JP2000097899A

JP2000097899A - 微少量オンラインバイオセンサー及びその製造方法

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Publication number: JP2000097899A
Application number: JP10269363A
Authority: JP
Inventors: Riyouji Kurita; 僚二栗田; Hisao Tabei; 久男田部井; Osamu Niwa; 修丹羽; Tsutomu Horiuchi; 勉堀内; Keiichi Torimitsu; 慶一鳥光; Masao Morita; 雅夫森田
Original assignee: NTT Advanced Technology Corp; Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: NTT Advanced Technology Corp; Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 1998-09-24
Filing date: 1998-09-24
Publication date: 2000-04-07
Anticipated expiration: 2018-09-24
Also published as: JP3515908B2

Abstract

(57)【要約】【課題】生体試料の微少量の物質を測定する場合、セ
ンサーにとって妨害物質を高効率に、短時間で除去でき
るようにすること、酵素反応を利用したセンサーで
は、酵素活性にセンサー感度が依存されるため、酵素反
応を高効率で反応させること、微小流路内で、複数溶
液が効率よく撹拌されるようにすること、を課題とす
る。【解決手段】本発明の微小量オンラインバイオセンサー
は、薄層電気化学セルの流路内において、作用電極の上
流に多数の微小突起を作製し、微小突起の表面を導電性
の材料もしくは特定物質と反応する触媒機能を有する酵
素等の生体物質で修飾したものである。作用電極の前
で、電極もしくはリアクタを微小突起構造にすることに
より、平坦な構造と比較し表面積が増加し、妨害物質を
電気化学的に高効率、短時間に分解、除去でき、また、
微小突起構造に固定した酵素と高効率に反応させること
が出来る。また、複数溶液の混合では溶液の撹拌が高効
率に、短時間に行われる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、培養細胞や生体内
の微小部分から微量の試料を採取し、それを連続的に定
量分析するための微少量オンラインバイオセンサーに関
する。

【０００２】

【従来の技術】神経科学や分子生物学などの研究におい
て、生体内の微小領域に含まれる生理活性物質をリアル
タイムで計測しようという試みが数多くなされている。
その中で電気化学的な分析法は、（１）微少量の計測に
適している。（２）感度が比較的高い。（３）選択的な
膜や酵素などで電極を修飾することにより、高選択的な
測定が可能である。（４）簡便で低価格のセンサーを作
製することができるなどの特徴を有している。生体を生
かしたままで直接、電気化学的に生理活性物質を測定す
る試みとしては、炭素繊維電極などの微小電極を直接生
体内の特定領域に挿入して、その場計測を行うか、また
はマイクロダイヤリシスプローブと呼ばれる透析膜で覆
った１〜５ｍｍ程度の微小な二重管を生体中に挿入し、
ポンプにより透析液を送って、生体に含まれる生理活性
物質を膜を介してサンプリングし、オンラインで電気化
学センサーに送り込むことにより生体物質を計測してい
る。センサーに生体試料内の目的物質と選択的に反応し
電気化学的に活性な物質を生成する酵素膜などを修飾し
た電極を用いることにより、グルコース、ラクトースな
どの糖類、乳酸、グルタミン酸などの神経伝達物質がリ
アルタイムで計測されている。

【０００３】一方、培養細胞などの系では細胞一個から
放出される生理活性物質の計測など、超微少量の試料の
測定が要求されている。微小電極法では直径数μｍの炭
素繊維電極が容易に利用できるために、カテコールアミ
ンなど電極で直接電気化学反応して計測できる神経伝達
物質などでは単一細胞レベルの計測が行われている。こ
のことは、例えば、Ｔ．Ｊ．Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｊ．
Ａ．Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｋ．Ｔ．Ｋａｗａｇｏｅ，
Ｒ．Ｍ．Ｗｉｇｈｔｍａｎ，Ｃ．Ｌｅｆｒｏｕａｎｄ
Ｃ．Ａｍａｔｏｒｅ，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，６４巻，３０７７−３０８３頁，１９９２
年に記載されている。

【０００４】また、走査型電気化学顕微鏡を利用してマ
イクロメータオーダーの微小領域での酵素反応や免疫反
応の検出が試みられている。このことは、例えばＨ．Ｓ
ｈｉｋｕ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｅ，Ｉ．Ｕｃｈｉｄａ，Ａｎ
ａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６８巻，１２
７６−７８頁，１９９６年に記載されている。更に、前
述したオンライン型のセンサーにおいても微小なガラス
キャピラリあるいはマイクロダイヤリシスプローブと酵
素修飾電極をセットした微少容量のフローセルを組み合
わせたセンサーが作製されている。また、更に微少量の
オンラインセンサーの作製法として、シリコンやガラス
基板上に、マイクロマシン技術、例えば異方性エッチン
グやドライエッチング法を用いて溝を作製し、薄膜電極
を有する他の基板と融着して流路を形成した後、内部に
酵素を固定化した微少容量のセンサーが報告されてい
る。このことは、例えば、Ｙ．Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．
Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｅ．Ｔａｍ
ｉｙａａｎｄＩ．Ｋａｒｕｂｅ，Ａｎａｌｙｔｉｃ
ａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５巻，２７３１−２７３
５頁，１９９３年に記載されている。この様なマイクロ
マシン技術を用いて作製したセンサーでは速い応答性や
微少量での高感度測定が期待できる。このことは、例え
ば、丹羽、堀内、鳥光、化学センサー研究会予稿、１３
巻、７３−７６頁，１９９７年に記載されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】生体試料の微少量の物
質を測定する場合、ファイバー型の微小電極では、単一
細胞レベルのサイズまで容易に微小化でき、電気化学反
応を容易に起こす化合物については、極めて微少量まで
検出することができる。しかしながら、電気化学反応を
起こさず、酵素反応と電極反応を組み合わせて測定を行
う系では微小電極上に固定化できる酵素量が少なく、利
用する酵素によっては長期安定性に劣る。また、共存物
質が存在する系では、その影響をすべて電極上で除く必
要があるため、高い選択性を得るのが困難であるなどの
欠点を有している。また、酵素反応に補酵素などの物質
が必要な場合、測定を行う培養系にその物質を加える必
要があり、その生体試料への影響を常に考慮する必要が
あった。

【０００６】一方、オンライン型のセンサーでは、高い
感度が得られ、酵素を厚く修飾することも可能なため
に、安定で長時間の測定が可能である。また、ファイバ
ー型センサーで困難であった補酵素などの添加も流路を
複数設置し、検出器の上流で合流させることにより容易
に行うことができる。

【０００７】オンライン型のセンサーでは、流路中の検
出の為の電極の上流側に、測定の際に影響のある生体試
料内の妨害分子を選択的に除くため、電気化学的に活性
な妨害物質では前電解用電極を、又酵素反応を起こす妨
害物質については酵素を固定化したビーズをプレカラム
に充填し、上流に配置することにより選択性を向上させ
ている。しかしながら、前電解用の電極やプレカラムを
配置すると、センサーの内容積が増加し、応答性が低下
する。一方、マイクロマシン技術を用いて作製したオン
ラインセンサーでは、応答性は通常のオンラインセンサ
ーに比較すれば速い応答を示すものの、高い選択性を得
るためには（１）前電解を行う場合、電極をある程度大
きくしないと妨害物質を１００％除くことができない、
（２）妨害物質を除くための酵素固定化ビーズをマイク
ロセンサーの微小流路内に固定するのが難しいなどの問
題があった。

【０００８】一方、選択性を向上させるのではなく、生
体試料内の目的物質をプレカラムで反応させ、生成物を
電気化学的に検出する場合においても、プレカラム中で
目的物質を高い反応効率で反応させる必要があるため
に、容量が増加し、その結果センサーの応答性が低下す
るという問題があった。

【０００９】

【課題を解決するための手段】このような問題を解決す
るために本発明による微小量オンラインバイオセンサー
は、二つの微小流路が形成された絶縁性の第１の基板
と、内部に作用電極、参照電極、対向電極とこれら３電
極上を生体試料が流れる流路とを有する薄層電気化学セ
ルが形成された第２の基板とを、該二つの微小流路と該
流路とが連続するように貼合せた構造を有し、該流路に
おいて、該作用電極の上流部分に多数の微小突起が形成
されていることを特徴とする。また、該多数の微小突起
の表面が導電性の材料で修飾され、あるいは特定物質と
反応する酵素等の生体物質で修飾されていることを特徴
とし、この微小突起部分にて生体試料内の妨害物質を電
気化学的あるいは酵素反応を利用して除去したり、生体
試料内の目的物質の反応効率を高めたりする。

【００１０】また、このような問題を解決するために本
発明によるオンラインバイオセンサーの製造方法は、例
えば、二つの微小流路を絶縁性の第１の基板に形成し、
該第１の基板にサンプリング用のキャピラリ、或いはマ
イクロダイヤリシスプローブを接続し、第２の基板にフ
ォトリソグラフィ法により導電体薄膜からなる作用電
極、参照電極、対向電極を形成した後、再びフォトリソ
グラフィ法により薄層電気化学セルの流路と多数の微小
突起とを、生体試料が該多数の微小突起、該作用電極、
該参照電極、該対向電極上を流れるように、かつ該作用
電極の上流部分に該多数の微小突起が配置されるように
形成し、該多数の微小突起を導電性の材料、或いは特定
物質と反応する酵素等の生体物質により修飾した後、該
第１の基板と該第２の基板とを該二つの微小流路と該流
路とが連続するように貼合せることを特徴とする

【００１１】

【発明の実施の形態】以下、図面を参照して本発明の実
施例を詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例の
みに限定されるものではない。

【００１２】

【実施例１】図１に本発明の微小量オンラインバイオセ
ンサー（以下、「センサー」と略す。）を上面から見た
構成を示す。センサーは、マイクロマシン技術で二つの
微小流路２が形成された第一の基板１（図１ａ）と、酵
素などが修飾された作用電極４、参照電極５、対向電極
６と、これら３電極４，５，６の上流に表面が導電性の
材料で修飾された多数の微小突起１６からなる微小突起
構造電極３とが形成され、さらに、これら３電極４，
５，６と微小突起構造電極３上に流路７が形成された第
２の基板１３（図１ｂ）とを貼合せた構造を有してい
る。このとき、微小流路２と流路７とが連続するように
貼合せられる。また、微小突起構造電極３、作用電極
４、参照電極５、対向電極６と流路７とで薄層電気化学
セルが構成される。

【００１３】微小突起構造電極３、作用電極４、参照電
極５、対向電極６のパッド８，９，１０，１１はそれぞ
れポテンシオスタットの端子部分と接続する。微小流路
２には、それぞれサンプリングに用いるキャピラリーや
マイクロダイヤリシス（ＭＤ）プローブ、或いはシリン
ジと接続する為のキャピラリーを容易に取り付けること
ができる。

【００１４】多数の微小突起１６の表面には導電性の材
料が修飾されている。生体試料内の目的物質と同時にセ
ンサーの薄層電気化学セルに注入された生体試料内の妨
害物質が電気化学的に活性な物質では、多数の微小突起
１６の表面が導電性のため、電位を印加すると、微小突
起構造電極３上で反応させて妨害物質を除去することが
できる。微小突起構造電極３は多数の円柱状突起からな
るため、通常のフラットな薄膜電極に比較し、表面積が
大きく反応率が向上する。その結果、電気化学反応を非
常に短い時間で完結させることができ、流路７を短縮し
て応答性の向上を計ることができるという特徴を有す
る。

【００１５】

【実施例２】本実施例では、実施例１の微小突起構造電
極に代えて、多数の微小突起の表面が酵素等の生体物質
で修飾されたセンサーの例を示す。センサーはマイクロ
マシン技術で微小流路２が形成された第一の基板１（図
１ａ）と、酵素などが修飾された作用電極４、参照電極
５、対向電極６とこれら３電極４，５，６の上流に表面
が酵素等の生体物質で修飾された多数の微小突起構造リ
アクタ１２とが形成され、さらに、これら３電極４，
５，６と多数の微小突起構造リアクタ１２上に流路７が
形成された第２の基板１３（図１ｂ）とを貼合せた構造
を有している。このとき、微小流路２と流路７とが連続
するように貼合せられる。また、微小突起構造リアクタ
１２、作用電極４、参照電極５、対向電極６と流路７と
で薄層電気化学セルが構成される。また、酵素等の生体
物質は特定物質と反応する触媒機能を有する。

【００１６】マイクロマシン技術で作製したオンライン
センサーでは、酵素などの生体物質を固定化したビーズ
を微小流路内に入れるのは非常に困難である。しかる
に、多数の微小突起１６上に酵素を固定すると、多数の
酵素固定化突起が、薄層流路中に酵素固定化ビーズを入
れた場合と同様な挙動を示し、基質を高い反応効率で酵
素反応させることができる。固定化した酵素が生体試料
内の目的物質と反応する場合は高い感度が、共存する生
体試料内の妨害物質と反応する場合は高い反応率のため
に目的物質を選択的に検出できる。また、二つの溶液を
合流させる場合でも、微小突起構造リアクタ１２を有す
る薄層電気化学セル内では二つの溶液が良く撹拌され、
混合が短時間で終るため、高い感度を実現できる。

【００１７】この様に多数の微小突起１６を有する薄層
電気化学セルを酵素反応器として利用することにより、
高感度、高選択性のセンサーを実現することができると
いう特徴を有する。また、微小突起間の間隙は、常に一
定であるため、流路に長時間圧力が印加されても、ビー
ズのように移動せず、めづまりがおこらないという利点
を有する。

【００１８】

【実施例３】図２に、本発明による微小突起構造電極を
有するセンサーの製造工程の一実施例を示す。石英ウエ
ハ１３（図２ａ）上にＴＨＢ−５１６−Ｌポジ型フォト
レジスト１４をスピナーにより、毎分４０００回転で塗
布した（図２ｂ）。その後、フォトマスクをウエハ１３
に重ね、マスクアライナーＰＬＡ−５０１を用いて、微
小突起構造電極３すなわち前電解用電極として用いる多
数の微小突起１６部分及び流路７の溝１５となる部分
（多数の微小突起１６部分を除く）のパタンを露光し
た。露光時間は１５秒とした。露光後、ウエハをアルカ
リ現像液中で３０秒間現像し、水洗、乾燥を行った（図
２ｃ）。現像後のウエハでは、多数の微小突起１６の周
辺の凹部及び流路の溝１５となる部分が露出している。
このレジスト１４付き基板１３をフッ酸緩衝液中におい
て２０分間ウエットエッチングを行い、多数の微小突起
１６の凹凸と流路の溝１５を作製した（図２ｄ）。これ
らの微小突起１６の高さは２０μｍ、直径は２０μｍで
あった。残ったレジスト１４をプラズマアッシャにて除
去した（図２ｅ）後、ポジ型フォトレジスト１７をスピ
ンコートし（図２ｆ）、その後、フォトマスクをウエハ
１３に重ね、マスクアライナーを用いて、微小突起構造
電極３部分及び作用電極４、参照電極５、対向電極６の
３電極部分を露光、アルカリ現像を行った（図２ｇ）。
その後、マグネトロンスパッタ装置にこのレジストパタ
ンを持つウエハ１３を取り付け、チタン、金１８を順に
スパッタした（図２ｈ）後、メチルエチルケトン中に浸
漬して超音波によりレジスト１７を除去し、微小突起構
造電極３と作用電極４、参照電極５、対向電極６を作製
した（図２ｉ）。なお、センサーの薄層電気化学セルの
流路７は流路の溝１５（多数の微小突起１６部分を除
く）と微小突起構造電極３を合わせた範囲に形成され
る。

【００１９】微小突起構造電極３及び３電極４，５，６
を有する基板１３の構成を図３に示す。金１８は左から
微小突起構造電極３、作用電極４、参照電極５、対向電
極６用薄膜となり、作用電極４上には西洋わさびペルオ
キシターゼ（ＨＲＰ）を含むオスミウムーポリビニルピ
リジン錯体（Ｏｓ−ｇｅｌ）２０を下層に、グルタミン
酸酸化酵素をコラーゲンと混合した膜２１を上層に修飾
した。又、参照電極５上には参照物質として、銀１９を
メッキした（図２ｊ）。薄層電気化学セルの流路７は微
小突起構造電極３、作用電極４、参照電極５、対向電極
６を覆う範囲に形成されている。

【００２０】図１０はガラスキャピラリーを接続した第
１の基板（ふた用基板）の製造工程を示す。ガラス基板
１をダイシングソーを用いて幅１２ｍｍ、長さ２７ｍｍ
に切断した（図１０ａ）。さらに、サンプリング及びア
ウトレット用のキャピラリーを接続するため、長い辺と
平行にダイシングソーにより幅０．４ｍｍ、深さ０．４
ｍｍ、長さ７ｍｍの微小流路２用の溝を両端から作製し
た（図１０ｂ）。サンプリング用の溝に、外径３７５μ
ｍ、内径７５μｍのサンプリング用キャピラリー２２
を、アウトレット用の溝には、外径３７５μｍ、内径１
５０μｍのシリンジ接続用キャピラリー２３を接続し、
瞬間接着剤により固定した（図１０ｃ）。

【００２１】図２ａから図２ｊの工程で作製した、微小
突起構造電極３と３電極４，５，６と流路７とを有する
第２の基板１３と、キャピラリー２２、２３を接続した
微小流路２を有する第１の基板１を二つの微小流路２と
流路７とが向かい合うように、かつ連続するように、押
し当て位置合わせをした後、常温で、光硬化性の接着剤
を周りから浸込ませた。接着剤が流路７の直前までしみ
こんだとき、高圧水銀ランプを用いて光を照射し、両基
板１，１３を接着した（図２ｋ）。従来はかなりの高温
にして貼り合わせることが多かったため、酵素等は活性
が失われてしまい、応用できなかったのが、常温で貼り
合わせることが可能となり、酵素の活性を失わせずにセ
ンサーを作製できるようになった。なお、光硬化性接着
剤の代わりに、ポリマー薄膜を溶媒蒸気で溶解させたも
の、或いは低融点ガラス薄膜を用いて貼合せることもで
きる。

【００２２】図４に、作製したセンサーをシリンジに接
続した測定系の構成を示す。又、ポテンシオスタット２
４（ＬＣ４Ｃ）の端子はそれぞれ、薄層電気化学セルの
微小突起構造電極３、作用電極４、参照電極５、対向電
極６の各パッド８，９，１０，１１に接続した。まず、
最初にシリンジ２５を用いてサンプリング用キャピラリ
ー２２から溶液を、流速４μｌ／ｍｉｎで吸引しなが
ら、微小突起構造電極３と作用電極４に０ｍＶの電位を
印加して測定を行った。

【００２３】図５は、１００μＭアスコルビン酸に対す
る応答を示す。縦軸は、時間を、横軸は電流値を示す。
リン酸緩衝溶液によって、ベースラインを得た後、アス
コルビン酸溶液に切り替えることにより、急激に酸化電
流が増加し、センサーは３００ｎＡの定常電流を示し
た。再び、リン酸緩衝溶液をセンサーの薄層電気化学セ
ルへ導入することにより再びベースラインに戻った。次
に、多数の微小突起構造電極３に５００ｍＶの電圧を印
加した後、１００μＭアスコルビン酸をセンサーの薄層
電気化学セルへ導入したが、アスコルビン酸による酸化
電流は確認されなかった。これは、微小突起構造電極３
部分で、アスコルビン酸がすべて酸化されたことによ
る。

【００２４】更に、図２と同様な工程を用いて、電極の
見かけ上の面積は等しいが、微小突起をもたないセンサ
ーを作製し、応答を比較した。前電解用の薄膜電極に５
００ｍＶ、作用電極に０ｍＶの電位を印加して測定を行
うと、前電解を行っているのに関わらず２０ｎＡの酸化
電流が観測され、アスコルビン酸の影響を完全に除去す
る為に、微小突起構造電極３が極めて有効であることが
示された。また、１０μＭのグルタミン酸と１００μＭ
のアスコルビン酸を含むＰＢＳ溶液を流すと微小突起構
造電極を用いない場合、２５５ｎＡの酸化電流が流れ、
グルタミン酸の応答がアスコルビン酸により妨害され
た。一方、微小突起構造電極３を用いると、９．５ｎＡ
の還元電流が得られ、アスコルビン酸の影響を受けずに
グルタミン酸のみを定量できることが分かった。

【００２５】

【実施例４】実施例３と同様な方法により微小流路２を
有する第１の基板１、及び微小突起構造リアクタ１２及
び金薄膜の３電極４，５，６を有する第２の基板１３を
作製した。ただし、微小突起構造リアクタ１２上には金
をスパッタしなかった。また微小流路２を有する第１の
基板１には実施例３と同様にキャピラリー２２，２３を
接続した。微小突起構造リアクタ１２および金薄膜の３
電極４，５，６上に酵素や銀を次のように修飾した。す
なわち、図２ｊの工程代わりに、微小突起構造リアクタ
１２にはグルタミン酸酸化酵素を固定化した。固定化方
法は、まず微小突起構造リアクタ１２部分を１ｍＭメル
カプトウンデシル酸エタノール溶液に１０分間浸した
後、０．１％グルタルアルデヒド水溶液に５分間浸し
た。その後、水で洗浄後、０．１％グルタミン酸酸化酵
素水溶液に浸し、冷蔵庫内（５℃）で２０時間放置する
ことにより、酵素を固定した。また作用電極４上には、
ＨＲＰを含むポリビニルピリジンオスミウム錯体膜を１
μｌをキャスト、乾燥させ、参照電極５上には銀をメッ
キした。

【００２６】測定は、作用電極４、参照電極５、対向電
極６の各パッド９，１０，１１をポテンシオスタット２
４の端子に接続し、シリンジ２５を用いてサンプリング
用キャピラリー２２から溶液を吸引しながら、作用電極
４に０ｍＶの電圧を印加して行った。流速４μｌ／ｍｉ
ｎでシリンジ２５を用いてリン酸緩衝生理食塩水をセン
サーの薄層電気化学セルへ連続的に導入する。こうして
ベースラインを得た後、リン酸緩衝生理食塩水から、１
０μＭのグルタミン酸溶液をセンサーの薄層電気化学セ
ルへ導入することにより、還元電流が流れ始め、１０秒
後には１０ｎＡ／μＭの還元電流と高い感度を得ること
が出来た。しかしながら、同一容積で微小突起のない酵
素リアクタを使用し、同様の測定を行った際には２ｎＡ
／μＭ程度の還元電流しか得ることが出来なかった。こ
れは、多数の円柱状微小突起１６を作製したことによ
り、通常のフラットな薄膜電極に比較し、表面積が大き
く反応性が増加したことによる。

【００２７】

【実施例５】実施例３と同様な方法により微小流路２を
有する第１の基板１、及び微小突起構造電極３及び金薄
膜の３電極４，５，６を有する第２の基板１３を作製し
た。また微小流路２を有する第１の基板１には実施例３
と同様にキャピラリー２２，２３を接続した。微小突起
構造電極３に、実施例４と同様に酵素を固定化した。酵
素はコリンオキシデースとカタラーゼを混合したものを
用いた。作用電極４には、下層にＨＲＰを含むポリビニ
ルピリジンオスミウム錯体を、上層にはアセチルコリン
エステラーゼとコリンオキシデースを同様に固定した。

【００２８】1μＭアセチルコリン溶液をセンサーの薄
層電気化学セルに、流速４μｌ／ｍｉｎで導入すると還
元電流が流れ、５ｎＡ／μＭの感度が得られた。しかし
ながら、１０μＭのコリン溶液を導入しても、応答は全
く得られなかった。これは、微小突起構造電極３のコリ
ンオキシデースによりコリンが酸化され、発生した過酸
化水素はカタラーゼにより分解されるためである。これ
に対し、アセチルコリンは微小突起構造電極３では反応
せず、作用電極４上のアセチルコリンエステラーゼによ
り、コリンになり、さらにコリンオキシデースにより酸
化され還元電流が得られる。又、アセチルコリンとコリ
ンを同時にセンサーの薄層電気化学セルに導入しても、
アセチルコリンのみを導入した際と、大きな差は見られ
なかった。センサーが微小突起構造電極３部分を有する
ため、コリンが微小突起構造電極３で効率よく反応し、
アセチルコリンのみが作用電極４に到達するので、高い
選択性を得ることが出来る。しかしながら、同一容積で
微小突起のない酵素リアクタを使用した際には５ｎＡ／
μＭ程度の還元電流が確認された。これは、多数の円柱
状微小突起１６を作製したことにより、通常のフラット
な薄膜電極に比較し、表面積が大きく反応性が増加し、
微小突起構造電極３でのコリンの除去能力が大きく向上
したことによる。

【００２９】

【実施例６】実施例３と同様な方法により微小流路２を
有する第１の基板１、及び微小突起構造電極３及び金薄
膜の３電極４，５，６を有する第２の基板１３を作製し
た。また微小流路２を有する第１の基板１には、実施例
３と同様にキャピラリー２２，２３を接続した。図６に
示すように微小突起構造電極３にコリンオキシデースと
ＨＲＰを含むポリビニルピリジンオスミウム錯体２７を
固定した。さらに、実施例３と同様に作用電極４上に、
上層にアセチルコリンエステラーゼとコリンオキシデー
ス、下層にＨＲＰを含むポリビニルピリジンオスミウム
錯体２６を固定した。

【００３０】微小突起構造電極３のパッド８、及び作用
電極４のパッド９をそれぞれポテンシオスタット２４の
第１、第２電極端子につなぎ、参照電極パッド１０、対
向電極パッド１１もそれぞれポテンシオスタット２４の
端子につなぎ、微小突起構造電極３、作用電極４ともに
０ｍＶの電圧を印加した。１０μＭコリン溶液を流速４
μｌ／ｍｉｎでセンサーの薄層電気化学セルに導入する
ことにより、微小突起構造電極３のみで還元電流を確認
することが出来た。また、１μＭアセチルコリンを導入
することにより、作用電極４のみで還元電流を確認でき
た。さらに、コリン、アセチルコリン溶液を同時に導入
すると、それぞれの還元電流を得ることが出来た。ま
た、それぞれ単独で導入した際と、大きな差は確認でき
なかった。微小突起構造電極３と作用電極４とを電極に
用いることにより、２成分の同時測定も可能である。

【００３１】

【実施例７】実施例４と同様な方法により微小流路２を
有する第１の基板１、及び微小突起構造リアクタ１２及
び金薄膜の３電極４，５，６を有する第２の基板１３を
作製した。また微小流路２を有する第１の基板１には実
施例４と同様にキャピラリー２２，２３を接続した。微
小突起構造リアクタ１２部分にギャバーゼ、作用電極４
上にグルタメートオキシデースとＨＲＰを含むポリビニ
ルピリジンオスミウム錯体膜を固定した。

【００３２】流速４μｌ／ｍｉｎにおいて、１００μＭ
のαーケトグルタル酸とともに１０μＭのＧＡＢＡ（γ
−アミノ酪酸）を導入することにより、１ｎＡの還元電
流を得ることが出来た。微小突起構造電極３の性能比較
のため、微小突起構造リアクタ１２部分に微小な突起が
無い平坦な酵素リアクタで同様の測定を行ったところ、
０．５ｎＡの還元電流しか得ることが出来なかった。こ
れは、微小突起構造リアクタ１２が多数の微小な突起１
６を有するため、微小化されたセンサーの薄層電気化学
セル内でも多くの表面積を得ることが出来、ギャバーゼ
のような活性の低い酵素でも効率よく反応することが出
来るためである。

【００３３】図７は、本実施例のセンサーの測定に使用
した測定系を示す。センサーの薄層電気化学セルの上流
部でサンプリング用キャピラリー２２を分岐２８により
２流路に分岐させ、その分岐の一方を目的試料吸引用キ
ャピラリーとし、１μＭのＧＡＢＡを含むリン酸緩衝溶
液３１に接続し、他方に１００μＭのαケトグルタル酸
と、濃度が１ｕｎｉｔ／ｍｌのギャバーゼを含むシリン
ジ２９を接続する。αケトグルタル酸とギャバーゼを含
むシリンジ２９を流速１μｌ／ｍｉｎで押し出し、薄層
電気化学セルの下流部のシリンジ接続用キャピラリー２
３にシリンジ３０を接続し、流速５μｌ／ｍｉｎで吸引
する事により、目的試料である１０μＭのＧＡＢＡを流
速４μｌ／ｍｉｎでセンサーの薄層電気化学セルに導入
した。これにより、約４ｎＡの還元電流を得ることが出
来た。これはセンサーの薄層電気化学セルの上流で２路
が混合され、ＧＡＢＡとαケトグルタル酸及びギャバー
ゼが混合され、グルタミン酸が生成されたことによる。

【００３４】微小突起構造リアクタ１２の性能比較のた
め、リアクタ部分に微小な突起が無い平坦な酵素リアク
タで同様の測定を行ったところ、２ｎＡの還元電流しか
得ることが出来なかった。これは微小突起がない場合に
比べ、多数の微小突起１６がある場合では、２流路の混
合が適切に行われたため、酵素反応が効率よく行われ、
感度が向上したと考えられる。このように、本センサー
の微小突起構造リアクタ１２は、２溶液を適切に混合さ
せる場合にも有用であり、例えば本実験のように活性の
低い酵素であっても、効率よく反応させることができ
る。

【００３５】

【実施例８】図８は、微小突起構造電極３を有するセン
サーの製造工程の他の実施例示す。石英ウエハ３２（図
８ａ）上にポジ型フォトレジスト３３を、毎分４０００
回転でスピンコートした（図８ｂ）。その後、フォトマ
スクをウエハ３２に重ね、マスクアライナーＰＬＡ−５
０１を用いて、作用電極４、参照電極５、対向電極６の
３電極部分のパタンを露光した。露光時間は１５秒とし
た。露光後、ウエハをアルカリ現像液中で３０秒間現像
し、水洗、乾燥を行った（図８ｃ）。現像後のウエハ３
２では、３電極４，５，６を作製する部分が露出してい
る。マグネトロンスパッタ装置にこのレジストパタンを
持つウエハ３２を取り付け、金３４をスパッタした（図
８ｄ）。残ったレジスト３３をメチルエチルケトン中で
超音波をかけながら剥離し、除去した（図８ｅ）。再
び、ポジ型フォトレジスト３５をスピンコートし（図８
ｆ）、その後、フォトマスクをウエハ３２に重ね、マス
クアライナーを用いて、レジスト３５のうち多数の微小
突起３６の凹部になるべき部分のレジスト、及び３電極
４，５，６部分を囲む流路になるべき部分を露光、アル
カリ現像を行った（図８ｇ）。これにより、レジストか
らなる多数の微小突起３６と流路７の側壁３７が形成さ
れる。その後、メタルマスクを用いて多数の微小突起３
６部分のみに金３８をスパッタし、微小突起構造電極３
を作製した（図８ｈ）。なお、センサーの薄層電気化学
セルの流路７はレジストからなる側壁３７に囲まれた領
域であり、微小突起構造電極３と３電極４，５，６を覆
う範囲に形成されている。

【００３６】キャピラリー２２，２３を接続した二つの
微小流路２を有する第１の基板１は、実施例３と同様に
微小流路２となるキャピラリー取り付け溝を作製した
後、さらに二つのキャピラリー取り付け溝をつなぐよう
にダイシングソーにより深さ２０μｍ、幅４００μｍの
流路を作製し、実施例３と同様に両基板１，１３を接着
した。これにより微小突起構造電極３上に生体試料が流
れる空間を確保できる。

【００３７】また、実施例３と同様な実験を行ったとこ
ろ、図５に示したものとほぼ同様な結果が得られ、微小
突起のレジストパタンに金を蒸着して作製した微小突起
構造電極３により効率的に妨害物質を除去することがで
きた。また、この工程では、実施例３のようにフッ酸に
よるウエットエッチング工程を省くことが出来、危険な
試薬を使用することなくセンサー作製が可能となる。

【００３８】

【実施例９】図９は、微小突起構造電極３を有するセン
サーの製造工程のさらに他の実施例示す。直径７５ｍ
ｍ、厚さ０．５ｍｍのガラス基板４０上にポジ型のフォ
トレジスト３９（ＴＳＲ−Ｖ３）を毎分４０００回転で
スピンコートし、９０℃のホットプレート上で９０秒間
ベークした（図９ａ）後、マスクアライナー（ＰＬＡ−
５０１）にて微小突起構造電極３及び作用電極４、参照
電極５、対向電極６の３電極部分のパタンを露光した。
次に、レジスト現像液にて９０秒間現像後、純水にて２
分間リンスしてレジストパタンを形成した（図９ｂ）。
次に、当該基板４０上に真空蒸着装置にて真空を破るこ
となく５ｎｍ厚のクロムに続いて１００ｎｍ厚の金４１
を蒸着した（図９ｃ）。続いて、当該基板４０をメチル
エチルケトンに浸漬し、超音波をかけながらレジストを
剥離し、金の微小突起構造電極３の下地及び３電極４，
５，６を作製した（図９ｄ）。当該基板４０をダイシン
グソーにて所定の大きさにカットした後、基板４０上に
ポジ型厚膜レジスト４２（ＴＨＢ−５１６−Ｌ）を２０
μｍ厚に塗布し（図９ｅ）、マスクアライナーにて多数
の微小突起１６部分のパタンを露光、現像、リンスを
し、微小突起が形成されるべき部分がホール４３となる
柱状のレジストパタンを形成した（図９ｆ）。この基板
４０を金のメッキ液に浸漬し、当該ホール４３の底に露
出した下地の金部分につながる金のパッド８を電鋳用の
定電圧電源に接続し、温度６０℃、電流密度５０ｍＡ／
ｃｍ²、電着速度８０μｍ／ｈの条件で１５分間金メッ
キした（図９ｇ）。その後、当該基板４０をメチルエチ
ルケトンに浸漬して超音波をかけながらレジスト４２を
剥離し、２０μｍ厚の金電鋳による多数の円柱状微小突
起４４を作製した（図９ｈ）。このようにして、図１ｂ
と同様の微小突起構造電極３を作製した。次に、実施例
１と同様の方法で作用電極４表面を西洋わさびペルオキ
シターゼを含むオスミウム−ポリビニルピリジン錯体か
らなる膜およびグルタミン酸酸化酵素をコラーゲンと混
合した膜で修飾し、参照電極５上に銀をメッキした。

【００３９】一方、キャピラリー２２，２３を有する第
１の基板（ふた用基板）１は以下の工程にて作製した。
まず、直径７５ｍｍ、厚さ０．５ｍｍのガラス基板１に
スパッタ装置により低融点ガラス（＃７５７０）を０．
２μｍ厚にスパッタ堆積した。次に、ポジ型厚膜レジス
トを２０μｍ厚に塗布し、パタンを露光、現像、リンス
して微小突起構造電極３及び３電極４，５，６の上部に
当たる部分が露出したレジストパタンを形成した。ダイ
シングソーにて所定の形状に切断した後、当該基板をフ
ッ酸緩衝液に浸漬し、低融点ガラスおよびその下のガラ
ス基板１を２０μｍエッチングした。メチルエチルケト
ンによりレジストを剥離した後、実施例８と同様にダイ
シングソーにより流路７の上部となる部分を加工した。

【００４０】実施例３と同様に微小流路２を有する第１
の基板１の溝部分にキャピラリー２２，２３をはさみ、
図９の工程で作製した微小突起構造電極３及び３電極
４，５，６を有する第２の基板１３と第１の基板１とを
陽極接合装置にてアライメントし、１ｋＶの電圧を５分
間印加して二つの基板１，１３を接合させた。実施例３
と同様に当該センサの薄層電気化学セルにシリンジ２５
を接続し、各電極３，４，５，６のパッド８，９，１
０，１１をポテンシオスタット２４に接続した。微小突
起構造電極３および作用電極４にそれぞれ４５０ｍＶ、
０ｍＶの電位を印加し、１０μＭのグルタミン酸および
１００μＭのアスコルビン酸の混合溶液を吸引した。そ
の結果、作用電極４にグルタミン酸による４０ｎＡの還
元電流が流れた。微小突起構造電極３に電位を印加しな
いと、アスコルビン酸の酸化が作用電極４においても起
こり、１６０ｎＡの酸化電流が観測され、グルタミン酸
のみによる信号電流を測定することはできなかった。

【００４１】

【実施例１０】実施例３と同様な方法により、図１ｂに
示すような多数の微小突起１６を有する微小突起構造電
極３、作用電極４、参照電極５、対向電極５及び流路７
を有する第２の基板１３を作製した。この基板１３の微
小突起構造電極３のパッド８を定電圧電源接続し、金線
と共に、コリン酸化酵素１０ｍｇ／ｍＬを溶解させた白
金のメッキ液に浸漬した。温度４５℃、電流密度５０ｍ
Ａ／ｃｍ²、電着速度８０μｍ／ｈの条件で６分間金メ
ッキした。メッキ後、多数の微小突起１６はその表面が
白金黒とコリンオキシターゼ複合体により覆われた。そ
の後、作用電極４表面を西洋わさびペルオキシターゼを
含むオスミウム−ポリビニルピリジン錯体からなる膜お
よびアセチルコリンエステラーゼ及びコリン酸化酵素を
ＢＳＡと混合し、グルタルアルデヒド０．２％で架橋し
た膜で修飾した。また、参照電極５上に銀ペーストを塗
布した。

【００４２】一方、微小流路２を有する第１の基板１は
ダイシングソーを用いて実施例３の図1ａに示したもの
と同様な基板１を作製した。その後、ＵＶ硬化樹脂によ
り２枚の基板１，１３を接合した。

【００４３】実施例３と同様に当該センサの薄層電気化
学セルにシリンジ２５を接続し、微小突起構造電極３及
び３電極４，５，６の各パッド８，９，１０，１１をポ
テンシオスタット２４に接続した。微小突起構造電極３
および作用電極４にそれぞれ４５０ｍＶ、０ｍＶの電位
を印加し、１μＭのアセチルコリンおよび１００μＭの
コリンの混合溶液を吸引した。その結果、作用電極４に
３．５ｎＡの還元電流が流れた。この値は、コリンを混
合せず、１μＭのアセチルコリンのみを測定した値
（３．３ｎＡの還元電流）とほぼ等しかった。一方、微
小突起構造電極３に電位を印加しないと、コリンは多数
の微小突起１６部分で酸化されるが、発生した過酸化水
素が作用電極４上で反応し、５μＡの大きな還元電流が
観測された。これは、コリンもアセチルコリンと同時に
作用電極４上で参加され、アセチルコリンのみを検出で
きないためである。これらの結果より、酵素を固定化し
た多数の微小突起１６を有する微小突起構造電極３を用
いることにより、選択性よくアセチルコリンのみを検出
できることがわかった。

【００４４】

【発明の効果】以上説明したように、本発明による微小
突起構造電極を有する微小量オンラインバイオセンサー
は、次の効果を有する。

【００４５】第１に、多数の微小突起の表面を導電性の
材料で修飾した場合、微小突起構造電極の表面が導電性
であるため、微小突起構造電極に電圧を印加する事によ
り、電気化学検出の際支障となる電気化学的に活性な物
質を除去することが出来る。また、微小突起を多数有す
るため、表面積が大きく、効率よく電気分解が行われる
ため、短時間で反応を完結させることが出来、平坦な電
極に比べ、その効果は大きい。

【００４６】第２に、多数の微小突起の表面を特定物質
と反応する触媒機能を有する酵素等の生体物質で修飾す
ることにより、平坦な構造に比べ、酵素等を効率よく反
応させることが出来るため、活性の低い酵素等を使用す
る際に、非常に有用である。

【００４７】第３に、微小突起構造電極の表面は導電性
であるため、微小突起構造電極３と作用電極４とを電極
に用いることにより、２成分の同時測定が可能となる。

【００４８】第４に、多数の微小突起間を溶液が流れる
ことにより、これより上流で合流された複数の溶液を効
率よく混合することが出来る。

【００４９】第５に、微小突起間の間隙は常に一定であ
るため、流路に長時間圧力が印加されても、ビーズのよ
うに移動せず、めづまりがおこらないという利点を有す
る。

【００５０】第６に、第１の基板と第２の基板とを常温
で貼り合わせることが可能となり、酵素の活性を失わせ
ずにセンサーを作製できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例１におけるセンサーの構成を示
す図である。図１ａは、微小流路を有する第１の基
板、図１ｂは、微小突起構造電極、３電極、流路を有す
る第２の基板、図１ｃは、微小突起構造リアクタ、３電
極、流路を有する第２の基板の各構成を示す。

【図２】本発明の実施例３におけるセンサーの製造工程
を示す図である。

【図３】実施例３におけるセンサーの構成を示す図であ
る。

【図４】実施例３におけるセンサーを用いた測定系の構
成を示す図である。

【図５】実施例３におけるセンサーを用いた測定したア
スコルビン酸の応答を示す図である。

【図６】実施例６におけるセンサーの構造を示す図であ
る。

【図７】実施例７におけるセンサーを用いた測定系の構
成を示す図である。

【図８】実施例８におけるセンサーの製造工程を示す図
である。

【図９】実施例９におけるセンサーの製造工程を示す図
である。

【図１０】実施例３における微小流路を有する第１の基
板の製造工程図である。

【符号の説明】

１．第１の基板２．微小流路３．微小突起構造電極４．作用電極５．参照電極６．対向電極７．流路８．微小突起構造電極のパッド９．作用電極のパッド１０．参照電極のパッド１１．対向電極のパッド１２．微小突起構造リアクタ１３．第２の基板１４．レジスト１５．流路の溝１６．微小突起１７．レジスト１８．金１９．銀２０．オスミウムを含むポリビニルピリジン錯体２１．グルタミン酸酸化酵素をコラーゲンと混合した膜２２．サンプリング用キャピラリー２３．シリンジ接
続用キャピラリー２４．ポテンシオスタット２５．シリンジ２６．上層がアセチルコリンエステラーゼとコリンオキ
シデースの混合物、下層がオスミウムを含むポリビニル
ピリジン錯体の２層２７．上層がコリンオキシデース、下層がオスミウムを
含むポリビニルピリジン錯体の２層２８．分岐２９．１００μＭαーケトグルタル酸とギャバーゼを含
むリン酸緩衝溶液を満たしたシリンジ３０．シリンジ３１．１μＭのＧＡＢＡを含むリン酸緩衝溶液３２．石英ウエハ３３．レジスト３４．金３５．レジスト３６．レジストからなる微小突起３７．レジストからなる流路の側壁３８．金薄膜３９．レジスト４０．ガラス基板４１．金４２．レジスト４３．ホール４４．金電鋳による微小突起

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者栗田僚二東京都武蔵野市御殿山一丁目１番３号エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株式会社内 (72)発明者田部井久男東京都武蔵野市御殿山一丁目１番３号エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロジ株式会社内 (72)発明者丹羽修東京都新宿区西新宿三丁目19番２号日本電信電話株式会社内 (72)発明者堀内勉東京都新宿区西新宿三丁目19番２号日本電信電話株式会社内 (72)発明者鳥光慶一東京都新宿区西新宿三丁目19番２号日本電信電話株式会社内 (72)発明者森田雅夫東京都新宿区西新宿三丁目19番２号日本電信電話株式会社内Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ02 QQ15 QQ61 QQ80 QR02 QR03 QR10 QR12 QR85 QS20 QS39 QX04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】二つの微小流路が形成された絶縁性の第１
の基板と、内部に作用電極、参照電極、対向電極とこれ
ら３電極上を生体試料が流れる流路とを有する薄層電気
化学セルが形成された第２の基板とを、該二つの微小流
路と該流路とが連続するように貼合せた構造を有し、該
流路において、該作用電極の上流部分に多数の微小突起
が形成されていることを特徴とする微少量オンラインバ
イオセンサー。
【請求項２】請求項１において、該多数の微小突起の表
面が導電性の材料で修飾され、電極として働くことを特
徴とする微少量オンラインバイオセンサー。
【請求項３】請求項１において、該多数の微小突起の表
面が、特定物質と反応する酵素等の生体物質で修飾され
ていることを特徴とする微少量オンラインバイオセンサ
ー。
【請求項４】二つの微小流路を絶縁性の第１の基板に形
成し、該第１の基板にサンプリング用のキャピラリ、或
いはマイクロダイヤリシスプローブを接続し、第２の基
板にフォトリソグラフィ法により導電体薄膜からなる作
用電極、参照電極、対向電極を形成した後、再びフォト
リソグラフィ法により薄層電気化学セルの流路と多数の
微小突起とを、生体試料が該多数の微小突起、該作用電
極、該参照電極、該対向電極上を流れるように、かつ該
作用電極の上流部分に該多数の微小突起が配置されるよ
うに形成し、該多数の微小突起の表面を導電性の材料、
或いは特定物質と反応する酵素等の生体物質により修飾
した後、該第１の基板と該第２の基板とを該二つの微小
流路と該流路とが連続するように貼合せることを特徴と
する微少量オンラインバイオセンサーの製造方法。
【請求項５】二つの微小流路を絶縁性の第１の基板に形
成し、該第１の基板にサンプリング用のキャピラリ、或
いはマイクロダイヤリシスプローブを接続し、第２の基
板にフォトリソグラフィ法とエッチング法とを併用して
薄層電気化学セルの流路と多数の微小突起とを形成した
後、再びフォトリソグラフィ法により導電性薄膜からな
る作用電極、参照電極、対向電極を、生体試料が該多数
の微小突起とこれら３電極上を流れるように、かつ該作
用電極の上流部分に該多数の微小突起が配置されるよう
に形成し、該多数の微小突起の表面を導電性の材料、或
いは酵素等の特定物質と反応する生体物質により修飾し
た後、該第１の基板と該第２の基板とを該二つの微小流
路と該流路とが連続するように貼合せることを特徴とす
る微少量オンラインバイオセンサーの製造方法。
【請求項６】二つの微小流路を絶縁性の第１の基板に形
成し、該第１の基板にサンプリング用のキャピラリ、或
いはマイクロダイヤリシスプローブを接続し、第２の基
板にフォトリソグラフィ法と、エッチング法あるいはリ
フトオフ法とを併用して作用電極、参照電極、対向電極
を形成し、その後、フォトリソグラフィ法と電鋳法とを
併用して薄層電気化学セルの流路と多数の柱状微小突起
とを、生体試料が該多数の柱状微小突起、該作用電極、
該参照電極、該対向電極上を流れるように、かつ該作用
電極の上流部分に該多数の柱状微小突起が配置されるよ
うに形成し、該柱状微小突起の表面を導電性の材料、或
いは特定物質と反応する酵素等の生体物質で修飾した
後、該第１の基板と該第２の基板とを該二つの微小流路
と該流路とが連続するように貼合せることを特徴とする
微少量オンラインバイオセンサーの製造方法。
【請求項７】請求項４ないし６において、該第１の基板
と該第２の基板とを貼合せる工程が、光硬化性接着剤、
あるいはポリマー薄膜を溶媒蒸気で溶解させたもの、或
いは低融点ガラス薄膜を用いて貼合せる工程であること
を特徴とする請求項４ないし６記載の微少量オンライン
バイオセンサーの製造方法。
【請求項８】請求項６において、該柱状微小突起の表面
への生体物質による修飾と、電鋳法による該柱状微小突
起の形成とを同時に行うことを特徴とする微少量オンラ
インバイオセンサーの製造方法。