JP5416692B2 - 電気的分析方法 - Google Patents
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Description
非特許文献1には、反応液中に溶解する銀イオンを還元することにより、感知部に銀を沈着させた後、それを再酸化して銀イオンが生じるときの電気化学的変化を電流の変化として検出する方法が開示されている。
特許文献3には、標識酵素としてコリンエステラーゼを結合させた標識抗体を使用し、試料中の被検物質の濃度又は量を、コリンエステラーゼの活性を測定することにより計測する方法において、前記酵素活性を、前記酵素分解物であるチオコリンを貴金属電極に吸着、濃縮し、このチオコリンの電極における還元脱離により発生する電流信号を増幅して検出する方法が開示されている。
特許文献4には、酵素標識抗体のサイクリック反応の生成物であるチオール化合物量又は生成速度を絶縁ゲート電界効果トランジスタ上に形成された金電極への吸着速度として測定する装置及び方法が開示されている。
これらの従来技術では、化学反応及び電気的検出を非流動条件で実施している。
この従来技術は、先述の特許文献1又は2に記載の従来技術と同様に、感知部上に沈殿を生じさせるものではない。
従って、本発明の課題は、従来公知の分析方法よりも検出感度や精度の高い分析方法を提供することにある。
[1](a)少なくとも、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーとを反応させ、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、不溶化反応を実施することによって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させる工程、
(b)前記感知部に沈殿させた不溶性物質を電気的に分析する工程
を含み、
前記工程(a)又は工程(b)の少なくとも1つの工程を流動的条件下で実施する
ことを特徴とする、分析方法、
[2]前記特異的パートナーが酵素である、[1]の分析方法、
[3]前記工程(a)が、
(1)披検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
(2)形成された前記複合体に含まれる標識物質により直接的又は間接的に引き起こされる不溶化反応によって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させる工程
を含み、
前記工程(2)又は工程(b)の少なくとも1つの工程を流動的条件下で実施する、[1]の分析方法、
[4]前記標識物質が加水分解酵素である、[3]の分析方法、
[5]前記加水分解酵素がアルカリフォスファターゼである、[4]の分析方法、
[6]前記不溶化反応が酸化還元反応である、[1]〜[5]の分析方法、
[7]前記可溶性物質が、無機イオン、有機イオン、酵素基質又はその反応生成物、色素から選ばれる、[1]〜[6]の分析方法、
[8]前記可溶性物質が金属イオンである、[7]の分析方法、
[9]前記金属イオンが銀イオンである、[8]の分析方法、
[10]前記感知部が、金属、高分子、カーボン、ナノチューブ状構造体、グラファイト、無機物質を単独もしくは組み合わせで構成される、[1]〜[9]の分析方法、
[11]前記感知部が少なくとも一つ以上の鋭角状の立体構造を有する、[1]〜[10]の分析方法、
[12]前記感知部に前記特異的パートナーが固定されている、[1]〜[11]の分析方法、
[13]前記流動条件が、強制的流動もしくは自発的流動である、[1]〜[12]の分析方法、
[14]前記電気的に分析する工程を含む分析方法が、アンペロメトリック型分析法である、[1]〜[13]の分析方法、
[15][1]〜[14]の分析方法に用いる感知部であって、少なくとも一つ以上の鋭角状の立体構造を有する感知部、
[16]前記分析方法に用いることを特徴とする、分析対象物を測定するための試薬及びキットであって、前記分析対象物と選択的相互作用を示す特異的パートナー、及び、不溶化反応により不溶性物質に変換される可溶性物質、少なくとも一つの前記感知部を含む試薬及びキット、
[17]前記感知部を、感知部を有する分析用カートリッジとして含む、[16]の試薬及びキット
に関する。
本発明の分析方法には、利用する選択的相互作用や不溶化反応に応じて、例えば、
(1)選択的相互作用に関与する一方のパートナーに、直接的または間接的に標識可能な標識物質により、不溶化反応が直接的又は間接的に引き起こされる方法(以下、複合体形成型分析方法と称する)、
(2)選択的相互作用それ自体により、不溶化反応が直接的又は間接的に引き起こされる方法(以下、酵素利用型分析方法と称する)
などが含まれる。なお、前記区分は、選択的相互作用により複合体を形成するか否かに基づいて大別するものであり、例えば、標識物質として酵素を用いる方法は、複合体形成型分析方法に含まれる。
以下、本発明の複合体形成型分析方法の具体的な一態様を示す図1に示す反応模式図に基づいて、本発明の概略を説明した後、本発明について更に詳細に説明する。
また、この分析系では、標識酵素による酵素反応として、以下に示す反応式1を利用し、不溶化反応として、反応式2を利用する。なお、図1において、pAPPはp−アミノフェニルホスフェート、pAPはp−アミノフェノールを、pQIはp−キノンイミンを、それぞれ、意味し、pAPPはALPの基質である。また、反応式1における「(ALP)」は、ALPが反応式1の触媒として関与することを示す。
更に、電気的分析法として、作用極1、対極、及び参照極を備えた電極部を用いるアンペロメトリック型分析法を使用する。
p−アミノフェノール+2Ag+→p−キノンイミン+2H++2Ag↓ (反応式2)
Ag→Ag++e− (反応式3)
また、前記相互作用以外にも、選択的相互作用を示す特異的パートナーが存在する種々の物質が公知であり、分析対象物質としては、例えば、タンパク質(酵素、抗原/抗体、レクチン等)、ペプチド、脂質、ホルモン(アミン、アミノ酸誘導体、ペプチド、タンパク質等からなる含窒素ホルモン、及びステロイドホルモン)、核酸、糖鎖(例えば、糖、オリゴ糖、多糖等)、薬物、色素、低分子化合物、有機物質、無機物質、若しくはこれらの融合体、又は、ウィルス若しくは細胞を構成する分子、血球などが挙げられる。
例えば、酵素基質BCIPを用いる場合には、ALPが関与する酵素反応によりBCIが形成され、還元反応により2BCIが析出する。また、酵素基質BCIPと色素NBTとの混合物を用いる場合には、ALPの酵素反応により2BCIが生じると共に、還元反応によりNBTジホルマザンが生じ、その複合体である2BCI/NBTジホルマザンが析出する。また、酵素基質3−インドキシルホスフェートを用いる場合には、ALPの酵素反応によりインドールが形成され、還元反応によりインディゴとして析出する。
これらの例では、標識物質として使用するALPが関与する酵素反応によって、それに続く不溶化反応が引き起こされ、その結果、水溶性物質が水不溶性物質に変換される。本発明には、標識物質が引き金となって間接的に不溶化反応が引き起こされる態様と、標識物質により直接的に不溶化反応が引き起こされる態様とが含まれる。
また、これらの酵素以外にも、各種還元剤又は酸化剤を用いることもできる。
例えば、水溶性物質として金属イオンを使用する場合、金属が沈殿した感知部に、参照極に対して電圧を印加することにより、感知部に沈着させた金属を金属イオンに再酸化し、感知部における電気化学的変化を電流の変化として検出することができる。
また、電流の変化を捉える方法としては、電流測定の他、サイクリックボルタノメトリー、微分パルスボルタノメトリー、クロノアンペロメトリー、微分パルスアンペロメトリー等、広く知られた方法を用いることができる。
例えば、水溶性物質としてアセチルチオコリンを使用する場合は、アセチルコリンエステラーゼにより感知部に沈着させたチオコリンによる感知部における電荷の変化を、電圧(電位)変化として検出することができる。
前記ナノチューブ状構造体の好ましい態様としては、カーボンナノチューブ、ボロンナイトライドナノチューブ、チタニアナノチューブよりなる群から選ばれる構造体である。
また、感知部が導電性を有しているかぎり、感知部の構成に、上記導電性物質と共に非導電性物質を加えても良い。非導電性物質としては、ポリエステル系樹脂等の不溶性担体等が挙げられる。
例えば、バッチ法では、反応用液の所望の量を一度に供給した後、所望の反応を所定時間行い、反応終了後、反応液を排出するが、本発明方法では、反応用液の供給と反応液の排出とが同時に進行する。なお、本発明方法では、所望工程の全期間に亘って、連続的に前記供給及び排出を同時実施することが一般的であるが、本発明の効果が充分に得られる限り、前記供給及び排出の同時実施を断続的に行う(すなわち、供給及び排出の一時停止を伴う)こともできる。
例えば、図1に示す反応のように、水溶性物質として銀イオンを利用した場合、酵素基質及び銀イオンが酸化還元反応時に消費される。非流動的条件下に比べ、流動的条件下では、新たな酵素基質及び銀イオンが供給されるため、感度が上昇すると推測される。また、析出した銀を銀イオンに再酸化する際、感知部付近に発生した銀イオンを流動的条件下で感知部付近から取り除くことにより、銀の再酸化反応速度を上昇させ、感度を上昇させていると推測される。更に、この2つの反応が同時に起こることにより、相乗的に感度が上昇すると推測される。
1−1.電極部及び感知部の作製
図2に示すパターンからなる電極部を、図3に示すマスクパターンを用いて、スパッタ法とリフトオフ法により作製した。まず、ポリエチレンテレフタレート(PET)からなる絶縁性の基板11上に、金薄膜(膜厚:50nm)を形成した後、一部に銀・塩化銀インク(BAS社製)を塗布することにより、参照極16を作製した。次に、電極部12とリード部13間を仕切るため、絶縁膜17にてリード部の一部を覆うことにより、作用極14、対極15、参照極16を備えた電極部を作製した。作用極、対極、参照極の反対側の端部は、接続用コネクター18として機能する。電極部中の前記作用極は、感知部として機能する。
次に、前記電極部の作用極上に、B型肝炎表面抗原(HBs抗原)に対する抗体である抗HBsモノクローナル抗体(IgG:自社製)を含む水溶液2μLを適下し、37℃、飽和水蒸気圧下で30分間固定化させた。なお、前記抗体水溶液は、0.15mol/L NaClを含む0.1mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)(以下、緩衝液Aと称する)中に抗体濃度が1mg/mLとなるように調製した。その後、25℃、湿度40%の条件下で1時間乾燥させ、更に、真空デシケーター内で室温にて2時間乾燥させた後、1%カゼイン(和光純薬製)含有0.15mol/L NaClを含む0.1mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)中に30分間振とう下、浸漬させて、未反応部をブロッキングし、更に、脱塩水を用いて基板を洗浄後、乾燥した。このようにして、特定物質として抗HBsモノクローナル抗体を作用極(感知部)上に固定化することにより、相互作用反応部かつ不溶性反応部(酸化還元反応部)を作用極上に作製した。
抗HBsウサギポリクローナル抗体(自社製)、ALP(ロシュ社製)、架橋試薬(Succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]-cyclohexane-1-carboxylate:PIERCE社製)を用いて、「高感度酵素免疫測定法(石川栄治:学会出版センター、1993)」記載のマレイミド・ヒンジ法に基づき、ALP標識抗HBsウサギポリクローナル抗体(Fab’)を作製した。得られた酵素標識抗体[ALP標識抗HBsウサギポリクローナル抗体(Fab’)]を緩衝液Aにて所定の濃度に調整した溶液を、ALP標識抗HBs抗体溶液とした。
2mmol/L p−アミノフェニルホスフェート(pAPP:LKT Laboratories社製)、0.125mmol/L AgNO3、0.5mmol/L MgSO4、0.25mmol/L MgCl2、0.075mol/L NaClを含む0.05mol/Lジエタノールアミン溶液(pH9.4)を作製し、銀イオン含有基質溶液とした。
2mmol/L pAPP、0.5mmol/L MgSO4、0.25mmol/L MgCl2、0.075mol/L NaClを含む0.05mol/Lジエタノールアミン溶液(pH9.4)を作製し、pAPP基質溶液とした。
図4〜図7に示すバイオセンサユニットを作製した。図4〜図7に示すように、反応溶液の液入口22、液出口23としてガラス板の2ヶ所に穴(開口部)を開けたウインドー(window)21と、先に作製した抗HBsモノクローナル抗体28が固定化された電極部27を備えた基板26とを用いて、両面テープ(厚み0.64mm:3M社製)を縦長の流路の形状に切り抜くことにより作製したガスケット24を上下から挟むことにより、中空状態の流路25の作製を行い、流路内に電極部を保持させ、バイオセンサユニット31とした。
次に、バイオセンサユニット31の流路入口に、図8に示すように、溶液(試薬)サーバー34〜38、切換バルブ(EV100−105:GLサイエンス社製)32、ポンプ(PERISTALTIC PUMP P-1:旧ファルマシア社製)33をチューブにより接続し、流路出口に廃液サーバー39を接続した。これにより、流路内に試薬サーバーから各溶液(検体、試薬、緩衝液)を所定流速にて入口から出口方向へ流すことができる。
構築したバイオセンサユニット及び流動条件制御装置を用いて、HBs抗原の測定を行った。まず、緩衝液A(試薬サーバー1)を流路に2分間送液した後、バルブを切換えることにより、HBs抗原溶液[HBs抗原(組換え品、サブタイプadw:自社製)を緩衝液Aにて所定濃度に調整した溶液](試薬サーバー2)を流路に30分間送液した。続いて、バルブを切換えることにより、ALP標識抗HBs抗体溶液(2μg/mL)(試薬サーバー3)を流路に30分間送液した後、更にバルブを切換えることにより、銀イオン含有基質溶液(試薬サーバー4)又はpAPP基質溶液(試薬サーバー5)を流路に送液し、4分後にその送液状態を維持したまま、電気化学的測定を行った。
(1)HBs抗原(測定対象化合物)の存在に基づく酸化電流の検出
HBs抗原濃度0U/mLの場合のCV測定結果を図9に、HBs抗原濃度48U/mLの場合のCV測定結果を図10に、それぞれ、示す。なお、流路への送液(すなわち、流動条件)は、全操作工程(2分間の緩衝液Aの送液から電気化学的測定まで)を通して、流速360μL/minで行った。
HBs抗原濃度が48U/mLの場合(図10)、参照極に対して+0.138Vの電位(酸化電位)にて、析出した銀の酸化反応に伴う酸化電流として、5.44μAの酸化電流が検出されたのに対し、HBs抗原濃度が0U/mLの場合(図9)、同様の酸化電流は検出されなかった。
次に、銀イオンの有無による銀の析出の効果を調べた。図11は、銀イオン含有基質溶液の代わりにpAPP基質溶液(すなわち、銀イオン不含)を用いたこと以外は、図10と同じ条件で実施したCV測定結果を示す(HBs抗原濃度48U/mL、流速360μL/min)。
図10及び図11の結果を比較すると、銀イオン含有基質溶液を用いた場合(図10)、参照極に対して+0.138Vの電位(酸化電位)にて、析出した銀の酸化反応に伴う酸化電流として、5.44μAの酸化電流が検出されるのに対し、pAPP基質溶液を用いた場合(図11)、生成物であるp−アミノフェノール(pAP)由来の酸化電流は明白には検出されなかった。このことから、流動的条件下では、生成物として銀等による析出を行うことにより、HBs抗原検出感度が著しく高めることが分かった。
次に、流動条件(流速)の影響効果を調べるため、流速を0、200、360、1260μL/minと変化させたときの、各流速条件における、参照極に対して+0.138Vの電位での酸化電流を調べた。測定は、流速を除き、図8と同じ条件で実施した(HBs抗原濃度48U/mL)。
結果を表1に示す。表1から明らかなとおり、流速0μL/min(非流動的条件)に比べて、流動的条件下で反応性が著しく高くなることが判明した。
次に、HBs抗原測定における定量性を評価するために、HBs抗原濃度を0、24、48U/mLに変化させ、そのときの、参照極に対して+0.138Vの電位での酸化電流を調べた。測定は、HBs抗原濃度を除き、図10と同じ条件で実施した(流速360μL/min)。
結果を図12に示す。図12から明らかなように、酸化電流値がHBs抗原の濃度に依存して増加したことから、定量性があることが確認された。
2−1.電極部及び感知部の作製
実施例1の項目1−1に記載の手順に従って、電極部を作製した。電極部中の作用極は、感知部として機能する。
次に、前記電極部の作用極上に、緩衝液A中に2000U/mLのGOD(ロシュ社)を含む水溶液2μLを適下し、37℃、飽和水蒸気圧下で30分間固定化させた。その後、溶媒を除去するために、25℃、湿度40%の条件下で1時間乾燥させ、更に、真空デシケーター内で室温にて2時間乾燥させた後、1%カゼイン(和光純薬製)含有0.15mol/L NaClを含む0.1mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)中に30分間振とう下、浸漬させて、未反応部をブロッキングし、更に、脱塩水を用いて基板を洗浄後、乾燥した。このようにして、特定物質としてGODを作用極(感知部)上に固定化することにより、相互作用反応部かつ不溶性反応部を作用極上に作製した。
0.25mmol/L AgNO3、1mmol/L MgSO4を含む水溶液(pH9.0)を作製し、銀イオン含有溶液とした。
0.5mmol/L MgCl2、0.15mol/L NaClを含む0.1mol/Lジエタノールアミン溶液(pH9.8)に所定濃度のグルコースを含む水溶液を作製し、グルコース溶液とした。
抗HBsモノクローナル抗体が固定化された電極部に代えて、前記項目2−2記載のGODが固定化された電極部を備えた基板を使用すること以外は、実施例1の項目1−6に記載の手順に従って、流路の作製と流動条件制御装置の構築を行った。
構築したバイオセンサユニット及び流動条件制御装置を用いて、グルコースの測定を行った。まず、緩衝液A(試薬サーバー1)を流路に2分間送液した後、バルブを切換えることにより、銀イオン含有溶液/グルコース溶液の混合溶液(試薬サーバー2)を流路に流速1.26mL/minで送液し、5分後にその送液状態を維持したまま、電気化学測定を行った。なお、前記混合溶液は、バルブ切換え直前に、銀イオン含有溶液と所定濃度に調整されたグルコース溶液とを1:1に混合することにより調製したものを使用した。
(1)グルコース濃度に依存する酸化電流の検出
混合溶液中に含有されるグルコース濃度を0、100、200mg/dLに変化させ、CV測定を実施した。参照極に対して+0.086Vの電位での、析出した銀の酸化反応に伴う酸化電流を図13に示す。また、その結果の内、混合溶液中に含有されるグルコース濃度が0mg/dL(すなわち、グルコース不含)の場合のCV測定結果を図14に、グルコース濃度200mg/dLの場合のCV測定結果を図15に、それぞれ、示す。
次に、流動的条件(流速)の影響や効果を調べるため、流速が0mL/min(静置:非流動条件)で、混合溶液中に含有されるグルコース濃度が0mg/dL及び200mg/dLにおける酸化電流を測定した。参照極に対して−0.15Vと0.4Vとの間で電位を変化させることにより、CV測定を実施した。混合溶液中に含有されるグルコース濃度が0mg/dL(グルコース不含)の場合のCV測定結果を図16に、グルコース濃度200mg/dLの場合のCV測定結果を図17に示す。図16と図17との間には、グルコース濃度が変化したことによる酸化電流の変化は検出されなかった。この結果から、図15に示したように、流動的条件下では、グルコース濃度200mg/dLの場合、酸化電流が検出されたのに対し、流速を0mL/min(静置:非流動条件)の場合(図16及び図17)は、同様の酸化電流は検出されなかったことから、流動的条件下において、銀等による生成物として析出を行うことにより、グルコース測定感度が著しく高められることがわかった。
次に、流動的条件下における銀イオンのグルコースによる非特異的な還元反応の影響を調べるため、作用極にGODが固定化されていない電極を用いたバイオセンサユニットを用いて、前記と同様の条件で、混合溶液中に含有されるグルコース濃度が200mg/dLにおける酸化電流を測定した。CV測定結果を図18に示す。図18から明らかなとおり、本実施例で用いた流速では、銀の非特異的な析出に由来する酸化電流は検出されなかった。
(1)酸化電流に与える流動的条件の影響
(A)不溶性反応(酸化還元反応)によって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させる工程、あるいは、(B)前記感知部に沈殿させた不溶性物質を電気的に分析する工程において、流動的条件で影響や効果を調べた。実施例1において構築したバイオセンサユニット及び流動条件制御装置を用いて、以下の3つの流動的条件における、HBs抗原の測定を行った。
4−1.電極部及び感知部の作製
実施例1の項目1−1に記載の手順に従って、電極部を作製した。電極部中の作用極は、感知部として機能する。
実施例1の項目1−2に記載の手順に従って、相互作用反応部かつ不溶性反応部を作用極上に作製した。
実施例1の項目1−3及び1−4に記載の手順に従って、各試薬溶液を作製した。
(1)ALP標識抗HBsウサギポリクローナル抗体−HBs抗原−抗HBsモノクローナル抗体複合体(ALP標識HBs複合体)固定化電極部の作製
上記項目4−2で作成した抗HBsモノクローナル抗体固定化電極部をHBs抗原溶液[HBs抗原(組換え品、サブタイプadw:自社製)を緩衝液Aにて所定濃度に調整した溶液]中に振とう下、浸漬させて、30分間反応させた後、脱塩水を用いて、電極を洗浄・風乾した。続いて、ALP標識抗HBs抗体溶液(2μg/mL)中に振とう下、浸漬させて、30分間反応させた後、脱塩水を用いて、電極を洗浄・風乾して、ALP標識HBs複合体固定化電極とした。
電極部を保持したイムノクロマトグラフストリップは、以下のように作成した。図22、図23に示すように、ニトロセルロースメンブレン(Hi-Flow 180 Unbacked:MILLIPORE社製)51を5mm×40mmのサイズに切断し、そのニトロセルロースメンブレンの一端(A端)上部に、図24、図25に示したサイズにシリコンラバーシート(厚み:5mm、SR板 SR-50:タイガースポリマー社製)を切り抜いた試薬添加プール52を配置した。また、そのニトロセルロースメンブレンの他の一端(B端)上部に、吸収パット53としてセルロースパット(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS:MILLIPORE社製)を10mm×30mmに切断したものを、そのニトロセルロースメンブレンと10mm重ね合わせて貼付した。続いて、ニトロセルロースメンブレンのB端からA端方向に10mm内側の位置で、メンブレンの下部に、上記項目(1)にて作製したALP標識HBs複合体固定化電極54(電極部55にALP標識HBs複合体56を固定化したもの)を電極部側がニトロセルロースメンブレンと接触するように配置し、電極部保持イムノクロマトグラフストリップの構築を行った。この電極部保持イムノクロマトグラフストリップにより、ニトロセルロースメンブレンによる毛細管現象を利用した自発的流動下での反応を電気的に測定することを可能にした。
HBs抗原濃度を0、18、36U/mLと変化させて作製した各電極部保持イムノクロマトグラフストリップを用いて、HBs抗原の測定を行った。各電極部保持イムノクロマトグラフストリップの試薬添加プールにそれぞれ銀イオン含有基質溶液150μLを添加し、毛細管現象によりこの溶液をB端側に移動させ、6分後にその状態にて電気化学的測定を行った。
(1)HBs抗原の存在に基づく酸化電流の検出
HBs抗原濃度が0、18、36U/mLの場合のCV測定結果を図26〜図28に、それぞれ示した。HBs抗原濃度が0U/mLの場合は、シグナルが検出されず、18U/mLの場合は、参照極に対して+0.132Vの電位での酸化電流値は4.27μAであり、36U/mLの場合は、参照極に対して+0.124Vの電位での酸化電流値は11.2μAであった。更に、参照極に対して+0.132Vの電位での酸化電流の測定結果を図29に示す。図29から明らかなように、酸化電流値がHBs抗原の濃度に依存して増加したことから、定量的に測定可能であることが確認された。
5−1.電極部及び感知部の作製
図2に示すパターンからなる電極部を、図3に示すステンレス鋼製マスクパターンを用いて、印刷法より作製した。まず、ポリエチレンテレフタレート(PET)からなる絶縁性の基板11上に、導電性カーボンペースト(アサヒ化学研究所FTU−20)にて電極構造を印刷形成した後、一部に銀・塩化銀インク(BAS社製)を塗布し、120℃にて10分間加熱することすることにより、電極部12および参照極16を作製した(以下、カーボン電極と称することがある)。作用極、対極、参照極の反対側の端部は、接続用コネクター18として機能する。電極部中の前記作用極は、感知部として機能する。
実施例1−2に記載の手順に従い、相互作用反応部および不溶性反応部を作製した。
実施例1−3記載の手順に従い、アルカリホスファターゼ(ALP)標識抗HBsウサギポリクローナル抗体(Fab’)溶液を作製した。
2mmol/L p−アミノフェニルホスフェート(pAPP:Universal sensors社製)、0.125mmol/L AgNO3、1mmol/L MgSO4を含む0.04mol/Lジエタノールアミン溶液(pH9.4)を作製し、銀イオン含有基質溶液とした。
1mmol/L MgSO4を含む0.04mol/Lジエタノールアミン溶液(pH9.4)を作製し、洗浄液とした。
図30に示すように電極部を保持したキャピラリーフローユニットを作製した。
図30に示すようにカーボン電極を形成したPET基板11上に、平行に配置した両面テープ62(3M社製 ScotchST416)によりPET基板63を貼り付けて流路を作製した。さらに流路の一端(A)に形成した開口部64a上に、図31及び図32に示す構造のシリコンラバーシート(厚み5mm、SR板:SR-50:タイガースポリマー社製)製の試薬添加プール64を配置した。また、他の一端(B)には吸収パット65として、セルロースパット(CELLULOSE FIBER SAMPLE PADS:MILLIPORE社製)を10mmx150mmに切断したものを、流路開口部と密着するように配置し、カーボン電極部保持キャピラリー流路の構築を行った。
構築したカーボン電極部保持キャピラリー流路を用いてHBs抗原の測定を行った。抗原溶液49.17μL[HBs抗原をヒト血清で所定濃度に調整した溶液]にALP標識抗HBs抗体溶液(120μg/mL)0.83μLを添加してA端側(試薬添加プール側)より流路に注入した。続いて洗浄液750μLを試薬添加プールに添加し、毛細管現象によりB端側に移動させた。洗浄液の全量が試薬プールから流路に流入した時点で銀イオン含有基質溶液500μLを試薬プールに添加し、毛細管現象によりB端側に移動させ、2分後にその状態にて電気化学的測定を行った。
(1)HBs抗原の存在に基づく酸化電流の検出
HBs抗原濃度が0、0.25、2.5U/mLの場合のDPV測定結果を図33〜図35に、それぞれ示した。参照極に対して+0.165Vの電位での酸化電流値は、HBs抗原濃度が0U/mLの場合は13.74nAであり、0.25U/mLの場合は38.10nAであり、2.5U/mLの場合は218.5nAであった。またグラフ(図36)から明らかなように、酸化電流値がHBs抗原の濃度の濃度に依存して増加したことから、定量的に測定可能であることが確認された。
6−1.電極部及び感知部の作製
実施例5の項目5−1に記載の手順に従って、電極部を作製した。電極部中の作用極は、感知部として機能する。
実施例1の項目1−2に記載の手順に従って、相互作用反応部かつ不溶性反応部を作用極上に作製した。
実施例1の項目1−3の記載に従って、試薬溶液を作製した。
2mmol/L p−アミノフェニルホスフェート(pAPP:Universal Sensors社製)、0.125mmol/L AgNO3、1mmol/L MgSO4、0.04mol/Lジエタノールアミン、および所定濃度(0、0.5、1、2mmol/L)のNaClを含む溶液(pH9.4)を作製し、銀イオン含有基質溶液とした。
実施例5の項目5−5に記載の手順に従い洗浄液を作製した。
実施例5の項目5−6に記載の手順に従って、カーボン電極部保持キャピラリー流路の構築を行った。
構築したカーボン電極部保持キャピラリー流路を用いてHBs抗原の測定を行った。抗原溶液49.17μL[HBs抗原を0.1%BSA含有0.1mol/Lリン酸緩衝液で所定濃度に調整した溶液]にALP標識抗HBs抗体溶液(120μg/mL)0.83μLを添加してA端側(試薬添加プール側)より流路に注入した。続いて洗浄液750μLを試薬添加プールに添加し、毛細管現象によりB端側に移動させた。洗浄液の全量が試薬プールから流路に流入した時点で銀イオン含有基質溶液500μLを試薬プールに添加し、毛細管現象によりB端側に移動させ、2分後にその状態にて電気化学的測定を行った。電気化学的測定は、実施例5の項目5−7に記載の手順・条件に従って行った。
HBs抗原濃度0U/mLの場合のDPV測定結果を図37〜図40に、HBs抗原濃度45U/mLの場合のDPV測定結果を図41〜図44に示す。
HBs抗原濃度45U/mLにおいてNaCl濃度を0mmol/L(図41)、0.5mmol/L(図42)、1mmol/L(図43)、2mmol/L(図44)として測定を行った場合、それぞれ参照極に対して+0.050V、−0.015V、+0.036V、+0.026Vの電位の酸化電流値は、0.5mmol/Lにおいて最も高く(1842nA)なった。一方、HBs抗原濃度0U/mLにおいては、NaCl濃度を0mmol/L(図37)、0.5mmol/L(図38)、1mmol/L(図39)、2mmol/L(図40)として測定を行った場合、それぞれ参照極に対して+0.030Vにて151.8nA、+0.055Vにて286.2nA、+0.010Vにて699.4nA、+0.020Vにて466.9nAであった。適当量のNaCl添加により、反応性が向上することが分かった。
7−1.電極部及び感知部の作製
図45〜図47に示す四角錐型の立体構造が多数形成された電極部を、ポリ乳酸基板に作製し(以下、立体構造基板)、電極部および感知部を図3に示すマスクパターンを用いて、スパッタ法とリフトオフ法により作製した。四角錐型の立体構造および立体構造基板は、電鋳法により作製した。図46及び図47に示す顕微鏡写真より、立体構造の大きさはおよそ、底面が135μmX135μmの正方形、高さが300μm、密度が12.3本/mm2で規則的に配置されているのがわかった。
実施例1の項目1−2に記載の手順に従って、相互作用反応部かつ不溶性反応部を作用極上に作製した。
実施例1の項目1−3の記載に従って、試薬溶液を作製した。
2mmol/L p−アミノフェニルホスフェート(pAPP:Universal sensors社製)、0.0625mmol/L AgNO3、1mmol/L MgSO4を含む0.04mol/Lジエタノールアミン溶液(pH9.4)を作製し、銀イオン含有基質溶液とした
実施例1の項目1−6に記載の手順に従って、流路の作製および流動条件制御装置の構築を行った。
実施例1の項目1−7に記載の手順に従って、上記で作製した立体構造化電極を用いて、HBs抗原の測定を行った。なお、実施例1で作製した立体構造を有しない電極(平面電極と称することがある)を比較対照として使用した。ただし、電気化学的測定は、実施例5の項目5−7に記載の手順・条件に従って行った。
(1)HBs抗原(測定対象化合物)の存在に基づく酸化電流の検出
HBs抗原濃度0U/mLの場合の立体構造化電極でのDPV測定結果を図48に、HBs抗原濃度0.7U/mLの場合のDPV測定結果を図49に、それぞれ示す。また対照実験として、立体構造を有しない電極(平面電極)でのHBs抗原濃度0U/mLの場合のDPV測定結果を図50に、HBs抗原濃度0.7U/mLの場合のDPV測定結果を図51に、それぞれ示す。なお、流路への送液(すなわち、流動条件)は、全操作工程(2分間の緩衝液Aの送液から電気化学的測定まで)を通して、流速360μL/minで行った。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
Claims (17)
- (a)少なくとも、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーとを反応させ、被検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、不溶化反応を実施することによって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させる工程、
(b)前記感知部に沈殿させた不溶性物質を電気的に分析する工程
を含み、
前記工程(a)又は工程(b)の少なくとも1つの工程を流動的条件下で実施する
ことを特徴とする、分析方法であって、
前記可溶性物質が
(A)水性溶媒において水溶性であり、不溶化反応により金属として析出する金属イオン、あるいは、
(B)シッフ試薬、アニリン、5−ブロモ−4クロロ−3−ヒドロキシインドール、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド、インドール、5−ブロモ−4クロロ−3−インドリルホスフェート)、3−インドキシルホスフェートから選択される水溶性色素
である、前記分析方法。 - 前記特異的パートナーが酵素である、請求項1に記載の分析方法。
- 前記工程(a)が、
(1)披検試料中の分析対象物質の存在量に相関させて、分析対象物質と、前記分析対象物質と選択的相互作用を示す特異的パートナーと、標識物質とを含む複合体を形成させる工程、及び
(2)形成された前記複合体に含まれる標識物質により直接的又は間接的に引き起こされる不溶化反応によって、可溶性物質を不溶性物質に変換し、感知部に沈殿させる工程
を含み、
前記工程(2)又は工程(b)の少なくとも1つの工程を流動的条件下で実施する、請求項1に記載の分析方法。 - 前記標識物質が加水分解酵素である、請求項3に記載の分析方法。
- 前記加水分解酵素がアルカリフォスファターゼである、請求項4に記載の分析方法。
- 前記不溶化反応が酸化還元反応である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記可溶性物質が金属イオンである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記金属イオンが、アンチモンイオン、ビスマスイオン、銅イオン、水銀イオン、銀イオン、パラジウムイオン、白金イオン、又は金イオンである、請求項7に記載の分析方法。
- 前記金属イオンが銀イオンである、請求項8に記載の分析方法。
- 前記感知部が、金属、高分子、カーボン、ナノチューブ状構造体、グラファイト、無機物質を単独もしくは組み合わせで構成される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記感知部が少なくとも一つ以上の鋭角状の立体構造を有する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記感知部に前記特異的パートナーが固定されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記流動的条件が、強制的流動もしくは自発的流動である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の分析方法。
- 前記電気的に分析する工程を含む分析方法が、アンペロメトリック型分析法である、請求項1〜13に記載の分析方法。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の分析方法に用いる感知部であって、少なくとも一つ以上の鋭角状の立体構造を有する感知部。
- 請求項1〜14のいずれか一項に記載の分析方法に用いることを特徴とする、分析対象物を測定するための試薬及びキットであって、前記分析対象物と選択的相互作用を示す特異的パートナー、及び、不溶化反応により不溶性物質に変換される可溶性物質、少なくとも一つの感知部を含む試薬及びキット。
- 前記感知部を、感知部を有する分析用カートリッジとして含む、請求項16に記載の試薬及びキット。
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