JPH05281181A

JPH05281181A - 酵素修飾電気化学検出器およびその製造方法

Info

Publication number: JPH05281181A
Application number: JP4074158A
Authority: JP
Inventors: Osamu Niwa; 修丹羽; Hisao Tabei; 久男田部井; Tsutomu Horiuchi; 勉堀内
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 1993-10-29

Abstract

(57)【要約】【目的】感度、応答性に優れた酵素修飾電気化学検出
器の製造方法を提供する。【構成】基板５１に作用電極５３を形成し、作用電極
５３以外の基板５１の表面に絶縁膜５４を形成し、絶縁
膜５４の表面にアミノ基５５を導入し、アミノ基５５に
酵素５６を固定化させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は体液中の生理活性物質の
測定、臨床検査、食品などの製造工程管理、水中の環境
計測などに使用する電気化学バイオセンサー、クロマト
グラフィやフローインジェクション装置の検出器に使用
する酵素修飾電気化学検出器およびその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】溶液中に溶解している原子、分子、イオ
ンの検出の方法として電気化学反応に伴う電流を検出す
る方法が広く使用され、体液中の生理活性物質、廃液や
食品中の重金属イオンなどの検出に応用されている。

【０００３】この方法では目的物質が電気化学的に活性
であること、すなわち、比較的低い電位を印加すること
により目的物質が酸化または還元反応して電極との間で
電子の出入りが起こることが必要で、血液中の糖類など
電位変化に対して安定な物質の検出には利用することが
難しかった。電気化学的に非活性な物質を検出する方法
として生体反応と電気化学反応を組み合せる方法が開発
され、バイオセンサーとして応用領域が拡大している
（例えば「バイオセンサー」鈴木周一著、講談社、１９
８４年記載など）。バイオセンサーの中でも酵素を電極
上に固定化した酵素電極は酵素反応により目的物質（基
質）を電気化学的に活性な物質に変換した後、電極反応
を用いて電流を検出するかまたは酵素反応によって溶液
中の酵素量の減少を電気化学的に評価する原理を利用し
ている。これまでに、グルコースなどの糖類のセンサー
では実用化され、Ｌ−アスコルビン酸、尿素、コレステ
ロール、アルコールなどのセンサーが研究されている。
近年、血管などに直接センサーを挿入して体液中の生理
活性物質を直接モニターする必要から、センサーの小型
化が求められている。また、免疫検定法や免疫センサー
のラベルにも酵素が使用され、検出器として高感度なも
のや微量サンプルに対応できるものが要求されている。

【０００４】微小で高感度な酵素電極（センサー）を作
製するため、微小電極上に酵素膜を修飾した検出器が報
告されている。微小電極の多くは、ガラス細管中に白
金、金などの金属線、炭素繊維などを封入して使用す
る。この微小電極の応答挙動は電極形状に依存し、電極
サイズが減少するに従って応答速度、Ｓ／Ｎ比が向上
し、原理的には高感度化ができるため種々の電極形状や
微細化が検討されている。

【０００５】しかし、微小電極ではミクロンオーダーへ
の微細化により、検出できる電流値はｎＡオーダー以下
に低下し、測定時に外部ノイズに敏感になる等の理由で
測定が困難になる。このため、微小電極の数を増やして
（アレイ化して）、微小電極の高電流密度、充電電流に
対する高Ｓ／Ｎ比などの特徴を保持させたままで絶対電
流値を増加させることが提案されている。微小電極や微
小アレイ電極上に酵素膜を堆積させるのは困難であるた
め電極を酵素を懸濁させた高分子溶液に浸漬し電極およ
び電極をシールしている絶縁膜全体に酵素膜を形成する
方法が一般的であった。また、近年リソグラフィ技術の
利用により基板上に微小電極が再現性良く作製されるよ
うになってきたため酵素を含む高分子のスピンコートに
より容易に酵素修飾電極を多数作製できる。

【０００６】しかしながら、この方法では近接した複数
の電極に別々の酵素膜を修飾することは困難で、多種の
センサーを修飾することができなかった。目的の微小電
極上のみに酵素膜を修飾する方法として、電解重合法や
メッキ法が知られている。電解重合法ではピロール、チ
オフェン、アニリンを含む溶液に電極を浸し電気化学的
に酸化反応を行うと、電極上に導電性の膜が得られる方
法を利用しており、重合の際にモノマーと共に溶液中に
酵素分子を分散させておくと、重合時にポリマー中に酵
素が取り込まれ酵素膜が電位を印加した電極上のみに形
成される方法である。また、メッキ法も白金が電位を印
加した電極上のみにメッキされ白金黒を形成する際に酵
素を同時に白金黒膜中へ取り込む方法で電解重合法と同
様に特定の微小な電極上のみに酵素膜を作製することが
できる。白黒金は電解重合で作製した導電性膜に比較し
導電性が大きくまた安定なため特性の良いグルコースセ
ンサーなどが報告されている（例えば、逢坂哲弥、小山
昇、電気化学法：応用測定マニュアル、講談社サイエ
ンティフィックｐ７７，１９９０年）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
酵素電極では電極上に直接酵素膜を固定して検出が行わ
れており、微小電極の特長である速い応答性を維持する
ことは困難で、電極上に形成した膜の性質によっては膜
中での酵素反応生成物の拡散速度が小さく高い感度が得
られない問題点を有していた。さらに、電極上に電解重
合法やメッキ法により導電性の酵素膜を作製する方法で
は電極電位を掃引した場合、表面積の増加による充電電
流が増大した。特に、電解重合法では膜の再現性に問題
があった。

【０００８】近年、リソグラフィ技術の応用により微小
電極を基板上に多数配列し、電極自体に電流増幅機能や
選択性を付与しようとする試みがなされている。例え
ば、２つ以上の多数の電極を近接して配列することがで
きるため２つの近接した作用電極に別々の電位を印加す
ると、非常に高い酸化還元種のレドックスサイクルが起
こり電流を４０倍以上に増幅することができる（Ｊ．Ｅ
ｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｒｅｌｉｍｉｎａ
ｒｙｎｏｔｅ，２６７巻、ｐ２９１，１９８９年）。
さらに、Ｌ−アスコルビン酸のような非可逆な分子の存
在化で可逆な分子のみを検出する際に、くし形電極の一
方を掃引して両方の分子を酸化し他方の電極の電位を目
的分子の還元電位に固定して測定を行うと、両者の酸化
体の寿命の差より可逆な目的分子のみを選択的に検出す
ることができる。また、一方の電極を電位掃引し、他方
の電極で検出を行うことにより充電電流の影響が少ない
測定が可能で１０ｎＭの高い検出度が得られている。

【０００９】これらの機能を有する電極に酵素膜を修飾
して酵素電極検出器を作製する際、電極の機能を維持し
たまま修飾を行うことが重要である。しかし、複数の微
小電極を修飾する際に電極上に直接修飾を行うと、電極
自体が本来有する機能を発揮させることができない問題
点があった。

【００１０】裸の微小電極の感度や応答性を維持したま
ま修飾電極を作製するには電極の周辺のみに膜を作製す
る方法が考えられる。通常のサイズの電極では酵素膜を
電極近傍に作製しても酵素反応生成物が電極内部まで拡
散するには長い時間が必要で電極内部は電気化学反応に
殆ど利用されず効率が悪い。一方、微小電極の電極近傍
に膜を修飾した場合には電極中心までの拡散距離が短く
電極上でほぼ一様に電気化学反応が起こると予想され
る。しかしながら、微小電極近傍や微小電極間の絶縁性
部分のみに修飾するのは非常に困難である。半導体作製
の際に使用するレジスト膜に酵素をブレンドしてホトリ
ソグラフィ技術により酵素膜パターンを作製する方法が
提案されている（例えば、ＡｎａｌｙｔｉｃａＣｈｉ
ｍｉｃａＡｃｔａ，２５１（１９９１）１１７）。この
方法では基板が導電性、絶縁性にかかわらず微細な酵素
膜パターンを作製することができる。しかしながら、こ
の方法ではレジスト中へ酵素膜をブレンドする必要があ
り使用できるレジストに制限がある。また、リソグラフ
ィプロセスの際に酵素が活性を失う可能性があるため使
用する酵素の種類やプロセスに使用する現像液、溶媒、
温度等に制限があった。

【００１１】そこで、本発明の目的は、上記の問題点を
解決し、感度、応答性に優れた酵素修飾電気化学検出器
およびその製造方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るために、本発明の酵素修飾電気化学検出器は、少なく
とも表面が絶縁性である基板上に形成された少なくとも
一つの作用電極を有する酵素修飾電気化学検出器におい
て、前記作用電極の近傍に酵素膜が固定化されているこ
とを特徴とする。

【００１３】また、本発明の酵素修飾電気化学検出器
は、少なくとも表面が絶縁性である基板上に複数の作用
電極が微小間隙により分離され、前記作用電極間に酵素
膜が固定化されていることを特徴とする。

【００１４】さらに、本発明の酵素修飾電気化学検出器
の製造方法は、絶縁体によって互いに隔てられた複数の
作用電極を有する酵素修飾電気化学検出器の製造方法に
おいて、前記複数の作用電極を少なくとも表面が絶縁性
の基板上に形成する工程と、前記複数の作用電極を隔て
る前記絶縁体の表面に酵素に対して活性な活性基を導入
する工程と、該活性基が導入された前記絶縁体の表面に
酵素膜を固定化する工程とを含むことを特徴とする。

【００１５】

【作用】発明者らは酸化膜付きシリコン基板上に微小く
し形電極を作製した後、電極をアルカリ処理、酸処理し
て酸化シリコン部分に水酸基を導入し、それを利用して
酵素の固定化を行うと金や白金電極上には水酸基が殆ど
存在しないために電極間の微小間隙のみに酵素膜を作製
できることを見いだした。さらに、この方法によりくし
形電極間に電気化学的に可逆な生成物を産出する酵素を
固定化し生成物の測定を行った所、くし形電極の２つの
電極電位をそれぞれ生成物の酸化還元電位以上と酸化還
元電位以下に設定した時、電極間で高いレドックスサイ
クルが得られ電流増幅が得られること、さらに、電極の
応答性も殆ど変化しないことを見いだし本発明に至っ
た。また、リソグラフィ工程を終わった後、酵素膜を固
定化するため固定化による活性の低下は少なかった。さ
らに、リソグラフィ技術により電極間にクロロメチル化
ポリスチレンの微細パターンを作製し、光反応によって
残ったクロロメチル基を用いて酵素固定を行っても同様
に電極間に酵素膜パターンを得ることができることを見
いだした。

【００１６】酵素修飾電気化学検出器に用いる少なくと
も表面が絶縁性の基板としては、酸化膜が形成されたシ
リコン基板、窒化膜が形成されたシリコン基板、ガラス
基板、酸化アルミニウム基板、プラスチック基板を挙げ
ることができる。また、作用電極用の金属としては、
金、白金、クロム、チタン、ステンレス、銅、銀などを
挙げることができる。また、作用電極用の半導体として
は、ｐ型およびｎ型シリコン、ｐ型およびｎ型ゲルマニ
ウム、硫化カドミウム、二酸化チタン、酸化亜鉛、ガリ
ウムリン、ガリウムヒ素、インジウムリン、カドミウム
セレン、カドミウムテルル、二酸化モリブデン、セレン
化タングステン、二酸化銅、酸化インジウム、酸化ス
ズ、インジウム−スズ酸化物が挙げられる。作用電極用
の半金属として、導電性カーボンを挙げることができ
る。体液と電極リード部分とを隔てる絶縁膜としては、
酸化シリコン、二酸化シリコン、窒化シリコン、シリコ
ン樹脂、ポリイミドおよびその誘導体、エポキシ樹脂、
高分子熱硬化物などを挙げることができる。参照電極上
の参照物質としては、銀、銀／塩化銀、ポリビニルフェ
ロセン等を挙げることができる。作用電極近傍、また
は、作用電極間に固定化する酵素としては、グルコース
オキシターゼ、アルカラインホスフェターゼ、アルコー
ルオキシデース、コレステロールオキシデース、ジアホ
ラーゼ、ガラクトースオキシターゼ、コリンオキシデー
ス、Ｌ−アスコペートオキシターゼ等を挙げることがで
きる。酵素を固定化する方法としては、電極の作製に使
用した基板の表面処理により活性な置換基を導入して酵
素を共有結合により固定化するか、または作用電極の近
傍または作用電極間に置換基を持つ高分子のパターンを
作製し、この高分子と上記に例示した酵素とを反応させ
る方法、水溶性高分子の架橋物などの多孔性材料のパタ
ーンを形成し、酵素を吸着または吸収により固定化する
方法などを挙げることができる。

【００１７】

【実施例】以下、本発明の酵素修飾電気化学検出器の構
成について、実施例によって具体的に説明する。なお、
本発明はこれらの実施例の内容に限定されるものではな
い。

【００１８】（実施例１）実施例１において微小孔電極
の周辺にグルコースオキシターゼを固定化した酵素修飾
電気化学検出器の作製方法について図１を用いて説明す
る。

【００１９】シリコンウエハ基板１１（大阪チタニウム
社製）上に酸化膜１２を形成し、１μｍの厚さの酸化膜
付きシリコンウェハを形成した（図１（Ａ））。スパッ
タ装置（アネルバ製：ＳＰＦ−３３２Ｈ）内の所定の位
置に酸化膜付きシリコンウエハをメタルマスクと共に取
付け、クロム、白金、二酸化シリコンを順次スパッタデ
ポジションを行った。圧力を０．０１Ｔｏｒｒとし、ア
ルゴン雰囲気下で、クロムを５０Ｗで、１０秒間、白金
を７０Ｗで、１分間、二酸化シリコンを５０Ｗで、１０
分間スパッタリングを行いクロム／白金膜１３を１００
ｎｍの膜厚に、二酸化シリコン膜１４を３００ｎｍの膜
厚に形成した（図１（Ｂ））。その後、上記のクロム／
白金膜１３および二酸化シリコン膜１４を形成した基板
上に、ホトレジスト（東京応化社製：ＴＳＭＲ−Ｖ３）
を１μｍの厚さに塗布した。上記のレジストが塗布され
たシリコンウエハをオーブン中に入れ９０℃、９０秒の
条件下でベークした。その後、クロムマスクを用いてマ
スクアライナ（キヤノン製）により２０秒間密着露光し
た。露光したシリコンウエハをレジスト現像液（東京応
化社製）中で、２０℃、４０秒間現像を行い、水洗、乾
燥してマスクパターンをレジストに転写した（図１
（Ｃ））。現像後、上記の基板を反応性イオンエッチン
グ装置（アネルバ社製：ＤＥＭ−４５１）中に入れ、Ｃ
₂ Ｆ₆ ガスを流量を２５ＳＣＣＭとし、圧力を０．２５
Ｐａとし、１５０Ｗの条件下で１０分間、二酸化シリコ
ンをエッチングして、多数の微小孔をうがち、その底面
に作用電極を露出させた（図１（Ｄ））。以下、この作
用電極を微小孔電極１５と言う。各微小孔電極１５の直
径は１μｍ、個数は１００００個とした。

【００２０】次に、パターン化した上記の基板上に、再
度ホトレジストを１μｍの厚さに塗布した。レジストが
塗布されたシリコンウエハをオーブン中に入れ９０℃、
９０秒の条件下でベークした。その後、クロムマスクを
用いてマスクアライナ（キヤノン製）により２０秒間密
着露光した。露光したシリコンウエハをレジスト現像液
（東京応化社製）中で、２０℃、４０秒間現像を行い、
水洗、乾燥してマスクパターンをレジストに転写した。
現像後、上記のシリコンウエハをスパッタ装置内の所定
の位置に取付け、クロム、白金を順次デポジションし
た。その後、上記のシリコンウエハをメチルエチルケト
ン中に浸漬して超音波処理を行い、作用電極が形成され
た部分以外のレジストを剥離して参照電極１６および対
向電極１７を得た（図１（Ｅ））。

【００２１】上記の基板の参照電極１６のみにリード線
を接続して６０℃に加熱した銀メッキ液に浸漬し、参照
電極１６部分だけに電流密度を１ｍＡとし、３秒間通電
して銀メッキを行い、参照電極１６上へ酸化還元物質１
８として銀を析出させ、多数の微小孔電極を作用電極と
する微小電気化学測定用セルを得た。この電極セルパタ
ーンを有する基板を１Ｍの水酸化ナトリウム、１Ｍの塩
酸に順次浸漬して表面に水酸基を導入した後、５％の３
−アミノプロピルトリエトキシシランのアセトン溶液に
入れ、５０℃で１０時間加熱して微小孔電極１５、参照
電極１６および対向電極１７以外の絶縁膜の部分にアミ
ノ基を導入した。次に、このウエハは１０％のグルタル
アルデヒドを含むｐＨ７の０．１Ｍのリン酸緩衝溶液中
に入れ、常温（約２５℃）で２時間反応させた後、表面
を緩衝溶液を用いてリンスした。最後に、ウエハを１％
のグルコースオキシターゼを懸濁させたリン酸緩衝溶液
に浸し一昼夜放置して、絶縁膜の部分のみに固定化酵素
膜１９を形成した（図１（Ｆ））。酵素の固定化後、作
用電極上に非特異的に吸着した酵素を除去するため１Ｍ
の塩化ナトリウム溶液で作用電極の表面を十分に洗浄し
た。このようにして作製した酵素電極の模式的斜視図を
図２に示す。図２において図１と同一の構成には同一の
符号を付す。

【００２２】この酵素電極をポテンシオスタットに接続
し１０ｍＭの濃度のグルコースを含む０．１Ｍの塩化ナ
トリウム溶液に浸漬して０．７Ｖの電位を印加した所、
グルコースオキシターゼとグルコースとの反応により生
成する過酸化水素に基づく２２０ｎＡの酸化電流が観測
された。この酵素電極をフローセル内にセットし、流量
１ｍｌ／ｓｅｃで１０ｍＭのグルコースの注入を行った
所、２秒以下で１００％応答した。また、その時のピー
ク電流値は５２５ｎＡであった。グルコースの濃度を変
化させて電流値を測定したところ１００ｎＭから１０ｍ
Ｍの間で直線性が得られた。

【００２３】（実施例２）実施例２においては微小孔電
極の周辺のみにＬ−アスコベートオキシターゼを固定化
した酵素修飾電気化学検出器の性能について説明する。

【００２４】実施例１と同様な酵素電極上に同様な手法
を用いてＬ−アスコベートオキシターゼを固定化した。
この電極上に１μＭのドーパミンを含むリン酸緩衝溶液
を１０μｌ滴下し、０Ｖから０．６Ｖまで１００ｍＶ／
ｓｅｃの速度で電位掃引すると２．３ｎＡの限界電流が
得られた。次に、１μＭのドーパミンと１０μＭのＬ−
アスコルビン酸を含む溶液を酵素電極上に滴下し、５分
後に電位掃引を行ったところ電流値は３ｎＡとやや増加
した。一方、Ｌ−アスコルビン酸オキシターゼを固定し
ない酵素電極を用いて測定を行うとＬ−アスコルビン酸
の妨害効果により電流値は１２．５ｎＡとなり、Ｌ−ア
スコルビン酸オキシターゼを固定化した酵素電極では酵
素がＬ−アスコルビン酸を酸化するため、Ｌ−アスコル
ビン酸の妨害効果が抑制されてドーパミンを選択的に検
出することができた。

【００２５】（実施例３）実施例３においてバンドアレ
イ電極の電極間にグルコースオキシターゼを固定化した
酵素修飾電気化学検出器の作製方法について説明する。

【００２６】実施例１と同様な酸化膜が形成されたシリ
コンウエハ上にフォトレジスト（東京応化社製：ＴＳＭ
Ｒ−Ｖ３）を１μｍの厚みに塗布した。このレジストが
塗布されたシリコンウエハをオーブン中に入れ、９０
℃、９０秒の条件下でベークした。その後、クロムマス
クを用いてマスクアライナ（キヤノン製ＰＬＦ−５０
１）により１５秒間密着露光し、幅が２μｍ、間隔が２
μｍ、本数が５０本のバンドアレイの作用電極、および
参照電極、対向電極を露光させた。このようにして露光
したシリコンウエハをレジスト現像液（東京応化社製）
の中で、２０℃、４０秒間現像を行い、水洗、乾燥して
マスクパターンをレジストに転写した。このレジストが
形成された基板をスパッタ装置（アネルバ製：ＳＰＦ−
３３２Ｈ）内の所定位置に取付け、クロム、および白金
のスパッタデポジションを順次行った。圧力を１０^-2Ｔ
ｏｒｒとし，アルゴン雰囲気下で、クロムを１０秒間、
白金を１分間スパッタリングを行い、全体で１００ｎｍ
の膜厚とした。その後、上記の基板をメチルエチルケト
ン中に浸漬して超音波処理を行い、電極形成部以外のレ
ジストを剥離して電極パターンを得た。

【００２７】次に、基板をスパッタ装置内の所定位置に
取付け、二酸化シリコンのスパッタデポジションを行っ
た。圧力を１０^-2Ｔｏｒｒとし、温度が２５０℃のアル
ゴン雰囲気下で、１０分間スパッタリングを行い、全体
として３００ｎｍの膜厚とした。基板上へレジストを再
び塗布し、９０℃で、９０秒間ベーキングを行った後、
クロムマスクを用いて露光、現像し、バンドアレイ作用
電極、参照電極先端、対向電極部分を残して、レジスト
で基板を覆った。次に、このレジストをマスクにしてス
ピンオングラスをＣＦ₄ ガスによりアネルバ製ＤＥＭ４
５１を使用してエッチングし、バンドアレイ作用電極、
参照電極先端、対向電極部分を露出させた。その後、電
極基板を銀メッキ液中に浸漬し、参照電極部分のみに電
流密度を１ｍＡとし、１０秒間通電して、参照電極上に
銀を析出させた。露出させたバンドアレイ部分の長さは
２ｍｍとした。この電極セルを実施例１と同様な方法に
より作用電極間に露出した二酸化シリコン部分のみにグ
ルコースオキシターゼを固定化した。

【００２８】酵素の固定化中、電極セル内の絶縁膜以外
に固定化が起こらないようにリードを覆っている二酸化
シリコンのパッシベーション膜は粘着性のテフロンテー
プによりマスクした。酵素の固定化後、このようにして
作製した酵素電極をポテンシオスタットに接続し１ｍＭ
の濃度のグルコースを含む０．１Ｍの塩化ナトリウム溶
液に浸漬けして０．７Ｖの電位を印加したところ、グル
コースオキシターゼとグルコースとの反応に基づく８５
ｎＡの酸化電流が観測された。この酵素電極をフローセ
ル内にセットし、流量１ｍｌ／ｓｅｃで１ｍＭのグルコ
ースの注入を行ったところ、２秒以下で１００％応答し
た。また、この時のピーク電流値は２４５ｎＡであっ
た。グルコースの濃度を変化させて電流値を測定したと
ころ１００ｎＭから１０ｍＭの間において直線性が得ら
れた。

【００２９】（実施例４）実施例４において微小くし形
電極の電極間にアルカリフォスフェターゼを固定化した
酵素修飾電気化学検出器の作製方法について図３を用い
て説明する。

【００３０】シリコンウエハ基板３１上に厚さ１μｍの
酸化膜３２を形成し、フォトレジスト３３を１μｍの厚
みにスピンコートした（図３（Ａ））。このレジストが
塗布されたシリコンウエハをオーブン中に入れ、９０
℃、９０秒の条件下でベークした。その後、クロムマス
クを用いてマスクアライナ（キヤノン製ＰＬＦ−５０
１）により２０秒間密着露光した。露光したシリコンウ
エハーをレジスト現像液（シプレー社製、ＡＺデベロバ
ー）の中で、２０℃、１２０秒間現像を行い、水洗、乾
燥してマスクパターンをレジストに転写した（図３
（Ｂ））。

【００３１】このレジストが塗布された基板をスパッタ
装置（アネルバ製：ＳＰＦ−３３２Ｈ）内の所定位置に
取付け、クロム、および白金のスパッタデポジションを
順次行った。圧力を１０^-2Ｔｏｒｒとし、アルゴン雰囲
気下で、クロムを１０秒間、白金を１分間スパッタリン
グを行い、全体として１００ｎｍの膜厚とした。その
後、上記の基板をメチルエチルケトン中に浸漬して超音
波処理を行い、電極形成部以外のレジストを剥離して酸
化側のくし形電極３４と還元側のくし形電極３５を得た
（図３（Ｃ））。その後、この電極基板をプラズマＣＶ
Ｄ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｅｒｉａｌｓ社製、Ａ
ＭＰ−３３００）に入れ、シランガスを２３ＳＣＣＭ、
アンモニアガスを４８ＳＣＣＭの流量で流し、ガス圧を
０．２Ｔｏｒｒとし、投入電力を５００Ｗとし、基板温
度を３００℃として１０分間堆積を行い、４００ｎｍの
厚さの窒化シリコン膜３６によりこの基板を被覆した
（図３（Ｄ））。

【００３２】次に、基板上へレジストを再び塗布し、９
０℃において、９０秒間ベーキングを行った後、マスク
を用いて露光、現像し、くし形作用電極、参照電極先
端、対向電極部分を残して、レジストを用いて覆った
（図３（Ｅ））。次に、このレジストをマスクにして窒
化シリコン膜をＣＦ₄ ガスによりアネルバ製ＤＥＭ４５
１を使用して反応性イオンエッチングし、くし形作用電
極を露出させた（図３（Ｆ））。

【００３３】このようにして作製した酵素修飾電気化学
検出器は、くし形作用電極の電極幅を３μｍ、ギャップ
を２μｍ、くしの長さを２ｍｍ、くしの本数を５０対と
した。このくし形作用電極を実施例１と同様な方法によ
り作用電極間に露出した二酸化シリコンの表面をアミノ
化し、グルタルアルデヒドを反応させた後、１ｗｔ％の
アルカリホスフェターゼを懸濁させた酢酸緩衝溶液中に
２０時間以上浸漬させて作用電極間に固定化酵素膜３７
を形成した。その後、このようにして形成した電極セル
を１Ｍの塩化ナトリウム溶液で洗浄して非特異的に作用
電極表面に吸着した酵素を除去して酵素が修飾されたく
し形電極を得た（図３（Ｇ））。

【００３４】このくし形電極をデュアルポテンシオスタ
ットに接続して１ｍＭのパラアミノフェニルホスフェー
トを含むｐＨ９の緩衝溶液中に浸漬し、くし形電極の一
方の電位を−０．２Ｖに固定して、他方の電位を−０．
２Ｖから０．５Ｖまで電位掃引すると、電位を掃引した
側で６５０ｎＡの酸化限界電流、電位を固定した側で６
００ｎＡの還元限界電流が観測され、くし形電極間にお
ける酵素反応により生成したパラアミノフェノールがく
し形電極上に拡散して容易に検出されていることが分か
った。対照実験として、くし形電極の一方の電極のみを
ポテンシオスタットに接続し電位掃引を行うと電流値は
２電極を使用した時の１／８に低下した。これは酵素反
応により生成したパラアミノフェノールの酸化電流がく
し形電極間のレドックスサイクルにより増幅されたため
で、酵素の固定化後もくし形電極本来の性質である電流
増幅機能が維持されていることを示している。

【００３５】さらに、従来法を利用して架橋ポリビニル
アルコールにアルカリホスフェターゼを分散させた膜
を、くし形電極全面に１０μｍの厚みに塗布し同様の測
定を行うと、くし形電極の一方のみを電位掃引した場合
と、一方をパラアミノフェノールの酸化還元電位以下に
電位印加して、他方のくし形電極を電位掃引した場合の
間での変化は小さかった。これはくし形電極自体が本来
有する電気化学的に可逆な物質の信号をレドックスサイ
クルにより増幅できる機能が全面を修飾された膜では低
下していることを示しており、くし形電極間のみを修飾
した電極では従来法で作製した酵素電極に比較して電極
自体の機能低下が起こりにくいことが確認された。

【００３６】電極間のみを修飾したくし形電極セルと酵
素を高分子に分散させて全面修飾したくし形電極との両
者をフローセルに組み込み、流速を０．１ｍｌ／ｓｅｃ
としてくし形電極の一方に０．３Ｖ、他方に−０．２Ｖ
の電位を印加した後、１００μＭのパラアミノフェニル
ホスフェート溶液を注入した。その結果、電極間に酵素
を部分修飾した電極では０．８μＡ、酵素を全面修飾し
た電極では１μＡ以上の電流が得られたが、電極間に酵
素を部分修飾した電極では酵素を全面修飾した電極より
も４倍も速い時間で１００％応答し、酵素を部分修飾し
た電極では酵素の固定化量は低いが応答性に優れた結果
が得られた。

【００３７】（実施例５）実施例５において微小くし形
電極の電極間にＬ−アスコベートオキシターゼを固定化
した酵素修飾電気化学検出器の性能について説明する。

【００３８】実施例４と同様な方法を用いてくし形電極
を作製し、実施例１の方法に従ってＬ−アスコベートオ
キシターゼを電極上に固定化した。この電極上に１０μ
Ｍのドーパミンを含むｐＨ７のリン酸緩衝溶液を１０μ
ｌ滴下し、くし形電極の一方を０Ｖに固定し、他方を０
から０．７Ｖまで電位掃引すると酸化側で１１０ｎＡ、
還元側で１０５ｎＡの限界電流が観測された。次に、酵
素を固定化したくし形電極と酵素を固定化していないく
し形電極にそれぞれ１０μＭのドーパミンを含むｐＨ７
のリン酸緩衝溶液を１０μｌ滴下し、１０分間放置した
後、それぞれ電位掃引を行うと、酵素を固定化した電極
ではＬ−アスコルビン酸を含まない溶液と同じ大きさの
信号が得られた。一方、酵素を修飾しない電極ではＬ−
アスコルビン酸の妨害により酸化電流は約８倍に増加
し、還元電流は２０ｎＡ以下に低下した。また、酵素を
修飾した電極に一方の電位を０Ｖに固定したまま、他方
の電位を０．６Ｖにステップするとドーパミンの酸化電
流は１１０ｍｓｅｃ以内に定常状態に達し、裸電極の応
答性を失うことなしに酵素修飾電極を得ることができ
た。

【００３９】（実施例６）実施例６において微小段差く
し形電極の電極間にグルコースオキシターゼを固定化し
た酵素修飾電気化学検出器の作製方法について図４を用
いて説明する。

【００４０】シリコンウエハ４１上に厚さ１μｍの酸化
膜４２を形成し、酸化膜が形成されたウエハをスパッタ
装置（アネルバ製：ＳＰＦ３３２Ｈ）内の所定位置に取
り付け、クロム、金を順次スパッタデポジションを行っ
た。圧力を１０^-2Ｔｏｒｒとし、アルゴン雰囲気下で、
クロムを５０Ｗとして、１０秒間、金を７０Ｗとして、
１分間スパッタリングを行い膜厚が１００ｎｍの金／ク
ロム薄膜４３を得た（図４（Ａ））。その後、この基板
上にフォトレジスト（シプレイ社製、ＭＰ１４００−２
７）を１．０μｍの厚みに塗布した。このレジストが塗
布された基板をホットプレート上において９０℃、２分
間の条件下でベークした。その後、マスクアライナー
（キヤノン製ＰＬＡ−５０１）により１５秒間密着露光
した。露光したシリコンウエハは、レジスト現像液（シ
プレー社製、ＭＦ３１９）中で、２０℃、６０秒間現像
を行い、水洗、乾燥してマスクパターンをレジストに転
写した。次に、この基板をイオンミリング装置（Ｃｏｍ
ｍｏｎｗｅａｌｔｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｍｉ
ｌｌａｔｒｏｎ）内の所定位置に取付け、アルゴンガス
圧を２×１０^-4Ｔｏｒｒとし、引きだし電圧を５５０Ｖ
として白金／クロムのミリングを２分間行い、アッシン
グ装置（東京応化製、プラズマアッシャー）にてレジス
トを除去して下部電極を形成した（図４（Ｂ））。次
に、この基板を再びスパッタ装置（アネルバ製ＳＰＦ
３３２Ｈ）中に入れ、基板の全面にわたって１００ｎｍ
の厚みの二酸化シリコン膜４４で覆った（図４
（Ｃ））。その後、この基板上にフォトレジスト（シッ
プレー社製ＡＺ１４００−２７）を１μｍの厚みに塗
布し、位置合わせを行ってくし形電極を密着露光した。
レジストが形成された基板をスパッタ装置に取り付け、
クロム、金を順次スパッタデポジションを行い、リフト
オフ法により上部くし形電極４５，４６を作製した（図
４（Ｄ））。

【００４１】次に、この基板をＣＶＤ装置に入れ、実施
例４と同様な方法により３００ｎｍの厚さの窒化シリコ
ン膜４７で覆った（図４（Ｅ））後、フォトレジスト
（ジプレー社製ＡＺ１４００−２７）を１μｍの厚み
に塗布し、クロムマスクを用いて上下にかみ合ったくし
形電極部分（１ｍｍ×０．２５ｍｍ）、パッド部分のみ
を露光、現像し、その部分を露出させた。次に、この基
板を反応性イオンエッチング装置（アネルバ製、ＤＥＭ
−４５１）中に入れ、ＣＦ₄ ガスの流量を２５ＳＣＣＭ
とし、圧力を０．２５Ｐａとして、１５０Ｗの条件下で
レジストパターンをマスクにして５分間、窒化シリコン
および下層の二酸化シリコン膜のエッチングを行って上
部および下部電極を露出させた。この結果、上下に別れ
た２つの作用電極の間が非常に小さくかみ合ったくし形
電極が得られた（図４（Ｆ））。このようにして作製し
たくし形電極の形状は、各くしの電極幅が２μｍ、くし
形電極間の段差が０．５μｍ、くしの長さが２ｍｍ、く
しの本数が各２００本づつであった。このくし形電極の
絶縁膜の段差部分に実施例１と同様な方法によりグルコ
ースオキシターゼの固定化酵素膜４８を得た（図４
（Ｇ））。

【００４２】この酵素電極をポテンシオスタットに接続
し、１０ｍＭの濃度のグルコースを含む０．１Ｍの塩化
ナトリウム溶液に浸漬してくし形電極の両方の電極に
０．７Ｖの電位を印加した所、グルコースオキシターゼ
とグルコースとの反応に基づく４６０ｎＡの酸化電流が
観測された、この酵素電極をフローセル内にセットし、
流量１ｍｌ／ｓｅｃで１０ｍＭのグルコースの注入を行
ったところ、２秒以下で１００％応答した。また、この
時のピーク電流値は１．２μＡであった。グルコースの
濃度を変化させて電流値を測定したところ１００ｎＭか
ら１０ｍＭの間において直線が得られた。

【００４３】（実施例７）実施例７において微小くし形
電極の電極間にクロロメチル化ポリスチレンをパターン
形成し、その上にグルコースオキシターゼを固定化した
酵素修飾電気化学検出器の作製方法を図５を用いて説明
する。

【００４４】実施例４と同様な方法により酸化膜５２が
形成されたシリコン基板５１上にくし形電極５３を作製
し、窒化シリコン膜によって電極セル、パッド部分以外
の部分を絶縁化した。その後、この基板上にクロロメチ
ル化ポリスチレン膜５４を１μｍの厚みに形成し、クロ
ロマスクを重ねてマスクアライナ（キヤノン製）によっ
て電極間のみに遠紫外線を１０秒間露光し、現像を行っ
て電極パターンを形成した（図５（Ａ））。この電極パ
ターン間にクロロメチル化ポリスチレン膜５４を有する
くし形電極を１０％のトリスアミノエチルアミン溶液に
浸漬し、２時間放置してスチレンの表面にアミノ基５５
を付着した（図５（Ｂ））。次に、実施例１と同様な方
法によりグルタルアルデヒドを反応させ、酵素５６であ
るグルコースオキシターゼを固定化して酵素電極を得た
（図５（Ｃ））。

【００４５】この酵素電極をポテンシオスタットに接続
し、１０ｍＭの濃度のグルコースを含む０．１Ｍの塩化
ナトリウム溶液に浸漬して両方の電極に０．７Ｖの電位
を印加したところ、グルコースオキシターゼとグルコー
スとの反応に基づく３１０ｎＡの酸化電流が観測され
た。この酵素電極をフローセル内にセットし、流量１ｍ
ｌ／ｓｅｃで１０ｍＭのグルコースの注入を行ったとこ
ろ、２秒以下で１００％応答した。また、この時のピー
ク電流値は８５０ｎＡであった。グルコースの濃度を変
化させて電流値を測定したところ１００ｎＭから１０ｍ
Ｍの間において良い直線性が得られた。

【００４６】（実施例８）実施例８において微小くし形
電極の電極間にクロロメチル化ポリスチレンをパターン
形成し、この上にアルカリホスフェターゼを固定化した
酵素修飾電気化学検出器の性能について説明する。

【００４７】実施例７と同様な方法によりくし形電極間
にクロロメチル化ポリスチレンパターンを作製し、アル
カリホスフェターゼを固定化して酵素電極を作製した。
この電極をデュアルポテンシオスタットに接続して１ｍ
Ｍのパラアミノフェニルホスフェートを含むｐＨ９の緩
衝溶液中に浸漬し、くし形電極の一方の電位を−０．２
Ｖに固定して、他方の電位を−０．２Ｖから０．５Ｖま
で電位掃引すると電位を掃引した側で７８０ｎＡの酸化
限界電流、電位を固定した側で６８５ｎＡの還元限界電
流が観測され、電極間で酵素反応により生成したパラア
ミノフェノールが電極上に拡散して容易に検出されてい
ることが分かった。さらに、くし形電極の一方の電極の
みをポテンシオスタットに接続し電位掃引を行うと、電
流値は２電極を使用した時の１／８に低下した。これは
酵素反応により生成したパラアミノフェノールの酸化電
流がくし形電極間のレドックスサイクルにより増幅され
ていることを示している。さらに、架橋ポリビニルアル
コールにアルカリホスフェターゼを分散させた膜を電極
全面に１０μｍの厚みに塗布し同様の測定を行うと、く
し形電極の一方のみを電位掃引した場合と、一方をパラ
アミノフェノールの酸化還元電位以下に電位印加して、
他方の電極を電位掃引した場合の間での変化は小さかっ
た。これは電極自体が本来有する電気化学的に可逆な物
質の信号をレドックスサイクルにより増幅できる機能が
全面を修飾された膜では低下していることを示してい
る。また、パラアミノフェニルフェートの濃度を変化さ
せて測定を行うと１０ｎＭまで検出することができた。

【００４８】

【発明の効果】以上説明したように、本発明によれば、
速い応答性、電流増幅機能、感度を保持したまま酵素電
極の特長である分子の選択検出を行うことができるた
め、バイオセンサーの電極や液体クロマトグラフィやフ
ローインジェクション分析の検出器として利用価値が高
い。

【図面の簡単な説明】

【図１】酵素修飾微小孔電極を作製する手順の一例を示
す工程図である。

【図２】酵素修飾微小孔電極の模式的斜視図である。

【図３】酵素修飾くし形電極を作製する手順の一例を示
す工程図である。

【図４】酵素修飾段差くし形電極を作製する手順の他の
例を示す工程図である。

【図５】くし形電極上への酵素修飾の反応工程図であ
る。

【符号の説明】

１１シリコンウエハ基板１２酸化膜１３クロム／白金膜１４二酸化シリコン膜１５微小孔電極１６参照電極１７対向電極１８酸化還元物質１９固定化酵素膜３１シリコンウエハ基板３２酸化膜３３フォトレジスト３６窒化シリコン膜３７固定化酵素膜４１シリコンウエハ４２酸化膜４３金／クロム薄膜４４二酸化シリコン膜４５，４６くし形電極４７窒化シリコン膜４８固定化酵素膜５１シリコン基板５２酸化膜５３くし形電極５４クロロメチル化ポリスチレン膜５５アミノ基５６酵素

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも表面が絶縁性である基板上に
形成された少なくとも一つの作用電極を有する酵素修飾
電気化学検出器において、前記作用電極の近傍に酵素膜
が固定化されていることを特徴とする酵素修飾電気化学
検出器。
【請求項２】少なくとも表面が絶縁性である基板上に
複数の作用電極が微小間隙により分離され、前記作用電
極間に酵素膜が固定化されていることを特徴とする酵素
修飾電気化学検出器。
【請求項３】前記基板上に参照電極および対向電極が
一体化されていることを特徴とする請求項１または２に
記載の酵素修飾電気化学検出器。
【請求項４】前記複数の電極のうち、少なくとも２つ
の作用電極が基板平面内の微小間隙あるいは基板表面と
垂直方向の微小間隙によって隔てられた対電極であるこ
とを特徴とする請求項２に記載の酵素修飾電気化学検出
器。
【請求項５】前記酵素膜が、前記作用電極間の絶縁性
部分に形成された有機膜に固定化されていることを特徴
とする請求項２に記載の酵素修飾電気化学検出器。
【請求項６】絶縁体によって互いに隔てられた複数の
作用電極を有する酵素修飾電気化学検出器の製造方法に
おいて、前記複数の作用電極を少なくとも表面が絶縁性の基板上
に形成する工程と、前記複数の作用電極を隔てる前記絶縁体の表面に酵素に
対して活性な活性基を導入する工程と、該活性基が導入された前記絶縁体の表面に酵素膜を固定
化する工程とを含むことを特徴とする酵素修飾電気化学
検出器の製造方法。