JPH10185916A - 前駆型ペプチドの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】前駆型ペプチドと変換物質との被疑混入物
を還元条件下にて、そのジスルフィド結合の開裂を行う
工程と、前記第１の部位に対して特異的に結合する第１
のリガンドの固相化物と、第２の部位に対して特異的に
結合する第２のリガンドとを用いて、該前駆型ペプチド
と該変換物質を区別する工程を含むことにより、第１の
リガンドと第２のリガンドの両方に結合する物質または
第１のリガンドには結合せず第２のリガンドには結合す
る物質のいずれかの量を測定する該前駆型ペプチドまた
は該変換物質の測定法。 【効果】 生理学的意義の全く違う２つの蛋白質の混入
物において、一方を特異的に測定することが可能であっ
て、診断学、臨床医学、生理学や医薬品の製造開発分野
に大きく貢献できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は診断学、基礎医学、
医薬品の製造開発において、ヒト由来検体、医薬品およ
び医薬品製造工程由来検体中の特定の物質、すなわち前
駆型ペプチドまたは該前駆型ペプチドからの変換物質を
特異的に測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペプチド結合とジスルフィド結合を有す
る前駆型ペプチドと、該前駆型ペプチドが特定の切断反
応による特定のペプチド結合部位の切断により少なくと
も第１の部位と第２の部位に分けられるが、ジスルフィ
ド結合により１つの物質を構成する前記前駆型ペプチド
からの変換物質との混入が疑われる検体（被疑混入物と
略すことがある）中において、該前駆型ペプチドまたは
該変換物質を測定する需要は高い。例えば血栓溶解剤と
して上市されている１本鎖組織プラスミノーゲンアクチ
ベータ（以降組織プラスミノーゲンアクチベータをｔＰ
Ａと略すことがある）やプロウロキナーゼ等を臨床に使
用した時、患者において１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡの
血中濃度を測定したり、またプロウロキナーゼとウロキ
ナーゼの血中濃度を測定することにより、その生理学的
挙動を明確にする必要がある場合がある。またｔＰＡや
プロウロキナーゼ等の血栓溶解剤の製造工程において、
原体や製剤中の１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡの含有比や
プロウロキナーゼとウロキナーゼの含有比を明らかにす
る必要がある場合も想定される。

【０００３】ちなみに１本鎖ｔＰＡは、ペプチド結合と
ジスルフィド結合を有する前駆型ペプチドとして、正常
細胞やメラノーマ細胞、さらには遺伝子操作された形質
転換細胞から産出され、プラスミンまたはカリクレイン
により１本のペプチド鎖が、クリングル構造を持つ部位
とセリンプロテアーゼ活性を持つ部位との間に存在する
リジンとイソロイシン間のペプチド結合が切断され、２
本のペプチド鎖となるが、ジスルフィド結合により依然
として物質としては一つである２本鎖ｔＰＡ（変換物
質）となる。またプロウロキナーゼは、正常細胞や遺伝
子操作された形質転換細胞から産出され、そのものは特
別の生理活性を示さず、後述のウロキナーゼに変換され
て、フィブリン溶解活性を示すものであって、該プロウ
ロキナーゼは１本のペプチド鎖が、クリングル構造を持
つ部位とセリンプロテアーゼ活性を持つ部位との間に存
在する、リジンとイソロイシン間のペプチド結合が、プ
ラスミン、カリクレインまたはトリプシンにより切断さ
れ、Ａ鎖とＢ鎖からなる２本のペプチド鎖となるが、ジ
スルフィド結合により依然として物質としては一つであ
る分子量約５万の高分子ウロキナーゼ（変換物質）、ま
たは、上記のリジンとイソロイシン間のペプチド結合の
切断に加え、さらにプラスミンにより、前記のリジンと
クリングル構造を持つ部位との間に存在する、リジンと
リジンの間のペプチド結合が切断され、クリングル構造
を持つ部位は欠くが、ジスルフィド結合により依然とし
て物質としては一つである分子量約３万の低分子ウロキ
ナーゼ（変換物質）となる。本願では特に言及しない限
り、高分子ウロキナーゼと低分子ウロキナーゼの両方を
合わせてウロキナーゼと表示する。

【０００４】１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡの混合物、プ
ロウロキナーゼとウロキナーゼの混合物において、それ
ぞれの物質の濃度を測る従来の測定法は次のような方法
である。すなわち１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡの混入物
においては、ｔＰＡに比較的特異的な合成基質を用い、
１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡのこの合成基質に対する分
解能の差を指針にしてその含有比を測定していた。また
プロウロキナーゼとウロキナーゼの混入物においては、
ウロキナーゼの濃度はウロキナーゼに比較的特異的な合
成基質を用いて測定し、プロウロキナーゼの濃度はプラ
スミンによってプロウロキナーゼをウロキナーゼに変換
し、変換後の全ウロキナーゼの濃度を測定し、その濃度
から変換前のウロキナーゼを引くことによってプロウロ
キナーゼの濃度を測定していた。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
従来の測定法は用いる合成基質の特異性が必ずしも厳密
ではないこと、酵素の合成基質の分解能が測定バッファ
ーの温度、ｐＨやイオン強度など多くの変動因子に大き
く依存することなど、その特異性や精度の点で満足のい
くものではなく、これらの正確性を期するためには、測
定条件の正確な管理や多くの予備実験を必要とする。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、ペプチド
結合とジスルフィド結合を有する前駆型ペプチドと、該
前駆型ペプチドが特定の切断反応による特定のペプチド
結合部位の切断により少なくとも第１の部位と第２の部
位に分けられるがジスルフィド結合により依然１つの物
質を構成する該前駆型ペプチドからの変換物質という、
構造が極めて類似しているがその生理学的意義の全く違
う２種類の物質の混入物において、一方を特異的に測定
するという課題を解決すべく、鋭意検討して本発明を完
成するに至った。すなわち、本発明は、ペプチド結合と
ジスルフィド結合を有する前駆型ペプチドと、特定の切
断反応による該前駆型ペプチドの特定のペプチド結合部
位の切断により少なくとも第１の部位と第２の部位に分
けられるが、ジスルフィド結合により１つの物質を構成
するその前駆型ペプチドからの変換物質との混入が疑わ
れる検体中での、該前駆型ペプチドまたは該変換物質の
測定法であって、前駆型ペプチドと変換物質との被疑混
入物を還元条件下にて、そのジスルフィド結合の開裂を
行う工程と、前記第１の部位に対して特異的に結合する
第１のリガンドの固相化物と、第２の部位に対して特異
的に結合する第２のリガンドとを用いて、該前駆型ペプ
チドと該変換物質を区別する工程を含むことにより、第
１のリガンドと第２のリガンドの両方に結合する物質ま
たは第１のリガンドには結合せず第２のリガンドには結
合する物質のいずれかの量を測定することを特徴とする
該前駆型ペプチドまたは該変換物質の測定法である。

【０００７】本発明で、前駆型ペプチドとはペプチド結
合とジスルフィド結合を有するものであって、この前駆
型ペプチドから特定のペプチド結合が切断されて、何ら
かの変換物質となり得るものを意味する。この切断され
るべきペプチド結合は、特定の切断反応、例えば酵素反
応によって、特定の位置において行われるものが好まし
く、酵素反応としては、生理的環境下に存在する各種の
プロテアーゼ、例えばセリンプロテアーゼ、チオールプ
ロテアーゼ、カルボキシルプロテアーゼ、メタロプロテ
アーゼ等が挙げられ、特にセリンプロテアーゼが好まし
い。セリンプロテアーゼとしては、プラスミン、カリク
レイン、トリプシンが例示される。

【０００８】前駆型ペプチドのペプチドとは一般に言う
蛋白質やポリペプチドを含むものであって、場合によっ
てオリゴペプチドであっても良い。また糖鎖等が付くこ
とも特に問題とはならない。すなわち少なくともペプチ
ド結合とジスルフィド結合の結合を含むものであればよ
くに限定されない。前駆型ペプチドとしては１本鎖ｔＰ
Ａ、プロウロキナーゼ、プラスミノーゲンが具体例とし
て挙げられる。

【０００９】また、変換物質とは前記前駆型ペプチドの
特定のペプチド結合が切断され、少なくとも第１の部位
と第２の部位に分かれたもので、ジスルフィド結合によ
り依然として物質としては一つの物質であるものを意味
し、具体的には、２本鎖ｔＰＡ、ウロキナーゼ、プラス
ミンが例示される。上記のペプチド結合の切断部位は、
１箇所であっても複数の箇所であっても良く、第１の部
位、第２の部位の他、それ以上の部位となっている場合
も含む。また複数の箇所のペプチド結合の切断により、
前駆型ペプチドのアミノ酸配列と変換物質のアミノ酸配
列を比べたときに、１つまたは２つ以上のアミノ酸配列
が結果的に欠損している場合もある。具体例として、変
換物質が低分子ウロキナーゼである場合が挙げられる。

【００１０】第１の部位と第２の部位は好ましくは生理
的に意義のある活性中心またはその近傍であることが好
ましく、ｔＰＡにおいてはクリングル領域、セリンプロ
テアーゼ活性部位、グロースファクター領域が挙げら
れ、プロウロキナーゼにおいても、クリングル領域、セ
リンプロテアーゼ活性部位、グロースファクター領域が
挙げられる。

【００１１】本願で検体とは、前記前駆型ペプチドと変
換物質との混入が疑われるものであれば特に限定されな
いが、例えば原薬用原体や製剤の溶解液が挙げられる。
また血漿や血清等においても測定可能であって、この場
合は前駆ペプチドから変換物質への変換反応が進行しな
いように、何らかの処理をほどこすことが好ましく、例
えば、阻害剤等を添加することが特に好ましい。

【００１２】阻害剤としては、測定しようとする前駆型
ペプチドや変換物質により適宜選択すれば良く、例えば
ｔＰＡ、プロウロキナーゼにおいてはアプロチニン、ジ
イソプロピルフルオロリン酸が例示される。これらの被
疑混入物を還元条件下にてジスルフィド結合の開裂を行
う工程の詳細な説明は次の通りである。

【００１３】還元条件として、２−メルカプトエタノー
ル、１，４−ジチオスレイオールまたはトリ−ｎ−ブチ
ルホスフィンからなる群より選ばれた１つ以上の還元剤
を用いる方法がある。これらの群の中で、ジスルフィド
結合の開裂に最もよく使用される２−メルカプトエタノ
ールを用いるのが好ましい。還元剤の濃度としては０．
０１％〜１０％の濃度の範囲が例示され、０．１〜２％
が好ましく、特に約１％が好ましい。還元条件下に置く
時間は通常１時間以内で十分であり、５分が好ましい例
として挙げられる。還元条件における温度は室温で十分
であるが、還元剤の量や対象物に応じて、冷却下で行う
こともできる。この工程によって前駆型ペプチドおよび
その変換物質のジスルフィド結合の開裂を行うことがで
きる。なお、このジスルフィド結合の開裂反応は、存在
するジスルフィド結合の全てを切断しなければならない
ものではなく、複数のペプチド鎖同志が離れる程度であ
ればよいが、できるだけ全てのジスルフィド結合を開裂
する方が、確実な測定結果を与えることとなることから
好ましい。この開裂の工程は後記の第１の部位に対する
リガンドと第２の部位に対するリガンドを用いる工程の
前に実施することが好ましく、例えば被疑混入物として
検討検体を用い、これに還元剤を添加することが具体的
に例示される。

【００１４】またジスルフィド結合の開裂後、第１のリ
ガンドの固定化物または第２のリガンドを接触させる場
合、ジスルフィド結合の開裂工程で用いた還元剤は取り
除くか、または十分希釈して用いることが好ましい。第
１の部位に対して特異的の結合するリガンドの固相化物
と第２の部位に特異的に結合するリガンドを用いて、前
駆型ペプチドとその変換物質を区別する工程の詳細な説
明は次の通りである。

【００１５】第１の部位に対して特異的の結合するリガ
ンドの固相化物と第２の部位に特異的に結合するリガン
ドを用いて、前駆型ペプチドとその変換物質を区別する
工程は種々の態様が考えられる。典型的な方法として
は、先に述べた検体を予め還元条件下にて、ジスルフィ
ド結合を開裂し、これを第１のリガンドの固相化物へと
接触させる。接触後、検体と固相化物を分離し、好まし
くは固相化物を適宣の溶液により洗浄することが例示さ
れる。この分離法としては、デカンテーションや遠心分
離法やカラムによる方法が例示される。第１のリガンド
に検体中の前駆型ペプチドのジスルフィド結合開裂物が
結合するとともに、変換物質がジスルフィド結合開裂工
程により、第１の部位と第２の部位に分離しているた
め、変換物質からの第１の部位が第１のリガンドに結合
している。分離後固相化物に対し、第２のリガンドを接
触させる。第２のリガンドが結合するものは固相化物の
前駆型ペプチドのジスルフィド結合開裂物のみであり、
以上の工程により、前駆型ペプチドと変換物質を区別す
ることができる。

【００１６】第１のリガンドと第２のリガンドの用い方
の他の例は、例えば、前記と同様に検体を予めジスルフ
ィド結合の開裂工程を行った後、第２のリガンドを反応
させ、次いでこれを第１のリガンドの固相化物と接触さ
せる方法により、前駆型ペプチドと変換物質を区別する
ことができる。またジスルフィド結合の開裂工程を、第
１のリガンドの固相化物と第２のリガンドを用いる工程
とを組み合わせる方法も考慮させる。例えば、検体を先
ず第１のリガンドの固相化物と接触させ、固相化物と検
体を分離し、必要に応じて固相化物を洗浄し、次いでこ
の固相化物に対して、ジスルフィド結合の開裂工程を行
い、必要に応じて固相化物を洗浄後、第２のリガンドを
この固相化物に接触させることにより、前駆型ペプチド
と変換物質を区別することができる。また、予め第２の
リガンドと検体を接触させ、反応させた後にジスルフィ
ド結合の開裂を行い、その後第１のリガンドの固相化物
と接触させ、必要に応じて洗浄を行う方法もある。その
他にも、検体を先ず第１のリガンドの固相化物と接触さ
せ、固相化物と検体を分離し、必要に応じて固相化物を
洗浄し、次いでこの固相化物に対して、第２のリガンド
をこの固相化物に接触させ、必要に応じて洗浄し、その
後、ジスルフィド結合の開裂を行い、必要に応じて洗浄
する方法もある。この方法も、予め検体を第２のリガン
ドと接触させた後、第１のリガンドの固相化物と接触さ
せ、必要に応じて洗浄して得た固相化物に対して、ジス
ルフィド結合の開裂工程を行い、必要に応じて洗浄する
ことで前駆型ペプチドと変換物質を区別することができ
る。

【００１７】しかし、上述の各種方法において、リガン
ドの種類によっては、選択が難しかったり、還元条件の
微妙な調整が必要な場合もある。例えば、リガンドがジ
スルフィド結合を有する物質で、上述のジスルフィド結
合の開裂工程により、リガンドのジスルフィド結合が切
断され、第１のリガンドと第１の部位との結合に影響を
与えるもの、例えば抗体においては注意が必要である。
これらにおいては、第１のリガンドと第２のリガンドが
存在する時にジスルフィド結合の開裂を行う工程は避け
た方がより好ましいと理解される。

【００１８】ジスルフィド結合の開裂反応を行った後
に、酸化により再びジスルフィド結合が生じる可能性も
あるため、その後の工程や処理においては還元条件の中
で処理を行うことが好ましい。勿論、先に説明した通
り、第１のリガンドや第２のリガンド等に影響を与えな
いように、強すぎない還元条件下とすることも容易に理
解される。具体的例としては、還元条件として還元剤を
用いる場合、その濃度を０．０５％以下にすることで強
すぎない還元条件下の中で処理を行うことができる。強
すぎないが、再びジスルフィド結合を生じさせない還元
条件として、０．０５％の還元剤を用いることがより好
ましい。

【００１９】以下に第１のリガンドの固相化物について
さらに説明する。第１のリガンドとは、第１の部位に特
異的に結合するもので、通常両者の結合関係は共有結合
ではなく、水素結合のような非共有結合であることが普
通である。具体的には、抗体、レクチン、細胞膜上レセ
プター、基質、補酵素が挙げられ、これら群の中で抗体
が好ましく、モノクローナル抗体がより好ましい。

【００２０】第１の部位に特異的に結合する第１のモノ
クローナル抗体の作製方法は公知の方法、例えば次の通
りである。第１の部位からなるペプチドを適宜な方法に
より取得し、必要に応じて担体と結合せしめ、所望によ
りアジュバンドとともに、マウスを免疫する。そのマウ
スから取得した脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とをポ
リエチレングリコールを用いて融合させ、作成したハー
ブリドーマの培養上清を以下の方法によりチェックす
る。例えば前述の如く取得した第１の部位からなるペプ
チドを後述の適宜の方法により水不溶化担体に固定化し
て調整した固相化物と接触させる。必要に応じて洗浄
し、その後固相化物と酵素標識したウサギ抗マウスＩｇ
Ｇ抗体を接触させる。必要に応じて洗浄し、標識酵素に
応じた基質を用いて酵素反応させる。ハイブリドーマの
培養上清中に第１の部位に特異的に結合するモノクロー
ナル抗体が存在すれば発色反応がおこる。コントロール
として第２の部位からなるペプチドの固相化物について
同様に行えば、第１の部位に特異的に結合するが、第２
の部位に結合しない、第１の部位に特異的に結合するモ
ノクローナル抗体を作製することができる。

【００２１】第１の部位に特異的なポリクローナル抗体
の取得方法は次の通りである。同様に取得した第１の部
位からなるペプチド、または必要に応じて担体と結合し
たもので動物を免疫し、抗血清を得る。抗血清から抗体
を精製する過程で、第１の部位からなるペプチドを固相
化したカラムによるアフィニティ精製と第２の部位から
なるペプチドを固相化したカラムによるアフィニティ精
製を行う。第１の部位からなるペプチドを固相化したカ
ラムに結合し、第２の部位からなるペプチドを固相化し
たカラムを素通りする分画を得て、第１に部位に特異的
に結合するポリクローナル抗体を取得できる。

【００２２】本発明で第１のリガンドの固相化物とは、
水不溶性担体に第１のリガンドを固相化したものであっ
て、水不溶性担体は、ポリスチレンらのプラスティック
やガラス等を素材にするものであって、固相化方法は、
共有結合、イオン結合等の化学的結合やファンデルワー
ルス結合、疎水結合等の物理吸着結合や、それらの結合
の組合せが採用でき、特に限定されない。具体的にはポ
リスチレンを水不溶性担体に用いた場合のイオン結合と
疎水結合の組合せが例示させる。固相化物の形状は特に
限定されず、容器壁面やビーズであってもよく、好まし
くはマイクロプレートが良い。

【００２３】第２のリガンドは第２の部位に特異的に結
合するもので、第１のリガンドおよび第１の部位と区別
されるものであるが、例示させるリガンドの種類、その
結合方法やその作製方法は第１のリガンドと同様であ
る。第２のリガンドは多くの場合、予め標識しておくこ
とが好ましい。標識物として、酵素、ラジオアイソトー
プ等が挙げられ、具体的にはペルオキシダーゼ、ヨウ素
１２５やビオチン等が挙げられる。

【００２４】リガンドに接触させる方法は、リガンドを
接触させる検体を、予めバッファーに溶解するか希釈し
て、リガンドに接触させる。検体を溶解するか希釈する
バッファーについては限定されないが、好ましくは前述
の通り微量の還元剤を含むもので、ｐＨは中性が良く、
検体中の前駆型ペプチドや変換物質の容器壁面への吸着
を防ぐために、界面活性剤を含むものが良い。具体的に
は、例えば０．０５％２−メルカプトエタノール、０．
０１％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート含有
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）が挙げられる。ま
たリガンドに接触させる温度や時間についても特に限定
されないが、測定する前駆型ペプチド、変換物質の種類
や安定性、用いるリガンドの種類によって決まるので、
好ましくは予備実験によって設定することが良く、通常
３０分から３時間、４℃から３７℃が例示される。固相
化物と検体の分離の方法はデカンテーション、遠心分離
やカラムによる方法が挙げられ、具体的には、マイクロ
プレートを水不溶性担体として用いた場合、検体をデカ
ンテーションにより除去した後に、洗浄液をマイクロプ
レートに添加し、直ちに洗浄液を除去し再び洗浄液を添
加する方法が例示される。洗浄液については限定されな
いが、具体例として、０．０１％ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水が挙げ
られる。

【００２５】次いて、第１のリガンドと第２のリガンド
の両方に結合する物質または第１のリガンドには結合せ
ず第２のリガンドに結合する物質のいずれかの量を測定
する方法について説明する。第１のリガンドと第２のリ
ガンドの両方に結合する物質は、上記のジスルフィド結
合の開裂を行う工程の後も、第１の部位と第２の部位の
両方の部位を有する、前駆型ペプチドに対応する物質で
ある。第１のリガンドには結合せず第２のリガンドに結
合する物質は、ジスルフィド結合の開裂を行う工程の
後、第１の部位と第２の部位をつなげていたジスルフィ
ド結合が開裂したため、第１の部位を有せず第２の部位
を有する、変換物質に対応する物質である。

【００２６】量の測定には、第２のリガンドが標識され
ている場合には、その標識を検出に用いればよい。また
後述の通り第２のリガンドを認識する第３のリガンドを
用いる方法も存在する。第１の部位と第２の部位の両方
に結合した物質を検出する場合には、固相上の標識物の
量を測定すれば良い。また、第１のリガンドには結合せ
ず第２のリガンドに結合する物質を検出する場合は、ジ
スルフィド結合の開裂を行う工程後、第１の部位と第２
の部位をつなげていたジスルフィド結合が開裂したため
第１の部位を有せず第２の部位を有す変換物質に対応す
る物質に結合している第２のリガンドの標識物を検出に
用いればよい。

【００２７】標識物としては、酵素やラジオアイソトー
プ等が挙げられ、具体的にはペルオキシダーゼ、ヨウ素
１２５やビオチンが挙げられることは前述の通りであ
る。また、第２のリガンドを予め標識することの他に、
第２のリガンドに特異的に結合する第３のリガンドを用
い、この第３のリガンドを標識しておいても良い。この
場合、第３のリガンドは第１のリガンドには結合しない
ことが求められる。このようなリガンドとして、抗体が
好ましい例として挙げられる。例えば第１のリガンドと
第２のリガンドの由来動物を変え、第２のリガンドに特
異的な抗体を第３のリガンドとすることができる。具体
的例として、第１のリガンドとしてマウス由来抗体を用
い、第２のリガンドとしてウサギ由来抗体を用い、第３
のリガンドとしてラット由来抗ウサギ抗体抗体を用いる
例が挙げられる。

【００２８】標識物の量の測定は、標識物が酵素の場合
は、酵素に応じた基質を適宜のバッファーに適宜の基質
に応じた濃度で溶解し、酵素と基質溶解液を接触させる
ことにより、基質の酵素反応を行う方法がある。酵素反
応の温度と時間は特に限定しないが、多くの場合温度は
室温で良く、時間は１時間以内である。標識物がビオチ
ンの場合は、酵素標識したアビジンか、酵素標識したビ
オチンとアビジンをプレインキュベーションしたものを
標識ビオチンと接触させ、結合反応を行い、必要の応じ
て洗浄を行う。次にアビジンまたはビオチンとアビジン
を介して、標識ビオチンに結合した酵素の酵素反応を行
うことで、標識物であるビオチンの濃度を測定する。酵
素反応の条件は前記と同様である。標識物がラジオアイ
ソトープの場合は、放射線カウンターによって、該ラジ
オアイソトープから放出される放射線量を測定すること
で標識物であるラジオアイソトープ量を測定する。測定
は既知量の前駆型ペプチドまたは既知量変換物質を用い
て検量線を作成し、測定値を算出する。測定対象物の濃
度は、測定する前駆型ペプチド、変換物質の種類や用い
るリガンドの種類等の条件によって変わり、好ましくは
予備実験によってその濃度範囲を設定することが好まし
いが、通常１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ程度が例示され
る。

【００２９】

【発明の実施の形態】好ましい具体的な方法として、前
駆型ペプチドの測定例を下記に示す。予め第１のリガン
ドである抗体を、１０μｇ／ｍｌの濃度になるように５
０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）に溶解し、溶解液
を酵素免疫測定用マイクロプレートに、各ウェルの１２
５μｌずつ分注し、４℃で１昼夜静置する。マイクロプ
レートに分注してある抗体溶解液をデカンテーションに
より除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を各
ウェルに２００μｌずつ分注し、直ちに除去する。この
ような洗浄を数回行う。最終濃度が１％となるように、
２−メルカプトエタノールを含むバッファーを被疑混入
物に添加する。室温で５分間程静置して、ジスルフィド
結合の開裂を行う。検体を０．０１％ポリオキシエチレ
ンソルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．４）で２０倍希釈し、希釈液を上記のマイク
ロプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注する。この
方法により、酵素免疫測定用マイクロプレートに固相化
した第１の抗体の固相化物とジスルフィド結合の開裂工
程後の検体を接触させる。予備実験によって設定した温
度と時間で静置させ、第１の抗体と第１の部位の結合反
応を行う。反応後デカンテーションにより検体を除去
し、各ウェルに０．０１％ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．
４）を２５０μｌずつ分注し、直ちに除去する。この洗
浄操作を数回行う。第２のリガンドである、ペルオキシ
ダーゼ標識した抗体を０．０１％ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４）で希釈し、洗浄液を除去したマイクロプレート
の各ウェルに標識抗体希釈液を１００μｌ分注する。予
備実験によって設定した温度と時間で静置させ、上記の
洗浄操作を数回行う。１，２−ベンゼンジアミンを１ｍ
ｇ／ｍｌの濃度のなるように、５０ｍＭクエン酸、１０
０ｍＭリン酸バッファーと０．０６％過酸化水素水を等
量混合したバッファー（ｐＨ５．０）に溶解し、洗浄液
を除去したマイクロプレートの各ウェルに１００μｌず
つ分注する。室温で１０分間反応させた後、１規定の塩
酸を各ウェルに１００μｌずつ分注し、反応を停止させ
る。各ウェルの発色度はマイクロプレートリーダー用い
て、検出波長４９２ｎｍで測定する。検量線として、既
知量の該前駆型ペプチドを用いて作成した検量線から、
この被疑混入物中の該前駆型ペプチド濃度を算出する。

【００３０】変換物質の測定実施例は下記の通りであ
る。予め第１のリガンド（抗体）を１０μｇ／ｍｌの濃
度になるよう、５０ｍＭ炭酸バッファー（ｐＨ９．６）
に溶解し、溶解液を酵素免疫測定用マイクロプレート
に、各ウェルの１２５μｌずつ分注し、４℃で１昼夜静
置する。マイクロプレートに分注してあるリガンドをデ
カンテーションにより除去し、リン酸緩衝生理食塩水
（ｐＨ７．４）を各ウェルに２５０μｌずつ分注し、直
ちに除去する。このような洗浄を数回行う。検体を０．
０１％ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート含有
リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、希釈液
をマイクロプレートの各ウェルに１００μｌずつ分注す
る。この方法により、酵素免疫測定用マイクロプレート
に固相化した第１のリガンドの固相化物と検体を接触さ
せる。４℃で１昼夜の間静置させ、第１のリガンドと第
１の部位の結合反応を行う。反応後デカンテーションに
より検体を除去し、各ウェルに０．０１％ポリオキシエ
チレンソルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩
水（ｐＨ７．４）を２００μｌずつ分注し、直ちに除去
する。この洗浄操作を数回行う。第２のリガンドであ
る、ペルオキシダーゼ標識した抗体を０．０１％ポリオ
キシエチレンソルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、洗浄液を除去したマ
イクロプレートの各ウェルに標識リガンド希釈液を１０
０μｌ分注する。２５℃で２時間静置させ、上記の洗浄
操作を数回行う。洗浄液を除去したマイクロプレートに
１％２−メルカプトエタノール含有リン酸緩衝生理食塩
水（ｐＨ７．４）を添加し、室温で５分程静置させ、ジ
スルフィド結合の開裂を行う。１，２−ベンゼンジアミ
ンを２ｍｇ／ｍｌの濃度のなるように、１００ｍＭクエ
ン酸、２００ｍＭリン酸バッファーと０．１２％過酸化
水素水を等量混合したバッファー（ｐＨ５．０）に溶解
する。マイクロプレートの各ウェルに分注してあるジス
ルフィド結合の開裂を行った溶液を蒸留水で２０倍希釈
した希釈液５０μｌと上記１，２−ベンゼンジアミン溶
解液を５０μｌ混合する。室温で６０分間反応させた
後、１規定の塩酸を各反応液に１００μｌずつ添加し、
反応を停止させる。各反応液の発色度はマイクロプレー
トリーダー用いて、検出波長４９２ｎｍで測定する。既
知量の該変換物質を用いて作成した検量線と既知量の該
前駆型ペプチドを用いて得られたバックグランドから、
この被疑混入物中の該変換物質濃度を算出する。

【００３１】

【実施例】以下に実施例を上げて、本発明を更に説明す
るが、これらの実施例により、本発明は何ら限定される
ものではない。

【００３２】

【実施例１】 １本鎖ｔＰＡの測定 １．酵素免疫測定用マイクロプレートの作成 ｔＰＡの測定に用いた酵素免疫測定用マイクロプレート
の作成法は次の通りである。第１のリガンド（第１の抗
体）として、抗ｔＰＡモノクローナル抗体（１ＶＰＡ、
テクノクローン社、オーストリア）を用いた。この抗体
を１０μｇ／ｍｌになるよう５０ｍＭ炭酸バッファー
（ｐＨ９．８）で調整した。このモノクローナル抗体は
１本鎖ｔＰＡが２本鎖化し、２本鎖ｔＰＡに変換した時
の２つのポリペプチド鎖の内、セリンプロテアーゼ活性
を持つポリペプチド鎖に対する抗体である。この第１の
抗体溶液を酵素免疫測定用マイクロプレート（ヌンク
社、デンマーク）に、１ウェルに１２５μｌずつ分注
し、４℃で１昼夜静置する。その後第１の抗体溶液を廃
棄し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（日水製薬
社、日本）を１ウェルに２５０μｌずつ分注し、すぐに
廃棄した。この洗浄操作を４回繰り返した後、各ウェル
に２５０μｌずつリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）
が分注されている状態で、マイクロプレート用シール
（住友ベークライト社、日本）で酵素免疫測定用マイク
ロプレートにふたをし、使用時まで４℃に冷蔵保存し
た。 ２．組織プラスミノーゲンアクチベータの測定 測定サンプルとして１本鎖ｔＰＡ（アメリカンダイアゴ
ノスチック社、アメリカ）、１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰ
Ａ（アメリカンダイアゴノスチック社、アメリカ）の混
合物、２本鎖ｔＰＡを測定した。１本鎖ｔＰＡを１μｇ
／ｍｌになるように、また１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡ
を同濃度ずつ含有する混合物を、各々の濃度が１μｇ／
ｍｌになるように、２本鎖ｔＰＡを１μｇ／ｍｌになる
ように、１％２−メルカプトエタノール（ナカライテス
ク社、日本）、０．０１％ポリオキシエチレンソルビタ
ンモノオレート（和光純薬社、日本）含有リン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈した。各検体を室温で５
分間静置させた後、２−メルカプトエタノール、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生
理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、１本鎖ｔＰＡを最終
濃度が１０、７、５、３、０ｎｇ／ｍｌになるように、
１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡの混合物を、各々の最終濃
度が１０、７、５、３、０ｎｇ／ｍｌになるように、２
本鎖ｔＰＡを１０、７、５、３、０ｎｇ／ｍｌになるよ
うに、２−メルカプトエタノールの濃度が０.０５％、
ポリオキシエチレンソルビタンモノオレートの濃度が
０．０１％になるように調整した。酵素免疫測定用マイ
クロプレートのウェルに上記のサンプルを１００μｌ添
加した。１つのサンプルに対して４つのウェルにサンプ
ルを添加した。その後２０℃で２時間静置し、サンプル
を廃棄後、各ウェルに２５０μｌの０．０１％ポリオキ
シエチレンソルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理
食塩水（ｐＨ７．４）を分注し、直ちに廃棄した。この
洗浄操作を５回繰り返し、第２のリガンド（第２の抗
体）としてペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体
（３ＶＰＡ、テクノクローン社、オーストリア）を各ウ
ェルに１００μｌずつ分注した。この第２のリガンド、
すなわち第２の抗体は０．０１％ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４）で抗体濃度が１μｇ／ｍｌになるように使用時
に調整した。この第２の抗体は１本鎖ｔＰＡが２本鎖化
し、２本鎖ｔＰＡに変換した時の２つのポリペプチド鎖
の内、クリングル構造を持つポリペプチド鎖に対するモ
ノクローナル抗体である。２０℃で２時間静置後、洗浄
操作を５回繰り返す。各ウェルに１ｍｇ／ｍｌ１，２−
ベンゼンジアミン（シグマ社、アメリカ）を１００μｌ
ずつ分注した。１，２−ベンゼンジアミンは５０ｍＭク
エン酸、１００ｍＭリン酸バッファーと０．０６％過酸
化水素水を等量混合したバッファー（ｐＨ５．０）に使
用時に溶解して調整した。室温で１０分間反応させた
後、１規定の塩酸（和光純薬社、日本）を各ウェルに１
００μｌずつ分注し、反応を停止した。各ウェルの発色
度はマイクロプレートリーダー（マルチスキャンバイク
ロマティック、ラボシステム社、フィンランド）を用い
て、検出波長４９２ｎｍで測定した。

【００３３】結果は表１に示す。１本鎖ｔＰＡを測定対
象とした場合、１本鎖ｔＰＡのみの検体では、その量に
対応して検量線が示され、１本鎖ｔＰＡと２本鎖ｔＰＡ
の半々の混合物でも１本鎖ｔＰＡの量の従って検量線が
示された。しかし２本鎖ｔＰＡの検体では、２本鎖ｔＰ
Ａの量に依存しては標識物の量は増えなかった。従っ
て、２本鎖ｔＰＡの混入条件においても、２本鎖ｔＰＡ
の存在に影響されず、１ｎｇ／ｍｌ以上の１本鎖ｔＰＡ
が測定できることが確認された。

【００３４】

【実施例２】 プロウロキナーゼの測定 １．酵素免疫測定用マイクロプレートの作成 プロウロキナーゼの測定の用いた酵素免疫測定用マイク
ロプレートの作成法は次の通りである。第１のリガンド
（第１の抗体）として、抗プロウロキナーゼモノクロー
ナル抗体（ＭＵＫ１、バイオプール社、スエーデン）を
用いた。この抗体を１０μｇ／ｍｌになるよう５０ｍＭ
炭酸バッファー（ｐＨ９．８）で調整した。このモノク
ローナル抗体はプロウロキナーゼが２本鎖化し、活性型
酵素ウロキナーゼに変換した時の２つのポリペプチド鎖
の内のＡ鎖に対する抗体である。この第１の抗体溶液を
酵素免疫測定用マイクロプレート（ヌンク社、デンマー
ク）に、１ウェルに１２５μｌずつ分注し、４℃で１昼
夜静置する。その後第１の抗体溶液を除去し、リン酸緩
衝生理食塩水（ｐＨ７．４）（日水製薬社、日本）を１
ウェルに２５０μｌずつ分注し、すぐに除去した。この
洗浄操作を４回繰り返した後、各ウェルに２５０μｌず
つリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）が分注されてい
る状態で、マイクロプレート用シール（住友ベークライ
ト社、日本）で酵素免疫測定用マイクロプレートにふた
をし、使用時まで４℃に冷蔵保存した。 ２．ビオチン化した第２のリガンド（第２の抗体）の作
成 １ｍｇ／ｍｌの抗プロウロキナーゼモノクローナル抗体
（ＭＵＫ４、バイオプール社、スエーデン）２５０μｌ
とエヌエッチティー−ビオチンエステル（ピアス社、ア
メリカ）２５μｌを混入し、室温で３０分静置した。こ
の第２の抗体はプロウロキナーゼが２本鎖化し、ウロキ
ナーゼに変換した時の２つのポリペプチド鎖の内のＢ鎖
に対する抗体であり、エヌエッチティー‐ビオチンエス
テルは１ｍｇを７５μｌのジメチルスルホオキシドに溶
解させた溶液である。その後蛋白質濃縮器のモルカット
（分画分子量１万、日本ミリポア社、日本）で約１００
μｌになるまで濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４）で約１ｍｌまで希釈した。このダイアフィルト
レーション操作を３回繰り返し、最終２５０μｌの溶液
に調整し、使用時まで４℃に冷蔵保存した。 ３．プロウロキナーゼの測定 測定サンプルとしてプロウロキナーゼ（トロンボリーゼ
注１５００、ミドリ十字社、日本）と対照サンプルとし
てウロキナーゼ（ウロキナーゼ２４万、ミドリ十字社、
日本）を測定した。測定サンプルを最終１μｇ／ｍｌに
なるように、１％２−メルカプトエタノール（ナカライ
テスク社、日本）、０．０１％ポリオキシエチレンソル
ビタンモノオレート（和光純薬社、日本）含有リン酸緩
衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈した。プロウロキナ
ーゼの重量はプロウロキナーゼの比活性を４５０Ｕ／ｍ
ｇとし活性量から算定した。ウロキナーゼの重量もその
比活性を１６万Ｕ／ｍｇとして活性より算定した。室温
で５分間静置させた後、２−メルカプトエタノール、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート含有リン酸緩
衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で希釈し、プロウロキナー
ゼの最終濃度が５０、３０、１０、５、０ｎｇ／ｍｌ、
２−メルカプトエタノールの濃度が０．０５％、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノオレートの濃度が０．０１
％になるよう調整した。酵素免疫測定用マイクロプレー
トのウェルに上記のサンプルを１００μｌ添加した。一
つのサンプルに対して４つのウェルにサンプルを添加し
た。その後２０℃で２時間静置し、サンプルを除去後、
各ウェルに２５０ｌの０．０１％ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４）を分注し、直ちに除去した。この洗浄操作を５
回繰り返し、ビオチン化第２の抗体を各ウェルに１００
μｌずつ分注した。ビオチン化第２抗体は前記で取得保
存していたビオチン化した第２の抗体をを０．０１％ポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレート含有リン酸緩
衝生理食塩水（ｐＨ７．４）で５００倍に希釈して使用
した。２０℃で２時間静置後、洗浄操作を５回繰り返
す。各ウェルに５μｇ／ｍｌのアビジン化ペルオキシダ
ーゼ（ベクター社、アメリカ）を１００μｌ分注した。
アビジン化ペルオキシダーゼは５ｍｇ／ｍｌの濃度で４
℃に保存し、使用時に０．０１％ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレート含有リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４）で調整した。２０℃で２時間静置後、洗浄操作
を５回繰り返す。各ウェルに１ｍｇ／ｍｌ１，２−ベン
ゼンジアミン（シグマ社、アメリカ）を１００μｌずつ
分注した。１，２−ベンゼンジアミンは５０ｍＭクエン
酸、１００ｍＭリン酸バッファーと０．０６％過酸化水
素水を等量混合したバッファー（ｐＨ５．０）に使用時
に溶解して調整した。室温で１０分間反応させた後、１
規定の塩酸（和光純薬社、日本）を各ウェルに１００μ
ｌずつ分注し、反応を停止した。各ウェルの発色度はマ
イクロプレートリーダー（マルチスキャンバイクロマテ
ィック、ラボシステム社、フィンランド）を用いて、検
出波長４９２ｎｍで測定した。

【００３５】結果は表２に示す。プロウロキナーゼのみ
の検体においては、測定値に濃度依存性があり測定でき
るが、ウロキナーゼのみの検体においては、測定値の濃
度依存性がなく、測定値に影響を与えないことが示され
た。従って、この方法により、ウロキナーゼの混入条件
においても、ウロキナーゼを検出せず、プロウロキナー
ゼを特異的に測定できることが確認された。

【００３６】

【実施例３】 生体由来検体中のプロウロキナーゼ濃度の測定例 表３に記載の濃度のプロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、
プラスミン、アプロチニン、トロンビンおよび可溶化フ
ィブリンを混在して、モデル生体由来検体を作成し、こ
の検体を用い、実施例２の方法により検体中のプロウロ
キナーゼの濃度を測定した。この結果はウロキナーゼや
その他の混入物が存在する検体においても、プロウロキ
ナーゼを特異的に測定できることが示された。

【００３７】

【発明の効果】生理学的に意義のあるペプチド、例えば
酵素の多くは、最初１本鎖の蛋白質である活性が微弱か
活性のないプロ型（前駆型）酵素として生体内に存在
し、そのペプチド結合が１箇所開裂し、２本鎖化するこ
とで活性型酵素と変換する。これらのペプチドは互いに
極めて構造的に近似しているが、生体由来検体や医薬品
の製造工程由来検体中にこれらプロ型酵素と活性型酵素
は混在することが多い。

【００３８】本発明によれば、生理学的意義の全く違う
前駆型ペプチドと変換物質との混入物において、一方を
特異的に測定することが可能であって、診断学、臨床医
学、生理学や医薬品の製造開発分野に大きく貢献でき
る。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】

【００４１】

【表３】

【００４２】

【表４】

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ペプチド結合とジスルフィド結合を有す
   る前駆型ペプチドと、特定の切断反応による該前駆型ペ
   プチド特定のペプチド結合部位の切断により少なくとも
   第１の部位と第２の部位に分けられるが、ジスルフィド
   結合により１つの物質を構成するその前駆型ペプチドか
   らの変換物質との混入が疑われる検体中での、該前駆型
   ペプチドまたは該変換物質の測定法であって、前駆型ペ
   プチドと変換物質との被疑混入物を還元条件下にて、そ
   のジスルフィド結合の開裂を行う工程と、前記第１の部
   位に対して特異的に結合する第１のリガンドの固相化物
   と、第２の部位に対して特異的に結合する第２のリガン
   ドとを用いて、該前駆型ペプチドと該変換物質を区別す
   る工程を含むことにより、第１のリガンドと第２のリガ
   ンドの両方に結合する物質または第１のリガンドには結
   合せず第２のリガンドには結合する物質のいずれかの量
   を測定することを特徴とする該前駆型ペプチドまたは該
   変換物質の測定法。
2. 【請求項２】 前駆型ペプチドと変換物質との被疑混入
   物を還元条件下にて、そのジスルフィド結合の開裂を行
   う工程の後、第１のリガンドの固相化物と第２のリガン
   ドを用いることを特徴とする請求項１に記載の測定法。
3. 【請求項３】 第１および第２のリガンドが抗体である
   請求項１または２に記載の測定法。
4. 【請求項４】 還元条件が、２−メルカプトエタノー
   ル、１，４−ジチオスレイオールまたはトリ−ｎ−ブチ
   ルホスフィンからなる群より選ばれた１つ以上の還元剤
   を用いるものである請求項１〜３のいずれかに記載の測
   定法。
5. 【請求項５】 還元剤が０．０１％〜１０％の濃度であ
   る請求項４に記載の測定法。
6. 【請求項６】 前駆型ペプチドが、１本鎖組織プラスミ
   ノーゲンアクチベータ、プロウロキナーゼまたはプラス
   ノーゲンである請求項１〜５のいずれかに記載の測定法
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の測定方
   法のための測定用キット。