JP3973657B2

JP3973657B2 - 連続分離検出チップ

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Publication number: JP3973657B2
Application number: JP2004371081A
Authority: JP
Inventors: 勝義林; 勉堀内; 弦岩崎; 彰之館
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2004-12-22
Publication date: 2007-09-12
Anticipated expiration: 2024-12-22
Also published as: JP2006177767A

Description

本発明は液体中の生体分子を分離して選択的に測定するための連続分離検出チップに関する。

血液や脳内に存在する生体分子を分離し、選択的に測定する手法としては、液体クロマトグラフィー法や電気泳動法が挙げられる。

液体クロマトグラフィー法は、電気化学検出器や蛍光などを用いた光学検出器と組み合わせて用いられ、高感度かつ高選択的に測定できる方法で、適応範囲が広い。固定相または担体と呼ばれる物質の表面あるいは内部を移動相と呼ばれる物質が通過することで分離されるという原理で、分離の原理は物質の大きさ、吸着力、電荷、質量、疎水性などが挙げられる。

電気泳動法は、荷電粒子あるいは分子が電界中を移動する現象を利用したもので、液体クロマトグラフィーとは異なり、担体を必要としない場合やアガロースゲルなどを担体とし、電荷や分子サイズの違いを利用してより分離能を高めることも可能である。

近年では、チップ上に電界を発生させるための電極や微小な流路を集積した多くの電気泳動チップが報告されており、ＤＮＡやタンパク質の分離に応用されている。また、フリーフロー電気泳動により、連続的に送液しながら、その液の流れと垂直方向に電圧を印加し、試料内の高分子を連続、かつ分離して、光学検出器と組み合わせて測定する手法が報告されている（非特許文献１）。

オンラインセンサーでは、微小透析膜付プローブ（マイクロダイヤリシスプローブ）を接続し、血管や脳から直接試料を採取しながら測定を行うことができる。またこのセンサーでは、検出器の上流に酵素を固定したカラムや電極を設置することにより、高感度かつ高選択的に測定対象物質を測定することができる。

近年では、チップ上に反応器や検出器を集積した微小なセンサーが報告されており、時間分解能良く測定を行うことができる（非特許文献２）。連続測定用のセンサーとしては、直径が数μｍ〜数十μｍの微小電極を用いた（非特許文献３）ものや、光ファイバーを用いたセンサーが挙げられる。これらのセンサーは、直接生体内に挿入して測定を行うことができるため、実時間での測定が容易である。
Ｄ．Ｅ．Ｒａｙｍｏｎｄ，Ａ．Ｍａｎｚ，Ｈ．Ｍ．Ｗｉｄｍｅｒ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，６６，２８５８−２８６５Ｋ．Ｈａｙａｓｈｉ，Ｙ．Ｉｗａｓａｋｉ，Ｒ．Ｋｕｒｉｔａ，Ｋ．Ｓｕｎａｇａｗａ，Ｏ．Ｎｉｗａ，ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ５（２００３）１０３７−１０４２Ｙ．Ｈｕ，Ｋ．Ｍ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｆ．Ｎ．Ａｌｂａｈａｄｉｌｙ，Ｅ．Ｋ．Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ．，Ｇ．Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，ＢｒａｉｎＲｅｓ．１９９４，６５９，１１７−１２５

液体クロマトグラフィーや電気泳動を用いる場合では、ある一定量の試料を導入して分離を行う必要があるため、連続測定が困難であるという問題がある。また、微小化した電気泳動チップでは、導入できる試料体積が限られており、高感度に測定することが難しいという問題点がある。フリーフロー電気泳動では、光学測定を用いた系が多く報告されているが、ラベル化が必要な物質もあり、実際には生体から試料をサンプルして連続的に測定することは難しい。

オンラインセンサーでは、電気化学検出器を用いる場合では、生体試料内には電気化学活性を有する夾雑物質が多く存在することから、測定対象物質の濃度が夾雑物質に対して低い場合には、選択性良く測定することが困難であるという問題がある。生体内に直接挿入することのできる微小センサーにおいても、上記夾雑物質の影響のほか、生体試料に含まれるタンパク質の吸着によって応答感度が抑制されることも課題となる。

上記課題を解決するため、本発明による連続分離検出チップは、測定すべき試料が流れ、かつ電気泳動が行われる試料分離用の分離用流路と、前記分離用流路に相互に対向して設けられ、かつ電解液溶液中に浸漬された電気泳動用電極と、前記電解液の流路と前記分離用流路とを分離するセパレータと、前記分離用流路の下流に接続する分岐流路と、前記分岐流路の少なくとも一つに前記試料を測定するための電気化学検出器を備え、前記電解液の流路と前記分離用流路とを分離するセパレータは微小突起構造を介して前記電解液の流路および前記分離用流路と接触する塩橋または高分子膜であることを特徴とする。

本発明による連続分離検出チップでは、連続測定が可能なオンラインセンサーを基本とし、電気化学検出器の上流で、前記分離用流路と垂直方向に電界をつくるための電気泳動用電極と検出器や電気泳動によって分離された生体分子を捕集するための分岐流路を形成する。電気泳動用の電極と試料との接触を避けるために、塩橋や高分子膜を用いて作製した層（セパレータ）を分離用流路と電気泳動用電極との間に設置する。またより測定妨害物質に対する分離効率を高めるために、分離用流路内には酵素を固定する。このことにより連続的に送液しながら、感度、選択性良く測定を行うことができる。

本発明による連続分離検出チップは、連続測定が可能で電荷の違いを用いた分離検出が可能であり、塩橋や高分子膜によって、電気泳動用電極と試料とを隔離できるため、ｐＨ変化による応答特性の劣化を抑制することができ、試料を連続的に採取しながら測定を行うため、リアルタイム測定を行うことができる。このことから、病態の変化などによく追随することができるという効果を有する。

本発明による連続分離検出チップ１は、例えば図１（ａ）に示すように、ガラスなどの基板１１上に、試料を分離するための分離用流路１２と分離用流路１２の下流に接続する分岐流路１３を備えている。前記分岐流路１３は、分離した試料が流れる試料用流路１３１と測定上不必要な物質を排出する排出用流路１３２に分岐している。前記分離用流路１２には相互に対向して電気泳動用電極１４が備えられており、一方、試料用流路１３１には、参照電極１５１、検出用電極１５２および対向電極１５３を含む電気化学検出器１５が設けられた構造になっている。なお、１６は試料導入用ポート、１７は試料排出用ポート、１８は阻害物質排出ポートである。

図１（ｂ）は、前記連続分離検出チップに接続する濃縮チップ２は、前記連続分離検出チップ１と同様な構造をしており、濃縮用分岐流路に電気化学検出器が設けられていない点異なっている。すなわち、ガラスなどの基板２１上に、試料を分離するための濃縮用流路２２とこの濃縮用流路２２の下流に接続する濃縮用分岐流路２３を備えている。前記濃縮用分岐流路２３は、分離し濃縮された試料が流れる濃縮試料用流路２３１と測定上不必要な物質を排出する排出用流路２３２に分岐している。前記濃縮用流路２２には相互に対向して電気泳動用電極２４が備えられている。なお、２６は試料導入用ポート、２７は濃縮試料排出用ポート、２８は阻害物質排出ポートである。

図２は、分離用流路１２の拡大図であるが、前記分離用流路１２は、電解質溶液１４１中に浸漬された電気泳動用電極１４間に設けられており、前記電解質溶液１４１は微小突起２０１、塩橋２０２、微小突起２０１からなるセパレータ２０によって前記分離用流路１２と隔離されている。なお、１９は電解質溶液１４１を保持するためのフォトレジスト層の支持層、Ｓはガラス基板である。

図３は同様に前記分離用流路を示すものであるが、この実施態様では、電解質溶液１４１と分離用流路１２は高分子膜２０３よりなるセパレータ２０によって３隔離されている。なお１９は、両面テープよりなる支持層であり、ガラス基板Ｓを固定する作用を営む。高分子膜としては、たとえばイオン交換膜が使用される。

前記分離用流路１２の幅は、好ましくは５ｍｍ以下である。５ｍｍを超えると、測定用溶液が一様に流れない恐れがあるからである。濃縮チップを使用する場合、前記濃縮チップ２の濃縮用流路２２も同様な幅であることが望ましい。

図２および図３には本発明による連続分離検出チップの分離用流路の例を示したが、図１（ｂ）に示した濃縮チップの濃縮用流路も同様であることができる。

本発明による一実施態様においては、測定妨害物質の分離効率を向上させるため、前述のように酵素を固定することができ、また測定物質の検出を効率よく、また容易にするため、検出用電極１５２に前記酵素と別の酵素を固定することもできる。

検出用電極１５２としては、図４に示すように、たとえばバンド電極、バンド電極アレイ（くし形電極）、微小ディスク電極、微小ディスク電極アレイのいずれかであることができる。

測定用試料溶液を試料導入用ポート１６から導入すると、前記試料溶液は分離用流路１２に流れる。分離用流路１２には電気泳動用電極１４によって電界が負荷されているので（前記電気泳動用電極１４は、測定用試料は分岐流路１３の試料用流路１３１側に測定用試料が泳動されるように、電極の陰陽を定める）、イオン化した測定用試料は分岐流路１３の試料用流路１３１に流れ、一方阻害物質は排出用流路１３２に流れることになる。すなわち、これによって測定用試料と阻害物質は分離される。この試料用流路１３１に流れる試料を電気化学検出器によって検出することにより、試料を連続的に検出可能になる。

また濃縮チップを使用する場合、前述の連続分離検出チップと同様に試料を濃縮可能であり、電気泳動用電極２４によって濃縮用流路２２で分離され、濃縮された試料は濃縮試料用流路２３１を通り、濃縮試料排出用ポート２７を介して前記連続分離検出チップの試料導入用ポート１６に導入される。これによって濃縮された試料が本発明による連続分離検出チップに導入されることになり、検出効率が向上する。この濃縮チップは、複数接続して使用することができるのは明らかである。

以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

図１および図２に示す本発明による連続分離検出チップを使用して、試料導入用ポート１６に微小透析膜付プローブ、或いはガラスキャピラリーを接続して測定を行う。

本実施例では、電気泳動用電極１４として、白金を用いた。検出用電極１５２として、炭素薄膜をくし形に加工した検出用電極１５２を用いた。参照、対向電極１５１，１５３には、それぞれ銀、白金を使用した。くし形の電極には、参照電極１５１に対して、一方のバンド電極アレイに６００ｍＶ、他方のバンド電極アレイに−２００ｍＶの電位を印加した。試料の導入にはシリンジポンプを使用し、ポート１７，１８から吸引しながら試料を導入した。流速は、２μｌ／ｍｉｎ．とした。

電気泳動用電極には、電気化学検出器１５に近い側（分岐流路の試料用流路１３１）側の電気泳動用電極が＋、遠い側の電極が−となるようにして１００Ｖ／ｃｍの電圧を印加した。電極１４と試料が通過する分離用流路１２との間に微小突起２０１を介して塩橋（セパレータ）２０を配置しておくことにより、電気泳動用電極１４上で起こる電気分解反応によって生じるｐＨ変化の影響を抑制することができる。塩橋は、寒天および塩化カリウムを水に溶かしたものを、流しこんで形成した。

はじめに、カテコールアミンの一種であるドーパミン（１０μＭＭ＝ｍｏｌ／ｌ）を導入し測定を行った。その結果、検出用電極（くし形電極）で、約８０ｎＡの電流値が得られた。次にドーパミン溶液（１０μＭ）にドーパミンと同濃度になるようにＬ−アスコルビン酸を混合し、同様な測定を行った。その結果、得られた応答電流値は、約８０ｎＡとなり、ドーパミンのみを測定した場合と比べて同じ電流値が得られた。次に、Ｌ−アスコルビン酸溶液を導入したところ、応答電流は観測されなかった。これは、電気泳動の効果により、アニオンであるＬ−アスコルビン酸は、電気化学検出器１５から遠い側へ（すなわち分岐流路１３の排出用流路１３２側へ）と泳動し、カチオンであるドーパミンは、電気化学検出器１５に近い側へ（すなわち試料用流路１３１側）と泳動するため、これらの分子は、分離用流路１２において、液の流れとは垂直方向に分離され、電気化学検出器１５ではドーパミンのみが検出されたためである。

比較実験として、電気泳動用電極に電圧を印加しなかった場合、ドーパミン溶液、及びドーパミン、Ｌ−アスコルビン酸混合溶液から得られた応答はそれぞれ、約４０ｎＡ、約５０ｎＡであった。これは、ドーパミンとＬ−アスコルビン酸が分離されていないことを示している。

以上により、本発明による連続分離検出チップは、電荷の異なる分子を分離しながら連続的に測定を行うことが可能であり、生体分子の濃度変化を連続モニターへの適用が可能である。

図１および図３に示す本発明による連続分離検出チップを使用して、試料導入用ポート１６に微小透析膜付プローブ、或いはガラスキャピラリーを接続して測定を行う。セパレータ２０としてはイオン交換膜（アニオン交換膜）を使用した。

本実施例では、電気泳動用電極１４として、白金を用いた。検出用電極１５２として、金薄膜を微小電極アレイに加工した電極を用いた。参照、対向電極１５１，１５３には、それぞれ銀、白金を使用した。微小電極アレイ（検出用電極）１５２には、参照電極１５１に対して６００ｍＶの電位を印加した。試料の導入にはシリンジポンプを使用し、ポート１７，１８から吸引しながら試料を導入した。流速は、２μｌ／ｍｉｎ．とした。

電気泳動用電極には、電気化学検出器１５に近い側（分岐流路の試料用流路１３１側）の電極が＋、遠い側（分岐流路の排出用流路１３２側）の電極が−となるようにして１００Ｖ／ｃｍの電圧を印加した。イオン交換膜（セパレータ）２０によって電極と試料を隔離することにより電気泳動用電極上で起こる電気分解反応によって生じるｐＨ変化の影響を抑制することができる。

はじめに、カテコールアミンの一種であるノルアドレナリン：（１０μＭＭ＝ｍｏｌ／ｌ）を導入し測定を行った。その結果、微小電極アレイ（検出用電極）１５２において約５０ｎＡの電流値が得られた。次にノルアドレナリン溶液（１０μＭ）にノルアドレナリンと同濃度になるようにカテコールアミンの代謝物の一種であるＤＯＰＡＣを混合し、同様な測定を行った。その結果、得られた応答電流値は、約５０ｎＡとなり、ノルアドレナリンのみを測定した場合と比べて同じ電流値が得られた。次に、ＤＯＰＡＣ溶液を導入したところ、応答電流は観測されなかった。これは、電気泳動の効果により、アニオンであるＤＯＰＡＣは、電気化学検出器１５から遠い側（分岐流路の排出用流路１３２側）へと泳動し、カチオンであるノルアドレナリンは、電気化学検出器１５に近い側（分岐流路の試料用流路１３１側）へと泳動するため、これらの分子は、分離用流路１２において、液の流れとは垂直方向に分離され、電気化学検出器１５ではノルアドレナリンのみが検出されたためである。

比較実験として、電気泳動用電極に電圧を印加しなかった場合、ノルアドレナリン溶液、及びノルアドレナリン、ＤＯＰＡＣ混合溶液から得られた応答はそれぞれ、約４０ｎＡ、約５０ｎＡであった。これは、ノルアドレナリンとＤＯＰＡＣが分離されていないことを示している。

実施例１と同様なデバイス構造に於いて、検出用電極１５２として金を用いた。この金電極１５２上には、西洋わさびペルオキシダーゼを含むオスミウムポリマーの膜を形成した。分離用流路１２には、グルタミン酸酸化酵素を牛血清アルブミンとグルタルアルデヒドを用いて固定した。

グルタミン酸酸化酵素は、酵素反応によりグルタミン酸を酸化し、過酸化水素を生成する。西洋わさびペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰ）は、グルタミン酸とグルタミン酸酸化酵素との間の酵素反応による過酸化水素を酸化する酵素であり、過酸化水素を酸化するとＨＲＰの活性中心は還元状態となる。一方、オスミウムは、電子の移動を媒介する物質で、通常の二価のイオン（Ｏｓ^２＋）で存在している。Ｏｓ^２＋は、還元状態のＨＲＰを酸化し、自らは三価のイオン（Ｏｓ^３＋）となる。検出用電極には−５０ｍＶｖｓ．Ａｇの電位が印加されており、この電位でＯｓ^３＋は、Ｏｓ^２＋に還元される。このとき還元電流が観測されることになり、この還元電流の大きさが、グルタミン酸の濃度を反映する。

試料の導入にはシリンジポンプを使用し、ポート１７，１８から吸引しながら試料を導入した。流速は、２μｌ／ｍｉｎ．とした。電気泳動用電極への印加電圧は、実施例１と同じとした。検出用電極には−５０ｍＶｖｓ．Ａｇを印加した。

はじめに、グルタミン酸：（１μＭ）を導入し測定を行った。その結果、応答電流は、０．３ｎＡであった。次にグルタミン酸（１μＭ）に１００μＭのＬ−アスコルビン酸を混合し、同様な測定を行った。その結果、得られた電流値は０．３ｎＡとなり、グルタミン酸のみを測定した場合と比べて同じ結果が得られた。次に、Ｌ−アスコルビン酸溶液のみを導入したところ、応答電流は観測されなかった。これは、電気泳動の効果により、アニオンであるＬ−アスコルビン酸は、＋極へと泳動し、分離用流路１２内でＬ−アスコルビン酸と同じくアニオン性のグルタミン酸は過酸化水素に変換され、泳動の影響を受けずに直進し、Ｌ−アスコルビン酸のみを分岐流路１３の試料用流路１３１に回収できたためである。

比較実験として、電気泳動用電極に電圧を印加しなかった場合、グルタミン酸溶液、及びグルタミン酸、Ｌ−アスコルビン酸混合溶液から得られた電流値は、それぞれ、０．４、０ｎＡであった。これは、混合溶液から得られた応答電流が減少したのは、オスミウムを介した電極上の反応をＬ−アスコルビン酸が阻害しているためであり、グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸が分離されていないことを示している。

またグルタミン酸酸化酵素をオスミウムポリマー上に固定した場合では、グルタミン酸はＬ−アスコルビン酸とともに負の電極側に泳動されてしまい、応答電流は明瞭な応答は観測されなかった。

以上により、本発明による連続分離検出チップは、電荷が同じ分子であっても酵素を用いて測定対象物質を泳動の影響を受けない物質に変化させ、それらを分離しながら連続的に測定を行うことが可能であり、生体分子の濃度変化を連続モニターへの適用が可能である。

本発明は液体中の生体分子を分離して選択的に測定するための連続分離検出チップに関するもので、液体の流れる方向に対して垂直方向に電界をかけて電気泳動を行う電極を設けた流路の下流に分岐を設け、電気泳動によって測定対象物質を妨害物質から分離して片側の分岐に導き、この測定対象物質を導く分岐に電気化学測定用の電極を設けて、電気化学測定によって測定対象物質を検出することを特徴とする。

本発明による連続分離検出チップの概略図。分離用流路の一例の拡大図。分離用流路の他の例の拡大図。電極の形状を示す図。

符号の説明

１連続分離検出チップ
１１基板
１２分離用流路
１３分岐流路
１３１試料用流路
１３２排出用流路
１４電気泳動用電極
１４１電解質溶液
１５電気化学検出器
１５１参照電極
１５２検出用電極
１５３対向電極
１６試料導入用ポート
１７試料排出用ポート
１８阻害物質排出ポート
１９支持層
２０セパレータ
２０１微小突起
２０２塩橋
２０３イオン交換膜
２濃縮チップ
２１基板
２２濃縮用流路
２３濃縮用分岐流路
２３１濃縮試料用流路
２３２排出用流路
２４電気泳動用電極
２６試料導入用ポート
２７濃縮試料排出用ポート
２８阻害物質排出ポート

Claims

測定すべき試料が流れ、かつ電気泳動が行われる試料分離用の分離用流路と、前記分離用流路に相互に対向して設けられ、かつ電解液溶液中に浸漬された電気泳動用電極と、前記電解液の流路と前記分離用流路とを分離するセパレータと、前記分離用流路の下流に接続する分岐流路と、前記分岐流路の少なくとも一つに前記試料を測定するための電気化学検出器を備え、前記電解液の流路と前記分離用流路とを分離するセパレータは微小突起構造を介して前記電解液の流路および前記分離用流路と接触する塩橋または高分子膜であることを特徴とする連続分離検出チップ。
測定すべき試料が流れ、かつ電気泳動が行われる試料濃縮用の濃縮用流路と、前記濃縮用流路に相互に対向して設けられた電気泳動用電極と、前記濃縮用流路の下流に接続する濃縮用分岐流路を備え、前記濃縮用分岐流路は前記測定すべき試料が濃縮された溶液が流れる流路と、その他の成分を含む溶液が流れる流路に分岐している濃縮チップを、前記濃縮用分岐流路のうち、前記測定すべき試料が分離された溶液が流れる流路が前記請求項１の連続分離検出チップの試料分離用流路に連通するように、１以上接続したことを特徴とする請求項１記載の連続分離検出チップ。
前記電気泳動用電極は電解液溶液中に浸漬されており、
前記電解液の流路と前記濃縮用流路とを分離するセパレータを備えていることを特徴とする請求項２記載の連続分離検出チップ。
前記分離用流路および／または濃縮用流路の表面に酵素が固定されている請求項１から３のいずれか１項記載の連続分離検出チップ。
前記電解液の流路と前記濃縮用流路とを分離するセパレータは、微小突起構造を介して前記電解液の流路および前記濃縮用流路と接触する塩橋または高分子膜である請求項３から４のいずれか１項記載の連続分離検出チップ。
電気化学検出器の検出用電極が、バンド電極、バンド電極アレイ（くし型電極）、微小ディスク電極、微小ディスク電極アレイのいずれかである請求項１から５のいずれか１項記載の連続分離検出チップ。
前記電気泳動用電極が白金であり、前記検出用電極が金属、金属酸化物、炭素よりなる群より選択された１以上の材料より構成されていることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載の連続分離検出チップ。
前記分離用流路に固定された酵素と異なる酵素を、電気化学検出器の上流または前記電気化学検出器の検出用電極に固定したことを特徴とする請求項３記載の連続分離検出チップ。
前記分離用流路または濃縮用流路へ試料を導入するためにガラスキャピラリーあるいは微小透析膜付プローブが使用される請求項１から８のいずれか１項記載の連続分離検出チップ。
前記分離用流路の流路幅は５ｍｍ以下であることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載の連続分離検出チップ。