddik (0.24 Mol) og opparbeidet som i eksempel lb). Hydrobromidet av dipeptid-derivater som var tørket i vakuum over NaOH-stykker ble løst i 50 ml DMF og etter kjøling blandet med 3.04 g Et^N i 10 ml DMF

(30 mMol). Dannet Et^N•HBr ble frafiltrert og vasket med litt kaldt DMF. Filtratet ble tilsatt 8.20 g (22 mMol) Cbo-Val-

OpNP. Den videre opparbeiding skjedde analogt med eksempel lb. Ved gelfiltrering og en "Sephadex LH-20"-søyle ekvilibriert med MeOH ble det etter eluering med MeOH erholdt 10.95 g (87.0% av teoretisk) av en substans med smeltepunkt på 212 - 124°C som var kromatografisk enhetlig i løsningsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformelen C27H35NgOg ga de følgende verdier: C = 52.01% (51.50%; H = 5.68% (5,60%; N = 20.27% (20.028).

(Verdiene som er beregnet fra bruttoformelen er satt i parentes):

ld) N<o<>'-Bz-Val-Gly-Arg(N02)-pNA

10.90 g (17.3 mMol) tK-Cbo-Val-Gly-Arg(N02)-pNA

(se eksempel lc) ble behandlet med 70 ml 2-n HBr i iseddik (0.14 Mol). Reaksjons blandingen ble opparbeidet som beskrevet i eksempel lb. Etter løsning av det tørkede tripeptidhydrobromid-derivat i 60 ml DMF ble løsningen etter avkjøling tilsatt 3.60

ml Et3N (26 mMol). Det dannede Et^N•HBr ble frafiltrert og vasket med litt kaldt DMF. Det erholdte filtratet ble blandet med 6.66 g (29.4 mMol) benzosy.reanhydrid. Deretter ble det buffret og opparbeidet som i eksempel lb). Det tørkede produktet ble omkrystallisert fra MeOH hvorved 4.28 g substans som var kromatografisk enhetlig i løsningsmiddelsystemene A og B, erholdt med et smeltepunkt på 222 - 223°C. Fra moderluten ble utvunnet ytterligere 3.70 g substans med et smeltepunkt på 222 - 223°C

over en søyle av "Sephadex LH-20" ekvilibrert med en MeOH. Totalt ga dette således 8.03 g (77.4% av teoretisk)enhetlig substans. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n><C>26<H>33<N>9°8 ga

de følgende verdier: C = 51.88% (52.08%); 5.63% (5.55%);

N = 21.56% (21.03%).

I) N^-Bz-Val-Gly-Arg-pNA-HCl

6.044 g (10.08 m Mol) N^-Bz-Val-Gly-Arg(N02)-pNA) (se eksempel ld) ble innveiet i en erlenmeyerkolbe med sliff. 81 ml 1-molar bor-trifluoracetat i trifluoreddiksyre ble tilsatt. Etter en reaksjonstid på 2 timer ved 0°C og deretter 22 timer ved 20°C ble, under røring og utelukkelse av luftfuktighet,nitrobeskyttelsesgruppen avspaltet. Reaksjonsløsningen ble inndampet til tørrhet i vakuum og resten tatt opp i MsOH. For å overføre peptidderivatet i HCl-saltet ble 1.0 ml kons. HCl tilsatt og løsningen inndampet

til tørrhet i vakuum. Etter tre gangers gjentagelse av denne behandlingen ble resten løst i 200 ml 30% eddiksyre. For rensning ble AcOH-løsningen brakt på en 30% AcOH>ekvilibrert "Sephadex G-15"-søyle og eluert med 30% AcOH: Den delen av AcOH-eluatet, som lot seg spalte ved trypsinbehandling under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsettning av0.85 ml (10.1 mMol) kons. HCl. Man fikk 4.75 g (79.7 % av teoretisk) av et amorft pulver som var enhetlig ved tynnsjiktkromatografi med løsningsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttof ormelen C^gH^NgOgCl ga de følgende verdier: C = 52.71% (52.83%); H = 5.88% (5.97); N = 19.07% (18,96%) og Cl = 5.95% (6.00%).

Aminoanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold:

Arg: 0.97 - Gly: 1.0 - Val: 0.98.

EKSEMPEL 2

II. H-Val-Gly-Arg-pNA-2HC1

630 mg (lmmol) av ifølge eksempel 1, avsnitt Ic, fremstilt Na-Cbo-Val-Gly-Arg(NO)2~pNA ble innveiet i et Sakakibara-apparats reaksjonskar. 10 ml tørket hydrogenfluoridgass ble kondensert i reaksjonskaret. Etter en reaksjonstid på 1 time ved 0°C ble under røring Na<->karbobenzoksybeskyttelsesgruppen såvel som nitrobeskyttelsesgruppen av arginin spaltet av. Den kondenserte hydrogenfluoridgass ble avdestillert i vakuum og resten løst i DMF. For å overføre peptidderivatet i HCl-saltet ble 0,2 ml konsentrert HCl tilsatt., og løsningen inndampet til tørrhet. Etter å ha gjentatt denne fremgangsmåte to ganger ble resten løst i 25 ml 30% AcOH. For rensning ble AcOH-løsningen på-ført en med 30% AcOH ekvilibrert "Sephadex Gl-15"-søyle og eluert med 30% AcOH. Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandlingen , under frisetning av p-nitroanilin, lar seg spalte ble frysetørket etter tilsetning av 160 ul (2mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 360 mg (68,8% av det teoretiske) av et amorft pulver, som i tynns.jiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen CigH32Ng05Cl2 ga de følgende verdier: C = 43,85% (43,60%); H = 6,23% (6,16%); N = 21,65% (21,41%) og Cl = 13,42% (13,55%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,98 - Gly: 1,00 - Val: 0,96.

EKSEMPEL 3

III. Na<->Bz-Ile-Gly-Arg-pNA.HCl

Illa) Na<->Cbo-Ile-Gly-Arg(N02)-pNA

5,3 g (10 mmol) av den ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, i oppløst i 35 ml DMF og tilsatt 2,08 ml (15 mmol) Et^N. Etter kjøling til -lo°C ble det dannete Et^N.HBr frafiltrert

og vasket med litt kaldt DMF. Det erholdte filtrat ble tilsatt 4,25 g (11 mmol) Cbo-Ile-OpNP, og reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fikk man 5,50 g (85,5%

av det teoretiske) av den krystallinske forbindelse Illa, som smeltet ved 19 7-200°C og ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformle<n><C>2<g>H37<NgOg> ga de følgende verdier: C = 51,98% (52,25%); H = 5,91% (5,79%) og N = 19,73% (19,59%).

Illb) Na<->Bz-Ile-Gly-Arg(N02)-pNA

1,29 g (2 mmol) av den ifølge eksempel 3, avsnitt Illa, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, løst i 15 ml DMF og tilsatt 420 jul (3 mmol) Et^N. Etter kjøling til -10°C ble reaksjonsblandingen tilsatt 680 mg (3 mmol) Bz20, og reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fikk man 1,05 g (85,6% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse Illb, som i tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformle<n> C27H3;.NgOg ga de følgende verdier: C = 52,54% (52,85%); H = 5,85% (5,75%) og N = 20,68%

(20,54%).

III. Na<->Bz-Ile-Gly-Arg-pNA.HCl

614 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 3, avsnitt Illb, fremstilte forbindelse ble innveiet i reaksjonskaret for et Sakakibara-apparat. 10 ml tørket hydrogenfluoridgass ble kondensert i reaksjonskaret. Etter en reaksjonstid på 1 time ved 0°C ble under røring arginin-nitrobeskyttelsesgruppen spaltet av. Den kondenserte hydrogenfluoridgass ble avdestillert i vakuum fra reaksjonsblandingen og resten løst i DMF. For å overføre peptidderivatet i HCl-saltet ble 0,2 ml (~2,5 mmol) konsentrert HCl tilsatt og løsningen inndampet til tørrhet. Etter å ha gjentatt denne fremgangsmåte to ganger ble resten løst i 50 ml 30%

AcOH. For rensning ble AcOH-løsningen påført en med 30%

AcOH ekvilibrert "Sephadex G-15"-søyle og eluert med 30%

AcOH. Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling, under frisettelse av p-nitroanilin, lar seg spalte, ble etter tilsetning av 80 ul (1 mmol) konsentrert HCl lyofilisert. Man fikk 505 mg (83,5% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av brutt© formlen C27H37<NgOg>Cl

ga de følgende verdier: C = 53,28% (53,59%); H = 6,21% (6,16%); N = 18,70% (18,52%) og Cl = 5,82% (5,86%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Ile: Q98.

EKSEMPEL 4

TV l N^=Bz=Leu=GlY-Arg-pNAiHCl IY§i_N"lCb.ozLeu=GlYiArg^N02).-pNA

2,65 g (5 mmol) av den ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, løst

i 25ml DMF og tilsatt 1,04 ml (7,5 mmol) Et-jN. Etter kjøling til -10°C ble det dannete Et.jN.HBr frafiltrert og vasket med litt kaldt DMF. Det erholdte filtrat ble tilsatt 2,13 g (5,5 mmol) Cbo-Leu-OpNP, og reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fikk man 2,85 g (88,6% av det teoretiske) av den krystallinske forbindelse IVa, som smeltet ve d 189-191°C og ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C2gH37Ng09 ga de følgende verdier: C = 52,05% (52,25%); H = 5,79% (5,79%) og N = 19,91% (17,59%).

IVb) Na<->Bz-Leu-Gly-Arg(N02)-pNA

1,29 g (2 mmol) av den ifølge eksempel 4, avsnitt IVa, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, løst i 15 ml DMF og tilsatt 420 pl (3 mmol) Et^N. Etter kjøling til

-10°C ble reaksjonsblandingen tilsatt 680 mg (3 mmol) Bz20,

og reaksjonsløsningen viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH fikk man 0,99 g (80,7% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse IVb, som i tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformelen C^H^<NgOg> ga de følgende verdier: C = 52,49% (52,85%); H =5,81% (5,75%) og N = 20,59% (20,54%).

IV. Na<->Bz-Leu-Gly-Arg-pNA.HCl

614 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 4, avsnitt IVb, fremstilte forbindelse ble omsatt til forbindelsen IV ifølge eksempel 2, avsnitt II. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15"

i 30% , AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandlingen lar seg spalte under frigjøring av p-hitroanilin, ble lyofilisert etter tilsetning av 80/ul (1 mmol) konsentrert HCl. Man fikk 508 mg (84,0% av det teoretiske) av et amorft pulver, som i tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttof ormlen C__,Ho_<No0>,<C>l

£ I il o o

ga de følgende verdier: C = 53,75% (53,59%); H = 6,21% (6,16%); N = 18,74% (18,52%) og Cl = 5,76% (5,86%). Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,97 -

Gly: 1,00 - Leu: 1,02.

EKSEMPEL 5

V. Na<->Bz-Val-Ser-Arg-pNA.HCl

Va) Na<->B0C-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA

3,55 g (7,5 mmol) av den ifølge eksempel 1, avsnitt Ia, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, løst i 35 ml DMF og tilsatt 1,56 ml (11,3 mmol) Et^N. Etter kjøling til -10°C ble det dannete Et^N.HBr filtrert fra og vasket etter med litt kaldt DMF. Det erholdte filtrat ble tilsatt 3,35 g (8 mmol) BOC-Ser(O-benzyl)-OpNP, og reaks jonsløsningen viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 4,09 g (88,4% av det teoretiske) av en delvis krystallinsk forbindelse Va, som i tynnsj iktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C27<H>36<N>8°9 ga de f<zill?ende verdier: C = 52,82% (52 ,59%); H = 5,78% (5,88%) og N = 18,30% (18,17%).

Vb) Na-B0C-Val-Ser (O-benzyl^Arg (N02) -pNA

3,08 mg (5 mmol) av den ifølge eksempel 5, avsnitt Va, fremstilte forbindelse ble innveiet i en Erlenmeyer-kolbe og under utelukkelse av fuktighet tilsatt 15 ml trifluoreddiksyre. Under røring ved 20°C, 30 minutter, løste substansen seg under C02~ utvikling. Reaksjonsløsningen ble under intensiv røring langsomt dråpevis tilsatt 250 ml tørket eter, hvorved CF3C00H.H-Ser(OBzl)-Arg(N02)-pNA falt ut. Eterfasen ble suget fra med en filtre-ringsstav. Den tilbakeblivende felling ble ytterligere behandlet tre ganger med 50 ml tørr eter for å fjerne det dannete tert. butanol og overskytende trifluoreddiksyre. Etter tørkingen

i vakuum over NaOH-flak ble det deblokkerte produkt erholdt i nesten kvantitativt utbytte. Det tørre trifluoracetatderivat ble løst i 25 ml DMF, kjølt til -10°C og tilsatt 1,04 ml (7,5 mmoli Et.jN for å frigjøre H-Ser(0-benzy];hArg(N02) -pNA fra trif luoracetat, og deretter ble 1,7 3 g (5,5 mmol) BOC-Val-OSu tilsatt. Etter noen timer hadde reaksjonsløsningen antatt romtemperatur. Den ble igjen kjølt til -10°C og bufret med 0,35 ml (2,5 mmol) Et^N. Etter ytterligere 24 timer ble reaksjonsløsningen inndampet til tørrhet i vakuum ved 40°C. Resten ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20"

i MeOH fikk man 2,81 g (78,5% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen <C>32H45<Ng0>io ga de fØlgende verdier: C = 54,03% (53,70%);

H = 6,40% (6,34%) og N = 17,88% (17,6.1%).

Vc ) Na<->Bz-Val-Ser (0-benzyl)-Arg (N02) -pNA

716 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 5, avsnitt Vb, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 5, avsnitt Vb, løst i 8 ml DMF og tilsatt 210 pl (1,5 mmol) Et^N. Etter kjøling til

-10°C ble 450 mg (2 mmol) Bz.,0 tilsatt, og reaksjonsløsningen viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 532 mg (73,9%

av det teoretiske) av den krystallinske forbindelse Vc, som smeltet ved 175-178°C og ved tynnsjiktskromatografi var enhet-

lig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformelen ^ 2A^ A1^ 9^ 9 ga de følgende verdier: C = 56,65% (56,74%); H = 5,69% (5,74$) og N = 17,83% (17,52%).

V. Na<->Bz-Val-Ser-Arg-pNA.HCl

360 mg (0,5 mmol) av den ifølge eksempel 5, avsnitt Vc, fremstilte forbindelse ble ifølge eksempel 2, avsnitt II, omsatt til forbindelsen V. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15"

i 30%'ig AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsetning av 40 pl (0,5 mmol) konsentrert HCl. Man fikk 160 mg (51,5% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktsmromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C27H37Ng0^Cl

ga de følgende verdier: C = 52,49% (52,21%); H = 6,08% (6,00%); N = 18,26% (18,04%) og Cl = 5,63% (5,71%). Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,99-

Ser: 0,95 - Val: 1,00

EKSEMPEL 6

VI. Na<->Bz-Ile-Ser-Arg-pNA.HCl

Via) Na-BOC-Ile-Ser (0-benzyl )-Arg(N02 ) -pNA

1,54 g (2,5 mmol) av den ifølge eksempel 5, avsnitt Va, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 5, avsnitt Vb, løst i 15 ml DMF og tilsatt 520 pl (3,75 mmol) Et^N. Etter kjø-ling til -10°C ble 905 mg (2,75 mmol) BOC-Ile-OSu tilsatt og reaksjonsløsningen viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 1,45 g (79,5% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse Via som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringssysteme-ne A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C-33H47Ng010 ga de følgende verdier: C = 54 ,82% (54,31%); H = 6,52% (6,49%) og N = 17,35% (17,27%).

VIb) Na-Bz-Ile-Ser(0-benzyl>Arg(N02) -pNA

730 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 6, avsnitt Via, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 5, avsnitt Vb, og løst i 7 ml DMF. Etter avkjølingen til -10°C ble løsningen tilsatt 210 ul (1,5 mmol) Et3N og like etterpå 450 mg (2 mmol) Bz20. Reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 615-mg (83,8% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse VIb, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttof ormlen C35H43N9°g <3a de følgende verdier: C =

57,61% (57,29%); H = 6,01% (5,91%) og N = 17,53% (17,18%).

VI. Na<->Bz-Ile-Ser-Arg-pNA.HCl

367 mg (0,5 mmol) av den ifølge eksempel 6, avsnitt VIb, fremstilte forbindelse ble omsatt til forbindelsen VI ifølge eksempel 2, avsnitt II. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30% AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandlingen lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsetning av 40 jil (0,5 mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 168 g (45,8% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformle<n><C>2<gH>3gNg07Cl ga de følgende verdier: C = 53,21% (52,95%); H = 6,26% (6,19%);

N = 17,88% (17,64%) og Cl = 5,57% (5,58%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,96 - Ser: 0,95 - Ile: 1,00.

EKSEMPEL 7

VII. Na<->Bz-Leu-Ser-Arg-pNA»HCl

Vila) Na<->BOC-Leu-Ser (O-benzytf-Arg (N02) -pNA

1,55 g (2,5 mmol) av den ifølge eksempel 5, avsnitt Va, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 5, avsnitt Vb, løst i 15 ml DMF og tilsatt 520 ul (3,75 mmol) Et-jN. Etter kjø-ling til -10°C ble 0,91 g (2,78 mmol) BOC-Leu-OSu tilsatt, og reaksjonsløsningen viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 1,44 g (78,9% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse Vila, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C33H47<N>9°]_q 9a de følgende verdier: C = 54,70%

(54,31%); H = 6,55% (6,49%) og N = 17,43% (17,27%).

Vllb) Na-Bz-Leu-Ser (C-banzyltArg (N02) -pNA

1,46 g (2 mmol) av den ifølge eksempel 7, avsnitt Vila, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 5, avsnitt Vb og løst i 15 ml DMF. Etter kjøling til -10°C ble løsningen tilsatt 420 jai (3 mmol) Et3N og straks deretter 0,90 g (4 mmol) Bz20. Reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 1,25 g (85,2% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse Vllb, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C35H43<Ng>°9 <9>a de følgende verdier: C = 57,38% (57,29%); H = 5,98% (5,91%) og N = 17,57% (17,18%).

VII. Na<->Bz-Leu-Ser-Arg-pNA.HCl

735 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 7, avsnitt Vllb, fremstilte forbindelse ble ifølge eksempel 2, avsnitt II, omsatt til forbindelsen VII. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30<<>b AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsetning av 80 pl (1 mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 355 mg (55,9% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemet C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C2gH3gNg07<C>l

ga de følgende verdier: C = 53,09% (52,95%); H = 6,09% (6,19%)

N = 17,91 (17,64%) og Cl = 5,49% (5,58%). Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,95 - Ser: 0,93 - Leu: 1,00.

EKSEMPEL 8

VIII. Na<->3-fenylpropionyl-Val-Gly-Arg-pNA.HCl

Villa) Na<->3-fenylpropionyl-Val-Gly-Arg(N02)-pNA

3,15 g (5 mmol) av den ifølge eksempel 1, avsnitt Ic, fremstil-

te forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, og løst i 25 ml DMF. Etter kjøling til -10°C ble løsningen tilsatt 1,05 ml (7,5 mmol) Et3N og deretter 1,50 g (5,5 mmol) 3-fenyl-propionsyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 2,75 g (87,6% av det teoretiske) av den krystallinske forbindelse Villa, som smeltet ved 216-218°C og ved tynnsjiktskromatografi var enhetLig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C^H^NgOg ga de følgende verdier: C = 53,38% (53,58%);

H - 6,02% (5,94%) og N = 20,40% (20,09%).

VIII. Na<->3-fenylpropionyl-Val-Gly-Arg-ENAiHCl

1,26 g (2 mmol) av den ifølge eksempel 8, avsnitt Villa, fremstilte forbindelse ble omsatt til forbindelsen VIII ifølge eksempel 1, avsnitt I. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%'

AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble lyofilisert etter tilsetning av 160 pl (2 mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 1,12 g (90,4% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C2gH3gNg06Cl

ga de følgende verdier: C = 54,58% (54,32%); H = 6,29%

(6,35%); N = 18,40% (18,10%) og Cl = 5,67% (5,73%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,96 - Gly: 1,00 - Val: 1,02.

EKSEMPEL 9

IX. Na<->2-fenylacetyl-Val-Gly-Arg-pNA.HCl

IVa) Na<->2-fenylacetyl-Val-Gly-Arg-(N02)-pNA

1,57 g (2,5 mmol) av den ifølge eksempel 1, avsnitt Ic, frem-

stilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 1, avsnitt Ib, og løst i 15 ml DMF. Etter kjøling til -10°C ble løsningen tilsatt 520 pl (3,75 mmol) Et^N og deretter 710 mg (2,75 mmol) 2-fenyleddiksyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-20" i MeOH erholdt man 1,35 g (88,0% av det teoretiske) av den krystallinske forbindelse IXa, som smeltet ved 180-184°C og ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystemene A og B. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C^H^NgOg ga de følgende verdier: C = 53,09% (52,85%); H = 5,82% (5,75%) og N = 20,91% (20,54%).

IX. Na<->2-fenylacetyl-Val-Gly-Arg-pNA.HCl

615 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 9, fremstilte forbindelse IXa ble omsatt til forbindelsen IX ifølge eksempel 1, avsnitt I. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 30%' AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsetning av 80 pl (1 mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 515 mg (85,1% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformle<n><C>27H37<Ng>OgCl

ga de følgende verdier: C = 53,19% (53,59%); H = 6,21 (6,16%); N = 18,77% (18,52%) og Cl = 5,75% (5,86%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,94 - Gly: 1,00 - Val: 0,98.

EKSEMPEL 10

X. Na<->Cbo-C.cykloheksylglycyl-Gly-Arg-pNA.2HC1

Xa. Na<->Cbo-Arg-pNA.HCl

I en trehalsrundkolbe på 250 ml ble 16,0 g (47,0 mmol) av over

P205 i vakuum tørket Cbo-Arg-OH.HCl i 90 ml absolutt HMPTA opp-løst ved 20°C under utelukkelse av fuktighet. Ved romtemperatur ble den erholdte løsning først tilsatt porsjonsvis en løsning av 4,74 g (47,0 mmol) Et^N i 10 ml HMPTA og derpå 16,4 g (100 mmol) p-nitrofenylisocyanat (100%'ig overskudd). Etter 24 timers reaksjonstid ved 20°C ble det meste HMPTA avdestillert i vakuum. Resten ble ekstrahert flere ganger med 30%' AcOH. Resten ble kastet. De forenete eddiksyreekstrakter ble for ytterligere rensning påført en med 30%' AcOH ekvilibrert "Sephadex G-15"-søyle og eluert med 30%' AcOH. Den fraksjon av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket. Man erholdt 12,6 g av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen <C>20H25N6°5C1 ga de f^ 1' 3ende verdier: C = 51,29% (51,67%), H = 5,48% (5,42%), N = 17,92% (18,08%), Cl = 7,50% (7,63%).

Xb. Na<->Cbo-Gly-Arg-pNA.HBr

Under utelukkelse av fuktighet ble 4,65 g (10 mmol) av forbindelsen Xa behandlet med 40 ml 2-n HBr i iseddik under røring i 4 5 minutter ved 20°C. Aminosyrederivatet løste seg ved dette under utvikling av C02> Reaksjonsløsningen ble tilsatt dråpevis under intensiv røring til 250 ml absolutt eter, hvorved (2HBr).H-Arg-pNA falt ut. Eterfasen ble suget fra, hvorpå den faste fase ble vasket ytterligere 4 ganger med 100 ml absolutt eter for å fjerne det som biprodukt dannete benzylbromid såvel som overskuddet av HBr og AcOH. Ved tørking i vakuum over NaOH-flak ble det deblokkerte produkt erholdt i kvantitativt utbytte. Det tørre (2HBr).H-Arg-pNA ble løst i 25 ml DMF. Den til -10°C kjølte løsning ble tilsatt 1,40 ml (10 mmol) Et^N. Det dannet seg et bunnfall av Et^N.HBr, som ble frafiltrert og vasket etter med litt kaldt DMF. Filtratet ble tilsatt 3,65 g (11 mmol) Cbo-Gly-OpNP ved -10°C. Etter noen timer var temperaturen for reaksjonsløsningen steget til 20°C. Løsningen ble atter kjølt til -10°C og bufret med 0,35 ml (2,5 mmol) EtjN. Etter ytterligere 16 timer ble ytterligere 0,35 ml Et3N tilsatt ved -10°C. Etter ytterligere 24 timer ble reaksjonsløsningen inn-

dampet i vakuum ved 40°C til tørrhet. Resten ble løst i 33% AcOH. Løsningen ble renset ved gelfiltrering på en med 33%

AcOH ekvilibrert søyle av "Sephadex G-15". Den fraksjon av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under fri-gjøring av p-nitroanilin, ble inndampet til tørrhet i vakuum. Resten ble løst i 30 ml MeOH og under intensiv røring tilsatt dråpevis til 300 ml absolutt eter, hvorved Na<->Cbo-Gly-Arg-pNA. HBr falt ut. Eterfasen ble suget fra, hvorpå den faste fase ble vasket ytterligere to ganger med 100 ml absolutt eter for å fjerne MeOH og spor av AcOH. Etter tørking i vakuum over NaOH-flak erholdt man 4,45 g (78,6% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen <C>22H28N7°6Br ga de f<zilgende verdier: C = 46 ,33% (46,65%), H = 5,04% (4,98%), N = 17,88% (17,31%) og Br = 14,20% (14,11%).

Xc. Na<->Cbo-C.cykloheksylglycyl-Gly-Arg-pNA.HCl

2,85 g (5 mmol) av den ifølge eksempel 10, avsnitt Xb, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 10, avsnitt Xb, og løst i 20 ml DMF. Etter kjøling til -10°C ble løsningen tilsatt 0,70 ml ( 5 mmol) Etog deretter 2,30 g (5,5 mmol) Na-Cbo-L-C.cykloheksylglycin-p-nitrofenylester (s.p. 93-94°C). Reaks jonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 10,avsnitt Xb. Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33% AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetrøket etter tilsetning av 400 yul (5 mmol) konsentrert HCl. Man fikk 2,47 g (74,7% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C30H41N8°7C1 ga de f^ 1( 3ende verdier: C = 54,15% (54,50%), H = 6,33% (6,25%), N = 17,18% (16,95%) og Cl = 5,18% (5,36%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,97 - Gly: 1,00 - L-C.cykloheksylglycin: 1,05.

EKSEMPEL 11

XI. H-L-C.cykloheksylglycyl-Gly-Arg-pNA.2HC1

660 mg ( 1 mmol) av ifølge eksempel 10 fremstilt Na<->Cbo-L~C. cykloheksylglycyl-Gly-Arg-pNA.HCl ble deblokkert ifølge eksempel 10, avsnitt Xb. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33%'ig AcOH.

Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandlingen

lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetør-ket etter tilsetning av 160 yul (2 mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 465 mg (84,9% av det teoretiske) av et amorft pulver,

som ved tynnsj iktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C22H36N8°4C12 ga de ^^^^ verdier: C = 47,95% (48,26%), H = 6,75% (6,63%), N = 20,90% (20,47%) og Cl = 12,42% (12,95%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 0,99 - Gly: 1,00 - L-C.cykloheksylglycin: 1,03.

EKSEMPEL 12

XII. Na<->Bz-L-C.cykloheksylglycyl-Gly-Arg-

pNA.HCl

550 mg (1 mmol) av den ifølge eksempel 11 erholdt forbindelse ble løst i 10 ml DMF. Etter kjøling til -10°C ble løsningen tilsatt 140 pl ( lmmol) Et-^N og deretter 340 mg (1,5 mmol) Bz20. Etter noen timer var temperaturen for reaksjonsløsningen ste-

get til 20°C. Løsningen ble igjen kjølt til -10°C og bufret med 140 pl (1 mmol) Et^N. Etter ytterligere 4 timer ble ytterligere 140 jul Et3N tilsatt ved -10°C. Etter ytterligere 16 timer ble reaksjonsløningen inndampet til tørrhet i vakuum ved 40°C. Resten ble løst i 20 ml MeOH. Ved gelfiltrering på en med MeOH ekvili brert "Sephadex LH-20"-søyle ble etter eluering med MeOH 530 mg av ennå noe forurenset produkt oppnådd. For den ytterligere rensning ble produktet løst i 33% AcOH og påført en med 33%

AcOH ekvilibrert "Sephadex G-15"-søyle og eluert med 33% AcOH. Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandlingen lot seg spalte ved frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsetning av 80 pl (1 mmol) konsentrert HCl. Man erholdt 475 mg (75,3% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C. Elementæranalyse og beregning av bruttof ormlen <C>29H39<N>8°6<C>1 ga de f-*lgen~ de verdier: C = 54,92% (55,19%), H = 6,34% (6,23%), N = 17,96%

(17,76%) og Cl = 5,51% (5,62%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 1,01-Gly: 1,0 - L-C.cykloheksylglycin: 0,98.

EKSEMPEL 13

XIII Bz- Val- Gly- Arg- 2NA. HC1

XHIa Bz- Val- Gly- Arg- 0H. HC1

5,9 g av forbindelsen I (Eksempel 1) ble oppløst i 200 ml puffer med pH 8,2. Man tilsatte løsningen 2000 NF-enheter trypsin for å avspalte p-nitroanilingruppen uten race-

misering, hvorunder man holdt pH konstant ved tildrypping av IN natronlut. Etter avsluttet reaksjon ble 40 ml kons. eddiksyre tilsatt for å inaktivere trypsinet. Løsningen ble inndampet til tørrhet. Man oppløste resten i 50 ml 33 %-ig eddiksyre og kromatograferte løsningen på en "Sephadex G-15"-søyle som var ekvilibrert med 33 % eddik-

syre. Fra den første fraksjonen fikk man 4,43 g (94,1 %)

av en amorf substans, som var enhetlig i DSC i LMS C.

Ved elementæranalyse og beregning av bruttoformelen

C20H31N6°5C''" ^ant man de følgende verdier (tallene for bruttoformelen er satt i parantes): C = 50,48 % (51,01 %), H = 6,71 % (6,63 %), N = 18,17 %

(17,85 %), Cl = 7,38 % (7,53 %).

XIII. Bz-Val-Gly-Arg-2NA.HC1

I en rund trehalskolbe med 100 ml's innhold oppløstes

942 mg (2 mmol) av den tørkede forbindelse Xllla) i en blanding av 7,5 ml nydestillert vannfri DMF og 15 ml absolutt THF ved 20°C. Den til -10°C avkjølte løsning ble tilsatt under røring og utelukkelse av fuktighet 280 pl (2 mmol) Et^N. Så ble blandingen i løpet av 20 minutter tilsatt en løsning av 27 3 mg (2 mmol) klormaur-syre-isobutylester i 5 ml THF dråpevis, hvorunder man aldri lot reaksjonstemperaturen overstige -5°C. Etter en ytterligere reaksjonstid på 10 minutter ved en tempera-

tur på -10°C til -5°C ble reaksjonsløsningen dråpevis tilsatt en løsning av 286,4 mg (2 mmol)

(i-naftylamin i. 5 ml DMF i løpet av 30.minutter, hvorunder man holdt reaksjonstemperaturen stadig under -5°C. Man lot reaksjonsblandingen reagere videre 1 ytterligere time ved -5°C. Man rørte natten over ved 20°C og avkjølte så til -15<Q>C for å la Et3N.HCl utkrystallisere. Det dannede Et3N.HCl ble frafiltrert og ettervasket med litt kaldt DMF. Filtratet ble inndampet til tørrhet sammen med vaskeløsnin-gen i vakuum ved 50°C. Resten ble oppløst i 10 ml 33 %

AcOH og renset ved gelfiltrering på en søyle av "Sephadex G-15" ekvilibrert med 33 % AcOH. Den hovedfraksjon av AcOH-eluatene som lot seg spalte ved trypsinbehandling under fri-gjøring av Ø-naftylamin ble inndampet i vakuum ved 40°C til tørrhet. Etter tørking av resten i vakuumtørkeskap ved 50°C over P2°5 fikk man 505 m9 (42,4 % av teoretisk) av den amorfe forbindelse XIV, som var enhetlig i DSC i LMS C. Elemen-tøranalyse og beregning ut fra bruttoformelen C3oH3g<N>7<0>4Cl ga de følgende verdier: C = 59,88 % (60,44 %) , H = 6,47 % (6,43 %), N = 16,75 %

(16.,45 %) og Cl = 5,83 % (5,95 %) .

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg:0,97 - Gly- 1,00 - Val: 1,02.

EKSEMPEL 14

XXV. Na<->Cbo-Val-Gly-Arg-pNA.HCl

2,85 g (5 mmol) av den ifølge eksempel 10, avsnitt Xb, fremstilte forbindelse ble deblokkert ifølge eksempel 10, avsnitt Xb,

og løst i 20 ml DMF. Etter kjølingen til -10°C ble løsningen tilsatt 0,70 ml (5 mmol) Et^N og deretter 2,05 g (5,5 mmol) Cbo-Val-OpNP. Reaksjonsløsningen ble viderebehandlet ifølge eksempel 10, avsnitt Xb.

Rensning: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 33% AcOH. Utbytte: Den del av AcOH-eluatet som ved trypsinbehandling lot seg spalte under frigjøring av p-nitroanilin, ble frysetørket etter tilsetning av 400 jul (5 mmol) konsentrert saltsyre. Man erholdt 2,55 g (82,1% av det teoretiske) av et amorft pulver, som ved tynnsjiktskromatografi var enhetlig i elueringsmiddelsystem C.Elementæranalyse og beregning av bruttoformlen C27H37Ng07Cl ga de følgende verdier: C = 52,12% (52,21%), H = 6,16% (6,00%), N = 18,48% (18,04%) og Cl = 5,63 (5,71%).

Aminosyreanalysen ga de forventede aminosyrer i det riktige forhold: Arg: 1,01 - Gly: 1,00 - Val: 0,97.

Ifølge metodene som er beskrevet i eksemplene ble en rekke ytterligere substrater syntetisert. Resultatene av disse syn-teser er sammenfattet i de følgende tabeller.

Substratene ifølge oppfinnelsen, for eksempel det ifølge eksempel 1 i det erholdte substrat, nemlig Na<->Bz-Val-Gly-Arg-pNA<*>NCl, ble anvendt for bestemmelse av forskjellige enzymer i blodplasma. Bestemmelsen forløp etter det prinsipp av det ved den enzymatiske hydrolyse av substratet dannede spaltningsprodukt (NI^-R 2) har et UV-spektrum som er forskjellig fra substratets og forskjøvet mot høyere bølgelengder. Således har substratet ifølge eksempel 1, det vil si Na<->Bz-Val-Gly-Arg-p"NA*HCl, et absorbsjonmaksimum ved 302 nm (nanometer) og en molar ekstinksjonskoeffisieht på 12 9 50. Substratets absorp-sjon er ved 450 nm praktisk lik null. p-nitroanilin, det ved enzymatisk hydrolyse av substratet dannede spaltningsprodukt (NH2R 2) har et absorbsjonsmaksimum ved 380 nm og en molar ekstinksjonskoeffisient på 13 200. Ved 405 nm synker ekstink-sjonskoeffisienten litt, dvs. til 9 650.

Ved spektrofotometrisk måling ved 405 nm lar graden av enzyma-trisk hydrolyse av substratet hvis mengde er proposjonalt med avspaltet p-nitroanilin seg lett bestemme. Substratet som er til stede i overskudd forstyrrer ikke målingen ved 405 nm. Forholdene er praktisk talt identiske for de andre substratene ifølge oppfinnelsen som inneholder en p-nitroanilingruppe som kromofor-gruppen. Den spektrofotometriske målingen ble derfor i alle disse tilfellene utført ved 405 nm.

Den enzymatiske hydrolysereaksjonen kan vises skjematisk

som følger:

E = enzym

S = substrat

ES = enzym-substrat-kompleks

Pl og P2 = Produkter

k^, k2, k3 og k4 = hastighetskonstanter

k2 dissosiasjonskonstanten for ES = = K (Michaelis-konstanter)

k m

kl

Når [S]» [E] og k4« k3, gjelder:

Hastighetskonstanten hvorved P1 dannes er:

Når E er fullstendig bundet til S gjelder: Lineweaver-Burk-ligning

Fra ligningen (2) følger at konstantene Km og k3 bestemmer virksomheten av substratent for et gitt enzym. For bestemmelse av disse konstantene anvender man følgende metode: Man blander enzymet og substratet i en bufferløsning og for-følger hydrolysereaksjonen i 2 til 30 minutter. Substratets [S] konsentrasjonen varierer, mens enzymkonsentrasjonen holdes konstant. Når ekstinksjonen (OD = optisk densitet) opptegnes i et kordinatsystem som funksjon av tiden, får man en kurve hvis tangent i nullpunktet svarer til hydrolysens ideale forløp.

Ved hjelp av denne tangenten kan man bestemme hydrolysens begynnelseshastighet.

Når i opptegnes som funksjon av -r^r, får man et Lineweaver-Burk-v L b j

diagram (se "Kurzes Lehrbuch der Biochemie" von P. Karlson, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, side 70), hvorav ^ max

og 3 K mkan bestemmes grafisk.

v

K og k, = ^?ax ble bestemt under anvendelse av substratet m 3 3 E

ifølge forbindelsen, for eksempel Na<->Bz-Val-Gly-Arg-pNA.HCl (substrat I ifølge eksempel 1) for urokinase.

Resultatet ble sammenfattet i tabell I.

De målte verdier for K og v ved hjelp av de andre substratene

m J max J c

ifølge oppfinnelsen for urokinase er av samme stør-

relseorden hvorav fremgår at de nevnte substrater har en særlig høy ømfintlighet overfor urokinase.

For bestemmelse av de i tabell I avgitte kinetiske konstanter Km og vmax ble vandi9e fortynningsrekker fremstilt av substrater med konsentrasjoner på 0.1 til 2 umol pr. ml. I en målekuvette ble 2 ml tris-imidazol-puffer med pH 8.4 og ionestyrke 0.30

fylt ved 37°C, hvoretter så 0.25 ml av en vandig urokinase-løsning med konsentrasjon på 400 CTA pr. ml ble tilsatt. Blandingen ble pre-inkubert 1 minutt ved 37°C. Den pre-inkuberte blandingen ble så tilsatt 0.25 ml substratløsning. Forløpet til substratets enzymatiske hydrolyse ble fulgt for

de forskjellige substratkonsentrasjoner ved hjelp av et foto-meter ved 405 nm i 10 minutter. Mengden av den mengde p-nitroanilin som dannes pr. minutt er et mål for hydrolysehastig-

heten for en gitt substratkonsentrasjon. De resiproke verdiene av substratkonsentrasjonen ble opptegnet i et kordinatsystem på absissen og de tilhørende resiproke verdiene av hydrolysehastig-heten på ordinaten. I dette såkalte Lineweaver-Burk-diagrammet fikk man rette kurver for de substrater som er oppført i tabell I, hvilket var et bevis for at substratets hydrolyse med urokinase fulgte Michaelis-Mentens lov og at følgelig substratene er idelle for bestemmelse av urokinase. Fra kurvenes skjærings-punkter med absissen og ordinaten ble de i tabell I oppførte kinetiske konstanter K m og 3 v max målt.

BAEE (Benzoyl-L-arginin-etylester) - 1 BAEE-enhet urinkallikrein er den mengde enzym som under standardbetingelser hydrolyserer 1 pmol benzoyl-L-arginin-etylester pr. minutt.

NIH er en av "US National Institute of Health" standardisert enhet CE = kaseinenhet som måles på kasein under standardbetingelser.

NF = trypsin-enhet= den mengde enzym som bevirker en absorb-sjonsendringA OD = 0.003 pr. minutt, målt på benzoyl-L-arginin-etylester under standardbetingelser (se "The National Formulary XII", utgitt av "The American Pharmaceutical Assosiation", Washington, D.C.., 1965, side 417-418) .

I den første kolonnen i tabell II er den mengde avgitt av forskjellige enzymer.som spalter substrat I ifølge"oppfinnelsen ved 37°C, pH 8.4 og ionestyrke 0.3 ved en substratkonsentrasjon på 10 ^ M med en hastighet av 1 uM pr.minutt. I den andre kolonnen er angitt den tilsvarende enzymmengde i andre enzymenheter. Av tabell II fremgår at det tilstedeværende enzymet urinkallikrein som er sammen med urokinase i urinet bare spalter substrat I lite og derfor ikke forstyrrer ved bestemmelsen av urokinase

i urin. Substrat I spaltes også svært lite og uspesifikt av trombin.

På den vedlagte tegning er den eneste figur en grafisk fremstilling hvori endringen i optisk densitet ^ OD som frembringes ved den hydrolytiske virkning av forskjellig mengder urokinase på substratet I frembringes i løpet av 10 minutter påsettes som funksjon av urokinasemengden i et kordinatsystem. av denne figuren fremgår det at urokinasekonsentrasjonen kan bestemmes nøyaktig i området fra 1 til 10 CTA pr. ml. Ved bestemmelsen

av urokinaseinnholdet i urin hos 14 sunne forsøkspersoner ble mengder på ca. 8 CTA-enheter pr. ml urin funnet.

Bestemmelsen av urokinase i urin er særlig viktig da man derved, som allerede ovenfor nevnt, forholdsvis raskt og enkelt kan fast-slå patologiske tilstander. Den hittil mest anvendte metode for bestemmelse av urokinase i urin er den såkalte fibrinplatemetoden [I.Bjerrehuus, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 4, 179 (1952); F.E. Smyrniotis et al., Thromb. Diath. et Haemorrh. bind III, 258

(1959)], som utføres som følger: Etter Mullertsmetode [Acta physiol. Scand. 26^, 174 (1954)] fremstilles fibrinplater (fibrinogeninnhold: 0.2%). For hver urokinasebestemmelse anvender man en fibrinplate og 30 Lambdadråper (Lambdadråpe-pipette) av ufortynnet, 1:2 og 1:4 fortynnet urin (når urin-konsentrasjonen er meget høy, kan man fordoble fortynnings-faktorene). Platen inkuberes i 16 timer ved 3 0°C. De lyserte sonene gjøres synlige ved tilsetning av en dråpe kongrødt (0.1%). Produktet av to loddrett på hverandre stående tverrsnitt (av lyserte soner) tjener som mål for lyserende soner. Urokinase-konsentras jonen (enhet pr. ml) måles ved hjelp av en sammenlik-ningskurve som oppstilles ved anvendelse av en fortynningsrekke med standardurokinase.

Ved denne metoden bestemmes urokinasekonsentrasjonen ikke direkte, men over den fra plasminogen fra urokinase dannede plasmin-mengden. Denne bestemmelsen av sluttprodukter som løper over en kjede av réaksjoner er beheftet med mange feilkilder. Andre tungtveiende ulemper ved denne metoden går ut på at inkubasjons-tiden er meget lang og en kalibreringskurve må oppstilles for hver bestemmelse. Utregningen av resultatene er videre forholds-messig komplisert og unøyaktig på grunn av at kalibrerings-kurven ikke er lineær.

Ved hjelp av substratet ifølge oppfinnelsen lar ulempene

den ovenfor beskrevne bestemmelsesmetode seg lett overvinne,

da målingen av urokinasekonsentrasjonen skjer direkte og ingen bireaksjoner gir feil i målingsresultatet. Dertil foreligger måleresultater allerede etter 10 minutter, hvilket er spesielt viktig for den kliniske diagnostikken. En videre fordel består i at måleresultatene kan angis i substratenheter. Endringen av optisk densitet & 0D på 0.010/min. svarer til et innhold på 1 millienhet urokinase pr. ml innhold forsøkssats.

Når det gjelder å bestemme plasminogen-aktivatorer i blodplasma er det ofte hensiktsmessig å utføre bestemmelsen i en bufferløsning som inneholder aprotinin og/eller hirudin, da den sistnevnet ikke virker hemmende på plasminogen-aktivatorene, mens imidlertid andre eventuelt tilstedeværende aktiverte plasmaenzymer som for eksempel trombin, plasmin og plasmakalle-krein, som ved bestemmelsen av plasminogen-aktivatorerne under visse forhold kan virke forstyrrende, hemmer. Man kan for eksempel anvende en tris-imidazol- eller glycin-buffer med en pH på 8.2 til 8.6 og en ionestyrke på 0.15 til 1.0, som man har tilsatt 0.02 til 0.2 trypsininhibitor-enheter aprotinin og/ eller 0.001 til 10 antitrombinenheter hirudin pr. ml.

Når det ved urokinasebestemmelsen foreligger inhibitorer for urokinase i de væsker som skal analyseres, kan det være gun-stig å tilsette disse væsker et overskudd av urokinase, og etter noen minutters inkubering bestemme den øvrige urokinase-aktivitet ved tilsetning av substrat og måling av mengden spaltningsprodukt.

Gjengitt er resultatene for hver av de funne kommersielt fremstilte peptidderivater sammenlignet med det beskrevne tripeptid i henhold til den foreliggende patentsøknad: Bz-Val-Gly-Arg-pNA (I) sammenlignet i forhold til urokinase-aktivitet.

De benyttede, tidligere kjente peptidderivater var føl-gende :

A: Bz-Ileu-Glu-(Y~OMe)-Gly-Arg-pNA

B: H-D-Phe-Pip-Arg-pNA

C: H-D-Val-Leu-Arg-pNA

D: Bz-Val-Leu-Arg-pNA

E: Bz-Phe-Val-Arg-pNA

F: Cbo-Gly-Gly-Arg-&-NA

Sammenlignignsforsøkene var utført på følgende måte:

0,1 ml vandig urokinase-oppløsning med et innhold på 1000 CTH-enheter urokinase pr. ml ble tilsatt 1,7 ml trisimida-zolpuffer pH = 8,4, og ionestyrke 0,3 ved 3 7°C. Denne blan--3 ding ble tilsatt 0,2 ml med en 10 molar vandig oppløsning med tilsvarende peptidderivat. Den frigjorte mengde p-nitroanilin eller beta-naftylamin (for forbindelse F) ble målt pr. minutt spektrofotometrisk eller fluoressens-spektrofotometrisk og bestemt i nanomol. De fundne verdier for de undersøkte peptidderivater var proporsjonale med mengde urokinase. Resultatene er angitt i følgende tabell:

Av ovenforstående tabell fremgår at resultatene for tri-peptidderivat I i forhold til urokinase signifikant frem-hever seg i forhold til tidligere kjente peptidderivater A - F i henhold til teknikkens stand.

Substratet ifølge oppfinnelsen egner seg også for bestemmelse

av inhibitorer av plasminogenaktivatorer, for eksempel av urokinaseinhibitorer. Denne bestemmelsen kan gjennomføres ved at man inkuberer en bestemt mengde urokinase med en uro-kinaseinhibitorholdig kroppsvæske med eller uten et buffer-system, fortynner den inkuberte blandingen ved hjelp av tris-imidazol-buffer til et volum på 1.8 ml og blander den fortynnede blandingen ved 0.2 ml av en 2 x 10~<3> molar løsning av et substrat ifølge oppfinnelsen. Under måling av endringen av optisk densitet pr. minutt bestemmes den ikke-hemmede urokinaseaktiviteten. Forskjellen mellom den anvendte urokinasemengden og den øvrige urokinaseaktiviteten er et mål for den foreliggende inhibitormengden.

For bestemmelse av plasminogenpreaktivatorer i plasma aktiveres det sistnevnte først kvantitativt, hvorpå det derved dannede plasminogenaktivatorer bestemmes ved hjelp av substratet ifølge oppfinnelsen.

Aktiveringen av plasminogenpreaktivatorene skjer ved at man inkuberer plasma eller tilsetting av et aktivt Hagmann-faktor-preparat optimalt å tilsettte inkubatet i en aprotinin-holdig tris-imidazol-puffer for å hemme de likeledes oppståtte andre enzymer ved aktiveringen av plasminogenpreaktivatorene, særlig plasmakallikrein og plasmin.

Prinsippet for de ovenfor beskrevne bestemmelser ved hjelp av substratet ifølge oppfinnelsen består i å bestemme allerede tilstedeværende eller ved aktivering dannet etter en hemming av ennå tilstedeværende ikke-hemmet enzym, dvs. plaminogen-aktivator (f.eks. urokinase).

Claims

Tri- eller tetrapeptidderivater eller salter derav med mineralsyrer eller organiske syrer for anvendelse som substrater for den kvantitative bestemmelse av plasminogenaktivatorer, inhibitorer for disse og plasminogen-preaktivatorer i legemsvæske fra mennesker og pattedyr og

i vevsekstrakter,

karakterisert ved den generelle formel

hvori R<1> er hydrogen, en alkanoylgruppe med 2-18 karbonatomer som eventuelt har en aminogruppe i uJ-stilling, en feny]a]kanoylgruppe hvis alkanoylrest inneholder 2-6 karbonatomer og hvis fenylrest eventuelt er substituert med en aminogruppe, en cykloheksylkarbonylgruppe som eventuelt er substituert med en amino- eller aminometylgruppe, en benzoylgruppe som eventuelt er substituert med en metyl-, amino- eller aminometylgruppe, en benzyloksykarbonylgruppe eller en metyl-, etyl-, fenyl-, metylfenyl- eller naftyl-sulfonylgruppe, R 3 er en rettkjedet eller forgrenet alkyl-rest med 1-7 karbonatomer eller en cykloheksyl- eller cykloheksylmetylrest, Y er en glycyl- eller serylgruppe,

og R 2er en p-nitrofenylamino-, 2-naftylamino- eller 4-metoksy-2-naftylaminogruppe.