JP2007503833A - 合成チモーゲンを用いるシグナル増幅 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2003年9月2日に出願された米国仮出願第60/499,846号の恩恵を主張する。前記出願の全教示は参照によって本明細書に援用される。
化学的シグナルを増幅することによって、化学反応を受けるプロセスを、非常に低い濃度においてさえ検出することができる。かかる増幅プロセスは、化学反応の感度の良いおよび/または迅速な検出を必要とする任意の分野における大きな利用性も提供する潜在能力を有する。例えば、かかるプロセスを用いて、感染および疾患、化学または生物戦剤、または環境汚染物質を引き起こす微生物を検出することができよう。
本発明はチモーゲン、および検出アッセイおよび装置におけるその使用に関する。
本発明の好ましい態様の記載を以下に示す。本発明をその好ましい態様を参照して詳しく示し、記載するが、添付の特許請求の範囲に含まれる本発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細において種々の変化をなすことができることは、当業者に理解されよう。
本発明の種々の態様で用いる適当なチモーゲンを設計または選択する場合には、以下を含むいくつかの因子を考慮することができる:
1. チモーゲンとシグナル酵素との間の活性の差。好ましくは、活性の差は所望のシグナル分解を供するのに十分に大きいものである。
2. チモーゲンを用いるアッセイのタイプ。好ましくは、アッセイは経済的であって、目的の用途にとって必要以上に複雑でないものである。
3. チモーゲンの感度。好ましくは、チモーゲンは、検出可能なシグナルを生じさせる微生物の数が存在する場合、検出アッセイが適当なシグナルを供するように目的の微生物タンパク質の存在に対して十分に感受性がある。
4. 活性化機序。好ましくは、チモーゲンは所望の機序(例えば、タンパク質分解活性化)によって活性化される。
5. 活性部位。好ましくは、活性部位は、検出可能に標識された基質、または検出可能なシグナルを生じさせるための他の手段と特異的に相互作用可能なように構成される。
これらの基準のいくつかまたはいずれも、具体的適用、または検出される微生物に応じて重要であり得る。これらおよび他の基準を満足するためのチモーゲンの構築または選択は適当な酵素の変異誘発によって行い、ペプチドおよび阻害剤(またはプロテアーゼ)領域を付着させることができる。一旦これが構築されれば、ランダム変異誘発を用いて、得られたチモーゲンの阻害および活性化特性を洗練することができる。
1. 細胞を37℃にてLB培地中で一晩増殖させる。
2. 1mM IPTGでの誘導に続き、細胞を溶解させ、エピトープタグ結合プレート(例えば、ニトリロ三酢酸または抗体被覆プレート)に結合させる。
3. 次いで、プレートをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄する。
4. 次いで、細胞を細菌プロテアーゼと共にインキュベートして、CotAチモーゲン変異体の再活性化を測定する。
5. 次いで、基質(例えば、ABTS)の存在下で最も再活性化された色を生じる変異体を、DNA配列決定によって同定する。
ある態様において、シグナル酵素はラッカーゼである。ラッカーゼ(ジフェノールオキシダーゼ)は、酵素の多銅オキシダーゼファミリーのメンバーである。一般に、これらの酵素はフェノール、ポリフェノール芳香族アミン、および他の非フェノール性基質を1つの電子によって酸化してラジカル種を作り出すのに酸素を必要とする。ラッカーゼが触媒する一般的な酸化反応は以下の通りである:
(枯草菌CotA配列;本明細書中においては「配列番号:1」ともいう)。
CPI2 Edans-EGAMFLEAIPMSIPK-Dabcyl
ECT2 Dabcyl-KVSRRRRRGGD-Edans
(配列EGAMFLEAIPMSIPKは本明細書中においては配列番号:2ともいい;配列KVSRRRRRGGDは本明細書中においては配列番号:3ともいう)。
タイプ1のCPI2変異体 MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDAL
タイプ2のCPI2変異体 MASXXXSASEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDAL
タイプ3のCPI2変異体 MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKSASTLEKFVDAL
タイプ1のECT2変異体 MASXXXSASVSRRRRRGGSASTLEKFVDAL
(配列MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDALは本明細書中においては配列番号:4ともいい;配列MASXXXSASEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDALは本明細書中においては配列番号:5ともいい;配列MASXXXEGAMFLEAIPMSIPKSASTLEKFVDALは本明細書中においては配列番号:6ともいい;および配列MASXXXSASVSRRRRRGGSASTLEKFVDALは本明細書中においては配列番号:7ともいう)。
MASSFWEGAMFLEAIPMSIPKTLEKFVDAL(本明細書中では配列番号:8ともいう)
を有するSSM1 CotA変異体も調製した。
1. SSM1変異体についての一般的ペプチド配列であって、本明細書中においては配列番号:9ともいう一般的配列
2. SSM2変異体についての一般的ペプチド配列であって、本明細書中においては配列番号:10ともいう一般的配列
3. SSM3変異体についての一般的ペプチド配列であって、本明細書中においては配列番号:11ともいう一般的配列
4. SSM4変異体についての一般的ペプチド配列であって、本明細書中においては配列番号:12ともいう一般的配列
5. T3変異体についての一般的ペプチド配列であって、本明細書中においては配列番号:13ともいう一般的配列。
タイプ2およびタイプ3変異体については、3アミノ酸のSAS延長を配列に挿入して、付加したアームにより大きな柔軟性およびより長いリーチを与えた。1つ以上のSAS延長を異なる点で挿入して、フレキシブルなリンカーを作り出すことができる。例えば、SAS延長を、本明細書中においては「配列番号:14」ともいう、以下の配列によって示されるような、ペプチド(例えば、CPI2ペプチド)の前および/または後に挿入することができる。
同様の手法が、例えば、変異タンパク質の端部の3つのランダム化されたアミノ酸の組を有するECT2ペプチドにつき示すことができる。
いくつかの態様において、本発明は、ペプチドで固体表面(例えば、ビーズ)に連結されたシグナル酵素の使用を特徴とする。適当なシグナル酵素のいくつかの例として、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ルシフェラーゼ、ラッカーゼ(CotA)、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)が挙げられる。該ペプチドは微生物タンパク質(例えば、細菌プロテアーゼなどの細菌酵素)に対する基質として機能する。ペプチドが目的の微生物タンパク質と相互作用する場合、該ペプチドは微生物タンパク質によって切断または加水分解される。この相互作用でシグナル酵素が放出され、次いで、シグナル酵素は自由にレポーターまたは検出可能に標識された基質と相互作用し、目的の微生物の存在を示す検出可能なシグナルを生じる。適当なレポーター基質の例として、ABTSおよびナフトールが挙げられる。
(表1に示した)オリゴヌクレオチドプライマーを、枯草菌からのCotAバリアント増幅中に遺伝子の5’末端のNheI制限部位および遺伝子の3’末端のXhoI部位に一体化するように設計した(制限部位は表1において下線を施す)。PCR増幅された断片を発現ベクターpET24a(Novagen, San Diego, Calif.)のNheI/XhoI部位にクローン化して、組換えSSMプラスミドを生成した(表2)。
CotAバリアントを発現させるために、SSM構築体を大腸菌発現株BL21DE3に形質転換した。0.4の550nmにおける光学密度において、1mMのイソプロピル−β−D-チオガラクトピラノシド(IPTG; Sigma, St.Louis, Mo.)の添加によって細胞を誘導し、37℃にて増殖を3時間継続した。誘導に続き、1mlの細胞を遠心分離し、50μlのPSB(タンパク質試料緩衝液)に再懸濁させ、10分間沸騰させ、200Vで1時間電気泳動した。発現は、タンパク質試料を12%SDS PAGEゲルで泳動させることによって確認した。クローンJS6におけるCotAの過剰発現も示された。図10は、クローンJS6におけるCotAの過剰発現を示すゲルの写真を示す。
2,2’-アジノビス(3-エチルベンズチアゾリン−6-スルホネート)(ABTS)アッセイを用い、CotA野生型および変異バリアントの活性を測定した。簡単に述べれば、45μlの野生型および変異CotA溶解物を、10μlのABTS基質(2.0mM)および45μlの1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)と共にインキュベートした。37℃にて、415nmの波長を用い、96ウェルマイクロタイタープレートリーダーにて反応を追跡した。反応を1時間モニタリングし、KaleidaGraphソフトウェアを用いてプロットした。予測されたように、野生型は、CotA変異バリアントと比較した場合、ABTS基質に対して最高の反応性を有していた。図13は、CotAバリアント(SSM4-1、SSM1-1、SSM1-3、SSM2-4、およびSSM2-6)がCotAの延長および修飾によって部分的に阻害されたことを示すグラフを掲げる。図13において、「wt」とは野生型をいい、「1-1」とはSSM1-1をいい、「1-3」とはSSM1-3をいい、「2-4」とはSSM2-4をいい、「2-6」とはSSM2-6をいい、「3-1」とはSSM3-1をいい、「3-2」とはSSM3-2をいい、「4-1」とはSSM4-1をいう。
シグナル酵素を種々のペプチドで固体表面に連結またはコンジュゲートさせた。シグナル酵素を連結するのに首尾よく用いられたペプチドの例として以下のものが挙げられる:
1. (本明細書中においては配列番号:21ともいう)配列ETKVEENEAIQKを有するSAP2
2. (本明細書中においては配列番号:22ともいう)配列VTLENTALARCを有するC10
3. (本明細書中においては配列番号:23ともいう)配列QADALHDQASALKCを有するPAE8
4. 配列番号:2に示された配列を有するCPI2
5. (本明細書中においては配列番号:24ともいう)配列KVSRRRRRGGDKVSRRRRRGGDを有するT2X。
SAP2およびC10はブドウ球菌(Staphylococcus)に特異的であり、PAE8はシュードモナス(Pseudomonas)に対して特異的であり、T2は大腸菌に対して特異的であり、およびCPI2は広域スペクトルの病原体と相互作用するペプチドである。また、10アミノ酸可変配列を有する種々のランダムペプチドも、シグナル酵素を固体表面に連結するのに首尾よく用いられた。
Biobyne Cへのペプチド付着
1mgのペプチドをコンジュゲーション緩衝液(MES pH4.5)に溶解させた。125μlの10mg/mlのEDC(5:1比)を加え、室温で2時間の回転の間に膜と反応させた。室温での洗浄は、40mLのPBS+1%グリセロールおよびPBSにて20分間行った。
HRPマレイミドコンジュゲーション
2.5mgのRoche HRPを500μlの1Mリン酸ナトリウム(pH7.4)に溶解させた。スルホSMCCを50μlのDMSOに溶解させ、室温にて20分間、該HRPと合わせた。分離は、マレイミドコンジュゲーション緩衝液中、ゲル濾過で行った。
HRP-ペプチド膜コンジュゲーション
スルホ-SMCC(約1ml)を含まない画分をペプチド-Biodyneディスクと合わせ、回転させながら約4℃にて一晩反応させた。PBS中100mLの0.1%トリトンで20分間の洗浄を2回、続いて0.1% PEG5000溶液で20分間の洗浄を2回、および10%ショ糖溶液250mL中で1時間の洗浄を1回など、数回の洗浄を行い、続いてスピード真空処理を一晩行った。
連結チモーゲンは液相アプローチまたは、側方流動膜アプローチで用いることができる。側方流動膜アプローチにおいては、検出可能に標識された基質またはレポーター酵素が側方流動膜の表面に沈積した液体ニトロセルロースに捕捉または付着されて、レポーター酵素の拡散に続いて目に見えるラインが形成される。
Claims (77)
- a)チモーゲンを試料に曝露する工程であって、該チモーゲンが外因性ペプチドおよび該外因性ペプチドによって阻害されるシグナル酵素を含み、該曝露が、該外因性ペプチドの修飾を容易にする条件下で起こる工程;ならびに
b)修飾または修飾の非存在を検出する工程であって、該修飾が該外因性ペプチドの切断を含み、該切断によって該シグナル酵素の活性化および検出可能なシグナルの生成がもたらされる工程
を含む、ペプチドの修飾を検出する方法。 - 該外因性ペプチドが該シグナル酵素の活性部位を立体的に妨げることによって該シグナル酵素を阻害する、請求項1記載の方法。
- 該外因性ペプチドが該シグナル酵素を不活性なコンフォメーションに折りたたませることによって該シグナル酵素を阻害する、請求項1記載の方法。
- 該検出可能なシグナルが、該シグナル酵素が検出可能に標識された基質と相互作用した後に生じる、請求項1記載の方法。
- 該外因性ペプチドが微生物によって産生されたタンパク質によって切断される、請求項1記載の方法。
- 該シグナル酵素がラッカーゼを含む、請求項1記載の方法。
- 該シグナル酵素がCotA酵素を含む、請求項1記載の方法。
- 該CotA酵素がCotA変異体を含む、請求項7記載の方法。
- 該シグナル酵素が緑色蛍光タンパク質を含む、請求項1記載の方法。
- 該シグナル酵素がルシフェラーゼを含む、請求項1記載の方法。
- 該シグナル酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項1記載の方法。
- a)ある構造を試料に曝露する工程であって、該構造が外因性ペプチドおよび少なくとも1つの補因子を含む、該外因性ペプチドの修飾を容易にする条件下での工程;ならびに
b)修飾または修飾の非存在を検出する工程であって、該修飾が該外因性ペプチドの切断を含み、該切断によって、チモーゲンを活性化シグナル酵素にさせる補因子がもたらされ、該切断によって検出可能なシグナルももたらされる工程
を含む、基質の修飾を検出する方法。 - 該検出可能なシグナルが、該活性化シグナル酵素が検出可能に標識された基質と相互作用した後に生じる、請求項12記載の方法。
- 該外因性ペプチドが微生物によって産生されたタンパク質によって切断される、請求項12記載の方法。
- 該補因子が金属イオンである、請求項12記載の方法。
- 該構造が少なくとも3つの補因子を含む、請求項12記載の方法。
- 該構造が少なくとも5つの補因子を含む、請求項16記載の方法。
- 該構造が該補因子を固定し、該外因性ペプチドの修飾によって、該補因子を放出する構造がもたらされる、請求項12記載の方法。
- 該シグナル酵素がラッカーゼを含む、請求項12記載の方法。
- 該シグナル酵素がCotA酵素を含む、請求項12記載の方法。
- 該CotA酵素がCotA変異体を含む、請求項20記載の方法。
- 該シグナル酵素が緑色蛍光タンパク質を含む、請求項12記載の方法。
- 該シグナル酵素がルシフェラーゼを含む、請求項12記載の方法。
- 該シグナル酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項12記載の方法。
- a)外因性ペプチドを試料に曝露する工程であって、該外因性ペプチドが少なくとも2つの酵素に付着し、該外因性ペプチドが該酵素を阻害し、該曝露が、該外因性ペプチドの修飾を容易にする条件下で起こる工程;ならびに
a)修飾または修飾の非存在を検出する工程であって、該修飾が該外因性ペプチドの切断を含み、該切断によって該酵素の活性化および検出可能なシグナルがもたらされる工程
を含む、ペプチドの修飾を検出する方法。 - 該外因性ペプチドが、立体的に活性部位を妨げることによって該酵素の少なくとも1つを阻害する、請求項25記載の方法。
- 該外因性ペプチドが該酵素の少なくとも1つを、該酵素を不活性なコンフォメーションに折りたたませることによって阻害する、請求項25記載の方法。
- 該検出可能なシグナルが、活性化された酵素の1つが検出可能に標識された基質と相互作用した後に生じる、請求項25記載の方法。
- 該外因性ペプチドが微生物によって産生されるタンパク質によって切断される、請求項25記載の方法。
- 該酵素の1つが、検出可能に標識された基質および第二の酵素に特異的である、請求項25記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがラッカーゼを含む、請求項25記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがCotA酵素を含む、請求項25記載の方法。
- 該CotA酵素がCotA変異体を含む、請求項25記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つが緑色蛍光タンパク質を含む、請求項25記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがルシフェラーゼを含む、請求項25記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項25記載の方法。
- a)複合体を試料に曝露する工程であって、該複合体が少なくとも1つの外因性ペプチドおよび該外因性ペプチドによって阻害される少なくとも2つの酵素を含み、該曝露が、該外因性ペプチドの修飾を容易にする条件下で起こる工程;ならびに
a)修飾または修飾の非存在を検出する工程であって、該修飾が該外因性ペプチドの切断を含み、該切断によって検出可能なシグナルがもたらされる工程
を含む、基質の修飾を検出する方法。 - 該外因性ペプチドが、立体的に活性部位を妨げることによって該酵素の少なくとも1つを阻害する、請求項37記載の方法。
- 該外因性ペプチドが該酵素の少なくとも1つを、該酵素を不活性なコンフォメーションに折りたたませることによって阻害する、請求項37記載の方法。
- 該切断が該酵素を活性化し、活性化された酵素の少なくとも1つが検出可能に標識された基質と相互作用して該シグナルを生じる、請求項37記載の方法。
- 該外因性ペプチドが微生物によって産生されるタンパク質によって切断される、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがラッカーゼを含む、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがCotA酵素を含む、請求項37記載の方法。
- 該CotA酵素がCotA変異体を含む、請求項43記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つが緑色蛍光タンパク質を含む、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがルシフェラーゼを含む、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項37記載の方法。
- 該外因性ペプチドが、立体的に活性部位を妨げることによって該酵素の少なくとも1つを阻害する、請求項37記載の方法。
- 該外因性ペプチドが該酵素の少なくとも1つを、該酵素を不活性なコンフォメーションに折りたたませることによって阻害する、請求項37記載の方法。
- 該切断が該酵素を活性化し、活性化された酵素の少なくとも1つが検出可能に標識された基質と相互作用してシグナルを生じる、請求項37記載の方法。
- 該外因性ペプチドが微生物によって産生されるタンパク質によって切断される、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがラッカーゼを含む、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがCotA酵素を含む、請求項37記載の方法。
- 該CotA酵素がCotA変異体を含む、請求項53記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つが緑色蛍光タンパク質を含む、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがルシフェラーゼを含む、請求項37記載の方法。
- 該酵素の少なくとも1つがホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項37記載の方法。
- a)チモーゲンを液体試料に曝露する工程であって、該チモーゲンが外因性ペプチドおよび該外因性ペプチドによって阻害されるシグナル酵素を含み、該チモーゲンが付着点において固体表面と付着し、該曝露が、該外因性ペプチドの修飾を容易にする条件下で起こる工程;ならびに
a)修飾または修飾の非存在を検出する工程であって、ここで該修飾が該外因性ペプチドの切断を含み、該切断によって該シグナル酵素の活性化、該固体表面からの該シグナル酵素の分離および検出可能なシグナルがもたらされる工程
を含む、ペプチドの修飾を検出する方法。 - 該シグナル酵素が固体表面に付着した検出可能な基質と相互作用する、請求項58記載の方法。
- 該シグナル酵素が液体中の検出可能な基質と相互作用する、請求項58記載の方法。
- 外因性ペプチドに共有結合した酵素を含む合成チモーゲンであって、ここで該外因性ペプチドが該酵素の酵素活性を阻害し、該外因性ペプチドが微生物によって産生される酵素の標的を含む、合成チモーゲン。
- 該酵素がラッカーゼを含む、請求項61記載の合成チモーゲン。
- 該酵素がCotA酵素を含む、請求項61記載の合成チモーゲン。
- 該CotA酵素がCotA変異体を含む、請求項63記載の合成チモーゲン。
- 該酵素が緑色蛍光タンパク質を含む、請求項61記載の合成チモーゲン。
- 該酵素がルシフェラーゼを含む、請求項61記載の合成チモーゲン。
- 該酵素がホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項61記載の合成チモーゲン。
- 各々が外因性ペプチドに共有結合した少なくとも2つの酵素を含むチモーゲン複合体であって、該外因性ペプチドが各酵素の酵素活性を阻害する、チモーゲン複合体。
- 該酵素の少なくとも1つがラッカーゼを含む、請求項68記載のチモーゲン複合体。
- 該酵素の少なくとも1つがCotA酵素を含む、請求項68記載のチモーゲン複合体。
- 該酵素の少なくとも1つがCotA変異体を含む、請求項70記載のチモーゲン複合体。
- 該酵素の少なくとも1つが緑色蛍光タンパク質を含む、請求項68記載のチモーゲン複合体。
- 該酵素の少なくとも1つがルシフェラーゼを含む、請求項68記載のチモーゲン複合体。
- 該酵素の少なくとも1つがホースラディッシュペルオキシダーゼを含む、請求項68記載のチモーゲン複合体。
- 該外因性ペプチドが微生物によって産生される酵素の標的である、請求項68記載のチモーゲン複合体。
- a)膜;
b)該膜に付着した少なくとも1つのペプチドであって、該ペプチドは微生物によって産生される酵素の基質であるペプチド
c)該ペプチドに付着したシグナル酵素;および
d)第二の位置で該膜に付着した、検出可能に標識された少なくとも1つの基質であって、該検出可能に標識された基質が該シグナル酵素の標的である基質
を含む、テスト装置。 - a)固体表面;
b)該固体表面に付着したペプチド基質;および
c)該ペプチド基質に付着したチモーゲンであって、該チモーゲンが該ペプチド基質によって阻害されるシグナル酵素を含む、チモーゲン
を含む、テスト装置。
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