JPH0856665A - タンパク質分解酵素用の基質としての修飾された酵素前駆体 - Google Patents

タンパク質分解酵素用の基質としての修飾された酵素前駆体

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JPH0856665A
JPH0856665A JP7204981A JP20498195A JPH0856665A JP H0856665 A JPH0856665 A JP H0856665A JP 7204981 A JP7204981 A JP 7204981A JP 20498195 A JP20498195 A JP 20498195A JP H0856665 A JPH0856665 A JP H0856665A
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Johan Hendrikus Verheijen
ヘンドリクス ヘルヘイエン ヨハン
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明により解決される課題は、検出を自動
化するのがはるかに容易で簡単である日常的な適用に用
いうるアッセイ、およびそのためのタンパク質分解酵素
用の基質としての修飾された酵素前駆体を提供すること
である。 【解決手段】 プロテアーゼの基質とともにサンプルを
インキュベートし、前記基質のタンパク質分解による切
断を観察することによる、サンプル中のプロテアーゼの
検出または測定。この基質は、前記プロテアーゼにより
切断可能な認識部位、たとえば活性化部位を含む修飾さ
れた酵素前駆体である。修飾された酵素前駆体のタンパ
ク質分解による切断は、活性化された酵素前駆体の適当
な基質を用いて、生じる活性を観察することにより検出
される。プロテアーゼは、たとえばアスパラギン酸プロ
テアーゼまたはメタロプロテアーゼ、および修飾された
酵素前駆体は、たとえば測定されるプロテアーゼにより
切断可能な変異活性化部位をもつプロウロキナーゼであ
ってよい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル中のタン
パク質分解酵素の有無の判定または定量の分野に属し、
そのためのアッセイ方法ならびにアッセイキットおよび
デバイスのいずれにも関する。
【０００２】タンパク質分解酵素は、タンパク質または
ペプチド中のペプチド結合の加水分解を触媒する。これ
らの酵素は、自然界において微生物からヒトまでの広き
にわたって生じ、多くの異なる機能を有する。それら
は、生物体（消化管酵素、たとえばペプシン、（キモ）
トリプシン）および個々の細胞（リソソーム酵素、たと
えばカテプシン）の両方のレベルの消化過程に関与して
いる。それらは微生物および多細胞生物における細胞双
方の侵襲的行動（ｉｎｖａｓｉｖｅ ｂｅｈａｖｉｏｕ
ｒ）において役割をはたし、後者では成長および発生
（たとえばプラスミノーゲン活性化因子、コラゲナー
ゼ）に関与している。これらの明らかな過程のほかに
も、タンパク質分解酵素は、血液凝固および繊維素溶
解、血圧調節ならびに成長因子およびホルモン前駆体の
活性化のような調節的ネットワーク（ｒｅｇｕｌａｔｏ
ｒｙ ｎｅｔｗｏｒｋｓ）においても、重大な役割をは
たしている。
【０００３】これらの（病態）生理学的機能とは別にタ
ンパク質分解酵素は、医薬品合成から食品（たとえばチ
ーズ）の生産にいたる範囲のバイオテクノロジーにおい
て、および一般的用途の洗剤中に非常に大規模に、ます
ます用いられるようになっている。
【０００４】すべてのタンパク質分解酵素は同じ基本的
な反応を触媒する：
【０００５】
【化１】 すなわち、アミド結合は、典型的にはｐＨ５〜８および
温度２５〜３７℃の、穏やかな条件のもとで加水分解さ
れる。酵素がなければ、たとえば６Ｍの塩酸中で煮沸す
るような、はるかにきびしい条件が必要とされる。ペプ
チド結合の酵素的切断と非酵素的な切断の異なる点は、
反応条件の問題だけではなく、酵素的な過程ははるかに
速く、非常に選択的でありうる。混合物中、ただ１つの
特定のタンパク質だけが加水分解され、さらにときには
そのような１つのタンパク質中のただ１つの特定のペプ
チド結合のみが攻撃される例がいくつも知られている。
ペプチド結合の酵素的加水分解についての一般的な考え
方は、酵素は典型的には２ないし３アミノ酸残基を含ん
でおり反応に直接関与する活性部位、およびしばしば加
水分解反応には関係しないが酵素に特異性を与える基質
認識部位を含んでいるというものである。
【０００６】現在まで、４つの異なる種類のタンパク質
分解酵素が知られており、それらは反応のメカニズムお
よび触媒作用に関係するアミノ酸残基が異なる（表
１）。
【０００７】
【表１】 それぞれの種類の中で、基質特異性と特徴の異なる酵素
が生じている。多くのタンパク質分解酵素は、不活性な
酵素前駆体（ｐｒｏｅｎｚｙｍｅ）の形態で生じうる。
多くのばあい、酵素前駆体の活性化はそれ自身タンパク
質分解過程である。この方法により正または負のフィー
ドバック制御が生じうる。このような制御は、血液凝固
のようなタンパク質分解によるカスケードの制御に不可
欠である。
【０００８】多くの（病態）生理学的過程に関与してい
るため、タンパク質分解酵素は、多くの病気において役
割をはたしており、特定の酵素の活性を計測することは
診断のために重要でありうる（表２）。
【０００９】
【表２】 臨床上重要なタンパク質分解酵素の活性計測は、一般的
に用いられている。とくに血液凝固および繊維素溶解の
カスケードに関与する多くの重要な酵素ためのアッセイ
が開発されている。
【００１０】天然の基質を用いた酵素活性の計測は、つ
ねに可能なわけではなく、または日常的な利用に向かな
い綿密で複雑なアッセイを余儀なくされることもある。
ペプチド合成の発展により、タンパク質分解酵素用の基
質として合成ペプチドが用いられるようになった。とく
に多くのセリンプロテアーゼ用に、発色性（ｃｈｒｏｍ
ｏｇｅｎｉｃ）または蛍光性のペプチド基質が考えださ
れ、それらはしばしば市販されている。セリンプロテア
ーゼ用のそのような基質の開発は、比較的容易である。
なぜなら、これらの酵素が加水分解された結合に対し
て、Ｃ末端側
【００１１】
【外１】 の配列を認識しないからである（図１）。この部分は、
ｐ−ニトロアニリンまたはβ−ナフチルアミンのような
発色性または蛍光性の脱離基（ｌｅａｖｉｎｇｇｒｏｕ
ｐ）によって、置き換えうる。多くの市販の基質および
アッセイキットはこの原理にもとづいており、これらの
方法にもとづくアッセイはたやすく自動化されうる。多
くのばあい、これらのペプチド基質によりうることがで
きる特異性と感度は、生物学的液体または組織抽出物中
の生理学的濃度の酵素を検出し、定量するのに充分なほ
ど高い。プラスミノーゲン活性化因子について記載され
ている（ドレイパー（Ｄｒａｐｉｅｒ）ら、（１９７
９） バイオキミ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ）、６１巻、４
６３〜４７１頁）ように、２つの連結した反応を用いる
ことにより、ときには感度をさらに増大させることがで
きる。
【００１２】メタロプロテアーゼおよびアスパラギン酸
プロテアーゼの計測は、これらの酵素のいくつかの特別
な特徴のためにより困難である。一般的にこれらの酵素
は、セリンプロテアーゼとは異なり、切り離される結合
の両側
【００１３】
【外２】 のアミノ酸配列を認識する（図１）。このように、セリ
ンプロテアーゼの測定に用いる発色性または蛍光性の基
質のような非ペプチド結合が切り離される基質は、メタ
ロプロテアーゼまたはアスパラギン酸プロテアーゼの測
定には用いることができない。これらの酵素のため、現
在２つの異なる合成基質のタイプが存在する。（１）プ
ロテアーゼに必要な認識配列のみを含むペプチド。この
ばあいは、加水分解反応は、ＨＰＬＣのような物理化学
的な手段により追跡される。（２）認識配列のほかに消
光基（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）と潜在的な蛍
光基も含むペプチド。両方の基がきわめて近接している
とき、蛍光は消光されている。蛍光は、ペプチドが加水
分解され、その後消光が失われたのちにのみ、観察され
る。最初のグループに属する基質は、多くの興味深い酵
素に用いるため、記述されている。それらにもとづくア
ッセイは一般的に綿密で、実行することおよび自動化す
ることが困難であり、したがって日常的（臨床的）な適
用はなされていない。第２番目の内部で蛍光が消光され
ているタイプの基質は第一番目のタイプのものよりも魅
力的である。なぜなら自動化されるのにより簡単で検出
がより容易だからである。しかしながら、日常的な目的
に用いるためには、蛍光変化にかえて色変化を使った検
出が非常に望ましいであろう。というのは現在のラボラ
トリオートメーション装置のほとんどがそのような技術
にもとづいているからである。本発明においては、臨床
的または生化学的な実験室に一般的に存在する装置を使
い、２つのアミノ酸残基の間の結合のみを認識および加
水分解するタンパク質分解酵素を測定するための原理が
記述されている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、サンプルをプ
ロテアーゼの基質とインキュベートすることおよび該基
質のタンパク質分解による切断を測定することを含んで
なり、該基質が前記プロテアーゼにより切断可能な認識
部位を含む修飾された酵素前駆体である、サンプル中の
プロテアーゼ、またはその前駆体を活性化したのちに測
定する方法を提供する。前記認識部位は活性化部位（ａ
ｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）、すなわちその切断に
よって活性酵素が生じる部位であってもよい。あるい
は、前記認識部位が、その切断によって酵素前駆体を、
その酵素前駆体を活性化できるほかの酵素用の基質に変
える部位であってもよい。前記修飾された酵素前駆体の
タンパク質分解による切断は、活性化された酵素前駆体
の適当な基質を用いて、生じた活性を観察または計測す
ることにより測定しうる。サンプルは、生物学的液体、
生物学的液体の画分、生物学的組織、生物学的組織の抽
出物、生物学的組織の抽出物の画分のような、通常の生
物学的サンプルである。修飾された酵素前駆体は、測定
すべきプロテアーゼにより切断可能な認識部位を酵素前
駆体に付与することにより、酵素前駆体から誘導されう
る。とくに、前記修飾された酵素前駆体はその活性化部
位を測定すべきプロテアーゼにより切断可能な活性化部
位に置き換えることにより、酵素前駆体から誘導されう
る。
【００１５】本発明はまた、修飾された酵素前駆体それ
自体、さらに詳しくは修飾されていない酵素前駆体を活
性化するプロテアーゼとは異なるプロテアーゼにより切
断可能な活性化部位に、その酵素前駆体の活性化部位が
置き換えられることにより酵素前駆体から誘導される、
修飾された酵素前駆体を提供する。
【００１６】本発明はまたさらに、ここで定義した修飾
された酵素前駆体ならびに活性化された酵素前駆体用の
基質、第二の酵素、緩衝液、標準調製品、特異的な抗
体、マイクロタイタープレートおよび使用説明書よりな
る群の中の少なくとも１つの要素（ｍｅｍｂｅｒ）を含
んでなる、サンプル中のプロテアーゼまたはその前駆体
を活性化ののちに測定するためのキットも提供し、なら
びにここに定義した修飾された酵素前駆体を含んでな
る、サンプル中のプロテアーゼまたはその前駆体を活性
化ののちに測定するためのデバイスを提供する。
【００１７】
【発明の実施の形態】本発明は、バイオテクノロジー的
または（病態）生理学的に興味深い過程に関与する触媒
的に活性なプロテアーゼの測定に用いうる。
【００１８】「プロテアーゼの測定」という言葉は、定
性的分析、すなわちプロテアーゼの存在の検出、存在の
有無の判定、および定量的分析、すなわちプロテアーゼ
の定量、サンプル中に存在するプロテアーゼ活性の測定
の両方を意味する。
【００１９】このようなプロテアーゼまたはタンパク質
分解酵素の例を表２に示す。従来の方法とは対象的に、
本発明はセリンプロテアーゼ類もしくはシステインプロ
テアーゼ類の酵素または測定するのがはるかに困難なア
スパラギン酸プロテアーゼ類もしくはメタロプロテアー
ゼ類の酵素を等しくアッセイする能力のある方法を開示
する。多くのばあい、プロテアーゼは生物学的液体中
に、触媒的に活性型ではなく活性のないチモーゲン型と
して生じる。そのようなばあい、計測の前に、活性型へ
の変換が必要である。チモーゲンにより、活性なプロテ
アーゼへの変換は、限定的なタンパク質分解による消
化、特定の化学物質による処理または熱もしくはドデシ
ル硫酸ナトリウムの適用による穏やかな変性によってな
しとげられうる。本発明にもとづく方法は、非常に感度
が良くかつ特異的であり、一般的に利用可能な実験装置
を用いた自動化に容易に適用しうる。本発明は、バイオ
テクノロジー、動物またはヒトの健康のための研究施設
ならびに病院および臨床試験施設においてもっとも適用
可能であると思われる。他の適用としては、製薬または
食品産業における品質管理であろう。
【００２０】本発明は、１つまたはそれより多くの特異
的なタンパク質分解により活性酵素に変換されうる酵素
前駆体を用いる。そののち、活性酵素の活性は、既存の
方法により検出される（図２）。このような酵素前駆体
は天然に存在する：プロウロキナーゼタイプのプラスミ
ノーゲン活性化因子、プラスミノーゲンおよび多くの凝
血因子は、実際そのような酵素前駆体である。これらの
天然の酵素前駆体の活性化は、一般的に特定の酵素前駆
体の活性化に生理学的にも関係する、１つまたはごく少
数の特異的酵素の作用によってのみ、一般的に可能であ
る。個々の酵素前駆体およびそれらの活性化配列の例を
表３に示す。
【００２１】
【表３】 本アッセイに用いる酵素前駆体／酵素は、それ自身タン
パク質分解酵素であってもよいが、酵素前駆体の活性酵
素への変換がタンパク質分解による過程である限り、こ
れらは必須ではない。脂質分解に関与するエステラーゼ
であるホスホリパーゼＡ２はプロテアーゼにより活性化
される非プロテアーゼの代表的な例である。酵素前駆体
のタンパク質分解による活性化の原理にもとづくアッセ
イは知られている。代表的な例は、このばあい天然の基
質でもある酵素前駆体プラスミノーゲンの活性化と、つ
づいて確立された手順によって生じた活性プラスミンを
計測することによる組織タイプのプラスミノーゲン活性
化因子の測定である（ベレイジェン（Ｖｅｒｈｅｉｊｅ
ｎ）ら、（１９８２）トロンボ・ヘモスタス（Ｔｈｒｏ
ｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ）、４８巻、２６６〜２６９
頁）。活性化反応の極度の特異性基準および適当な天然
の酵素前駆体の入手が限られていることにより、この原
理の適用は一般的に限られている。
【００２２】本発明は、酵素前駆体の活性化に生理学的
に関与するものとは異なるプロテアーゼにより活性化さ
れうる、したがって酵素前駆体のタンパク質分解による
活性化によってプロテアーゼを計測するという原理をよ
り多くのプロテアーゼまで拡大する、修飾された、天然
に生じない酵素前駆体を開示する。酵素前駆体の活性酵
素への活性化には、しばしば酵素前駆体のペプチド配列
中の特定部位での特異的で限定されたタンパク質分解が
関与している。非常に多くのばあい切断部位（ｃｕｔ−
ｓｉｔｅ）の周囲の実際のアミノ酸配列が、活性化反応
の特異性の原因である。活性化後に形成される２つのポ
リペプチド鎖は、いくつかのばあいジスルフィド架橋
（ｂｒｉｄｇｅ）により接続されたままである（図３に
示すように）が、これは必ずしも問題ではなく、非共有
結合的相互作用および活性化ペプチドの完全な喪失も起
こる。
【００２３】本発明は活性化切断部位の周囲に修飾され
たアミノ酸配列をもつ酵素前駆体を開示する。その修飾
は、特異的プロテアーゼまたは特定の基質特異性をもつ
プロテアーゼの群が新しい配列を切断することができ、
それにより、確立された方法を用いて検出することので
きる活性酵素を生み出すように選ばれうる。修飾された
酵素前駆体は、非修飾の型では測定すべきプロテアーゼ
の基質ではない酵素前駆体から誘導される。酵素前駆体
の修飾により、酵素前駆体は測定すべきプロテアーゼの
基質に変えられる。通常、修飾は酵素前駆体とその活性
化に生理学的に関与する（複数の）プロテアーゼの間の
相互作用に影響を与える。好ましくは、修飾は、非修飾
の酵素前駆体の活性化に生理学的に関与する（複数の）
プロテアーゼにより、修飾された酵素前駆体が活性化さ
れえないような修飾である。
【００２４】活性化部位の周囲の修飾とは別に、ほかの
第二の修飾が存在していてもよい。このような第二の修
飾は、特定の適用のため酵素前駆体の特性を向上させる
ことを意図するものでありうる。有用な第二の修飾に
は、酵素前駆体の（温度）安定性を向上するため、アッ
セイの対象である目的のプロテアーゼ以外のプロテアー
ゼに対する耐性を与えるため、（天然に）生じる阻害剤
に対する耐性を与えるため、特定の抗体またはリガンド
との反応性を与えるため、発現または精製を助けるため
などの修飾が含まれる。ほとんどのばあい、これらの第
２の修飾は酵素前駆体のほかの部分であって活性化切断
部位の近くではないところに存在する。
【００２５】多くの酵素前駆体が潜在的に修飾に用いら
れうる。酵素／酵素前駆体活性の比率が高いとき、活性
酵素の特異性が狭いとき、および活性化された酵素に対
して高感度で単純な適当なアッセイ原理が存在するとき
には、とくに有利である。とくに適当なのは、セリンプ
ロテアーゼ類の一員である。これらの酵素の多くは酵素
前駆体型として生じ、活性化により活性の巨大な増加を
示す。さらに、これらの酵素の多くに対して分光光度計
または蛍光によるアッセイを含む、単純で高感度かつ特
異的なアッセイが存在する。適当な酵素前駆体およびそ
れらの天然の活性化配列の例は表３に見ることができ
る。酵素前駆体はセリンプロテアーゼである必要はな
く、たとえばプロホスホリパーゼ、脂質分解エステラー
ゼのように、酵素前駆体から活性酵素への変換が特異的
タンパク質分解による課程であるならば、他のプロテア
ーゼまたはほかの非タンパク質分解酵素すらも用いう
る。
【００２６】アッセイ原理のある特定の変形は、修飾さ
れた酵素前駆体を活性化するために、２つの連続した段
階において第二の酵素（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｅｎｚｙ
ｍｅ）を適用することを含む。最初の段階で、測定すべ
きプロテアーゼは、修飾された酵素前駆体の活性化切断
部位からいく分（少し）離れた所の結合を切り離す。切
り離されて生じた修飾された酵素前駆体は、酵素的には
まだ活性ではないが、ペプチジルジペプチダーゼのよう
な第二の酵素により活性化される潜在的能力をもってい
る。第二の酵素の働きにより活性化が起こる。本発明の
この実施態様の重要な利点は、アッセイすべきプロテア
ーゼにより認識される配列の選択を非常に広い範囲で行
うことができるということである。これはその切断部位
が酵素前駆体の活性化に直接関与すべき必要がないから
である。
【００２７】このような状態は、たとえば酵素ＭＭＰ−
２（ゼラチナーゼＡ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ Ａ））、
ＭＭＰ−３（ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉ
ｎ））およびアンジオテンシン変換酵素について起こ
る。加水分解される部位のＣ−末端側部分における、そ
れぞれの基質の選択、↑ＧｌｕＡｒｇ、↑ＰｈｅＴｒｐ
および↑ＧｌｙＧｌｙは、多くの酵素前駆体に生じる活
性化認識部位、とくにプロウロキナーゼのそれ（↑Ｉｌ
ｅＩｌｅＧｌｙＧｌｙ）とはかなり異なる。間接的な活
性化に適した修飾された酵素前駆体は、このばあいにも
っとも有効である。
【００２８】天然の配列ＡｒｇＰｒｏＡｒｇＰｈｅＬｙ
ｓ↑ＩｌｅＩｌｅＧｌｙＧｌｙのかわりに次の配列：Ｐ
ｒｏＬｅｕＧｌｙ↑1ＧｌｕＡｒｇ↑2ＩｌｅＧｌｙＧｌ
ｙ、ＰｒｏＬｅｕＧｌｙ↑1ＰｈｅＴｒｐ↑2ＩｌｅＩｌ
ｅＧｌｙＧｌｙおよびＡｌａＡｌａＡｌａＰｈｅ↑1Ｇ
ｌｙＧｌｙ↑2ＩｌｅＩｌｅＧｌｙＧｌｙがプロウロキ
ナーゼ中に存在することはそれぞれゼラチナーゼＡ、ス
トロメリシンおよびアンジオテンシン変換酵素の計測に
適当な例である。これらの酵素は修飾されたプロウロキ
ナーゼを位置↑1における加水分解により変換し、依然
として不活性な中間体を生じる。この不活性な中間体を
位置↑2における加水分解により活性酵素に変換するた
め、カテプシンＣ（ジペプチジルジペプチダーゼ）のよ
うな酵素がつづいて用いられる。そののち、何らかの適
当な手順により活性を測定することができる。
【００２９】現存する酵素前駆体に活性化のための新し
く望ましい特異性を与える新たなアミノ酸配列を導入す
るためのいくつかの方法を以下に述べることができる。
多くのばあい、組換えＤＮＡ技術は魅力ある選択に思わ
れる。特定の酵素前駆体をコードするｃＤＮＡが利用可
能でなくてはならない。このようなｃＤＮＡは、ｃＤＮ
Ａライブラリーから既存の技術を用いて、たとえば特定
のオリゴヌクレオチドを用いたスクリーニングおよびク
ローニングにより、またはそのかわりに酵素前駆体のコ
ーディング配列の両端にある２つの特異的なオリゴヌク
レオチドを用いるＰＣＲ法を用いることによりうること
ができる。コーディング配列は、プラスミド中の強力な
プロモーターおよび適当な終止配列の間に導入される。
どのプロモーターおよび終止配列が選択されるかは、発
現系に依存する。組換えタンパク質の発現のためにしば
しば使われる細胞系、チャイニーズハムスター卵巣細胞
（ＣＨＯ細胞）のような哺乳類の細胞系での発現のため
には、ＳＶ４０ウイルスのプロモーターおよびベータグ
ロブリンの終止シグナルを用いうる。しかしながら、昆
虫の細胞の使用などのほかの多くの戦略でも、それに匹
敵する結果をえることができる。
【００３０】とくに興味がもたれるのは、大腸菌または
酵母などの微生物での変異酵素前駆体の発現である。こ
れらの発現系は、取り扱いが容易、安価、かつ大量生産
へのスケールアップが比較的簡単である。それぞれの酵
素前駆体に依存して、特定の発現系が選ばれる、なぜな
らばジスルフィド結合（大腸菌中では一般に形成されな
いがいくつかのばあいには発現後導入可能である）の存
在などの酵素前駆体の特徴によって、すべての系におい
てすべての酵素前駆体が充分に発現しうるわけではない
からである。さらに、大腸菌で発現されたタンパク質は
グリコシル化されていないが、一方酵母で発現されたタ
ンパク質は、しばしば過剰にグリコシル化されている。
グリコシレーションが酵素前駆体の機能のために重要で
あるか否かは、常に予想できるわけではないが、それは
いくつかの日常的な実験により容易に決定されうる。
【００３１】発現プラスミドを酵素前駆体の天然の野生
型のコーディング配列を含んで構築するときには、発現
後に活性化部位の周囲に修飾されたアミノ酸配列が結果
として生じるようにＤＮＡに適切な修飾を導入する。こ
の新しい配列は、アッセイすべきプロテアーゼにより切
断可能なように選ばれる。ｃＤＮＡへの新たな配列の導
入は、ミスマッチをもつ合成オリゴヌクレオチドを用
い、通常のプロトコルにしたがう部位特異的突然変異
（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ）により、容易になしとげられうる。あるいは、１つ
または複数のミスマッチのある合成オリゴヌクレオチド
を常に用いるＰＣＲの様々な適合を用いることができ
る。ｃＤＮＡに変異を導入するほかの可能な方法は、コ
ーディング配列を部分的または完全にも試験管中（ｉｎ
ｖｉｔｒｏ）で合成することによるものである。変異
をＤＮＡに導入したのち、この変異が存在すること、ま
た第二の望ましくない変異が存在しないことは既存の方
法を用いるヌクレオチドの配列決定によって、確認しう
る。いずれのばあいにも、修飾されたｃＤＮＡが修飾さ
れた酵素前駆体の発現に用いられる。この酵素前駆体
は、標準の方法により精製および濃縮することができ
る。アッセイキットに適用するときには、長い保存期間
の間、酵素前駆体を安定化しておくために添加物が必要
であろう。
【００３２】活性化領域にある最適配列を同定するため
の便利な方法は、変異の導入のため、たとえば完全また
は部分的に無作為化したオリゴヌクレオチドを用いて、
すべての可能なＤＮＡ配列からの無作為な選択を行なう
ことであろう。単一のクローンの発現生産物の特性を試
験することができるようにこの無作為配列ライブラリー
の発現を行なうとき、活性化配列の効率のよい最適化を
達成することができる。このような手順を用いて、数千
の異なる配列のスクリーニングを行なうことができるで
あろう。
【００３３】酵素前駆体用の（最適な）修飾されたコー
ディング配列ならびに適切な制御および選択配列（最も
便利な配列は特定の抗生物質に対する耐性を与えるもの
である）を含む発現プラスミドを、適当な宿主生物に導
入する。この存在する選択配列を用いて、安定した形質
転換細胞を標準的なクローニング技術により単離する。
これらのクローニングされた細胞が、修飾された酵素前
駆体を発現するために用いられる。細胞または培地か
ら、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過またはア
フィニティークロマトグラフィーなどの既存の方法を用
いて、修飾された酵素前駆体を単離および精製する。
【００３４】組換えＤＮＡ技術は、必要な修飾を導入す
る唯一可能な方法ではない。いくつかのとくにより小さ
な修飾は、ほかのたとえば酵素前駆体に直接化学的な方
法によっても導入しうる。
【００３５】このような修飾された酵素前駆体は、多数
の測定を行なうためにすべての必要な材料を含む「キッ
ト」の要素になりうる。典型的には、このようなキット
は、充分な量の修飾された酵素前駆体、活性化された酵
素前駆体を検出するための適当な基質、計測すべきプロ
テアーゼを定量するための標準調製品および緩衝液を調
製するための材料を有する容器を含んでなる。さらに、
キットは、特定のプロテアーゼの活性を特異的に消滅さ
せることによって、またはプロテアーゼと特異的に結合
することによって、アッセイの特異性を増すための特異
的な抗体、および１枚または複数枚の９６穴マイクロタ
イタープレートも含んでいてよい。輸送または保存の間
の酵素前駆体の安定性を増すために、安定化剤を酵素前
駆体に添加することが必要とされるかもしれない。この
ような安定化剤は、アルブミンなどのほかのタンパク
質、マンニトールのような炭水化物、抗酸化剤またはほ
かの有機化合物であってよい。さらに、無機塩も安定性
に有利な効果をもたらしうる。もっとも便利なのは、酵
素前駆体を凍結乾燥状態にし、使用の直前に緩衝液また
は水を加えて元に戻さなければならないものである。加
えて、活性の測定および計算の行ない方の説明書も含ま
れている。特異性を増すほかの可能性は、「ＢＩＡ」手
順を用いることである：最初に計測すべきプロテアーゼ
を特異的な固定化（モノクローナル）抗体を用いて捕ら
え、つづいて捕られた酵素の活性を計測する。あるい
は、キットまたはデバイスはすべての必要な試薬が乾燥
形態で、材料上に帯または点として固定化されている
「ディプスティク（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）」タイプであっ
てもよい。
【００３６】以下に示す実施例は本発明の実例に過ぎ
ず、けっして本発明の適用性または範囲を限定するもの
ではない。
【００３７】
【実施例】実施例Ｉ 修飾されたプロウロキナーゼの調
製 本実施例では、メタロプロテアーゼ、とくにたとえばコ
ラゲナーゼのようなマトリックスメタロプロテアーゼ用
の基質としての修飾されたプロウロキナーゼの調製を記
載する。
【００３８】プロウロキナーゼは、１５８番目のリジン
と１５９番目のイソロイシンの間のペプチド結合を加水
分解し、活性のある二本鎖形態のウロキナーゼを生ず
る、たとえばプラスミンなどによって活性化されうる一
本鎖酵素前駆体である。
【００３９】コラゲナーゼがコラーゲンまたはモデル基
質を切断することがすでにわかっているアミノ酸配列の
比較により、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびストロ
メリシンを含む、多くの異なるマトリックスメタロプロ
テアーゼにより認識される共通配列が導き出された。そ
のような共通配列はＮ末端のＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ↑
Ｉｌｅ−Ｘｘｘ−Ｇｌｙから始まる。様々なマトリック
スメタロプロテアーゼにとって、とくにＰｒｏおよび両
方のＧｌｙ残基は重要であるように思われ、一方Ｌｅｕ
およびＩｌｅ残基はそれらに比べてはるかに重要性は少
なく、残基Ｘｘｘはほとんどいかなるアミノ酸残基であ
ってもよい。この共通配列を正常な野生型のプロウロキ
ナーゼの活性化部位の周囲の配列：−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−
Ｐｈｅ−Ｌｙｓ↑Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−と
比較し、この配列を
【００４０】
【外３】 に置き換えることを決定した（ここで、マトリックスメ
タロプロテアーゼの共通配列は四角で示し、矢印は加水
分解の望まれる場所を示している）。この配列は、本発
明を説明するために用いられる、多くの可能性のうちの
わずか１つであることに注意する必要がある（図４）。 ａ．ヒトのウロキナーゼをコードするｃＤＮＡの単離 ｕ−ＰＡｃＤＮＡの完全なタンパク質コーディング領域
を、ｕ−ＰＡを産生している線維肉腫細胞系ＨＴ１０８
０（クアックス（Ｑｕａｘ）ら、（１９９０）キャンサ
ー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）５０巻、１４
８８〜１４９４頁）のポリＡ+ｍＲＮＡから、逆転写酵
素ＰＣＲの技術を用いて単離した。つぎのオリゴヌクレ
オチド：ＴＡＧＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＴＣＧＣＣＡＣＣ
ＡＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびＡＣＧＧＧＴＣ
ＴＧＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：
３）を、ヒトｕ−ＰＡのｃＤＮＡの９９から１６２０番
目のヌクレオチドにわたるｃＤＮＡ断片を増幅するため
のプライマーとして用いた。 ｂ．ウロキナーゼ用の発現ベクターの構築 この断片を、真核生物の発現プラスミドｐＥＶ２ｔＰＡ
（デ ムンク（ＤｅＭｕｎｋ）ら、（１９８９）バイオ
ケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２８巻、７
３１８〜７３２５頁、ベレイジェンら（１９８６）エン
ボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ Ｊ）５巻、３５２５〜３５
３０頁）中に、ｔ−ＰＡｃＤＮＡ断と置き換えることに
よりクローン化した。これをなしとげるため、ｐＥＶ２
ｔＰＡをＢｇ１IIで消化し、ｕ−ＰＡｃＤＮＡ断片をつ
ぎの特異的リンカーオリゴヌクレオチド：ＡＧＣＴＴＣ
ＣＣＧＧＧＡＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：４）およびＧＡＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＧＧＣＣ
ＴＣＣＣＧＧＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）を用いて
ｐＥＶ２ベクター中にクローン化した。 ｃ．ウロキナーゼ発現ベクターへの変異の導入 ウロキナーゼ発現ベクターｐｅＶ２ｕＰＡ１．１中の変
異は、組換え循環ＰＣＲ法（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｃｉｒｃｌｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒ
ｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて導入した。
【００４１】つぎの異なる４つのオリゴヌクレオチドを
合成した：ＵＫＣＯＬ１Ａ：ｃｇｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇ
ａｔｔａｔｔｇｇｇｇｇａｇａａｔｔｃａｃｃ（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：６） ＵＫＣＯＬ２Ａ：ｃｃｃｇａｇｃｇｇｃｃｇｃｃｔｃａ
ｇａｇｔｃｔｔｔｔｇｇｃｃａｃａ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：７） ＵＫＣＯＬ３Ａ：ａｔｔａｔｔｇｇｇｇｇａｇａａｔｔ
ｃａｃｃ（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：８） ＵＫＣＯＬ４Ａ：ｃｃｔｃａｇａｇｔｃｔｔｔｔｇｇｃ
ｃａｃａ（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：９） ２つの独立したポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（ＰＣＲ）を行なった。オリゴＵＫＣＯＬ１ＡをＵＫＣ
ＯＬ４Ａと組み合せ、ＵＫＣＯＬ２ＡはＵＫＣＯＬ３Ａ
と組み合わせた。
【００４２】ＰＣＲは、プラスミドＤＮＡ ｐｅＶ２Ｕ
Ｋ１．１を２ｎｇ、２つのオリゴヌクレオチドをそれぞ
れ１μＭ、４種類すべてのデオキシリボヌクレオチドを
０．２ｍＭ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼを５Ｕおよび
ポリメラーゼとともに供給されるような適切な緩衝液を
含む総容積１００μｌ中で行ない、最後に試験管の内容
物をオイルで覆った。以下の温度により２０から３０サ
イクルのＰＣＲを行なった。９４℃で１分間、５５℃で
１分間および７２℃で３分間。両方のＰＣＲ産物を低融
点アガロースゲル（ｌｏｗ ｍｅｌｔｉｎｇ ａｇａｒ
ｏｓｅ ｇｅｌ）で電気泳動し、ゲルから切り出しおよ
び電気的抽出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）、つづ
いてエタノール沈降により単離した。
【００４３】プライマー ＵＫＣＯＬ１Ａ／ＵＫＣＯＬ
４Ａの組み合わせおよびプライマーＵＫＣＯＬ２Ａ／Ｕ
ＫＣＯＬ３Ａの組み合わせを用いてえられた、２つのＰ
ＣＲ産物を等モル量ずつ混合し、１０ｍＭトリス塩酸、
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０
の中で１００℃５分間変性し、５５℃まで１０分間隔で
温度を１０℃ずつ下げることにより、再度アニーリング
（ｒｅａｎｎｅａｌｅｄ）を行なった。確立された手順
（モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ）：ア・ラボラトリー・マニュアル（Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）第二版、サム
ブローク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、フリッチ（Ｆｒｉｔｓ
ｃｈ）およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）編集、
シーエスエッチ（ＣＳＨ）１９８９）にしたがい、この
再度アニーリングを行なった材料のうちの少量を大腸菌
（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株の形質転換に用いた。３
７℃で一晩インキュベートしたのちに、コロニーが現
れ、これを採取し、少量の培地で生育させ、標準的な手
順によるプラスミドＤＮＡの単離に用いた。プラスミド
ＤＮＡを、制限酵素ＡｖａＩまたはＤｒａＩＩにより切
断した。最初の酵素は、野生型のプラスミドを切断しな
いが変異プラスミドは１カ所で切断する。ＤｒａＩＩは
野生型プラスミドを４回切断するが、変異プラスミドは
３回しか切断しない。この手順を用いて、数個の潜在的
な変異クローンを選択し、大規模のプラスミド調製を行
なった。所望の変異が存在することおよび他の変異が存
在しないことを、ジデオキシ鎖停止法（ｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏ
ｄ）によるＤＮＡ配列決定により確認した。 ｄ．変異プロウロキナーゼの発現 １０〜２０μｇの発現プラスミドｐｅＶ２ＵＫｃｏｌ
を、選択マーカーを含む２μｇのプラスミドｐＳＶ２ｎ
ｅｏとともに、チャイニーズハムスター卵巣細胞にトラ
ンスフェクトさせた。トランスフェクションはリン酸カ
ルシウム共沈法を用いて行なった。培地に、１ｍｇ／ｍ
ｌのネオマインシン類似化合物、Ｇ４１８を添加し、培
養２〜３週間後に現れる耐性のあるクローンを選択し
た。選択されたクローンを個別に生育させ、２４時間の
コーディションドメディウムを集めた。プロウロキナー
ゼ変異体の生産は、発表されている手順（ビネーマ（Ｂ
ｉｎｎｅｍａ）ら、（１９８６）、トロンボ・レス（Ｔ
ｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．）、４３巻、５６９〜５７７頁）
を用いる酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ）により確認した。高生産クローンを、ロー
ラーボトル中の無血清培地で、増殖および生育させた。
培地を集め、遠心して、−２０℃で保存した。
【００４４】解凍後、プロウロキナーゼ変異体を培地か
ら亜鉛キレートセファロース（ｚｉｎｃ ｃｈｅｌａｔ
ｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）へ吸着させた。よく洗浄した
のち、プロウロキナーゼ変異体を５０ｍｌのイミダゾー
ルで溶出した。またはそうするかわりに、培地をセファ
デックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ２５と縦に並んだ、ウ
ロキナーゼに対するモノクローナル抗体の固定されたカ
ラムに吸着させた。よく洗浄したのち、変異プロウロキ
ナーゼを３ＭのＫＳＣＮで溶出し、そののち適当な緩衝
液に対して透析した。 実施例ＩＩ 修飾されたプロウロキナーゼの特徴づけ 前記のように精製された変異プロウロキナーゼを、ドデ
シル硫酸ナトリウム存在下のポリアクリルアミドゲル電
気泳動により、銀染色法により可視化したのち、分析し
た。推定分子量５５ｋＤａの位置に１つの大きなバンド
が観察され、実施例Ｉのたった一段階精製手順後にもか
かわらず、驚くべきことにコンタミネーションはほとん
どなかった。
【００４５】ゲル電気泳動ののち、ザイモグラフ技術
（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）（グ
ラネリ−ピパーノ（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎ
ｏ）ら、（１９７８）、ジェイ・エクスプ・メド（Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１４８巻、２２３〜２３４頁）を用
いることによって、その材料が、プロウロキナーゼ標品
に期待されるようないかなるタンパク質分解活性（ｐｒ
ｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）もほとんど持
たないことが示された（図５）。活性の欠失は、ウロキ
ナーゼに特異的な発色基質であるＬ−ｐｙｒｏＧｌｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド基質とインキュベ
ーションすることにより確認した。変異プロウロキナー
ゼをプラスミンとインキュベーションしても、野生型の
プロウロキナーゼとは違い、その活性は増加しなかっ
た。変異プロウロキナーゼをコラゲナーゼとともにイン
キュベートすると活性は増大したが、コラゲナーゼの阻
害剤ＥＤＴＡは活性化を阻害した（図５）。
【００４６】ほかの実験では、変異プロウロキナーゼを
コラゲナーゼとともに、様々な時間および様々な濃度で
インキュベートした。サンプルを採取し、還元的条件の
もとで電気泳動分析を行なった。つぎにウエスタンブロ
ッドを行ない、ウサギ抗ウロキナーゼ抗体、複数のペル
オキシダーゼで標識されたヤギの抗ウサギＩｇＧととも
にインキュベートし、化学発光キット（ｃｈｅｍｉｌｕ
ｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｋｉｔ）（ベーリンガー マンハ
イム ゲーエムベーハー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａ
ｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ）により可視化した。
【００４７】さらに、同じ材料の一部を、Ｌ−ｐｙｒｏ
Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ ｐ−ニトロアニリドを用いる
活性計測に用いた。図６には、コラゲナーゼとともにイ
ンキュベートすることにより５５ｋＤａのバンドが減少
し、それと平行して、コラゲナーゼが新しい配列の１５
９番目の残基のＮ末端側を切るときに期待されるような
約３０ｋＤａのバンドが増大したことを示す（図４）。
一本鎖の５５ｋＤａのプロウロキナーゼの低分子量産物
への変換により、発色基質を用いて計測される活性が増
大した（表４）。変換および活性化は、コラゲナーゼ阻
害剤であるＥＤＴＡにより阻害されうる。変異プロウロ
キナーゼをプラスミンとともにインキュベーションして
も効果はない。
【００４８】これらの結果により、変異プロウロキナー
ゼは、コラゲナーゼの測定に適当な基質でありうること
が示される。
【００４９】
【表４】 実施例ＩＩＩ 変異プロウロキナーゼを用いるコラゲナ
ーゼ活性の測定 変異プロウロキナーゼを用いる数種のコラゲナーゼ測定
方法を研究した。 ａ．方法Ｉ 様々な濃度のコラゲナーゼを様々なインキュベーション
時間ののち、変異プロウロキナーゼとともに３７℃に
て、ｐＨ７．５の０．１ｍｏｌ／ｌのトリス塩酸緩衝液
中でインキュベートした。サンプルを５０μｌ採取し、
コラゲナーゼが触媒する変異プロウロキナーゼの活性な
変異ウロキナーゼへの変換を止めるため、１０μｌの
０．５Ｍ ＥＤＴＡと混合した。そののち０．４ｍＭの
ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとともに、
総容量が２５０μｌのｐＨ７．５の０．１ｍｏｌ／ｌの
トリス塩酸緩衝液中、２５℃でインキュベートすること
により、変異ウロキナーゼの活性を計測した。インキュ
ベーションは、好ましくは９６穴平底マイクロタイター
プレート中で行なう。そうすることにより、適当な判読
装置での吸光度変化の迅速な計測が可能となる。このよ
うな実験の結果を図７に示す。
【００５０】そうするかわりに、コラゲナーゼが触媒す
るプロウロキナーゼの変換およびウロキナーゼが触媒す
るｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニ
リドの加水分解の両方の反応を、同じ反応容器中で行っ
て、パラボリック速度アッセイ（ｐａｒａｂｏｌｉｃ
ｒａｔｅ ａｓｓａｙ）まで行なうこともできる。この
後者の選択によって液体を取扱う階段数は最小になる
が、コラゲナーゼが触媒する修飾されたプロウロキナー
ゼの活性化およびトリペプチド基質の加水分解の反応条
件をそれぞれ最適化することはできない。 ｂ．方法II 方法Ｉに記載したように、コラゲナーゼを変異プロウロ
キナーゼとインキュベートし、所定のインキュベーショ
ン期間ののち、ＥＤＴＡの添加により反応を停止する。
そののちのウロキナーゼの活性計測には、プラスミノー
ゲンおよび発色性のプラスミン基質を用いる（図８）。
適当なプラスミン基質の例は、表５に見い出しうる。こ
のアッセイは、余分の増幅段階のために、方法Ｉのアッ
セイよりもかなり感度が高い。
【００５１】
【表５】 またはそうするかわりに、このアッセイを前記と同様い
くつかの利点および欠点をともなう一段階で行なうこと
もできる（図９）。このばあいには、３つの連結された
反応、コラゲナーゼが触媒する変異プロウロキナーゼの
変異ウロキナーゼへの変換、変異ウロキナーゼが触媒す
るプラスミノーゲンのプラスミンへの変換およびプラス
ミンが触媒するペプチド基質の変換が含まれている。 ｃ．方法III 前記の方法は、コラゲナーゼ様酵素の定量に大変適して
いる。方法ＩおよびIIの両方において、反応は溶液中で
行なわれる。コラゲナーゼ様酵素の混合物が存在すると
きには、このような方法の使用は制限される。このよう
なばあい、ゲル電気泳動による分離のあとに酵素活性を
検出するザイモグラフ法は魅力的な選択である。ここに
記載する方法において、コラゲナーゼ様酵素の存在は、
ドデシル硫酸ナトリウムの非存在下または存在下におけ
るポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたの
ち、可視化されうる。コラゲナーゼを含むサンプルは、
ドデシル硫酸ナトリウム存在下でポリアクリルアミド分
離ゲル上での電気泳動により分離される。電気泳動のの
ち、酵素を再生（ｒｅｎａｔｕｒｅ）するため、ゲルを
１％（ｖ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００
（商標）中で２０分間づつ３回洗浄する。検出ゲルは、
０．６５ｍＭ ＣａＣｌ2、０．６５ｍＭ ＭｇＣｌ2お
よび１４０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ７．７５の５０ｍ
Ｍベロナール塩酸（Ｖｅｒｏｎａｌ ＨＣｌ）中で、プ
ラスミノーゲン、フィブリノーゲン、変異プロウロキナ
ーゼおよび溶解したアガロース２５％（ｗ／ｖ）を混合
することにより調製する。ほかの成分を添加する前に、
アガロース溶液は４２℃程度まで冷却すべきである。そ
ののち、トロンビンを添加し、溶液を迅速に混合して、
清潔な平底のガラスまたはプラスチック容器に注ぐ。凝
固ののち、洗浄したポリアクリルアミドゲルをアガロー
ス層の上に置く。そのサンドイッチ状のものを、２５〜
３７℃で数時間、加湿チャンバー（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅ
ｄ ｃｈａｍｂｅｒ）中でインキュベートする。活性コ
ラゲナーゼの存在は、フィブリンの不透明のバックグラ
ウンド中の透明な溶解ゾーンとして示される（図５）。 ｄ．方法IV ポリアクリルアミドゲル中のコラゲナーゼの検出のため
のまた別の選択肢として、たとえばエレクトロブロッテ
ィング（ｅｌｅｃｔｒｏ−ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、
たとえばニトロセルロースまたはナイロンのシートにタ
ンパク質を移しとることができる。ブロットをアルブミ
ンまたはカゼインのような適当なタンパク質によりブロ
ックして、変異プロウロキナーゼ、プラスミノーゲンお
よび発色性のプラスミン基質とともに、ｐＨ６〜８のト
リス塩酸のような適当な緩衝液中でインキュベーション
することより活性が可視化される（原理を図１０に図解
する）。２５〜３７℃で３０分から数時間インキュベー
ションしたのち、ブロットを０．１％（ｖ／ｖ）ＮａＮ
Ｏ2を含む０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸中でインキュベート
し、ただちに０．５％（ｗ／ｖ）の（ＮＨ4）2ＳＯ4を
含む０．１ｍｌ／ｌの塩酸中で５分間のインキュベーシ
ョンを行なった。最後に、ブロットを４７．５％（ｗ／
ｖ）エタノール中の０．０５％（ｗ／ｖ）Ｎ−１ ナフ
チルエチレンジアミン溶液に移すと約３分間で赤色が現
われる。
【００５２】この手順は、修飾されたプロウロキナー
ゼ、プラスミノーゲンおよび発色性プラスミン基質を含
む薄いアガロース層上にブロットを置くことによっても
行ないうる。溶液中でのインキュベーションと比較し
て、より鋭いバンドがえられ、より少ない材料しか消費
しない。
【００５３】類似の手順は、組織切片上の酵素活性を染
色するために用いうる。 実施例IV マトリックスメタロプロテアーゼの測定 ヒトのｍｍｐ−２およびｍｍｐ−９を、ゼラチンセファ
ロース（ｇｅｌａｔｉｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（商
標）アフィニティークロマトグラフィーを用いて、ヒト
臍帯静脈内皮細胞のコンディションドメディウムから単
離した。精製された材料はほとんど不活性で、アミノフ
ェニル酢酸第二水銀（ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ ｍｅｒ
ｃｕｒｉｃ ａｃｅｔａｔｅ）処理により活性化しう
る。活性化または活性化されていないｍｍｐ−２および
ｍｍｐ−９のいずれかを含有する材料の一部を０〜４８
時間の期間、ｐＨ７．５の０．１ｍｏｌ／ｌトリス塩
酸、０．０１％ ｖ／ｖ トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−
８０（商標）中３７℃で、０．１５μＭの修飾されたプ
ロウロキナーゼとともにインキュベートした。コントロ
ール実験では、５ｍＭ ＥＤＴＡを加えたｍｍｐ混合物
を添加するかまたはｍｍｐ混合物を全く添加しなかっ
た。インキュベーションののち、最終濃度が５ｍＭにな
るようＥＤＴＡを添加し、０．０１％ ｖ／ｖ トゥイ
ーン−８０（商標）を含むｐＨ７．５の０．１ｍｏｌ／
ｌトリス塩酸のような適当な緩衝液中で、プラスミノー
ゲン（最終濃度０．１５μＭ）およびＨ−Ｄ−Ｖａｌ−
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリドのようなプラスミ
ン基質と前記混合物の一部を混合した。これらの混合物
を２５または３７℃でインキュベートし、４０５ｎｍで
の吸光度変化を規則的な間隔で計測した。このような実
験の結果を表６にまとめる。
【００５４】
【表６】 実施例Ｖ プロテアーゼ活性の測定用キット このようなキットは好ましくは、凍結されたまたは好ま
しくはたとえば炭水化物または他のタンパク質の存在下
で凍結乾燥することなどにより安定化された、計測され
た量の修飾された酵素前駆体を含む複数の容器、活性酵
素用の適当な基質を含む複数の容器、安定化された対照
調製品を含む１つの容器、ならびに濃縮されたまたは凍
結乾燥された緩衝液調製品および、要すれば、特異性を
増すための１つもしくは複数の特異的抗体または阻害剤
調製品を含む複数の容器を含んでなる。さらにこのキッ
トは、１つもしくは複数の９６穴マイクロタイタープレ
ートおよびどのように測定を行ない結果を計算するかに
ついて説明書を含んでいてもよい。 実施例VI 様々な精製されたマトリックスメタロプロテ
アーゼの反応の比較 等モル量（最終濃度１０ｎＭ）の活性化されたヒトマト
リックスプロテアーゼを、７５０ｎｇ（最終濃度５０ｎ
Ｍ）の修飾されたプロウロキナーゼおよび０．６ｍＭの
ウロキナーゼ基質ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−
ｐＮＡとともに、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ2、１μＭ
ＺｎＣｌ2および０．０１％（ｖ／ｖ）ＢＲＩＪ−３５
（商標）の総容量０．２５ｍｌ中、３７℃でインキュベ
ートした。吸光度変化を時間（０〜４時間）で追跡し、
反応速度をΔＡ／ｈ2として示した。反応は１ｍＭのＥ
ＤＴＡの非存在下（陰影線を入れた棒）および存在下
（塗りつぶした棒）で行なった。
【００５５】結果（図１１）は、ＥＤＴＡの存在下では
活性が検出されないことを示しており、マトリックスメ
タロプロテアーゼへの特異性を指し示している。このア
ッセイはＭＭＰ−１とＭＭＲ−９に対して最も感度が高
い。ＭＭＰ−１は一般的に非コラーゲン基質に対しては
低い活性をもつので、この酵素に対する高感度は著し
い。 実施例VII ヒトＭＭＰ−９用のパラボリック速度アッ
セイ 活性化されたヒトＭＭＰ−９（最終濃度２５０ｐＭ）
を、７５０ｎｇの修飾されたプロウロキナーゼおよび
０．６ｍＭ ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａとともに、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下（三角形）およ
び非存在下（円形およびダイヤ形、二重の実験）、３７
℃でインキュベートした。実施例VIに記載した緩衝液中
３７℃で７時間インキュベートする間、吸光度変化を追
跡した。
【００５６】ＥＤＴＡ非存在下の吸光度変化は、インキ
ュベーション期間の２乗に対して線型であることが認め
られた。ＥＤＴＡ存在下では、活性はほとんど認められ
なかった（図１２）。 実施例VIII ＭＭＰ−９に対する検出限界の測定 最終濃度０〜５００ｐＭの、各インキュベーションあた
り０〜１２５×１０-15モルの酵素に相当する、活性化
されたヒトＭＭＰ−９を、修飾されたプロウロキナーゼ
およびｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡとと
もに、実施例VIおよびVIIに記載したように１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡを用いておよび用いずに、インキュベートした。
０〜７時間の様々な時間間隔ののちに、吸光度変化をモ
ニターした。活性はΔＡ／ｈ2として示した。
【００５７】挿入図は０〜２５ｐＭのＭＭＰ−９濃度の
グラフの部分を示す。ＭＭＰ−９の濃度が５ｐＭより低
くても、濃度に対して線形である、信頼できる応答をう
ることができる（図１３）。 実施例IX 生物学的サンプル中のＭＭＰ活性の測定 実施例VIIの手順を用いて、様々な生物学的サンプルに
ついてＭＭＰ活性を測定した。各サンプルは、アミノフ
ェニル酢酸第二水銀により活性化（３７℃で２４時間）
し、または活性化せずに、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下ま
たは非存在下において測定した。全ＭＭＰ活性は活性化
されＥＤＴＡ非存在下において計測した活性であり、活
性ＭＭＰ活性は活性化せずにＥＤＴＡ非存在下において
計測した活性である。ＥＤＴＡ存在下の活性（極めて低
い）は省略する。
【００５８】表７はこれらの実験の結果を示す。数個の
組織抽出物および生物学的液体について、ＭＭＰ活性を
測定しうる。
【００５９】
【表７】
【図面の簡単な説明】
【図１】一般的なプロテアーゼ類による基質認識の概念
を、図式的に説明する。基質の活性化の原因であるタン
パク質分解酵素は、基質の活性化部位を形成するアミノ
酸残基Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１′、Ｐ２′およびＰ３′
の認識に関与するアミノ酸残基ｓ３、ｓ２、ｓ１、ｓ
１′、ｓ２′、ｓ３′（実施例中に示されている）を含
む。活性化により、Ｐ１残基とＰ１′残基の間のペプチ
ド結合の切断を結果として生じる。
【図２】本発明にしたがうプロテアーゼ計測のための連
結したアッセイの原理を図式的に説明する。検出すべき
プロテアーゼは、前記プロテアーゼにより切断可能な活
性化部位を含むように設計された修飾された酵素前駆体
を活性化することができ、形成された活性酵素を前記酵
素に適当な基質を用い、基質から形成された検出可能な
産物を観察または計測することにより検出する。
【図３】限定されたタンパク質分解による酵素前駆体の
活性化の概念を、図式的に説明する。示されているよう
に、酵素前駆体は活性化ペプチドをＮ−末端に含んでお
り、この活性化ペプチドは、活性化（活性化部位のＰ１
残基およびＰ１´残基の間のペプチド結合の切断に関与
している）後に、たとえばジスルフィド架橋により、活
性部位ドメインとつながったままであってよいが、これ
は必要なわけではない。
【図４】コラゲナーゼおよびほかのマトリックスメタロ
プロテアーゼの検出用の修飾されたプロウロキナーゼ
を、図式的に説明する。アミノ酸配列ＰｒｏＡｒｇＰｈ
ｅＬｙｓＩｌｅＩｌｅＧｌｙＧｌｙを含むプロウロキナ
ーゼ活性化部位は、コラゲナーゼおよびほかのマトリッ
クスメタロプロテアーゼにより切断されうるアミノ酸配
列ＡｒｇＰｒｏＬｅｕＧｌｙＩｌｅＩｌｅＧｌｙＧｌｙ
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）により、置き換えられてい
る。
【図５】レーン３に精製された変異プロウロキナーゼの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびフィブリンザイモグラフィーの
結果を示す。レーン１：プロウロキナーゼをコラゲナー
ゼとともにインキュベートした。レーン２：コラゲナー
ゼ阻害剤であるＥＤＴＡを添加した。写真による結果を
Ａに示し、その結果の図面をＢに示す。
【図６】様々な時点および様々な濃度でコラゲナーゼと
ともにインキュベーションしたのちに、変異ウロキナー
ゼ（３２ｎｇ）を可視化するためのウェスタンブロット
を行なった結果を示す（時間は０〜６時間）。レーン１
〜５：１５ｎｇコラゲナーゼ。レーン６：７．５ｎｇコ
ラゲナーゼ。レーン７：３０ｎｇコラゲナーゼ。レーン
８は、３３Ｋ ｕ−ＰＡ標準品を含む。矢印は５５ｋお
よび３３ｋの分子量を指し示す。３３Ｋ ｕ−ＰＡは、
５５ｋｐｒｏ−ｕ−ＰＡの活性化および電気泳動前のジ
スルフィド結合の還元により生じる。写真による結果を
Ａに示し、その結果の図面をＢに示す。
【図７】コラゲナーゼの量の関数として活性を示す。変
異プロウロキナーゼ（２５２ｎｇ）を、３７℃で様々な
量のコラゲナーゼとインキュベートした。６時間後、Ｅ
ＤＴＡを、ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
（０．４ｍＭ）を加え添加した。２５℃にて、４０５ｎ
ｍでの吸光度変化を計測した。
【図８】プラスミノーゲンおよびＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡを用いた一段階活性計測によりえた
結果を示す。
【図９】プラスミノーゲンおよびＨ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅ
ｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡを用いた二段階活性計測によりえた
結果を示す。
【図１０】酵素前駆体として用いられる修飾されたプロ
ウロキナーゼから形成される活性酵素であるウロキナー
ゼ用の基質としてプラスミノーゲン（ＰＬＧ）を用い、
フィルター上のブロッティングののちのマトリックスメ
タロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を検出する方法を、図式的
に説明する。プラスミノーゲンの加水分解の結果により
形成されたプラスミン（ＰＬＭ）を、プラスミンにより
検出可能な産物に変換される発色性プラスミン基質を用
いて検出する。
【図１１】様々な活性化されたヒトマトリックスメタロ
プロテアーゼに、１ｍＭのＥＤＴＡ非存在下（陰影線を
入れた棒）または存在下（塗りつぶした棒）において、
修飾されたプロウロキナーゼおよびウロキナーゼ基質ｐ
ｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡを接触させる
ことによりえられた、ΔＡ／ｈ2で表わされる、活性を
示している。
【図１２】１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下（三角形）または
非存在下（円形およびダイヤ形、二重の実験）で、活性
化されたヒトＭＭＰ−９とともに修飾されたプロウロキ
ナーゼおよびｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮ
Ａをインキュベートしてえた４０５ｎｍにおける吸光度
を時間の関数として示す。
【図１３】様々な最終濃度（０から５００ｐＭ）の活性
化されたヒトＭＭＰ−９と、１ｍＭ ＥＤＴＡの非存在
下（円形）または存在下（三角形）で、修飾されたプロ
ウロキナーゼおよびｐｙｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ
−ｐＮＡを接触させることによりえられた、ΔＡ／ｈ2
として表わされる活性を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヨハン ヘンドリクス ヘルヘイエン オランダ王国、2651 ヴェーベー ベルケ ル エン ローデンリース、ヘルジストラ ート 14

Claims (30)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 サンプルをプロテアーゼの基質とインキ
    ュベートすることおよび該基質のタンパク質分解による
    切断を測定することを含んでなり、該基質が前記プロテ
    アーゼにより切断可能な認識部位を含む修飾された酵素
    前駆体である、サンプル中のプロテアーゼ、またはその
    前駆体を活性化したのちに測定する方法。
  2. 【請求項２】 前記修飾された酵素前駆体のタンパク質
    分解による切断によってその酵素前駆体を活性化し、そ
    の活性化された酵素前駆体の適当な基質を用いて生じる
    活性を観察または計測することにより前記タンパク質分
    解による切断を測定する、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記修飾された酵素前駆体を、その酵素
    前駆体のタンパク質分解による切断を行なうことによ
    り、酵素前駆体を活性化することのできる第二の酵素の
    基質に変換し、前記第二の酵素とともにインキュベート
    することおよび活性化された酵素前駆体の適当な基質を
    用いて生じた活性を観察または計測することにより、前
    記の修飾された酵素前駆体のタンパク質分解による切断
    を測定する、請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記サンプルが、生物学的液体、生物学
    的液体の画分、生物学的組織、生物学的組織の抽出物お
    よび生物学的組織の抽出物の画分よりなる群から選択さ
    れたものである、請求項１記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記プロテアーゼが、セリンプロテアー
    ゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテア
    ーゼおよびメタロプロテアーゼよりなる群から選択され
    たものである、請求項１記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記プロテアーゼがアスパラギン酸プロ
    テアーゼまたはメタロプロテアーゼである、請求項１記
    載の方法。
  7. 【請求項７】 前記プロテアーゼがマトリックスメタロ
    プロテアーゼである、請求項１記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記マトリックスメタロプロテアーゼが
    コラゲナーゼ、ゼラチナーゼまたはストロメリシンであ
    る、請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記修飾された酵素前駆体が、その活性
    化部位を測定すべきプロテアーゼにより切断可能な活性
    化部位に置き換えることにより酵素前駆体から誘導され
    る、請求項１記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記修飾された酵素前駆体がセリンエ
    ステラーゼから誘導される、請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記修飾された酵素前駆体がプロホス
    ホリパーゼから誘導される、請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記修飾された酵素前駆体がセリンプ
    ロテアーゼから誘導される、請求項１記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記修飾された酵素前駆体が第Ｖ因
    子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩＩ因
    子およびプロトロンビンよりなる群から選択される凝固
    酵素から誘導される、請求項１記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記修飾された酵素前駆体が、トリプ
    シノーゲン、キモトリプシノーゲン、プラスミノーゲ
    ン、プロウロキナーゼ、プロエラスターゼ、プロサブチ
    リシンおよびカリクレインよりなる群から選択される酵
    素前駆体から誘導される、請求項１記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記修飾された酵素前駆体がプロウロ
    キナーゼから誘導される、請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】 プロウロキナーゼの修飾が、１４９番
    目のグリシンから１６８番目のグルタミン酸の領域にあ
    る、請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 プロウロキナーゼの修飾が配列Ｐｒｏ
    155−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌ
    ｙ−Ｇｌｙ162にある、請求項１５記載の方法。
  18. 【請求項１８】 配列Ｐｒｏ155−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌ
    ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ162を配列Ｘｘ
    ｘ155−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇ
    ｌｙ−Ｙｙｙ162（配列中、ＸｘｘおよびＹｙｙはいか
    なるアミノ酸でもよい）に置き換えてプロウロキナーゼ
    をコラゲナーゼおよびほかのマトリックスメタロプロテ
    アーゼ用の基質に変換する、請求項１５記載の方法。
  19. 【請求項１９】 配列Ｐｒｏ155−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌ
    ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ162を配列Ａｒ
    ｇ155−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇ
    ｌｙ−Ｇｌｙ162に置き換えてプロウロキナーゼをコラ
    ゲナーゼおよびほかのマトリックスメタロプロテアーゼ
    用の基質に変換する、請求項１５記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記修飾されたプロウロキナーゼの活
    性化がウロキナーゼによる加水分解により有色基または
    蛍光基を解離するウロキナーゼのペプチド基質を用いて
    測定される、請求項１５記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記ペプチド基質が化合物Ｘｘｘ−Ｙ
    ｙｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡである（ここでＸｘｘおよびＹｙ
    ｙはいかなるアミノ酸でもよく、ｐＮＡはパラニトロア
    ニリン部分を表す）、請求項１５記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ウロキナーゼ用の基質としてプラスミ
    ノーゲンを用い、かつ、プラスミンによる加水分解によ
    り有色基または蛍光基を解離するプラスミンに特異的な
    ペプチド基質を用いて、前記プラスミノーゲンの活性化
    を測定することにより、前記修飾されたプロウロキナー
    ゼの活性化を測定する、請求項１５記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記プラスミン特異的ペプチド基質
    が、Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｎ−イ
    ソバレリル−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｎ−イソバレリ
    ル−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｎ−アセチル−Ｄ−Ｖａ
    ｌ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｎ−アセチル−Ｄ−Ｖａ
    ｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、ε−アミノカプロイル−
    Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ、Ｎ−Ｏ−スルホ
    ベンゾイル−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡおよびＮ
    −カルボベンゾキシ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ
    よりなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
  24. 【請求項２４】 修飾されていない酵素前駆体を活性化
    するプロテアーゼとは異なるプロテアーゼにより切断可
    能な認識部位を酵素前駆体に設けることにより、酵素前
    駆体から誘導される修飾された酵素前駆体。
  25. 【請求項２５】 前記認識部位が、修飾されていない酵
    素前駆体を活性化するプロテアーゼとは異なるプロテア
    ーゼにより切断可能な活性化部位であり、該活性化部位
    に、その酵素前駆体の活性化部位が置き換えられた、請
    求項２４記載の修飾された酵素前駆体。
  26. 【請求項２６】 プロウロキナーゼから誘導される、請
    求項２４または２５記載の修飾された酵素前駆体。
  27. 【請求項２７】 配列Ｐｒｏ155−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌ
    ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ162を配列Ｘｘ
    ｘ155−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇ
    ｌｙ−Ｙｙｙ162に置き換え（配列中、ＸｘｘおよびＹ
    ｙｙはいかなるアミノ酸でもよい）、プロウロキナーゼ
    をコラゲナーゼおよびほかのマトリックスメタロプロテ
    アーゼ用の基質に変換する、請求項２６記載の修飾され
    た酵素前駆体。
  28. 【請求項２８】 配列Ｐｒｏ155−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌ
    ｙｓ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ162を配列Ａｒ
    ｇ155−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｉｌｅ−Ｇ
    ｌｙ−Ｇｌｙ162に置き換え、プロウロキナーゼをコラ
    ゲナーゼおよびほかのマトリックスメタロプロテアーゼ
    用の基質に変換する、請求項２６記載の修飾された酵素
    前駆体。
  29. 【請求項２９】 請求項２４、２５、２６、２７または
    ２８記載の修飾された酵素前駆体ならびに、活性化され
    た酵素前駆体用の基質、第二の酵素、緩衝液、標準調製
    品、特異的な抗体、マイクロタイタープレートおよび使
    用説明書よりなる群の中の少なくとも１つの要素を含ん
    でなる、サンプル中のプロテアーゼ、またはその前駆体
    を活性化したのちに測定するためのキット。
  30. 【請求項３０】 請求項２４、２５、２６、２７または
    ２８記載の修飾された酵素前駆体を含んでなる、サンプ
    ル中のプロテアーゼまたはその前駆体を活性化ののちに
    測定するためのデバイス。
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