JP2004226358A

JP2004226358A - バイオセンサ

Info

Publication number: JP2004226358A
Application number: JP2003017383A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Nakayama; 浩中山
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 2003-01-27
Filing date: 2003-01-27
Publication date: 2004-08-12

Abstract

【課題】試料量が極微量であっても測定感度が高いバイオセンサ及びその製造方法を提供する。
【解決手段】基板１、基板１との間に試料供給路を形成するカバー部材１１，１５、対極５、基板１上に設けられた作用極３、及び酵素を含む試薬を備え、対極５の少なくとも一部及び試薬の少なくとも一部が試料供給路内に設けられ、作用極３の表面に凹凸を有するバイオセンサ。
【選択図】図１

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれる測定対象物を定量的に測定するためのバイオセンサに関する。
【０００２】
【従来の技術】
スクロース、グルコースなど糖類の定量分析法として、施光度計法、比色法、還元滴定法および各種クロマトグラフィーを用いた方法等が開発されている。しかし、これらの方法は、いずれも糖類に対する特異性があまり高くないので精度が悪い。これらの方法のうち施光度計法によれば、操作は簡便ではあるが、操作時の温度の影響を大きく受ける。従って、施光度計法は、一般の人々が家庭などで簡易に糖類を定量する方法としては適切でない。
【０００３】
ところで、近年、酵素の有する特異的触媒作用を利用した種々のタイプのバイオセンサが開発されている。
【０００４】
以下に、試料中の基質の定量法の一例としてグルコースの定量法について説明する。電気化学的なグルコースの定量法としては、酵素であるグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４：以下ＧＯＤと略す）と酸素電極あるいは過酸化水素電極とを使用して行う方法が一般に知られている（例えば、非特許文献１参照）。
【０００５】
ＧＯＤは、酸素を電子伝達体として、基質であるβ−Ｄ−グルコースをＤ−グルコノ−δ−ラクトンに選択的に酸化する。酸素の存在下で、ＧＯＤによる酸化反応過程において、酸素が過酸化水素に還元される。酸素電極によって、この酸素の減少量を計測するか、あるいは過酸化水素電極によって過酸化水素の増加量を計測する。酸素の減少量および過酸化水素の増加量は、試料中のグルコースの含有量に比例するので、酸素の減少量または過酸化水素の増加量からグルコースの定量が行われる。
【０００６】
上記方法では、酵素反応の特異性を利用することにより、精度良く試料中のグルコースを定量することができる。しかし、反応過程からも推測できるように、測定結果は試料に含まれる酸素濃度の影響を大きく受ける欠点があり、試料に酸素が存在しない場合は測定が不可能となる。
【０００７】
そこで、酸素を電子伝達体として用いず、フェリシアン化カリウム、フェロセン誘導体、キノン誘導体等の有機化合物や金属錯体を電子伝達体として用いる新しいタイプのグルコースセンサが開発されてきた。このタイプのセンサでは、酵素反応の結果生じた電子伝達体の還元体を作用極上で酸化することにより、その酸化電流量から試料中に含まれるグルコース濃度が求められる。この際、対極上では、電子伝達体の酸化体が還元され電子伝達体の還元体の生成する反応が進行する。このような有機化合物や金属錯体を酸素の代わりに電子伝達体として用いることにより、既知量のＧＯＤとそれらの電子伝達体を安定な状態で正確に電極上に担持させて試薬層を形成することが可能となり、試料中の酸素濃度の影響を受けることなく、精度良くグルコースを定量することができる。またこの場合、酵素および電子伝達体を含有する試薬層を乾燥状態に近い状態で電極系と一体化させることもできるので、この技術に基づいた使い捨て型のグルコースセンサが近年多くの注目を集めている。使い捨て型のグルコースセンサにおいては、測定器に着脱可能に接続されたセンサに試料を導入するだけで容易にグルコース濃度を測定器で測定することができる（例えば、特許文献１参照）。
【０００８】
【特許文献１】
特開平３−２０２７６４号公報
【非特許文献１】
鈴木周一編、「バイオセンサー」、第１版、講談社、１９８４年３月１０日、ｐ．９１−１０２
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上記の様な従来のグルコースセンサを用いた測定では、数μｌオーダーの試料量で試料中の基質濃度を容易に求めることが可能であるが、近年、更に微量（１μｌ以下）な試料での測定が可能なバイオセンサの開発が各方面において切望されている。
【００１０】
試料量を低減するには、試料が供給される空間（試料供給路）の容積を小さくする必要があり、それに伴って作用極面積も小さくなり、その結果得られる電流量が減り測定感度が減少するという問題点があった。
【００１１】
そこで本発明は、上記従来の問題点に鑑み、試料量が極微量であっても測定感度が高いバイオセンサ及びその製造方法を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
上記の課題を解決するために本発明のバイオセンサは、基板、前記基板との間に試料供給路を形成するカバー部材、対極、前記基板上に設けられた作用極、及び酵素を含む試薬を備え、前記対極の少なくとも一部及び前記試薬の少なくとも一部が前記試料供給路内に設けられ、前記作用極の表面に凹凸を有することを特徴とする。
【００１３】
また本発明のバイオセンサの製造方法は、基板に凹凸を形成する工程Ａ、前記基板上に作用極を形成する工程Ｂ、対極を形成する工程Ｃ、酵素を含む試薬を設ける工程Ｄ、及び前記基板とカバー部材とを組み合わせる工程Ｅを有することを特徴とする。
【００１４】
また本発明のバイオセンサの製造方法は、他の態様において、基板上に作用極を形成する工程Ａ、前記作用極の表面に凹凸を設ける工程Ｂ、対極を形成する工程Ｃ、酵素を含む試薬を設ける工程Ｄ、及び前記基板とカバー部材とを組み合わせる工程Ｅを有することを特徴とする。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明のバイオセンサは、基板、前記基板との間に試料供給路を形成するカバー部材、対極、前記基板上に設けられた作用極、及び酵素を含む試薬を備え、前記対極の少なくとも一部及び前記試薬の少なくとも一部が前記試料供給路内に設けられ、前記作用極の表面に凹凸を有することを特徴とする。このようにすると、作用極の表面に凹凸がない場合と比較して、試料供給路の容積が小さくなるため、試料量を低減することができる。また、作用極の面積が増加するので、得られる電流量が増加して測定感度を向上させることができる。ここで、基板の表面に凹凸を有していてもよい。
【００１６】
また、作用極の表面の凹凸に加えて、前記作用極が設けられた部分を除く基板の表面に凹凸を有してもよい。また、カバー部材の表面であって、前記試料供給路に面した位置に凹凸を有してもよい。このようにすると、作用極の面積を低減することなく、さらに試料供給路の容積を小さくすることができるので、試料量をさらに低減することができる。
【００１７】
ここで、試料供給路内であって、センサ内に試料が供給される部分から作用極までの間に凹凸が形成されていることが好ましい。このようにすると、試料導入時に液体の乱流が起きて、試料が均一に導入され、試料と試薬との混合が容易となる。
【００１８】
また、作用極の表面における凹凸の段差が、２０〜５００μｍであることが好ましい。作用極の表面における凹凸の段差が、５０〜２５０μｍであることがさらに好ましい。
【００１９】
また、凹凸の形状としては、円柱、半円形、球形、三角錐等の多角錘、三角柱等の多角柱等が挙げられる。また、凹凸が規則的に設けられていることが好ましい。
【００２０】
本発明のバイオセンサにおいて、基板及びカバー部材としては、電気絶縁性を有し、保存および測定時に充分な剛性を有する材料であれば用いることができる。例えば、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、飽和ポリエステル樹脂等の熱可塑性樹脂、または尿素樹脂、メラニン樹脂、フェノール樹脂、エポキシ樹脂、不飽和ポリエステル樹脂等の熱硬化性樹脂があげられる。中でも、電極との密着性の点から、ポリエチレンテレフタレートが好ましい。
【００２１】
作用極としては、電子伝達体を酸化する際にそれ自身が酸化されない導電性材料であれば用いることができる。中でも、導電性材料が貴金属であることが好ましい。対極としては、パラジウム、銀、白金、カーボン等の一般的に用いられる導電性材料であれば用いることができる。
【００２２】
本発明のバイオセンサにおいては、電解メッキ、印刷、スパッタリング、レーザ加工、蒸着または噴射メッキ等によって、厚みが薄い部分と厚い部分とを有するように導電性材料を基板上に形成することにより、表面に凹凸を有する作用極を作製することができる。
【００２３】
また本発明のバイオセンサの製造方法は、基板に凹凸を形成する工程Ａ、前記基板上に作用極を形成する工程Ｂ、対極を形成する工程Ｃ、酵素を含む試薬を設ける工程Ｄ、及び前記基板とカバー部材とを組み合わせる工程Ｅを有するを特徴とする。工程Ａでは、基板上にホットエンボシング加工、射出成型加工、混練加工またはレーザ加工等により凹凸を形成し、その後工程Ｂにおいて、その凹凸上に導電性材料を形成することにより作用極を作製する。
【００２４】
また本発明のバイオセンサの製造方法は、他の態様において、基板上に作用極を形成する工程Ａ、前記作用極の表面に凹凸を設ける工程Ｂ、対極を形成する工程Ｃ、酵素を含む試薬を設ける工程Ｄ、及び前記基板とカバー部材とを組み合わせる工程Ｅを有することを特徴とする。工程Ａでは、導電性材料を基板上に実質的に平坦となるように形成することにより作用極を形成し、その後工程Ｂにおいて、作用極を構成する導電性材料の表面をエッチングすることにより作用極の表面に凹凸を設ける。
【００２５】
試薬に含まれる酵素としては、試料中に含まれる測定対象である基質に対応したものを用いればよい。例えば、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ等が挙げられる。
【００２６】
また、試薬に電子伝達体を含むことが好ましく、電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノン、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセン誘導体等が挙げられる。また、酸素を電子伝達体とした場合にも電流応答が得られる。電子伝達体は、これらの一種または二種以上が使用される。
【００２７】
以上の試薬は、作用極または対極中に、導電性材料と混合した形で設けられていても良い。
【００２８】
また、試料供給路内に親水性高分子を設けても良い。親水性高分子としては種々のものを用いることができ、例えば、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリリジン等のポリアミノ酸、ポリスチレンスルホン酸、ゼラチンおよびその誘導体、ポリアクリル酸およびその塩、ポリメタアクリル酸およびその塩、スターチおよびその誘導体、無水マレイン酸またはその塩の重合体が挙げられる。中でも、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳しく説明する。基板及び電極の形状、材質及び凹凸加工技術は以下に示す実施例に限定される訳ではない。以下の実施例においては、バイオセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。
【００３０】
（実施例１）
図１及び図２を用いて、本発明の実施例１を説明する。図１は、本実施例におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図であり、図２は、作用極部分の縦断面図である。
【００３１】
まず、基板１としてポリカーボネートを用い、射出成型加工により、基板１の表面に段差が２０μｍの凹凸を形成した。この基板１上にパラジウムをスパッタリングし、トリミングにより作用極３、作用極リード２、対極５、及び対極リード４を作製した。
【００３２】
このように作製した基板１上に、スリット１２を有するスペーサー１１を貼付した。次に、酵素であるＧＯＤおよび電子伝達体であるフェリシアン化カリウムを含有する水溶液を、基板１の作用極３および対極５上に滴下した後乾燥して試薬層７を形成した。さらに、試薬層７上に、界面活性剤であるレシチンを含有する界面活性剤層９を形成した。
【００３３】
最後に、スペーサー１１上にカバー１５を接着することにより、グルコースセンサを作製した。
【００３４】
ここで、スペーサー１１とカバー１５とにより構成されるカバー部材は、基板１と組み合わされることにより、基板１との間に試料供給路を形成している。また、カバー１５の空気孔１４は、この試料供給路に連通しているので、スリット１２の解放端に形成される試料供給口１３に試料を接触させれば、毛管現象により、試料は容易に試料供給路内にある試薬層７に達する。
【００３５】
また、基板の表面に凹凸を形成しない点以外は、本実施例と同様の製造方法によりグルコースセンサを作製し、比較例とした。
【００３６】
次に、本実施例において、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行った。本実施例では、試料を試料供給口１３から試料供給路に供給し、一定時間経過後に、対極５を基準にして作用極３に３００ｍＶの電圧を印加した。この電圧印加により、作用極３と対極５との間に流れた電流値を測定したところ、試料中のグルコース濃度に比例した電流応答が観察された。
【００３７】
本実施例のグルコースセンサの方が、比較例のグルコースセンサと比べてより高い応答値が得られた。本実施例のグルコースセンサは、作用極及び対極の表面に凹凸を有しているため、比較例のグルコースセンサと比べて試料供給路の容積が小さくなっていることから、センサ内に供給される試料量はより少なくなっている。したがって、本実施例のグルコースセンサによって、より少ない試料量で、高い測定感度を得ることができた。
【００３８】
（実施例２）
図３を用いて、本発明の実施例２を説明する。図３は、本実施例におけるグルコースセンサの縦断面図である。
【００３９】
まず、基板１としてポリカーボネートを用い、基板１上に銀薄膜をマスクを用いて印刷することにより、表面に段差が２０μｍの凹凸を有する導電性材料の層を形成した。その後レーザートリミングにより、作用極３、作用極リード２、対極５、及び対極リード４を作製した。
【００４０】
以下、実施例１と同様の工程により、グルコースセンサを作製した。
【００４１】
本実施例のグルコースセンサを用いて、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行った結果、実施例１と同様の効果が得られた。
【００４２】
（実施例３）
図４を用いて、本発明の実施例３を説明する。図４は、本実施例におけるグルコースセンサの縦断面図である。
【００４３】
まず、ポリカーボネートからなる基板１上に、スピンコートを用いて、シリカ粒子を含んだポリスチレン薄膜を形成することにより、表面に段差が２０μｍの凹凸を有するポリスチレン膜１６を形成した。その後、この膜上にパラジウムをスパッタリングし、トリミングにより作用極３、作用極リード２、対極５、及び対極リード４を作製した。
【００４４】
以下、実施例１と同様の工程により、グルコースセンサを作製した。
【００４５】
本実施例のグルコースセンサを用いて、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行った結果、実施例１と同様の効果が得られた。
【００４６】
（実施例４）
図５を用いて、本発明の実施例４を説明する。図５は、本実施例におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【００４７】
まず、基板１としてポリカーボネートを用い、射出成型加工により、基板１の表面に段差が２０μｍの凹凸を形成した。この基板１上にパラジウムをスパッタリングし、トリミングにより作用極３、作用極リード２、対極５、及び対極リード４を作製した。実施例１と異なり、作用極３が設けられた部分を除く基板１の表面であって、試料供給路に面した位置にも凹凸が設けられている。
【００４８】
以下、実施例１と同様の工程により、グルコースセンサを作製した。
【００４９】
次に、本実施例のグルコースセンサを用いて、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行い、実施例１のグルコースセンサと比較した。その結果、実施例１のグルコースセンサと同等の応答値が得られた。したがって、本実施例のグルコースセンサにより、より少ない試料量で、高い測定感度を得ることができた。
【００５０】
（実施例５）
図６を用いて、本発明の実施例５を説明する。図６は、本実施例におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【００５１】
カバー１５の表面であって、試料供給路に面した位置に段差が２０μｍの凹凸を形成した点以外は、実施例１と同様にして、グルコースセンサを作製した。
【００５２】
次に、本実施例のグルコースセンサを用いて、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行い、実施例１のグルコースセンサと比較した。その結果、実施例１のグルコースセンサと同等の応答値が得られた。したがって、本実施例のグルコースセンサにより、より少ない試料量で、高い測定感度を得ることができた。
【００５３】
（実施例６）
図７を用いて、本発明の実施例６を説明する。図７は、本実施例におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図である。
【００５４】
実施例４と同様の基板及び実施例５と同様のカバーを用いた点以外は、実施例１と同様にして、グルコースセンサを作製した。
【００５５】
次に、本実施例のグルコースセンサを用いて、一定量のグルコースを含む溶液を試料としてグルコース濃度の測定を行い、実施例４及び５のグルコースセンサと比較した。その結果、実施例４及び５のグルコースセンサと同等の応答値が得られた。したがって、本実施例のグルコースセンサにより、さらに少ない試料量で、高い測定感度を得ることができた。
【００５６】
【発明の効果】
以上のように本発明によれば、試料量が極微量であっても測定感度が高いバイオセンサ及びその製造方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図
【図２】同グルコースセンサの作用極部分の縦断面図
【図３】本発明の他の実施の形態におけるグルコースセンサの縦断面図
【図４】本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの縦断面図
【図５】本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図
【図６】本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図
【図７】本発明のさらに他の実施の形態におけるグルコースセンサの試薬層及び界面活性剤層を除いた分解斜視図
【符号の説明】
１基板
２作用極リード
３作用極
４対極リード
５対極
７試薬層
９界面活性剤層
１１スペーサー
１２スリット
１３試料供給口
１４空気孔
１５カバー
１６ポリスチレン膜

Claims

基板、前記基板との間に試料供給路を形成するカバー部材、対極、前記基板上に設けられた作用極、及び酵素を含む試薬を備え、前記対極の少なくとも一部及び前記試薬の少なくとも一部が前記試料供給路内に設けられ、前記作用極の表面に凹凸を有することを特徴とするバイオセンサ。
基板の表面に凹凸を有することを特徴とする、請求項１記載のバイオセンサ。
作用極の表面の凹凸に加えて、前記作用極が設けられた部分を除く基板の表面に凹凸を有することを特徴とする、請求項２記載のバイオセンサ。
カバー部材の表面であって、前記試料供給路に面した位置に凹凸を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
作用極の表面における凹凸の段差が、２０〜５００μｍであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオセンサ。
基板に凹凸を形成する工程Ａ、前記基板上に作用極を形成する工程Ｂ、対極を形成する工程Ｃ、酵素を含む試薬を設ける工程Ｄ、及び前記基板とカバー部材とを組み合わせる工程Ｅを有する、バイオセンサの製造方法。
基板上に作用極を形成する工程Ａ、前記作用極の表面に凹凸を設ける工程Ｂ、対極を形成する工程Ｃ、酵素を含む試薬を設ける工程Ｄ、及び前記基板とカバー部材とを組み合わせる工程Ｅを有する、バイオセンサの製造方法。