SU1606940A1 - Способ количественного определени каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к аналитической химии ферментов и представл ет собой способ количественного определени  каталитически активных молекул сериновых протеиназ бацилл. Цель изобретени  - повышение чувствительности и специфичности анализа. Анализируемый фермент взаимодействует с иммобилизованным на твердой фазе овомукоидом из белка утиных  иц или белковым ингибитором сериновых протеиназ из сем н кукурузы. Полученный комплекс обрабатывают антителами к этому ферменту,меченными другим ферментом с более высокой активностью. Детекцию осуществл ют по активности св завшейс  метки. 2 ил.

Description

Изобретение относитс  к аналитической химии ферментов, а именно к способам количественного определени  каталитически активных молекул ферментов в биологических и биотехноло- гичаских препаратах.

Цель изобретени  - повышение чувствительности и специфичности анализа .

Способ осуществл ют следующим образом ..

Пример 1. В лунки стандарт- ньк полистиролрвых микропланшетов дл  иммуноферментного анализа внос т

по 100 мкл 0,1 И калий-фосфатного буфера , рН 6,3, содержащего овомукоид из белка  иц утки в концентрации 0,1 мкг/мл. Планшет инкубируют при в течение 2 ч, затем удал ют из лунок раствор отсасыванием и внос т 100 мкл 1%г-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в том же буфере . После 30 мин инкубации при 37 С лунки 4-кратно промывают 0,05 К калий-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,1 У Nad и 0,05% твина-20 (буфер X), и внос т анализируемую пробу, содержащую сериновую протеинаS5

о а ;о

4

зу бацилл, разбавленную буфером X не енее, чем в 2 раза. Планшет инкубиуют 20 мин при 37°С, 4-кратно проывают буфером X и внос т по 100 мкл раствора конъюгата-поликлональньк кроличьих антител против сериновой протеиназы с пероксидазой в концентрации 1,2 мкг/мл по пероксидазе (Конъ- югат синтезирован из IgG, вьщеленных из сывороток с титром в ИФА 1:100000, и пероксидазы хрена с RZ- 3,0 перио- антным методом). Длительность инку- бации - 60 мин. Далее после четырех отмывок буфером X и одной - дистиллиованной водой в лунки внос т раствор 5-амин о салициловой кислоты (5,0 мМ) + НгОг (1,8 мМ), рН 6,0, и после 10 мин инкубации при комнатной ратуре определ ют оптическую плотность при 490 нм.

На фиг. 1 изображен типичный кали- бровочный график анализа. Чувствительность анализа - до 10 иг/мл. Средн   ошибка в серии измерений - 4,6%.

П. р и м е р 2. Анализ провод т в соответствии с примером 1, но ад -- сорбцию ингибитора провод т при +4 в течение 16 ч. При этом чувствительность и точность определени  не отичаютс  от примера 1.

Пример 3. В лунки полистироловых микропланшетов внос т по 100 мкл 0,1 К калий-фосфатного бз/ фе- ра, рИ 7,0, содержащего ингибитор се- риновых протеиназ из сем н кукурузы, в концентрации 0,8 мкг/мл. Планшет инкубируют при в течение 16 ч. затем удал ют из лунок раствор отсасыванием и внос т 100 мкл 1%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в том же буфере. После 30 мин инкубации при лунки 4-кратно промывают буфером X (как в примере 1) и внос т анализируемую пробу, содержащую сериновую протеиназу бацилл, раз- равленную буфером X не менее чем в 2 раза. Кикропланшет инкубируют 10 мин при и провод т дальнейший анализ по методике, приведенной в примере 1, вплоть до отмывки от иш(унопе роксидазного конъюгата. После отмывки в лунки внос т по 100 мкл 3,7 мМ раствора орто-фенилендиамина в 30 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, с 1,8 мМ HjOj. Микропланшет вьщерживают 10 мин в темноте при комнатной температуре , а затем останавливают реак

5

0

5

0

5

0

5

0

5

цию, добавл ют по 50 мкл 0,5 К HjSO. Оптическую плотность измер ют при 490 нм.

На фиг. 2 изображен калибровочньй график анализа. Чувствительность анализа - 1 нг/мл. Средн   ошибка определени  - 3,4%.

Пример 4. В лунках микро- планшетов провод т иммобилизацию мукоида из белка  иц утки и обработку .бычьим сывороточным альбумином в соот- ветствии с примером 1. После отмывки от альбумина буфером X микропланшет промьшают дистиллированной водой, высушивают и хран т при до 3 мес.

Далее анализ провод т в соответствии с примером 1, но концентраци  г конъюгата составл ет 2,0 мкг/мл (по содержанию пероксидазы).

Чувствительность определени  - 10 нг/мл, средн   ошибка - 8-10%, рабочий диапазон калибровочного графика достоверно не отличаетс  от примера 1.

Предлагаемьй способ по сравнению с известным позвол ет увеличить чувст-- вительность определени  ферментов более чем в 100 ра, сократить врем  анализа более чем в 4 раза, а также существенно повысить специфичность анализа и упростить способ его проведени , дл  которого может использоватьс  стандартное оборудование дл  иммуноферментного анализа, имеющеес  во многих исследовательских и клинических лаборатори х.

Формул а- изобретени 

Способ количественного определени  каталитически активных молекул сери- новых протеиназ -бацилл, предусматривающий проведение реакции анализируемого фермента с иммобилизованным на твердой фазе реагентом, специфически св зывающимс  с активньпу центром фермента , и детекцию образовавшегос  комплекса путем взаимодействи  со специфическими антителами, меченными другим ферментом, с последующим определением активности св завшейс  метки, отличающийс  тем, что,.с целью Повьш1ени  чувствительности и специфичности анализа, в качестве реагента , специфически св зывающегос  с активным центром фермента, исполь« - зуют овомукоид из белка утиных  иц или белковый ингибитор сериновых про- . теиназ из сем н кукурузы.

ОЛ

0.5

01

W

г.

Ю С.пкг

ОЛ

1.0

0

0.

Claims (1)

1. Формула· изобретения

   Способ количественного определения каталитически активных молекул сериновых протеиназ -бацилл, предусматривающий проведение реакции анализируемого фермента с иммобилизованным на твердой фазе реагентом, специфически связывающимся с активным центром фермента, и детекцию образовавшегося комплекса путем взаимодействия со специфическими антителами, меченными другим ферментом, с последующим определением активности связавшейся метки, отличающийся тем, что,.с целью повышения чувствительности и специфичности анализа, в качестве реагента, специфически связывающегося с активным центром фермента, исполь*=зуют овомукоид из белка утиных яиц или белковый ингибитор сериновых про- . теиназ из семян кукурузы.