JPH0480651A

JPH0480651A - 固定化酵素を用いるフロー型測定装置

Info

Publication number: JPH0480651A
Application number: JP2196534A
Authority: JP
Inventors: Akio Karigome; 刈米　昭夫; Yoshio Hashizume; 義雄橋爪; Ryuzo Hayashi; 隆造林
Original assignee: Kanzaki Paper Manufacturing Co Ltd
Current assignee: Kanzaki Paper Manufacturing Co Ltd
Priority date: 1990-07-23
Filing date: 1990-07-23
Publication date: 1992-03-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、緩衝液の流れの中に注入された測定試料が検
出部に送液されて検出されるフロー型測定装置に関する
ものである。

（従来の技術）近年、酵素・抗体等の生体触媒及び免疫反応系はそれら
の有する高い選択性、反応の迅速性、簡便性等から広く
分析目的に利用されている。

生体触媒を再使用に耐えるように不溶化処理したり、不
溶性の担体に結合、吸着または包括させた固定化生体触
媒は臨床検査、発酵生産、分析化学等の分野に広く応用
されている。

生体触媒のなかでも、特に酵素は固定化酵素カラム・固
定化酵素電極として、各種装置に広く利用されている。

固定化酵素を検出手段の一部に用いた測定装置であるバ
イオセンサーはその応用分野を広げるにつれてますます
高性能化が進んでおり、近年では簡便性に加えて更に測
定精度を向上させる要請が高くなっている。固定化酵素
を検出手段の一部に用いた測定装置の測定精度に影響を
与える要因としては多種多様なものが考えられるが、特
に温度による影響が大きい。

即ち、装置自体の発熱や室温の変動、また注入された試
料中の化学物質の希釈熱や反応熱などの要因によって送
液配管系の中を流れる緩衝液または緩衝液中に注入され
た試料の温度が変動すると測定値の精度に大きな影響を
及ぼすことになる。

従来このような温度依存性の高い測定装置の測定精度を
向上させるためにさまざまな方法が用いられており、例
えば特開昭６２−８４８号、特開昭６２−１１１６０号
には被測定液の温度を検出し補正演算を行う方法が紹介
されている。

また、特開昭６１−２１４３４１号では補正演算が可能
な温度変化範囲を越えていれば再較正を促す表示をする
装置が紹介されている。

これらの方法は実際に試料を測定する場合に被測定液の
温度も検出し、その測定値に温度補正を行う方法である
が、下記の問題がある。

まず、一般に用いられる濃度に対する検量線の他に、温
度に対する検Ｎ線を作成する必要があり非常に手間を要
する。

次に、測定値の補正方法の問題である。一般の化学反応
は温度が上昇するに従い反応速度が増大するが、酵素の
反応速度は酵素タンパクが受ける熱変性や熱失活の項も
含むので簡単な演算式で補正できない。また酵素の耐熱
性はその起源によってまちまちであり、近似的にしか温
度補正演算ができず、高精度測定に適用することは困難
である。

また被測定液の温度を検出する機構が必要となり測定装
置の構成が複雑になってしまう等の欠点があり簡単に高
精度の測定を行うことはできなかった。

上記のように測定値に補正を加える方法以外に被測定液
の温度を恒温槽内での熱交換によって一定にする方法な
ども行われており、例えば特開昭６３−１８２５６９号
にはフロー型測定装置の温度制御をより正確に行うため
に検出部用恒温槽と送液配管用恒温槽を設け、前者の熱
媒体には気体を後者の熱媒体には液体を用いて精度よく
温度制御する方法が紹介されている。

しかし、この方法では検出部と送液配管用の恒温装置を
それぞれ別個に設置し、かつ精度良く温度制御を行う必
要があり、装置構成が複雑になるという問題があった。

またフロー型測定装置では従来より送液配管系を長くし
、熱交換効率を高くする方法が用いられている。この場
合、装置構成、あるいは緩衝液の流速等の使用条件の変
更を伴わずに実施できるもので、恒温槽内で検出部に到
る時間を長くしてその間に送液配管系を流れる緩衝液ま
たは緩衝液中に注入された試料との熱交換効率を高める
ことができる。しかし、熱交換部の送液配管系を長（す
れば測定に時間を要することになりフロー型測定装置の
特長である高速性を損なうことになる。

また送液配管系の材質を熱伝導率の高い素材で構成すれ
ば熱交換効率が高くなるが、熱伝導率の高い金属類の配
管系は、緩衝液の種類によっては緩衝液中のイオンと化
学反応を起こし錆を発生したり、あるいは緩衝液中に少
量溶出してくる金属イオンにより固定化酵素の失活を招
くことがある。

従って従来よりフッ素樹脂チューブなどの高分子樹脂の
配管が広く利用されているが、熱伝導率が低く恒温槽内
での熱交換効率は極めて悪かった。

このようにフロー型測定装置において緩衝液または緩衝
液中に注入される試料の温度変動を押え測定精度値を向
上させることは極めて困難であった。

（発明が解決しようとする課題）本発明は、緩衝液およびその中に注入された測定試料の
温度制御を精度良く行うことにより高精度測定ができる
固定化酵素を用いたフロー型測定装置を提供することを
目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明者らは上記の問題は、例えば恒温槽内の検出部に
到る送液配管系を熱伝導率の大きな材質で被覆すること
により解決できることを見いだした。

本発明は、緩衝液の流れの中に注入した測定試料を送液
配管系を通して検出部に送液する固定化酵素を用いるフ
ロー型測定装置において、送液配管系の少なくとも一部
と検出部が熱媒体を含む恒温槽に格納され、且つ前記恒
温槽内の送液配管系および検出部の少なくとも一部分の
熱媒体と接する側の材質が、前記緩衝液と接する側の材
質及び恒温槽内の熱媒体より熱伝導率の大きな材質で構
成されていることを特徴とする固定化酵素を用いるフロ
ー型測定装置である。

また本発明の実施の態様には、送液配管系が配管とカラ
ムを含み、前記カラムは容器及び容器に内包された固定
化酵素を含み、且つ容器の少なくとも一部分の熱媒体と
接する側の材質が、容器の緩衝液と接する側の材質及び
恒温槽内の熱媒体より熱伝導率の大きな材質で構成され
ていることを特徴とする固定化酵素を用いるフロー型測
定装置が挙げられる。

（作用）本発明は、固定化酵素を用いるフロー型測定装置であり
、固定化酵素はカラムに内包させて、酵素反応による生
成物を下流側の検出部にある作用電極で検出することも
できるし、カラムを全く使わず検出部の作用電極として
固定化酵素電極を使用してもよい。

検出部は、フローセル、作用極、対極を含み、必要によ
り参照電極等を含む。

送液配管系とは、緩衝液が送液される部分のことで、固
定化酵素を内包するカラムを含んでもよい。

本発明のフロー型測定装置において、緩衝液または緩衝
液中に注入された測定試料は恒温槽内の送液配管系を通
過する際に熱伝導により恒温槽内の制御温度に近い温度
まで加温される。

恒温槽中の、熱媒体としては空気などの気体、水などの
液体等を用いることができるが、装置構成の簡便性、検
出部における電気絶縁性等の点から空気恒温槽が好まし
く用いられる。制御温度は、酵素により適宜調整する。

本発明では、送液配管系等における温度を制御された恒
温槽内の熱媒体と接する部分の少なくとも一部を熱伝導
率の大きな材質で構成するものであるが、例えば配管と
して外側にアルミニウム類の粘着テープを巻き付けたフ
ッ素樹脂製チューブを利用したり、或いはアルミニウム
類の配管の内部に樹脂層を形成することにより実施する
こができる。

送液配管系等の内壁、即ち緩衝液と接する側の材質とし
ては固定化酵素に対して悪影響を与えない材質のチュー
ブ、例えばフッ素樹脂、塩化ビニル、ポリエチレン等の
チューブなどが好ましい。

フッ素樹脂製チューブは耐薬品性が高く、高速液体クロ
マトグラフ装置などで一般に用いられているステンレス
チューブと比較して、固定化酵素を用いた生化学的分析
でよ（用いられるリン酸緩衝液等によって錆びを発生す
ることがない利点がある。また、固定化酵素の活性を低
下させるような金属イオンが溶出してくる心配もない。

本発明では送液配管系及び検出部の少なくとも一部分に
熱伝導率の高い素材、例えば前例のように空気恒温槽中
でフッ素樹脂チューブを送液配管系の内壁として用いた
場合には、フッ素樹脂及び空気よりも熱伝導率の高い材
質、例えば、アルミニウムなどの金属類、ステンレスな
どの合金類、またはガラス等で被覆する。なかでもアル
ミニウムやステンレスなどの金属箔は送液配管系の曲面
にあわせての加工をすることが容易であり好ましく用い
られる。

送液配管系の中を流れる緩衝液または緩衝液中に注入さ
れた試料は恒温槽中のフッ素樹脂チューブ中を通り界面
を通しての熱伝導により恒温化される。一方、フッ素樹
脂チューブの温度は、被覆されて恒温化されたアルミニ
ウムまたはステンレスなどの金属箔からの熱伝導により
、再び恒温化される。金属箔はフッ素樹脂チューブより
熱伝導率が高いので、恒温槽中の熱媒体から単位時間あ
たり多くの熱エネルギーを受けることができ、すばやく
恒温化することができる。

送液配管系等への熱伝導率の高い材質層の形成方法は、
特に限定されないが、例えば樹脂製のチューブに金属層
を形成する場合、樹脂製チューブの外径と等しい内径を
有する金属管にチューブを圧入する方法、金属箔を樹脂
製チューブに巻きつける方法、粘着剤を塗布した金属箔
をチューブに貼りつける等の方法がある。

熱伝導率の高い物質層の厚さは特に限定されないが、取
扱の容易さから１０μｍ〜１０００μｍ、より好ましく
は２０μｍ〜５００μｍ程度が望ましい。

尚、アルミニウムの熱伝導率は２３６　Ｗ　、　ｍ−’
・Ｋ　−１程度、ステンレスは１５Ｗ−ｍ−’・Ｋ−’
程度、フン素樹脂は０．００２５Ｗ−ｍ−’−に一’程
度、空気は０．０２４Ｗ−ｍ−’・Ｋ−’程度である。

緩衝液の流れの中に注入された試料は送液配管系を流れ
る際に混合されるので、希釈熱により流れの中に温度の
不均一な部分を生しるが、本発明では検出部に到るまで
の限られた時間内に効率よく熱交換が行われる。

なお、ステンレス、アルミニウム、ガラス等の材質で、
配管系や検出部のフローセル等を構成し、その内壁にフ
ン素樹脂、塩化ビニル、ポリエチレン等を被覆して本発
明のフロー型測定装置を構成することもできる。この方
法では、特に優れた固定化酵素カラムが得られる。

検出部、あるいは固定化酵素カラムなどは触媒反応によ
って反応熱が生じる部分であるため、これらの部分の熱
交換効率を高めることが効果的である。

本発明では緩衝液の温度を恒温化するとともに、注入さ
れた試料の希釈熱または反応熱により局所的に不均一と
なった温度差を吸収することができ、結果的に高精度の
測定が可能となる。

（実施例）以下に実施例を示し本発明をより具体的に説明するが、
もちろん本発明はこれのみに限定されるものではない。

実施例１（１）酵素電極の作成直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．　１Ｍ硫酸中、＋１，４Ｖで５分間の
電解処理を行う。

その後白金線をよく水洗した後、４０°Ｃで１０分間乾
燥し、１０％Ｔ−アミノプロピルトリエトキシシランの
無水トルエン溶液に１時間浸漬して、洗浄した。

〈酵素含有膜の形成〉このアミノシラン化した白金線上にグルコースに応答す
る酵素系を次のように固定化した。１００ｍＭリン酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６）中に、グルコースオキシダー
ゼ（シグマ社製、タイプ■）５ｍｇ／ｍｌ、牛血清アル
ブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔ　ｉｏｎ　　Ｖ）５ｍ
ｇ／ｍｌ及びグルタルアルデヒドを０．２％含む溶液を
５μ１滴下し、４０°Ｃで１５分間処理して固定化を行
った。

（３）測定装置第１図に示した如く酵素電極を配置したフロー型測定装
置を用いた。

このフロー型測定装置は、高速液体クロマトグラフィ用
のインジェクタ（レオダイン社製７１２５型）（３）と
、上述した手順で作成された酵素電極（７）を取り付け
た測定用セル（５）を外径１．５ｍｍ、内径０．５ｍｍ
、長さ１．０ｍのフッ素樹脂製配管（４）で接続されて
いる。

内容積４０μｍの測定用セル（５）には、酵素電極（７
）と参照極としてＡｇ／ＡｇＣ＋電極（８）が緩衝液の
管路を介して対向して配置されており、さらに対極（９
）として取り付けられたステンレス鋼から成る配管が接
続されている。これらは、恒温槽（１０）の内部に設置
され、槽内の温度は３７℃±　０．２°Ｃに保持されて
いる。

配管（４）に用いたフッ素樹脂の熱伝導率は約０．００
２５Ｗ−ｍ−’・Ｋ−’、恒温槽の熱媒体である空気の
熱伝導率は約０．０２４Ｗ−ｍ−’・Ｋである。このフ
ッ素樹脂製配管（４）の外壁を全長にわたって熱伝導率
が約２３６　Ｗ　−ｍ−’・Ｋであるアルミニウム箔（
厚さ０．０６ｍｍ）を粘着加工した粘着テープで被覆し
た。

酵素電極（７）にはポテンシオスタフト（１１）によっ
てＡｇ／ＡｇＣｌ電極に対して＋０．６Ｖの電圧が印加
され、電極で生成される過酸化水素を最終的に電気化学
的測定の対象として検出するようにした。検出信号はＡ
／Ｄ変換器（１２）、通信ケーブル（１３）を介してコ
ンピュータに転送してデータ処理を行った。

緩衝液リザーバ（１）からの緩衝液の送液は、コンピュ
ータによって送液ポンプ（２）を制御し、１．０ｍｌ／
ｍｉｎの流量で送液されるように設定されている。

緩衝液は、１ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６，０）である。測定を
緋えた緩衝液は、廃液リザーバ（６）で捕捉される。

（４）測定方法恒温槽温度が平衡に達した後、グルコースの標準液を５
μｍ注入した。

４０ｍＭの濃度まで検出値と濃度に比例関係が成立して
いるのを確認したのち、３０ｍＭの濃度のグルコース液
を１０回注入した。

（５）結果測定結果を第１表に示す。

検出値の平均値と標準偏差を求め、平均変動率を算出し
たところ０．４４％であった。

第１表実施例１の結果比較例１フン素樹脂チューブにアルミニウム箔を用いた被覆を設
けなかった以外は実施例１と同様の測定装置を用いた。

測定方法も、実施例１と同様にして行った。測定結果を
第２表に示す。３０ｍＭの濃度のグルコース液を１０回
注入し、その検出値の平均値と標準偏差を求め、平均変
動率を算出したところ０．８８％であった。

第２表　比較例１の結果実施例２（１）過酸化水素電極の作成直径２ｍｍの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび１５００番のエメリー紙で
平滑に仕上げる。この白金線を作用極、１ｃｍ角型白金
板を対極、飽和カロメル電極（以下ＳＣＥと略す）を参
照極として、０．１Ｍ硫酸中、＋２．ＯＶで１０分間の
電解処理を行った。その後白金線をよく水洗した後、４
０°Ｃで１０分間乾燥し、１０％Ｔ−アミノプロピルト
リエトキシシランの無水トルエン溶液に１時間浸漬後、
洗浄した。

生血清アルブミン（シグマ社製、Ｆｒａｃｔｉｏｎ　　
Ｖ）２０ｍｇを蒸留水１ｍｌに溶解し、その中にグルタ
ルアルデヒドを０．２％になるように加える。この混合
液を手早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、４０°
Ｃで１５分間乾燥硬化する。これを過酸化水素電極とし
た。

（２）固定化酵素カラムの作成耐火煉瓦（３０メツシュ〜６０メソシュ分級品）１５０
ｍｇをよ（乾燥し、Ｔ−アミノプロピルトリエトキシシ
ランのｌＯ％無水トルエン溶液１ｍｌを加え１時間放置
する。シランカップリング削をトルエンとメタノールで
よく洗浄後、１２０°Ｃで２時間乾燥する。放冷後、５
％グルタルアルデヒド水溶液を０．５ｍｌ加え、室温で
１時間放置する。この担体をよく水洗する。最後にｐＨ
７゜０のリン酸ナトリウム緩衝液で洗浄し、可能な限り
緩衝液を除く。

このアミノシラン化担体に、アルコールオキシダーゼ（
シグマ社製、Ｐｉｃｈｉａ　　−Ｌ」」Ｌ↓」−ｒｉｓ
由来の液状酵素標品）２５μｍをｐＨ７゜０のリン酸ナ
トリウム緩衝液で１０倍に希釈した酵素溶液を加え、室
温で１時間放置する。放置後緩衝液でよく洗浄する。こ
の酵素固定化担体を外径３ｍｍ、内径２ｍｍ、長さｌｏ
ｃｍのフ・２素樹脂製チユーブ中に充填して、固定化酵
素カラムを得た。

（３）測定装置第２図に示した如く固定化酵素カラムと過酸化水素電極
を配置したフロー型測定装置を用いた。

このフロー型測定装置は、高速液体クロマトグラフィ用
のインジェクタ（レオダイン社製７１２５型インジエク
タ）（２３）と、上述した手順で作成された固定化酵素
カラム（３６）と外径１゜５ｍｍ、内径０．５ｍｍ、長
さ１．０ｍのフッ素樹脂製配管（２４）で接続し、さら
に外径１．　５ｍｍ、内径０．５ｍｍ、長さ０．１５ｍ
のフン素樹脂製配管で過酸化水素電極（２７）を取り付
けた測定用セル（２５）と接続した。

内容積４０μｌの測定用セル（２５）には、過酸化水素
電極（２７）と参照極としてＡｇ／ＡｇＣ１電極（２８
）が緩衝液の管路を介して対向して配置されており、さ
らに対極（２９）として取り付けらだステンレス鋼から
成る配管が接続されている。これらは、恒温槽（３０）
の内部に設置され、槽内の温度は３７°Ｃ±　０．２°
Ｃに保持されている。

配管に用いたフッ素樹脂の熱伝導率は約０．００２５Ｗ
−ｍ−’・Ｋ−１、・恒温槽の熱媒体である空気の熱伝
導率は約０．０２４Ｗ−ｍ−’−に一’である。フッ素
樹脂製配管（２４）と固定化酵素カラム（３６）の全長
にわたって熱伝導率が約２３６Ｗ−ｒｒｖ’・Ｋ−’で
あるアルミニウム箔（厚さ０゜０６ｍｍ）の裏面を粘着
加工した粘着テープで被覆した。過酸化水素電極（２７
）にはポテンシオスタット（３１）によってＡｇ／Ａｇ
Ｃ］電極に対して＋０．６Ｖの電圧が印加され、電極で
生成される過酸化水素を最終的に電気化学的測定の対象
として検出するよう番こした。検出信号はＡ／Ｄ変換器
（３２）、通信ケーブル（３３）を介してコンピュータ
に転送してデータ処理を行った。

緩衝液リザーバ（２１）からの緩衝液の送液には、コン
ピュータによって送液ポンプ（２２）を制御し、１．０
ｍｌ／ｍｉｎの流量で送液されるように設定されている
。

緩衝液は、１ｍＭのアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭ
リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）である。測定を
終えた緩衝液は、廃液リザーバ（２６）で捕捉される。

（４）測定方法恒温槽温度が平衡に達した後、エチルアルコールの標準
液５μｍを注入した。

１、Ｏ（ｖ／ｖ）％の濃度まで検出値と濃度に比例関係
が成立しているのを確認したのち、１゜０　（ｖ／ｖ）
％の濃度のエチルアルコール液を１０回注入した。

（５）結果測定結果を第３表にボす。

検出値の平均値と標準偏差を求め平均変動率を算出した
ところ０．３７％であった。

第３表実施例２の結果比較例２フッ素樹脂チューブと固定化酵素カラムにアルミニウム
箔を用いた被覆を設けなかった以外は実施例２と同様の
測定装置を用いた。

測定方法も、実施例２と同様にして行った。

測定結果を第４表に示す。１．０　（ｖ／ｖ）％の濃度
のエチルアルコール液を１０回注入し、その検出値の平
均値と標準偏差を求め、平均変動率を算出したところ１
．４４％であった。

（効果）本発明の固定化酵素を用いるフロー型測定装置では、室
温などの周囲環境温度の変動、また試料の希釈熱、固定
化酵素の反応熱による影響を小さくした精度のよい測定
が可能であり、さらに装置の構成を非常に簡単にできる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１に記載したフロー型測定装置の系統図
を示す。（１）ｍｌｌ液液リザーバ２）送液ポンプ（３）インジェクタ（４）ミクシングコイル（５）測定セル（６）廃液リザーバ（７）酵素電極（８）Ａｇ／ＡｇＣ１参照電極（９）対極（１０）恒温槽（１１）ボテンシオスタット（１２）Ａ／Ｄ変換器（１３）通信ケーブル（１４）コンピュータ（１５）プリンター第２図は実施例２に記載したフロー型測定装置の系統図
を示す。（２１）ＩＮＮ液液リザーバ２２）送液ポンプ（２３）インジェクタ（２４）ミクシングコイル（２５）測定セル（２６）廃液リザーバ（２７）過酸化水素電極（２８）Ａｇ／ＡｇＣ１参照電極（２９）対極（３０）恒温槽（３１）ポテンシオスタント（３２）Ａ／Ｄ変換器（３３）通信ケーブル（３４）コンピュータ（３５）プリンター（３６）固定化酵素カラム

Claims

【特許請求の範囲】

（１）緩衝液の流れの中に注入した測定試料を送液配管
系を通して検出部に送液する固定化酵素を用いるフロー
型測定装置において、送液配管系の少なくとも一部と検
出部が熱媒体を含む恒温槽に格納され、且つ前記恒温槽
内の送液配管系および検出部の少なくとも一部分の熱媒
体と接する側の材質が、前記緩衝液と接する側の材質及
び恒温槽内の熱媒体より熱伝導率の大きな材質で構成さ
れていることを特徴とする固定化酵素を用いるフロー型
測定装置。
（２）送液配管系が配管とカラムを含み、前記カラムは
容器及び容器に内包された固定化酵素を含み、且つ容器
の少なくとも一部分の熱媒体と接する側の材質が、容器
の緩衝液と接する側の材質及び恒温槽内の熱媒体より熱
伝導率の大きな材質で構成されていることを特徴とする
請求項（１）記載の固定化酵素を用いるフロー型測定装
置。