JP3462401B2 - 電気化学検出器 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、フローインジェク
ション分析や液体クロマトグラフィー等に使用する電気
化学検出器に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】簡便で感度の高い方法としてフローイン
ジェクション分析や液体クロマトグラフィー等において
広く利用されている電気化学検出法においては、電気化
学反応を起こす作用電極、試料溶液の電位を一定にする
参照電極、作用電極に電流を流す対向電極等を試料溶液
に接触させて試料の分析を実施する。

【０００３】フローインジェクション分析や液体クロマ
トグラフィーにおいては、キャリア液あるいは溶離液の
リザーバー、送液ポンプ、試料のインジェクター、液体
クロマトグラフィーの場合には更に分離のためのカラム
等を細管で連接し、試料の流出口に電気化学検出器を配
置し、試料をインジェクターから注入し、流出口に到達
したキャリア液あるいは溶離液に混入された試料と作用
電極との間の電気化学反応に起因する電流を電気化学検
出器によってモニターすることにより試料の分析を行
う。

【０００４】図６は、従来の電気化学検出器の例を示す
図である。図において、（ａ）は従来の電気化学検出器
を説明するための分解図、（ｂ）は１個の作用電極が表
面に形成されたディスクの平面図、（ｃ）は２個の作用
電極が表面に形成されたディスクの平面図をそれぞれ示
す。

【０００５】従来の電気化学検出器の本体である治具２
６には、試料溶液を流入させる入口３０（図において
は、治具２６の背面に隠れている）と、治具２６内部の
中心部に設けられ、入口３０と連通している第１の孔３
１と、第１の孔３１を囲んで第１の孔３１の外側に設け
られた第１の孔３１と同心の環状の溝３２と、環状の溝
３２内に設けられた第２の孔３３と、第２の孔３３と連
通し、試料溶液を排出させる出口３４とが設けられてい
る。

【０００６】このような従来の電気化学検出器を使用し
て試料の分析を行う場合には、図の（ｂ）に示すような
１個の作用電極２２が表面に形成されたディスク２１、
または図の（ｃ）に示すような２個の作用電極２４が表
面に形成されたディスク２３を、図の（ａ）に示すよう
に、直径が環状の溝３２の外径に合致する円形の開口３
５が中心部に設けられたガスケット２５を介し、円形の
開口３５と環状の溝３２とを一致させて治具２６に装着
する。次いで、試料溶液を入口３０から流入させ、第１
の孔３１、環状の溝３２、第２の孔３３を経て、出口３
４から排出させる。その際、円形の開口３５内に位置す
る作用電極２２または作用電極２４と試料溶液とが接触
することによって作用電極と試料との間で起こる電気化
学反応による電流をモニターすることにより試料の分析
を行う。なお、図６（ａ）における２７は参照電極、２
８は対向電極を示す。

【０００７】電気化学検出法においては、作用電極に対
してある一定の電位を印加して計測するので、その電位
よりも低いレドックス電位を有する還元体の試料、ある
いはその電位より高いレドックス電位を有する酸化体の
試料のみが、電気化学反応を起こし、結果として検出さ
れる。したがって、レドックス電位の異なる複数の物質
を同時に検出するためには、複数の電極を用意し異なる
電位を印加する必要がある。

【０００８】このような電気化学検出器の一つとして、
微小間隔を隔てて平行に配設した２枚の平板の一方の表
面に複数の作用電極を設け、各作用電極に異なる電位を
印加して、２枚の平板の間に試料溶液を流す構造の薄層
型のフローセル検出器が知られている。

【０００９】また、電気化学検出器の直前で細管を分岐
し、それぞれに電気化学検出器を接続して別々に検出す
る方法が考えられる。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】しかし、このような電
気化学検出器のうち、２枚の平板の一方の表面に複数の
作用電極を設け、各作用電極に異なる電位を印加するフ
ローセル検出器においては、各作用電極上を流れる試料
の量が不均等となることにより測定値にバラツキが生
じ、また、ある作用電極上を流れる試料が、他の作用電
極上にも混入して流れることにより、試料中の各物質の
成分比が乱され、試料中に本来含まれている物質量に対
応する測定値が得られなくなるという問題があった。

【００１１】また、電気化学検出器の直前にＴ字管やＹ
字管を挿入して細管を分岐し、それぞれに電気化学検出
器を接続して別々に検出する場合には、試料溶液のデッ
ドボリュームが増えるので応答が遅くなり、分離が悪く
なり、再現性が悪くなる等の問題があった。

【００１２】本発明は上述の課題を解決するためになさ
れたもので、複数の作用電極の各作用電極上を流れる試
料溶液の量が不均等となったり試料溶液が互いに混入す
ることがなく、電気化学検出器の直前で細管を分岐し
て、それぞれに電気化学検出器を接続して別々に検出す
る必要のない、電気化学検出器を提供することを目的と
する。

【００１３】

【課題を解決するための手段】この目的を達成するため
の本発明の電気化学検出器においては、試料溶液を流通
させる流路と、参照電極及び対向電極並に複数の作用電
極とを含んでなる電気化学検出器において、上記参照電
極と上記対向電極と上記作用電極とを含む電極パタンを
設けた第１基板と、上記流路のための溝パタンが形成さ
れた第２基板とが、上記試料溶液と上記参照電極との接
触領域及び上記試料溶液と上記対向電極との接触領域並
びに上記試料溶液と上記作用電極との接触領域に開口部
を有する層間絶縁膜を介して互いに接合され、上記流路
を分岐し、分岐した各上記流路を流通する上記試料溶液
が、それぞれ上記複数の作用電極の１つのみに接するよ
うにした。

【００１４】この場合、上記流路は上記試料溶液が均等
に配分されるように分岐する。

【００１５】

【発明の実施の形態】図１は、本発明に係る電気化学検
出器の電極パタンを示す平面図である。

【００１６】本発明に係る電気化学検出器の製造工程に
おいては、まず、図１に示すような、２つの作用電極
３、４と、参照電極５と、対向電極６とを含む電極パタ
ンを、第１基板１の表面に形成する。各電極の表面積は
５０ｍｍ^２程度、膜厚は１００ｎｍ程度とする。電極の
材料としては炭素、白金、金などを用いることができ
る。また、参照電極５の表面には銀メッキを施す。第１
基板１の材料としては、表面を酸化したＳｉウエハ、Ｐ
ｙｒｅｘ（登録商標）ウエハ、または石英ウエハを用い
ることができる。

【００１７】次に、電極パタンが形成された第１基板１
の表面に、図２に示すような層間絶縁膜７を形成する。
層間絶縁膜７の、各電極のパッド領域及び試料溶液と電
極との接触領域に該当する個所には、開口部８、９、１
０を設ける。

【００１８】図３は、本発明に係る電気化学検出器の第
２基板を示す平面図である。

【００１９】第２基板２の表面には、図３に示すような
平面形状の溝パタン１１を形成する。この溝パタン１１
は、試料溶液を流通させる流路となるものであり、図に
示すように分岐されている。溝パタン１１は、幅０．４
ｍｍ、深さ３０μｍ程度に形成する。第２基板２の材料
としてＰｙｒｅｘウエハを用いると、フッ酸を用いたエ
ッチングによって、溝パタン１１を形成することができ
る。エッチングマスクとしてＣＶＤ（化学的気相成長
法）で形成したＳｉ膜、Ｗ膜またはＴｉＮ膜を用いる
と、ピンホールを生じることなく溝パタン１１を形成す
ることができる。

【００２０】次に、溝パタン１１が形成された第２基板
２の表面に、更に図４に示すような、幅０．４ｍｍ、深
さ０．４ｍｍの２つの溝、すなわち入口側の溝１２と出
口側の溝１３とを、ダイシングソーを用いて形成する。

【００２１】次に、電極パタンと層間絶縁膜７とが形成
された第１基板１の表面と、溝パタン１１と溝１２、１
３とが形成された第２基板の表面とを、図５に示すよう
に位置合わせして互いに接合する。その際、外径が０．
４ｍｍ以下の２本の細管、すなわち導入細管１４と排出
細管１５とを、溝１２内と溝１３内とに、それぞれ接着
剤を用いて固定する。導入細管１４は分離カラムに接続
してフローセルの導入口となるものであり、排出細管１
５はフローセルの排出口となるものである。

【００２２】以上の工程により、互いに対称的に配設さ
れた２つの作用電極３、４と、単一の導入細管１４から
各作用電極３、４へ均等に分流して試料溶液が流入する
互いに対称的に配設された２つの密閉された流路とを有
する、薄層型フローセルを有する電気化学検出器を得る
ことが可能となる。

【００２３】本発明の電気化学検出器においては、各作
用電極上を流れる試料溶液の量を均等にすることができ
るので、測定値のバラツキを小さくすることができる。
また、分岐された各流路を流れる試料溶液はそれぞれ１
つの作用電極のみと接するので、１つの作用電極上を流
れる試料が、他の作用電極上に混入することはなく、試
料中の各物質の成分比が乱され、試料中に本来含まれて
いる物質量に対応する測定値が得られなくなるというこ
とはない。また、電気化学検出器の前でＴ字管やＹ字管
を挿入して細管を分岐することはないので、試料溶液の
デッドボリュームが増えて応答が遅くなったり、分離が
悪くなってり、再現性が悪くなることはない。従って、
複数の作用電極に異なる電位を印加し、レドックス電位
の異なる物質を同時に等しい応答特性で検出することが
できる。

【００２４】さらに、流路を構成する溝パタンは微細加
工技術を用いて作製できるので、細管をＴ字管やＹ字管
により分岐した場合に比べて格段に再現性がよい。

【００２５】なお、上記実施の形態においては、第１基
板１の表面上に図１に示す電極パタンと図２に示す開口
部８、９、１０を設けた層間絶縁膜７とを形成し、第２
基板２の表面上に図３に示す溝パタン１１と図４に示す
溝１２、１３とを形成したが、第１基板に形成する電極
パタン及び層間絶縁膜の開口部の数及び形状、第２基板
に形成する溝パタン及び溝の数及び形状は、これらの数
及び形状に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範
囲内で種々に変更可能である。

【００２６】

【実施例】（実施例１）上記実施の形態において説明し
た本願発明の電気化学検出器を用いて次のような実験を
行った。

【００２７】２つの作用電極に、グルコース酸化酵素と
ラクテート酸化酵素とをそれぞれ固定した。固定する際
には西洋ワサビペルオキシターゼ（ＨＲＰ）を含むオス
ミウム−ポリビニルピリジン誘導体（Ｏｓポリマー）
（バイオアナリティカルシステムズ（Bioanalytical Sy
stems、BAS）社製）を最初に作用電極表面に塗布し乾燥
させた。続いてグルコース酸化酵素を牛血清アルブミン
と混合し、グルタルアルデヒドで架橋して一方の作用電
極表面に塗布し乾燥させることにより固定した。また、
ラクテート酸化酵素をコラーゲンと塩化ナトリウムとリ
ン酸緩衝液と混合し、もう一方の作用電極表面に塗布し
乾燥させることにより固定した。

【００２８】本願発明の電気化学検出器をシリンジポン
プに接続し、電極の端子をデュアルアンペロメトリック
検出器（BAS製、LC-4C）の対応する端子に接続した。２
つの作用電極にそれぞれ０Ｖの電位を印加して、グルコ
ース１ｍＭ、ラクテート１００μＭを含む生理食塩水を
２μＬ／分の流速で流したところ、２０秒後にグルコー
ス酸化酵素を固定した電極では１２０ｎＡ、ラクテート
酸化酵素を固定した電極では１１．６ｎＡとそれぞれの
濃度に応じた電流が観測された。

【００２９】（比較例１）実施例１の実験結果と比較す
るため、２つの作用電極が分離していない従来の構造の
電気化学検出器を作製し、実施例１と同様にグルコース
酸化酵素とラクテート酸化酵素とを固定化し、同様の実
験を行った。その結果、グルコース酸化酵素を固定化し
た電極では１１９ｎＡと実施例２とほぼ同じ応答を示し
たのに対し、ラクテート酸化酵素を固定化した電極にお
いては１３．４ｎＡと電流値が高くなった。これは、濃
度の高いグルコースが酸化酵素で分解された際に生成さ
れる過酸化水素がラクテート酸化酵素を固定化した電極
へも１部流れ込み、検出されたためである。このよう
に、流路が分離されていないと、他の電極での反応の影
響を受けることになる。

【００３０】（実施例２）上記実施の形態において説明
した本願発明の電気化学検出器の作用電極を炭素で形成
し、実施例１と同様にシリンジポンプおよびデュアルア
ンペロメトリック検出器に接続し、次のような実験を行
った。

【００３１】一方の作用電極の電圧を０．５Ｖに、他方
の作用電極の電圧を０．８Ｖに設定し、１００μＭのド
ーパミンと５０μＭのメタネフリンとの混合溶液を２μ
Ｌ／分の流速で流したところ、０．５Ｖを印加した電極
では２３ｎＡ、０．８Ｖを印加した電極では３１ｎＡの
電流が観測された。

【００３２】（実施例３）実施例１で使用した本願発明
の電気化学検出器を用いて次のような実験を行った。

【００３３】一方の作用電極にはアスコルビン酸酸化酵
素を固定し、他方の作用電極は酵素を含まない固定化膜
で被覆した。アスコルビン酸酸化酵素を固定する際に
は、アスコルビン酸酸化酵素を牛血清アルブミンと混合
しグルタルアルデヒドで架橋した。次に、アスコルビン
酸（ビタミンＣ）をｐＨ７のリン酸緩衝液に溶解した標
準溶液を調製し、２つの電極に０．４Ｖの電位を印加し
て実施例１と同様にシリンジポンプに接続し応答を観測
した。流す溶液を緩衝液からアスコルビン酸溶液に変え
ると、アスコルビン酸酸化酵素を含まない膜で覆われた
電極（Ａ電極）ではアスコルビン酸の酸化により電流が
増加した。これに対し、アスコルビン酸酸化酵素を含む
膜で覆われた電極（Ｂ電極）においてはアスコルビン酸
が電極に到達する前に全て酸化され、電気化学的に不活
性となるため、電流にほとんど変化はなかった。表１に
アスコルビン酸の濃度と観測された電流値を示す。

【００３４】

【表１】

【００３５】この結果、２つの作用電極における電流の
差は測定したアスコルビン酸の濃度に比例することがわ
かった。

【００３６】次に、レモン果汁をｐＨ７のリン酸緩衝液
で１０倍に希釈して同様の実験を行った。酵素を含んだ
膜で覆われた電極での応答電流は０．０１８７μＡ、酵
素を含まない膜で覆われた電極での応答電流は０．７７
１μＡとなり、この差から、用いた希釈前の試料には約
２．７ｍｍｏｌ／Ｌのアスコルビン酸が含まれているこ
とがわかった。レモン果汁を用いた場合、酵素を含んだ
膜で覆われた電極での電流が増加しているが、これはレ
モン果汁に含まれる他の電気化学活性を有する成分が反
応したことによるものであり、この反応は酵素を含まな
い膜で覆われた電極においても同様に起きており、２つ
の応答電流値の差から、アスコルビン酸のみによる応答
を得ることができる。

【００３７】次に、ラットの脳細胞をシャーレに１５日
間培養し、細胞外液をサンプリングして応答を測定した
ところ、Ａ電極では０．０１８μＡ、Ｂ電極では０．０
０６７μＡの電流が観測された。その後１００ｍｍｏｌ
／Ｌの塩化カリウムにて細胞を刺激した直後の細胞外液
をサンプリングし、同様に応答を記録したところ、Ａ電
極では０．０８６μＡ、Ｂ電極では０．１１μＡの電流
が観測された。刺激後に応答電流が増加しているのは、
刺激により神経細胞からカテコールアミン類などの電気
化学的に活性な神経伝達物質が放出されたためである。
アスコルビン酸の濃度はＡ電極とＢ電極の応答の差から
得られ、ほとんど同じであることが分かった。このこと
からも、本願発明の電気化学検出器を用いれば他の電気
化学的に活性な妨害物質が共存しても、アスコルビン酸
を選択的に検出できることがわかった。

【００３８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明に係る電気
化学検出器においては、流路と参照電極と対向電極と作
用電極とを、互いに表面が接合された複数の基板の接合
面に設け、流路を分岐し、分岐した各流路を流れる試料
溶液は、それぞれ複数の作用電極の１つのみに接するの
で、１つの作用電極上を流れる試料が、他の作用電極上
に混入することはなく、試料中の各物質の成分比が乱さ
れ、試料中に本来含まれている物質量に対応する測定値
が得られなくなるということはないという効果がある。

【００３９】また、各作用電極上を流れる試料溶液の量
を均等にすることができるので、測定値のバラツキを小
さくすることができるという効果がある。

【００４０】また、基板の接合面に分岐した流路を設け
るので、流路を構成する溝パタン等を微細加工技術を用
いて作製することが可能であり、再現性が向上するとい
う効果がある。

【００４１】また、電気化学検出器の直前にＴ字管やＹ
字管を挿入して細管を分岐する必要がないので、試料溶
液のデッドボリュームが増えて応答が遅くなったり、分
離が悪くなったり、分流の再現性が悪くなることはない
という効果がある。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る電気化学検出器の電極パタンを示
す平面図である。

【図２】本発明に係る電気化学検出器の層間絶縁膜を示
す平面図である。

【図３】本発明に係る電気化学検出器の第２基板を示す
平面図である。

【図４】本発明に係る電気化学検出器の第２基板に形成
する溝を示す平面図（ａ）と断面図（ｂ）である。

【図５】本発明に係る電気化学検出器の第１基板と第２
基板とを組合せて接合した状態を示す平面透視図（ａ）
と断面透視図（ｂ）である。

【図６】従来の電気化学検出器の例を示す図である。

【符号の説明】

１…第１基板 ２…第２基板 ３、４…作用電極 ５…参照電極 ６…対向電極 ７…層間絶縁膜 ８、９、１０…開口部 １１…溝パタン １２、１３…溝 １４…導入細管 １５…排出細管

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 堀内 勉 東京都新宿区西新宿三丁目19番２号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 鳥光 慶一 東京都新宿区西新宿三丁目19番２号 日 本電信電話株式会社内 (72)発明者 栗田 僚二 東京都武蔵野市御殿山一丁目１番３号 エヌ・ティ・ティ・アドバンステクノロ ジ株式会社内 (56)参考文献 特開 昭63−279153（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】試料溶液を流通させる流路と、参照電極及
   び対向電極並に複数の作用電極とを含んでなる電気化学
   検出器において、上記参照電極と上記対向電極と上記作
   用電極とを含む電極パタンを設けた第１基板と、上記流
   路のための溝パタンが形成された第２基板とが、上記試
   料溶液と上記参照電極との接触領域及び上記試料溶液と
   上記対向電極との接触領域並びに上記試料溶液と上記作
   用電極との接触領域に開口部を有する層間絶縁膜を介し
   て互いに接合され、上記流路を分岐し、分岐した各上記
   流路を流通する上記試料溶液が、それぞれ上記複数の作
   用電極の１つのみに接するようにしたことを特徴とする
   電気化学検出器。
2. 【請求項２】上記流路は上記試料溶液が均等に配分され
   るように分岐することを特徴とする請求項１に記載する
   電気化学検出器。