NL8802710A - Werkwijze voor het bepalen van een enzym en daarvoor geschikte kit en stof. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bepalen van een enzym en daarvoor geschikte kit en stof.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een verschijningsvorm van een enzym in een biologische vloeistof door van de vloeistof een monster af te scheiden en in dit monster met behulp van een immunologische bepalingsmethode het gehalte van de verschijningsvorm van het enzym te bepalen.

In biologische vloeistoffen, zoals weefselextracten, urine, celextracten, cultuurmedia, plantenextracten of bloed komen veel typen enzymen voor. In deze vloeistoffen zijn de enzymen vaak niet erg stabiel, bijvoorbeeld door de aanwezigheid van andere enzymen, fysiologische remmers of omdat het enzym intrinsiek niet stabiel is. Dergelijke enzymen komen veelal in lage concentraties voor en zijn daardoor niet eenvoudig accuraat te bepalen.

In bloed komen bijvoorbeeld proteasen voor, betrokken bij stolling, fibrinolyse, immunologische afweerreacties en weefselopbouw of afbraak-processen. Voorbeelden van dergelijke proteasen zijn thrombine, plasminogeen activatoren, plasminogeen, elastase en collagenase.

Deze proteasen zijn dikwijls in verschillende vormen aanwezig, nl. als inactief proenzym, actief enzym, enzym-inhibitor complexen en inactief enzym. Men is meestal in het actief vrij enzym geïnteresseerd, soms echter ook of vooral in het als proenzym of remmercomplex aanwezig enzym. Het bepalen van deze verschijningsvorm van het enzym is vaak moeilijk,bijv. doordat het actieve vrije enzym ook na monstername nog kan reageren met natuurlijke in het monster voorkomende remmers (fysiologische remmers) zodat de werkelijke waarde in het monster hoger zal zijn dan de in de test gemeten waarde.

Dit probleem kan zeer hinderlijk zijn, bijv. bij het bepalen van de plasminogeen activatoren t-PA (weefsel-type plasminogeen activator) en u-PA (urokinase) in bloed omdat deze enzymen in zeer lage concentraties voorkomen en er een zeer snelle fysiologische remmer in bloed bestaat. Ook bij een aantal stollings-enzymen zoals bijv. thrombine treedt dit probleem op.

Plasminogeen activatoren zijn zeer specifieke serine proteasen die omzetting van plasminogeen in piasmine katalyseren. Piasmine is in staat bloedsto-lsels op te lossen door het daarin aanwezige fibrine af te breken. Er zijn verschillende plasminogeen-activatoren bekend, waarvan urokinase en weefseltype plasminogeen activator de belangrijkste zijn. In het bijzonder lijkt t-PA een rol te spelen bij de fibrinolyse in vivo, waarschijnlijk als gevolg van de specifieke affiniteit voor fibrine. In verband hiermee is er behoefte aan een betrouwbare en eenvoudige methode voor het bepalen van de concentratie actief t-PA in lichaamsvloeistoffen, in het bijzonder bloed, van zowel gezonde mensen als van patiënten met bepaalde afwijkingen. Te denken valt hierbij aan op jonge leeftijd optredende thrombose of onverklaarbare bloedingen.

In lichaamsvloeistoffen kan t-PA, evenals andere proteasen, in verschillende vormen voorkomen, namelijk als actief vrij enzym, als inactief vrij enzym en als inactief complex met fysiologisch voorkomende remmers. Voor in vivo fibrinolyse is waarschijnlijk slechts het actieve vrije t-PA van belang.

Er kunnen twee verschillende type bepalingen voor t-PA worden onderscheiden: immunologische en functionele. Bij immunologische bepalingen wordt de hoeveelheid van plasminogeen activator antigeen bepaald. Afhankelijk van het gebruikte antilichaam wordt ofwel totaal t-PA antigeen, ofwel een of meer van de t-PA vormen, actief vrij t-PA, inactief vrij t-PA, of inactief t-PA in complex met remmers bepaald. Bij functionele bepalingen wordt alleen actief vrij t-PA bepaald.

Van beide typen bepalingsmethoden zijn een aantal voorbeelden bekend. Een probleem bij deze bepalingsmethoden blijft echter het bepalen van actief vrij t-PA in lichaamsvloeistoffen zoals bijv. bloed. Het is namelijk gebleken dat in dergelijke vloeistoffen vaak remmers voorkomen die met actief vrij t-PA kunnen reageren na het moment van bloedafname en zo de hoeveelheid actief vrij t-PA verlagen waardoor een onjuiste waarde wordt gemeten. In de klinische praktijk blijkt een snelle gestandaardiseerde bloedafname procedure om deze problemen op te lossen, moeilijk te realiseren.

Doel van de uitvinding is om de betrouwbaarheid van werkwijzen voor het bepalen van de concentratie van een actief vrij enzym, zoals in het bijzonder de proteasen t-PA en u-PA, in een biologische vloeistof, zoals bloed en weefselkweekmedia, waarin ook een of meer fysiologische remmers van het enzym voorkomen, te vergroten en met name minder afhankelijk te maken van de tijd die tussen het moment van monstername en het tijdstip van de bepaling verstrijkt.

Dit doel wordt volgens de uitvinding gerealiseerd met een werkwijze van het in de aanhef vermelde type, welke gekenmerkt wordt doordat men, wanneer de te bepalen verschijningsvorm het actieve enzym in vrije toestand is, tijdens of nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster, en wanneer de te bepalen verschijningsvorm een pro-enzym of een enzym-inhibitor complex is, ten laatste nagenoeg direkt na activering daarvan, voldoende van een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het enzym in het monster brengt om in hoofdzaak alle aanwezig actief vrij enzym te binden voordat het kan reageren met in het monster aanwezige fysiologische remmers, en men op een later tijdstip middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aldus gebonden actief vrij enzym vaststelt.

Volgens de uitvinding wordt, wanneer de te bepalen verschijningsvorm het actieve enzym in vrije toestand is, het monster direkt geincubeerd met een overmaat remmer van het desbetreffende enzym. Deze remmer bevat minimaal twee reactieve groepen waarvan er één met een zekere specificiteit reageert met het actief centrum van het enzym en één hetzij een label bevat dat specifiek kan worden aangetoond, zoals een radioisotoop, hetzij anderszins herkenbaar is, zoals door middel van een specifieke interactie met een reagens dat een detecteerbaar label bevat. Doordat alleen vrij en actief enzym met de remmer zal reageren, wordt alleen dit gelabeld en dus ook later bepaald.

Door een snelle reactie met het actief vrij enzym in het monster wordt reactie met fysiologische remmers of andere inactivering na de monstername of tijdens opslag van het monster voorkomen. De remmer is bij voorkeur een voor het te bepalen enzym specifieke, niet-macromoleculaire remmer. Macromoleculaire stoffen, zoals antilichamen die met het actief centrum van het te bepalen enzym reageren, zijn voor gebruik als remmer volgens de uitvinding minder geschikt. Redenen hiervoor zijn dat 1) de reactiesnelheid van een vrij enzym met een groot molekuul zoals een antilichaam laag is, waardoor een hoge concentratie van het antilichaam nodig zou zijn; 2) antilichamen niet erg stabiel zijn bij transport en opslag, 3) de gevoeligheid van de bepaling vrij laag is, 4) een antilichaam-antigeen reactie reversibel is, zodat de reactie met fysiologische remmers mogelijk blijft, vooral als deze laatsten irreversibel werken.

In de onderhavige uitvinding worden deze problemen ondervangen door gebruik te maken van laag moleculaire synthetische remmers, die zeer snel met actief vrij enzym, zoals de hier verder vooral als voorbeeld genomen proteasen reageren, in hoge molaire concentraties aanwezig zijn en stabiel zijn tijdens transport en opslag. Voor deze remmers is van belang dat zij een hoge affiniteit voor het doelenzym hebben, snel reageren, in elk geval veel sneller dan de concurrerende fysiologische remmers, bij voorkeur een covalente binding met het enzym aangaan, stabiel zijn bij opslag en transport, en bij voorkeur een grote mate van specificiteit vertonen voor het doelenzym. Veel van de enzymen voorkomend in biologische vloeistoffen behoren tot de proteasen. Verschillende typen proteasen worden gevonden zoals serineproteasen, thiolproteasen, asparaginezuur proteasen en metalloproteasen. De in bloed voorkomende stollings-en fibriolyse- (pro-)enzymen zoals thrombine, plasminogeen, tissue-type plasminogeen activator (t-PA) en urokinase (u-PA), zijn serine-proteasen. Een belangrijk thiolprotease is cathepsine B uit de lysosomen. Het maagenzym pepsine behoort tot de groep van asparaginezuur proteasen, terwijl collagenase, o.a. betrokken bij botmetabolisme, een metalloprotease is. Voor vele enzymen in elk van deze groepen zijn remmers bekend, vaak met hoge affiniteit en grote specificiteit. Zo worden serine proteasen onder andere geremd door organische fluorofosfaten (zoals diisopropylfluorofosfaat), sulfonylfluorides (zoals fenylmethaansulfonylfluoride) en peptidylhalo-methylketonen. Thioproteasen zijn ook te remmen door peptidylhalomethylketonen, peptidyldiazomethanen of peptidylaldehydes. Voor diverse asparaginezuurproteasen zijn inhibitors beschreven, vaak gebaseerd op gemodificeerde peptiden zoals statine en pepstatine. Ook voor metalloproteasen zijn inhibitors bekend, gebaseerd op aldehyde of keton afgeleiden van aminozuren of peptiden, of gebaseerd op fosforbevattende peptide analogen. In het algemeen zijn naast een reactieve groep die met het actieve centrum reageert ook één of meer groepen aanwezig die de specificiteit voor het doelenzym vergroten of bepalen. Hiervoor kunnen korte peptiden zeer geschikt zijn. Zo is bekend dat D-Phe-Pro-Arg-Chloromethylketon (PPACK) een uitstekende remmer van thrombine en t-PA is, terwijl urokinase (u-PA), een andere plasminogeen activator die voorkomt in bloed, hier vrij traag mee reageert. D-Glu-Gly-Arg-Chloromethylketon daarentegen is een zeer goede remmer van u-PA terwijl t-PA hier traag mee reageert.

Door een geschikte combinatie van reactieve groep en peptide kan voor vele enzymen een goede specificiteit worden bereikt.

In de onderhavige uitvinding worden derivaten van dergelijke synthetische remmers beschreven die naast de functionele groepen, nodig voor remming en specifieke herkenning van het enzym ook nog een later op eenvoudige en gevoelige wijze detecteerbaar label of anderszins herkenbare groep bevatten. Verschillende typen labels of herkenbare groepen kunnen worden gebruikt, zoals radioactieve isotopen, fluorescerende groepen (bijv. dansylgroep), met behulp van antilichamen detecteerbare haptenen (bijv. trinitrobenzeen), biotine(derivaten) die met behulp van (strept)avidine te detecteren zijn, enzymen die een detecteerbaar product leveren, of andere met behulp van fysische-, chemische-, biologische-, of immunologische methoden detecteerbare of detecteerbaar te maken groepen.

Wanneer het monster direct na of zelfs tijdens de monstername in contact wordt gebracht met een remmerderi-vaat van genoemd type reageert dus het aanwezige vrije protease, zoals t-PA onmiddellijk irreversibel met dit derivaat. Aldus wordt niet alleen de reactie met in het monster aanwezige fysiologische remmers voorkomen, maar wordt ook het aanwezige vrije t-PA voorzien van een detecteerbaar label.

Hierdoor is de hoeveelheid vrij t-PA die ten tijde van de monstername aanwezig was later te onderscheiden van het in andere vormen aanwezige t-PA. De procedure van monstername en opslag wordt hierdoor zeer vereenvoudigd. Indien men een proenzym of een inactief remmercomplex wenst te meten kan men, vóór dat men het remmerderivaat toevoegt een geschikte activeringsstap uitvoeren om het inactieve proenzym of remmercomplex om te zetten in actief enzym. Wanneer men de concentratie van het proenzym of het remmercomplex, exclusief de concentratie van het actief vrij enzym, wil bepalen kan men bijv. een aparte meting van het actief vrij enzym uitvoeren, waarbij het verschil tussen de twee meetresultaten informatie geeft over de gezochte concentratie, of kan men een bijdrage aan het meetresultaat door het actief vrij enzym verhinderen, bijv. door direkt bij de monstername remmer zonder herkenbare groep toe te voegen.

De volgens de uitvinding te gebruiken, gelabelde remmer kan gemakkelijk volgens gangbare technieken worden bereid. Hiertoe gaat men bijv. uit van commercieel verkrijgbare remmer preparaten met een specificiteit, geschikt voor het te bepalen enzym. Voor t-PA valt hierbij te denken aan bijv. D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl-keton, terwijl voor u-PA Glu-Gly-Arg-chloromethylketon geschikter is. Aan een dergelijke remmer wordt een detecteerbare groep gekoppeld, bijv. aan een vrije NH2~groep eventueel via een spacer van gewenste lengte.

Een hiervoor geschikte groep is bijv. biotine dat als N-hydroxy-succinimidylbiotine aan de vrije aminogroep van bijv. bovengenoemde remmers is te koppelen. Omdat in waterige oplossing chloromethylketonen hun grootste stabiliteit hebben bij lage pH en de koppeling met N-hydroxysuccinimidylgroep bij voorkeur bij hoge pH geschiedt, is het raadzaam de koppeling uit te voeren in een organisch oplosmiddel. Een hiervoor geschikt oplosmiddel is methanol waaraan bij voorkeur een organische base zoals triethylamine is toegevoegd om de bij de koppelingsreactie vrijkomende protonen te binden.

De temperatuur waarbij de koppelingsreactie kan worden uitgevoerd is niet kritisch maar ligt bij voorkeur rond kamertemperatuur. Onder dergelijke omstandigheden is de koppeling na ongeveer 3 uur compleet. Het product kan worden gezuiverd, bijv. door middel van reversed phase HPLC gebruikmakend van een gradient startend met 0.1% trifluorazijnzuur in water en eindigend met 0.1% trifluorazijnzuur in acetonitril. Het oplosmiddel kan worden verwijderd door verdamping, bij voorkeur onder vacuum. Het product kan worden opgelost in een organisch oplosmiddel of in water. Methanol is hiervoor zeer geschikt.

In een concreet geval is gebruik gemaakt van de remmer D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon en het label biotine. Uitgaande van D-Phe-Pro-Arg-chloromethyl-keton en N-hydroxy-succinimidyl biotine werd het remmer derivaat hiotinyl-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon bereid door reactie van D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon 5 mM met N-hydroxysuccinimidylbiotine 5 mM in methanol met triethylamine 10 mM gedurende 0-24 h bij kamertemperatuur. Na verschillende reactietijden werden monsters genomen en werd met behulp van HPLC gebruikmakend van een reversed phase kolom en elutie met een gradient lopend van 0.1% trifluorazijnzuur in water naar 0.1% trifluorazijnzuur in acetonitril, de omzetting gecontroleerd. De pieken van de beide uitgangsmaterialen bleken duidelijk af te nemen en er verscheen een piek van het koppelings-product. Na ca. 3 h incubatie was de omzetting maximaal.

Het product kon gezuiverd worden met behulp van preparatieve HPLC als boven geschetst. Het biotinyl-PPACK is een uitstekende remmer van t-PA, vergelijkbaar met PPACK zelf.

Aan een t-PA bevattend monster, waarvan men de concentratie aan vrij t-PA wil bepalen, wordt overmaat biotinyl-PPACK toegevoegd, bij voorkeur in een concentratie van Ο.Ι-Ι,ηΜ om een voldoend snelle reactie tussen t-PA en remmer te bereiken. Hierna volgt een bepaling sterk gelijkend op een traditionele enzym immunoassay.

Er wordt gebruik gemaakt van houders van kunststof, bijv. polyvinylchloride of polystyreen houders, bij voorkeur in de vorm van buizen of microtiter platen met een aantal afzonderlijke putjes. Deze houders worden gecoat met mono- of polyclonale antilichamen tegen t-PA en nagecoat met bijv. runderserum albumine volgens daarvoor gangbare procedures. Aan de gecoate houders worden monsters toegevoegd die met biotinyl-PPACK gelabeld t-PA bevatten. Na incubatie onder schudden gedurende 1-24 h in een buffer die daarvoor geschikt is zoals een 10 mM fosfaatbuffer met pH van bijv. 7.5, bij voorkeur bevattend 5 mM Ethyleendiaminotetraacetaat en een detergens zoals Tween 20 5 g/1, worden de houders een aantal malen gewassen met dezelfde of een overeenkomstige buffer. Hierna wordt er streptavidine of avidine, gekoppeld aan een enzym zoals mierikswortelper-oxidase of alkalische fosfatase toegevoegd en gedurende 1-4 h geïncubeerd bij bijv. kamertemperatuur onder schudden. De houders worden weer gewassen met een geschikte buffer en tenslotte geïncubeerd met een geschikt substraat voor mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase, waaruit een gekleurd product ontstaat. Zoals in enzym immunoassays is de concentratie in een bepaald gebied bij benadering evenredig met de hoeveelheid vrij t-PA in het oorspronkelijke monster. De detectie-limiet van de onderhavige methode is zodanig dat meting van fysiologische concentraties t-PA in bloed of andere lichaamsvloeistoffen mogelijk is.

Het grote voordeel van de onderhavige methode boven bestaande procedures is, dat de situatie die in het monster op een zeker moment bestaat, bij voorkeur direct na of tijdens opvangen, dan wel op een ander geschikt moment zoals na activatie van proenzym of remmercomplex, kan worden gefixeerd, waarna op een daarvoor geschikt tijdstip de eigenlijke bepaling kan worden uitgevoerd. Voor routine bepalingen van grote aantallen monsters wordt de bepaling bij voorkeur uitgevoerd in microtiterplaten en worden de metingen verricht met speciale meerkanaals fotometers, eventueel gekoppeld aan een computer voor data-opslag en verwerking.

De bepaling kan echter ook in buizen of cuvetten worden verricht. De specificiteit van de onderhavige methode wordt op twee punten bepaald, namelijk door de keuze van het remmerderivaat en door de keuze van het polyclonale-of monoclonale antilichaam bij de detectie. Door aanpassing hetzij van het remmerderivaat hetzij van het antilichaam of beide, kan de bepaling geschikt gemaakt worden voor andere proteasen. Hierbij valt te denken aan (pro-) enzymen voorkomend in bijv. stolling of fibrinolyse zoals plasminogeen, u-PA, t-PA, (pro)throm-bine, maar het hier beschreven principe is algemeen toepasbaar. Andere voorbeelden van enzymen die op een dergelijke manier zouden kunnen worden bepaald, zijn naast de serineproteasen, de thiolproteasen zoals cathepsine B waarbij derivaten van Phe-Phe-Arg-chloro-methylketon als remmers kunnen worden gebruikt, aspartaat-proteasen als renine met derivaten van statine als remmer, metalloproteasen als collagenase en angiotensine converterend enzym met bijv. ketoraethyleen- en amino-ketonpeptide derivaten.

De uitvinding verschaft verder een kit-type combinatie van middelen voor het uitvoeren van de bepalingsmethode volgens de uitvinding, omvattende (a) een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het te bepalen actief vrij enzym; en (b) een polyklonaal of monoklonaal antilichaam tegen het te bepalen actief vrij enzym.

Dergelijke kits zullen doorgaans, naast een met (a) gevulde houder en een met (b) gevulde houder, nog andere middelen en een of meer werkvoorschriften/ge-bruiksaanwijzingen bevatten.

Bij andere middelen kan bijv. gedacht worden aan een houder, gevuld met een bufferoplossing die desgewenst ook een preservatief en een oppervlakte actieve stof bevat; bij gebruik van een met biotine(derivaat) of hapteen gelabeld remmer derivaat, een houder met een afgemeten hoeveelheid van (bij voorkeur met een enzym) gelabeld streptavidine of avidine respectievelijk met een enzym gekoppeld monoklonaal- of polyklonaal antilichaam tegen het hapteen; bij gebruik van een op een enzymatische reactie gebaseerde detectie, houders met een voor een dergelijk enzym, bijv. mierikswortel-peroxidase of alkalische fosfatase, geschikt substraat, alsmede houders omvattende incubatievloeistof voor de uitvoering van de omzetting van dit substraat.

Een combinatie volgens de uitvinding kan ook een houder omvatten met een afgemeten hoeveelheid van het te bepalen enzym of proenzym, om controle metingen mogelijk te maken.

Tenslotte omvat de uitvinding ook van een detecteerbare groep voorziene remmers van een actief vrij enzym, welke voor gebruik in de werkwijze volgens de uitvinding geschikt zijn.

De uitvinding wordt aan de hand van een voorbeeld nader toegelicht.

VOORBEELD

(a) Remming t-PA

Men incubeerde een oplossing bevattende 5 IU/ml t-PA, met 1 uM van een gezuiverd biotinyl-PPACK preparaat gedurende enkele minuten bij een temperatuur tussen 0 en 37°C, bij voorkeur bij kamertemperatuur.

Hierna werd de overgebleven t-PA activiteit gemeten met een daartoe bekende methode. De t-PA activiteit bleek vrijwel volledig door het remmerpreparaat te worden geremd. Dit betekent dat het remmerpreparaat in staat is om een covalent complex te vormen met het actief centrum van t-PA.

(b) Bepaling van t-PA

Aan een t-PA bevattend monster werd biotinyl-FPACK als remmerpreparaat toegevoegd en er werd geïncubeerd als onder (a). Een oplossing, bevattende 10 ug/ml van polyklonale antilichamen die tegen t-PA waren opgewekt (verkrijgbaar bij Biopool, Zweden) in 0.1 M NaHCOg, pH 9.6 werd gedurende ongeveer 20 h bij kamertemperatuur onder schudden in contact gebracht met de putjes van een PVC microtiterplaat. Een volume van 0.10 ml van een dergelijke oplossing per putje was hiervoor zeer geschikt. Een nacoating met bijv. lQmg/1 runderserum-albumine in dezelfde buffer gedurende enkele uren bleek zeer aan te bevelen.

In putjes van een op deze wijze gecoate microtiterplaat werden verschillende hoeveelheden van een met biotinyl-PPACK remmerpreparaat geïncubeerd monster gebracht. Het volume werd gebracht op 0.10 ml per putje met een buffer bevattende 10 mM natriumfosfaat, 0.15 M NaCl, 5 mM EDTA en 0.5 g/1 Tween 20. De plaat werd overnacht bij kamertemperatuur licht geschud.

Na legen van de putjes werden deze drie maal gewassen met 0.15 ml van dezelfde buffer. Vervolgens werd per putje 0,10 ml van een oplossing van streptavidine-mieriks-wortelperoxidase conjugaat toegevoegd in dezelfde buffer. Na incubatie gedurende 2 uur bij kamertemperatuur werd de plaat weer driemaal met dezelfde buffer gewassen. Hierna werd per putje 0.10 ml van een oplossing van tetramethylbenzidine in een ureumperoxide bevattende buffer toegevoegd. Na incubatie gedurende 0-2 uur bij 25°C werd 0.05 ml 2 M H2SO4 toegevoegd en de extinctie gemeten bij 450 nm met behulp van een meerkanaals fotometer. Het bleek dat de gemeten extinctie nagenoeg lineair toenam met de hoeveelheid vrij t-PA in het monster.

(c) Kit voor t-PA bepaling Een "kit" voor 96 bepalingen als beschreven onder (b) omvat:

Een microtiterplaat gecoat en nagecoat volgens (b), voorzien van een stabilisator zoals mannitol. Een houder bevattende een voldoend grote hoeveelheid (O.lOyumol) biotinyl-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon in droge vorm dan wel opgelost in 1.0 ml methanol. Een houder bevattende 0.50 ml tetramethylbenzidine in vloeibare vorm. Een houder bevattende een afgepaste hoeveelheid ureumperoxide, bij voorkeur in tabletvorm. Eventueel een houder bevattende een bekende hoeveelheid gezuiverd t-PA in droge vorm waaraan water moet worden toegevoegd, voor het doen van controle metingen. Een werkvoorschrift volgens (b) en een voorschrift voor het voorbereiden van de monsters en opvangen van bloed. Inplaats van remmerpre-paraat in een voorraadhouder, kan de kit ook 96 gebruiksklare bloedopvangbuizen bevatten, bijv. van het vacuumtype, waarin zich een afgemeten hoeveelheid antistollings-middel zoals natriumcitraat en een afgemeten hoeveelheid biotinyl-phe-pro-arg-chloromethylketon bevinden.

Claims (12)

1. Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van een verschijningsvorm van een enzym in een biologische vloeistof door van de vloeistof een monster af te scheiden en in dit monster met behulp van een immunologische bepalingsmethode het gehalte van de verschijningsvorm van het enzym te bepalen, met het kenmerk, dat men, wanneer de te bepalen verschijningsvorm het actieve enzym in vrije toestand is, tijdens of nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster, en wanneer de te bepalen verschijningsvorm een pro-enzym of een enzym-inhibitor complex is, ten laatste nagenoeg direkt na activering daarvan, voldoende van een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het enzym in het monster brengt om in hoofdzaak alle aanwezig actief vrij enzym te binden voordat het kan reageren met in het monster aanwezige fysiologische remmers, en men op een later tijdstip middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aldus gebonden actief vrij enzym vaststelt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men een voor het enzym specifieke, niet-macromoleculaire remmer toepast.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men de concentratie in de biologische vloeistof bepaalt van het actieve enzym in vrije toestand door tijdens of nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster de van een detecteerbare groep voorziene remmer toe te voegen en later middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aan deze van een detecteerbare groep voorziene remmer gebonden actief vrij enzym vast te stellen.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een protease is.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het enzym een serine-protease is.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men een organisch fluorofosfaat, een organisch sulfonylfluoride of een peptidylhalomethylketon als remmer toepast.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men ter bepaling van actief vrij weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) of van geactiveerd t-PA/ inhibitor complex D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon als remmer toepast.

8. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat men ter bepaling van actief vrij urokinase (u-PA) of van geactiveerd pro-u-PA D-Glu-Gly-Arg-chloro-methylketon als remmer toepast.

9. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-8, met het kenmerk, dat men een van biotine als herkenbare groep voorziene remmer toepast.

10. Werkwijze voor het bepalen van de concentratie van actief vrij weefsel-type plasminogeen activator (t-PA) in bloed, door van het bloed een monster af te scheiden en in dit monster met behulp van een immunologische bepalingsmethode het gehalte van het actief vrij t-PA te bepalen, met het kenmerk, dat men nagenoeg direkt na het afscheiden van het monster voldoende biotinyl-phe-pro-arg-chloromethylketon in het monster brengt om in hoofdzaak alle aanwezig actief vrij t-PA te binden voordat het kan reageren met in het monster aanwezige fysiologische remmers, en men op een later tijdstip middels een immunologische bepaling de hoeveelheid van het aldus gebonden actief vrij t-PA vaststelt.

11. Kit-type combinatie van middelen voor het uitvoeren van de werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, omvattende (a) een van een detecteerbare groep voorziene remmer van het te bepalen actief vrij enzym; en (b) een polyklonaal of monoklonaal antilichaam tegen het te bepalen actief vrij enzym.

12. Van een detecteerbare groep voorziene remmer van een actief vrij enzym, geschikt voor gebruik in de werkwijze volgens een der conclusies 1-10.