JPH09127039A - 電気化学検出器及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 選択的に妨害物質を除去したり、２種類の分
析対象物質を分離できる微少容量のクーロメトリックな
検出器、及びその製造方法を提供する。 【解決手段】 絶縁性基板上に形成した薄膜型の電気化
学検出器において、その形状が円形と単一又は複数の同
心円状のパタン、あるいは複数の同心円パタンからな
り、その電極のうち少なくとも一つが多孔質薄膜電極か
らなるクーロメトリック電極であるラディアルフロー型
電気化学検出器。絶縁性の基板上に導電性薄膜を作製す
る工程、薄膜電極を形成する工程、該電極を絶縁性膜で
被覆した後、電極部分のみを露出させる工程、該電極の
うち少なくとも一つの電極に多孔質炭素膜からなるクー
ロメトリック電極を形成する工程、該電極が形成された
基板と対向ブロックにより内部を円形に切り取った高分
子フィルムを挟みこんで薄層セルを形成する工程を有す
る前記検出器の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はフローインジェクシ
ョン分析あるいはバイオセンサー等に適用されるラディ
アルフロー型の電気化学検出器及びその製造方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】一般に血糖値測定や免疫測定、脳内の微
量の神経伝達物質の測定をするための液体クロマトグラ
フィやフローインジェクション分析では紫外／可視、蛍
光や化学発光などの分光学的方法、屈折率測定、電導度
測定、電気化学的方法等が検出器に用いられている。特
に、電気化学的方法は簡便で感度が高いために広く用い
られている。電気化学的法では、流路中に電極を配置
し、そこに一定の電位を印加しておき、キャリヤに乗っ
て流れる試料が電極に到達した際に電極との間で起る酸
化還元反応をモニターすることで検出を行っている。電
気化学検出器は、円筒型、薄層型、ウオールジェット型
等の形状で分類する場合と、検出器中、溶離液が電極を
横切って流れる（クロスフロー型）か、電極中心から周
辺部分に向かって流れる（ラディアルフロー型）かとい
う流れの方向で分類する場合がある。それらの検出器の
形式の中で薄層セル構造でかつウオールジェット型のよ
うに電極面に対してその上面から垂直にキャリヤ溶液を
吹付ける構造を持つ薄層ラディアルフロー型検出器は電
極表面に形成される目的物質の拡散層の厚さが薄く、検
出感度が他の形式より特に優れている。電気化学検出器
の生体試料分析の方法としては、液体クロマトグラフィ
のように、カラム等で試料を分離し、検出器に逐次送り
込んで測定する方法が広く用いられている。このような
方法では、多数の試料を同時に分析するには極めて有効
である。しかしながら、液体クロマトグラフィ法では試
料の分離に数分〜数十分かかるため、一種類の試料に注
目し、その濃度変化をリアルタイムで測定することは不
可能である。それに対して、一種類の試料をリアルタイ
ムに測定する手段として直接、生体等からサンプルを導
入し、電極上でオンラインで分析する方法が研究されて
いる。この方法では、検出器（電極）を直接生体に導入
してその場で観測する方法と、透析膜などにより目的物
質をフロー分析中に透析させそれを検出器に導入して目
的物質の濃度変化を計測する方法が知られている。前者
は生体の極近傍に検出器があるために、急激な濃度変化
に追随できるが、蛋白質や脂質などの吸着により寿命が
短いこと、電極で直接反応しにくいものを酵素反応など
を利用して検出する場合、電極上に固定化できる酵素の
絶対量が限られるため高感度化、長寿命化が困難である
などの問題点がある。一方、後者では、試料から検出器
まで距離があるため前者よりやや応答性が低下する。し
かしながら、透析膜をサンプリング部分に利用し、電極
に付着する高分子量の物質を除去したり、サンプリング
部から検出器までの流路に酵素カラムなどを挿入し、電
極上で直接反応しない分子を酵素反応により電極上で反
応するように変化させることもできる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】生体中には、分析対象
分子の他に種々の電気化学的に活性な種々の妨害物質が
存在する。そのため、液体クロマトグラフィのように分
離カラムを有する分析システムにおいては、妨害分子と
目的分子のカラム内での保持時間が異なるために、容易
に目的分子を妨害分子の影響なしに測定することができ
る。一方、オンライン計測では妨害分子と目的分子が一
度に検出器上に到達するために、その影響を除去するた
めの研究が数多く行われている。生体中での典型的な妨
害物質として、Ｌ−アスコルビン酸や尿酸が挙げられ
る。Ｌ−アスコルビン酸などを除去する方法として、電
極上にナフィオンなどのアニオン性の高分子をコート
し、静電的な反発により目的分子のみを検出する試みが
なされている〔例えばケミストリー レターズ（Chemis
try letters)、１９８９年、第１３３頁〕。しかしなが
ら、この方法では、妨害物質と目的物質の静電的な性質
が異なることが必要であるほか、ポリマーの被覆により
電極近傍での目的物質の拡散速度が低下し、その結果感
度が低下するなどの問題点がある。一方、分子の電気化
学的な可逆性を利用して目的分子と妨害分子を分離する
試みもなされている。Ｌ−アスコルビン酸や尿酸などの
分子は電気化学的に非可逆で一度酸化されると酸化体が
不安定で逆反応が起らないために、複数の電気化学検出
器を用い上流の電極で妨害物質と目的物質をすべて反応
させると上流側の電極から下流側の電極に到達する前に
妨害物質は電気化学的に不活性な分子に変化する。一
方、生体中のモノアミンなどのように電気化学的に可逆
な活性種は上流電極で全分子が酸化された後、下流側で
還元されて検出されるために、目的分子と妨害分子を分
けて測定できる。この様子を図２に模式化して示す。す
なわち、図２は流れの系での２電極を用いた妨害物質の
除去の模式図である。図２において、Ｉは妨害物質、Ｒ
はカテコールアミンを意味する。注入した分子をすべて
反応させる検出器としてはクーロメトリックな電気化学
検出器が用いられている。この検出器では通常、多孔質
の炭素、炭素のフェルト、炭素の粒子などを流路に充て
んし、流れによって運ばれてくる活性種を効率的に電極
上に接触させることにより、すべての分子を反応させ
る。電気的な検出器の反応効率が通常数％なのに対し
て、クーロメトリックな検出器では１００％の反応効率
が得られる。しかしながら、通常のクーロメトリックな
検出器はフローセル中に多孔質炭素、炭素粉末などのパ
ルクの材料を充てんする必要があるために検出器の容量
が大きくなり微少化が困難で、より微少量の生体試料を
分析するために、微小な検出器が要求されている。本発
明は、前述した従来の課題を解決するためになされたも
のであり、その目的は、選択的に妨害物質を除去した
り、２種類の分析対象物質を分離できる微少容量のクー
ロメトリックな検出器を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はラディアルフロー型電気化学検出器
に関する発明であって、絶縁性基板上に形成した薄膜型
の電気化学検出器において、その形状が円形と単一又は
複数の同心円状のパタン、あるいは複数の同心円パタン
からなり、その電極のうち少なくとも一つが多孔質薄膜
電極からなるクーロメトリック電極であることを特徴と
する。本発明の第２の発明は、他のラディアルフロー型
電気化学検出器に関する発明であって、第１の発明にお
いて薄膜電極を形成した基板がもう一枚の導電性の対向
電極又は絶縁性のブロックと中心を打ち抜いた高分子膜
を挟みこむことにより薄層セルを形成し、測定溶液を導
入するための溶離液が導電性の対向電極又は絶縁性のブ
ロック側から分割された円形あるいは同心円の中心へ導
入され、電極の外側位置で対向電極又は絶縁性のブロッ
クを通して排出されるための流路を形成する構造である
ことを特徴とする。本発明の第３の発明は、ラディアル
フロー型電気化学検出器の製造方法に関する発明であっ
て、表面又は全体が絶縁性の基板上に導電性薄膜を作製
する工程、円形と単一又は複数の同心円状のパタン、あ
るいは複数の同心円パタンからなる薄膜電極を形成する
工程、該電極を絶縁性膜で被覆した後、電極部分のみを
フォトリソグラフィ法、又はフォトリソグラフィ法とエ
ッチング法により露出させる工程、該電極のうち少なく
とも一つの電極に電解重合膜を形成し、熱分解により多
孔質炭素膜からなるクーロメトリック電極を形成する工
程、該電極が形成された基板と対向ブロックにより内部
を円形に切り取った高分子フィルムを挟みこんで薄層セ
ルを形成する工程を有することを特徴とする。そして本
発明の第４の発明は、他のラディアルフロー型電気化学
検出器の製造方法に関する発明であって、絶縁性の基板
上にレジストを用いて円形と単一又は複数の同心円状の
パタン、あるいは複数の同心円パタンからなるパタンを
形成する工程、該基板上に導電性薄膜を被覆し、次いで
レジストをはく離することによって上記第１の発明の形
状を持つ導電性薄膜を形成する工程、該電極を絶縁性膜
で被覆した後、電極部分のみをフォトリソグラフィ法、
又はフォトリソグラフィ法とエッチング法を用いて露出
させる工程、該電極のうち少なくとも一つの電極に電解
重合膜を形成し、熱分解により多孔質炭素膜からなるク
ーロメトリック電極を形成する工程、該基板と対向ブロ
ックにより内部を円形に切り取った高分子フィルムを挟
みこんで薄層セルを形成する工程を有することを特徴と
する。

【０００５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。後述する実施例において、表面あるいは全面が絶縁
性の基板としては、酸化膜付きのシリコンウエハを用い
たが、この他に石英板、酸化アルミニウム基板、ガラス
基板、などを挙げることができる。また、導電性薄膜を
得る手段として、金属として金、白金などの貴金属、
鉄、銅、銀、ニッケルなどの金属、ステンレスなどの合
金、酸化スズ、酸化チタン、酸化インジウムスズなどの
導電性酸化金属、及びこれら電極材料と水銀とのアマル
ガム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウムヒ素、インジ
ウムリンなどの半導体を用いることができる。金属、半
導体などの導電性薄膜を作製する方法としては、蒸着
法、スパッタ法などを挙げることができる。炭素薄膜を
得るための出発物質としては、ＣＶＤ法を用いる場合ペ
リレンテトラカルボン酸無水物、フタロシアニン及びそ
の誘導体、デカシクレン及びその誘導体、ナフタレンテ
トラカルボン酸無水物などが、スピンコートをとる場合
ポリフェニレンビニレン、ポリチエニレンビニレン、ポ
リフリレンビニレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミ
ドが挙げられる。炭素薄膜電極の作製は、まず炭素薄膜
を得る方法としてペリレンテトラカルボン酸無水物など
の芳香族化合物の熱ＣＶＤ法、又はスピンコート、キャ
スト法により高分子薄膜を形成した後、熱分解し炭素化
させる方法などが挙げられる。電極基板上にパタンを形
成したり、絶縁膜として使用する材料には、感光性高分
子、酸化シリコン、二酸化シリコン、シリコーン樹脂、
窒化シリコン、エポキシ樹脂、ポリイミドとその誘導体
などが挙げられる。電極への加工は紫外線露光によるレ
ジストパタン形成法、エッチング法等のリソグラフィ技
術を組合せて行う。レジストパタン形成法としては、フ
ォトリソグラフィ、電子線リソグラフィ、Ｘ線リソグラ
フィ等を利用することができる。また、電極パタン形成
法としてはまず炭素薄膜全面をシリコン系レジストで被
覆した後、シリコン系レジストパタンを形成し、その後
酸素プラズマにより炭素膜をエッチングするドライエッ
チング法を挙げることができる。多孔質炭素膜電極を形
成するための電解重合高分子としてはポリピロール、ポ
リアニリン、ポリパラフェニレン、ポリチオフェン、ポ
リアズレンとその誘導体が挙げられる。また、Ｌ−アス
コルビン酸など電極反応が遅い分子の反応速度を向上さ
せるために多孔質炭素膜にコートする材料としてはポリ
ビニルフェロセン、ポリビニルフェロセンとジビニルベ
ンゼン共重合体、プルシアンブルー膜などを挙げること
ができる。

【０００６】本発明においては、薄層ラディアルフロー
セルの検出器の電極が、円形と単一又は複数の同心円状
のパタン、あるいは複数の同心円パタンからなり、その
電極のうち少なくとも一つが多孔質薄膜電極からなる構
造を有しているために、上流側（円の内周部）に形成し
た多孔質電極で、目的物質と妨害物質を同時に１００％
反応させ電気化学的に可逆な活性種のみを下流側の電極
（より外周部の電極）で検出することができる。また、
炭素電極上で反応しにくい過酸化水素などの目的分子が
妨害物質と共存している場合、妨害物質のみを上流側の
電極で除去し、下流側の白金電極や過酸化水素と低い電
位で反応するメディエータをコートした炭素薄膜電極に
より選択的に検出を行うことができる。更に上流側の多
孔質電極を下流側にかみ合ったリング状電極を配置する
ことにより、上流の多孔質電極で妨害物質を除いた後、
下流のかみ合った電極により目的物質の信号のみを電流
増幅することができる効果を有している。これらの効果
により、本発明の検出器をオンラインバイオセンサーや
フローインジェクション分析に用いることにより、目的
物質をより選択的に測定することができる。また、本発
明の検出器は従来のクーロメトリックな検出器のように
バルクの材料を用いるのではなく薄膜電極と電解重合の
ような薄膜形成技術、及び微細加工技術によって作製す
るため、自由に電極面積や形状を変化させることがで
き、またクーロメトリックな電極を微量容量で形成する
ことができるため、高感度化に有利で、また再現性良く
検出器を作製することができる特徴を有している。

【０００７】

【実施例】以下、図面を参照して本発明の実施例を詳細
に説明する。なお、本発明は以下の実施例のみに限定さ
れるものではない。

【０００８】実施例１ 図１の（ａ）〜（ｉ）は、本発明による電気化学検出器
の一実施例による構成をその製造方法に基づいて説明す
る各工程における基板の断面図である。同図において、
符号２１はシリコン酸化膜、２２はシリコン基板、２３
は炭素膜、２４はレジストパタン、２５は多孔質炭化ポ
リピロール膜、２６はレジスト絶縁膜、２７はメディエ
ータ（Ｏｓポリマーゲル）膜を意味する。まず、図１の
（ａ）に示すように表面に厚さ１μｍのシリコン酸化膜
２１を付着したシリコン基板（住友シチックス社製）２
２を、内部を減圧することが可能である石英チューブ中
に入れて、例えば、アプライド フィジクス レターズ
（ Applied Physics Letters）、第３６巻、第８６７頁
（１９８０）に記載のカプラン（ Kaplan ）らの方法に
より１０００℃、０．００１Ｔｏｒｒの条件下、３，
４，９，１０−ペリレンテトラカルボン酸無水物を加熱
分解しシリコン基板上に熱分解物を堆積付着させた。１
０００℃にて１５分間、保持した後に徐冷して、常温、
常圧下に基板を取り出して、表面抵抗１００Ｗ程度のポ
リペリナフタレン導電性炭素膜２３を有する基板を得た
（ｂ）。この炭素膜付きシリコン基板上にフォトレジス
ト（富士ハント社製、ＳＰ３Ｃ）を１μｍの厚さにスピ
ンコートした。このフォトレジスト塗布基板をホットプ
レート上で８０℃、２分の条件でベークした。クロムマ
スクを用いて扇形や円弧形の電極パタンを、マスクアラ
イナー（キャノン製；ＰＬＡ−５０１）により１５秒間
密着露光した。露光したシリコン基板は、レジスト現像
液（富士ハント社製）中で４０秒間現像を行い水洗、乾
燥してマスクパタンをレジストに転写してレジストパタ
ン２４を形成した〔図１の（ｃ）〕。レジストパタンを
形成した基板は反応性イオンエッチング装置（アネルバ
製、ＤＥＭ４５１）中に入れて、酸素ガス流量：１００
ＳＣＣＭ、圧力：２Ｐａ、７０Ｗの条件下で１０分間エ
ッチングし、炭素膜を加工した（ｄ）。次に、この基板
をアセトン中でリンスし、表面のレジストをはく離した
（ｅ）。得られた電極は図３のａに示すようにリング−
ディスクの２電極で構成させている。次に、電極基板を
ピロール１ｍｏｌ／リットル、支持電解質、テトラブチ
ルアンモニウムテトラフルオロボレート０．３ｍｏｌ／
リットルを含むアセトニトリル溶液に参照電極、対向電
極と共に浸漬し１．０Ｖの電位を内側のディスク電極に
１分間印加し、ポリピロール膜２５を形成した。次に基
板を石英管に入れ真空脱気した後、７００℃にて１時間
熱処理を行い、ポリピロールを炭化した（ｆ）。その
後、絶縁膜として基板全面をレジスト２６により被覆し
た（ｇ）。測定に用いる電極面、及びパッド部分を露出
させるためレジストにクロムマスクを用いて光を照射
し、現像、水洗、乾燥を行って電気化学検出器を得た
（ｈ）。最後に、外側のリング電極上に過酸化水素を低
い電位で還元する性質を有するオスミウム（Ｏｓ）ポリ
ビニルピリジン酸化還元ポリマー（Ｏｓポリマー）２７
〔例えば、アナリチカル ケミストリー（ Analytical
Chemistry ）、第６４巻、第３０８４〜３０９０頁（１
９９２）〕で修飾した（ｉ）。なお、図３は本発明の電
気化学検出器の実施例１による構成を示す平面図であ
る。図３において、ａは多孔質炭素膜、及びメディエー
タをコートする前の炭素薄膜電極を示し、ｂは多孔質炭
素膜、及びメディエータをコートした後の本発明の検出
器を示す。作用電極の内ディスク電極は炭化したポリピ
ロール膜により被覆されている。一方、リング電極はオ
スミウムポリマーにより修飾されている。

【０００９】この検出器を図４に示すようにガスケット
（厚さ１２μｍ）を介してステンレススチール製の対向
電極ブロックと接続した。対向電極ブロックの中心には
溶離液を導入する細孔が形成され、液は電気化学検出器
の中心へ対向電極側から導入され、周辺部分へ広がった
後排出される。すなわち、図４は本発明の電気化学検出
器と対向電極ブロックとの関係を示す模式図である。こ
のブロックに取り付けた薄層電気化学検出器をＣＭＡ社
製１０２型シリンジポンプ、ＬＣ４Ｃポテンシオスタッ
ト（ＢＡＳ社製）、流路切り替え用リキッドスイッチ、
Ｌ−グルタミン酸酸化酵素カラムと組合せてフローイン
ジェクション分析システムを構成した。このシステムの
ブロックダイヤグラムを図５に示す。すなわち図５は本
発明の検出器の特性評価を行ったフローインジェクショ
ンシステムのブロックダイヤグラムを示す図である。図
５中、４１はリン酸緩衝生理食塩水を入れたシリンジ、
４２はリン酸緩衝生理食塩水に所定の濃度のＬ−グルタ
ミン酸とＬ−アスコルビン酸を溶解させた標準試料溶液
を入れたシリンジ、４３はシリンジポンプ、４４はリキ
ッドスイッチ、４５はＬ−グルタミン酸酸化酵素カラ
ム、４６はＬＣ４Ｃデュアルポテンシオスタット、４７
は参照電極、４８は対向電極、４９は薄層セル、５０は
本発明の電気化学検出器である。測定は、多孔質炭素電
極を形成したディスク電極を７５０ｍＶに、Ｏｓポリマ
ーをコートしたリング電極を０ｍＶ電位設定し、初めに
リン酸緩衝生理食塩水を流速２０μｌ／ｍｉｎで送液
し、その後、Ｌ−グルタミン酸１μｍｏｌ／リットルと
Ｌ−アスコルビン酸２０μｍｏｌ／リットルを含むリン
酸緩衝生理食塩水に切り替えた。電流値の観測はディス
ク電極７５０ｍＶ、リング電極０ｍＶの時のそれぞれの
電流値を０ｎＡとし、標準溶液注入時の電流変化を測定
した。図６に実線でこの測定系におけるリング電極での
電流値の時間変化を示す。すなわち、図６は本発明の実
施例１の電気化学検出器のリング電極上でのＬ−グルタ
ミン酸、Ｌ−アスコルビン酸混合溶液の電流応答の時間
変化を示した図である。図６において、縦軸は電流（ナ
ノアンペア）を示し、横軸は時間（分）を示す。溶液を
リン酸緩衝生理食塩水から標準試料溶液に切り替えて約
３分後にディスク電極では約１．２μＡの酸化反応によ
る定常電流が観測された。一方、リング電極では電流値
の減少が観測され、約−１１ｎＡの定常状態電流（還元
電流）が観測された。１０分後溶液を元のリン酸緩衝生
理食塩水に戻すと約２分後にディスク、リング電極共に
電流は０に戻った。観測された電流の内、ディスク電極
で観測された酸化電流はＬ−アスコルビン酸の酸化、リ
ング電極で観測された還元電流は酵素カラム中でＬ−グ
ルタミン酸が酸化反応する際に生成した過酸化水素がＯ
ｓ高分子ゲル被覆電極により還元されることによる電流
である。次にディスク電極をポテンシオスタット４６に
接続せず、リング電極のみを測定に使用すると今度は大
きさ９０ｎＡの酸化電流が観測された。これは、ディス
ク電極でＬ−アスコルビン酸を酸化しないため、及び０
ｍＶの電位でもＬ−アスコルビン酸の酸化が起る電位の
ために、過酸化水素の還元ピークにＬ−アスコルビン酸
の酸化ピークが被さることによる。ディスク電極に酸化
ピークを印加した時に観測される電流値と単位時間に検
出器を通過するＬ−アスコルビン酸の量からディスク電
極でのＬ−アスコルビン酸の反応率を求めると９４％の
Ｌ−アスコルビン酸がディスク電極上で反応し除去され
ていることが分かった。また、流速を減少させると電流
効率は増加し、流速８μｌ／ｍｉｎで９８％の効率が得
られ多孔質炭素電極がほぼクーロメトリックな検出器と
して働いていることが分かった。同様の測定を、多孔質
炭素電極を形成しないリング−ディスク電極を用いて測
定を行ったところ反応率は８０％で本発明の検出器の方
が選択性に優れていることが分かった。

【００１０】また、図５のリキッドスイッチ４４とＬ−
グルタミン酸酸化酵素カラム４５の間に炭素粉末を充て
んした内径５ｍｍ、長さ５ｃｍのステンレスカラムを挿
入し、このカラムをポテンシシオスタットに接続するこ
とにより炭素粉末がクーロメトリックな電極として働く
ようにした。多孔質炭素電極には電位を印加せずに、挿
入した炭素カラム電極に７５０ｍＶの電位を印加し、本
実施例の最初と同様の測定を行った。該測定では溶液を
リン酸緩衝生理食塩水から標準試料溶液に切り替えて約
３分後に電流値の変化がみられたが、炭素カラム電極を
用いた場合には、約４５分経過してから電流値が徐々に
変化しだし、約６０分後に定常状態となり、応答が遅
く、多量の溶液を必要とすることが分かった。また、該
炭素カラム電極の代りに、内径０．５ｍｍ、長さ５ｃｍ
のステンレスカラムを接続し、７５０ｍＶの電位を印加
して同様の測定を行ったところ、電流は約４分後に変化
し始めたが、リング電極に１００ｎＡの電流が観測さ
れ、Ｌ−アスコルビン酸が挿入したステンレスカラムで
は十分に酸化されないことが分かった。ステンレスカラ
ムの長さを５０ｃｍにしてもリング電極での電流値は２
ｎＡあり、しかも定常状態になるために１０分以上の時
間を要した。

【００１１】実施例２ 実施例１と同様な電極を使用し、電解重合膜より作製し
た多孔質炭素電極を有するディスク電極をポテンシオス
タットに接続し、ポリビニルフェロセン１０μｍｏｌ／
リットル、支持電解質テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウム
パークロレート０．１ｍｏｌ／リットルを含むジクロロ
ベンゼン中に参照、対向電極と共に浸漬し、７００ｍＶ
の電位を２分間印加して、ポリビニルフェロセン膜を多
孔質炭素電極表面に固定化した。その電極を実施例１と
同様な測定装置系に組込んで、測定を行い結果を実施例
１の結果と比較した。リング電極での応答はほとんど変
わらなかったが、ディスク電極での電流値は１．２５ｎ
Ａの値が得られ、実施例１に比べやや増加した。この電
流値はほぼ９８％の電流効率に対応している。これはＬ
−アスコルビン酸の電極反応速度がポリビニルフェロセ
ンの被覆により向上し、その結果電流効率が向上したこ
とを示している。流速を１０μｌ／ｍｉｎ以下にして測
定を行うとほぼ１００％の電流効率が得られ、多孔質炭
素電極により修飾された炭素ディスク電極がクーロメト
リックな電極として働き、Ｌ−アスコルビン酸がディス
ク電極で反応し完全に除去された。

【００１２】実施例３ 図７に本発明のもう一つの電気化学検出器の製造工程を
示す。すなわち図７は円形と単一又は複数の同心円状の
パタン、あるいは複数の同心円パタンからなり、その電
極のうち少なくとも一つが電解重合膜から作製した多孔
質炭素膜電極からなるクーロメトリック電極であること
を特徴とするラディアルフロー型電気化学検出器の作製
の工程図であり符号６１はポジ型フォトレジスト、６２
はシリコン酸化膜、６３はシリコン基板、６４はクロム
／金積層薄膜、６５は多孔質炭素膜、６６はレジスト絶
縁膜、６７は過酸化水素の還元を促進するＯｓポリマー
のメディエータを各々示す。表面に酸化膜を有する３イ
ンチシリコンウエハ（住友シチックス製）上にフォトレ
ジスト（富士ハント社製 ＦＨ６４００）を１μｍの厚
さに塗布した（ａ）。このレジスト塗布シリコン基板を
オープン中に入れ、９０℃、９０秒の条件でベークし
た。その後、検出器のパタンが描かれたクロムマスクを
用いてマスクアライナ（キャノン製；ＰＬＦ−５０１）
により１５秒間密着露光した。露光したシリコンウエハ
をレジスト現像液（富士ハント社製）の中で、２０℃、
４５秒間現像を行い、水洗、乾燥してマスクパタンをレ
ジストに転写した（ｂ）。このレジスト付基板をスパッ
タ装置（日本シード社製）内の所定位置に取り付け、ク
ロム膜を１０ｎｍ堆積した後、金を１００ｎｍ堆積した
（ｃ）。その後、基板をメチルエチルケトン中に浸漬し
て超音波処理を行い、電極形成部以外のレジストをはく
離して検出器パタンを得た（ｄ）。得られた電極パタン
の構造は、実施例１と同様な構造を有し、材質のみ異な
る。次に電極基板をアニリン０．１ｍｏｌ／リットルを
含む１規定硫酸溶液に、塩化銀参照電極、白金対向電極
と共に浸漬し０．８Ｖの電位を内側のディスク電極に１
分間印加し、ポリアニリン膜を形成した。次に基板を石
英管に入れ真空脱気した後、７００℃にて１時間熱処理
を行い、ポリアニリンを炭化した（ｅ）。その後、絶縁
膜として基板全面をレジスト６６により被覆した
（ｆ）。測定に用いる電極面、及びパッド部分を露出さ
せるためレジストにクロムマスクを用いて光を照射し、
現像、水洗、乾燥を行って電気化学検出器を得た
（ｇ）。最後に、リング電極上にメディエータとして実
施例１に用いたものと同様なＯｓポリマー膜を形成した
（ｈ）。このラディアルフロー型の薄層電気化学検出器
を図３のうちのｂと同様な測定装置に組込んでＬ−グル
タミン酸の選択的検出について検討した。電流値の観測
はディスク電極７５０ｍＶ、リング電極５００ｍＶに設
定しリン酸緩衝生理食塩水を流したときの電流値を０ｎ
Ａとして、標準溶液注入時の電流変化を測定した。標準
溶液はＬ−グルタミン酸１μｍｏｌ／リットルを含むリ
ン酸緩衝生理食塩水とした。リキッドスイッチにてリン
酸緩衝生理食塩水から標準溶液に変えて２分で、ディス
ク電極では０．２ｎＡの酸化電流、リング電極では１
２．２ｎＡの還元電流が観測された。Ｌ−グルタミン酸
の酵素反応によって生成する過酸化水素は、白金電極上
では容易に酸化されるが、炭素電極では酸化されにくい
ので、上の結果は検出器のディスクの白金上を覆ってい
る炭素電極を透過してディスク白金電極上で反応する過
酸化水素の量は少量であることを示している。次に標準
溶液としてＬ−グルタミン酸１μｍｏｌ／リットル、Ｌ
−アスコルビン酸１μｍｏｌ／リットル、ドーパミン１
μｍｏｌ／リットルを含むリン酸緩衝生理食塩水を使用
した。リキッドスイッチにてリン酸緩衝生理食塩水から
標準溶液に変えて２分で、ディスク電極では１２５ｎＡ
の酸化電流、リング電極では１３．２ｎＡの還元電流が
観測された。一方、ディスク電極に電位を印加しない場
合は、リング電極で８９ｎＡの酸化電流が得られた。こ
れらの結果は、多孔質炭素電極を形成したディスク電極
を測定に使用しない場合Ｌ−グルタミン酸の酵素反応に
よって生成する過酸化水素の酸化電流にドーパミン、Ｌ
−アスコルビン酸の酸化ピークが重なり選択的な検出を
行うことができないことを示している。一方、ディスク
電極を測定に使用した場合は、ディスク電極で反応しき
れないＬ−アスコルビン酸やドーパミンがリング電極で
反応し、若干電流値を増加させるが、その影響は小さ
く、多孔質電極がクーロメトリックな応答を示している
ことが分かった。

【００１３】実施例４ 実施例１と同様な工程により、図８に示す電気化学検出
器を作製した。図８は炭素薄膜電極により構成され、３
電極より構成されている。中央のディスク電極上には電
解重合膜より作製した多孔質の炭素膜電極が形成され、
他の２つの電極は間隔５μｍ、電極幅５μｍの互いにか
み合った炭素薄膜リング電極である。この検出器の中央
のディスク電極に７５０ｍＶ、外側のかみ合ったマルチ
リング電極の一方の電極に７５０ｍＶ、他方の電極に５
０ｍＶの電位を印加し、ドーパミン１００ｎｍｏｌ／リ
ットル、尿酸１μｍｏｌ／リットルを含むクエン酸系標
準溶液（ｐＨ３．２）を流速２０μｌ／ｍｉｎで導入し
た。その結果、ディスク電極には６４ｎＡの酸化電流が
観測され、かみ合ったマルチリング電極の中の酸化側に
は１９．２ｎＡ、還元側では−１７．４ｎＡの電流値が
観測された。次に、中央のディスク電極に電位を印加せ
ずに同様の実験を行うと、酸化側のマルチリング電極で
は８１ｎＡ、還元側では−７．８ｎＡとなり、酸化側は
電流が増加、還元側では低下した。一方、尿酸を含まな
い溶液（ドーパミンのみ１００ｎｍｏｌ／リットル）で
測定を行うとかみ合ったマルチリング電極の内酸化側で
１９．０ｎＡ、還元側で−１７．５ｎＡとなり多孔質炭
素膜で被覆されたディスク電極を使用したときの電流値
と一致した。これは、多孔質炭素電極上で、尿酸がほと
んどすべて酸化され、下流側のかみ合ったリング電極上
での反応に影響を与えないことを示している。上流側の
ディスク電極を使用しないときは、尿酸がかみ合ったマ
ルチリング電極上での反応に影響する。すなわち、酸化
側ではドーパミンと尿酸が同時に電極反応するために大
きな酸化電流が、還元側では酸化されたドーパミンの一
部が還元側電極に到達するまでに尿酸によって還元され
るため還元電流の低下が観測される。

【００１４】実施例５ 実施例１の図３のうちのａに示すリング−ディスク構造
を有する炭素薄膜電極を用い、そのディスク、リング両
方を陽極に、白金線を陰極にして実施例１と同様な方法
により、ポリピロール膜を形成した。この電極を実施例
１と同様な方法により熱処理し、多孔質炭素膜により被
覆されたリング−ディスク電極を得た。この電極のディ
スク電極上に実施例２と同様な方法によりポリビニルフ
ェロセン膜を重合した。また多孔質炭素膜で被覆された
リング電極上にＯｓポリマーを染め込ませた後乾燥させ
た。この電極構造を図９のうちのａに示す。すなわち、
図９は本発明の電気化学検出器の実施例５の構成を示す
平面図（ａ）、及びアセチルコリン検出のために本発明
の検出器と共に用いた薄膜電極（ｂ）の平面図である。
この電極と電極Ｏｓポリマーを修飾した６ｍｍの炭素薄
膜ディスク電極（図９のうちのｂ）を使用し、酵素カラ
ムと組合せて図１０に示す分析系を構成した。すなわ
ち、図１０は本発明の実施例５に示す検出器の特性評価
を行ったフローインジェクションシステムのブロックダ
イヤグラムを示す図である。図１０において、９１はリ
ン酸緩衝生理食塩水を入れたシリンジ、９２はリン酸緩
衝生理食塩水に所定の濃度のアセチルコリンとコリン及
びＬ−アスコルビン酸を溶解させた標準試料溶液を入れ
たシリンジ、９３はシリンジポンプ、９４はリキッドス
イッチ、９５はコリン酸化酵素を固定化したカラム、９
６はＬＣ４Ｃポテンシオスタット（２台）、９７は参照
電極、９８は対向電極、９９は薄層セル１、１００は薄
層セル２、１０１は本発明の電気化学検出器、１０２は
アセチルコリンエステラーゼとコリン酸化酵素を固定化
したカラム、１０３はＯｓポリマーを修飾した炭素薄膜
電極である。測定は、多孔質炭素電極を形成したディス
ク電極（電極１）を７５０ｍＶに、Ｏｓポリマーを修飾
した多孔質炭素を形成したリング電極（電極２）を０ｍ
Ｖに、フローセル２の電極（電極３）を０ｍＶにそれぞ
れ電位設定し、初めにリン酸緩衝生理食塩水を流速１６
μｌ／ｍｉｎで送液し、その後、アセチルコリン０．１
μｍｏｌ／リットル、コリン１μｍｏｌ／リットル、Ｌ
−アスコルビン酸１０μｍｏｌ／リットルを含むリン酸
緩衝生理食塩水に切り替えた。その結果溶液をリン酸緩
衝生理食塩水から標準試料溶液に切り替えて２．５分後
にフローセル１のディスク電極では約０．６４μＡの酸
化反応による定常電流が観測された。また、リング電極
では電流値の減少が観測され、−６５ｎＡの定常状態電
流（還元電流）が観測された。一方、セル２にセットし
た薄膜電極では溶液切り替え後３．０分後に−４．７ｎ
Ａの還元電流が観測された。次に電極１を使用せずに同
様の試料の測定を行うと電極３では０．５７μＡの酸化
電流が観測された。また、電極１の代りに電極２を使用
しない場合は、−７０ｎＡの還元電流が得られた。更に
試料溶液をアセチルコリンのみとして測定を行うと、電
極３で得られる電流値は−４．８ｎＡで電極を３つ共に
使用した最初の実験の値にほぼ一致した。これらの結果
より電極１はＬ−アスコルビン酸を電極２はコリンの酵
素反応より生成した過酸化水素をクーロメトリックに反
応させ除去する役割を果たしていることが分かった。一
方、アセチルコリンは最初のカラム９５では反応せずカ
ラム１０２内で反応して過酸化水素を発生させるため
に、本発明の検出器で除去されず、セル２内の電極で定
量することができた。以上、示したように実施例５では
妨害物質となるＬ−アスコルビン酸の影響を完全に除い
てアセチルコリンとコリンを同時に検出できることが分
かった。

【００１５】実施例６ 実施例３と同様な方法により金製のリングディスク電極
を作製した。このディスク電極をポテンシオスタットに
接続し、塩化白金酸：４％、酢酸鉛：０．１４％を溶解
させた純水中に参照電極及び対向電極と共に浸漬し、−
２．２Ｖの電位を２秒と４Ｖの電位６秒のサイクルを６
回繰り返し、多孔質の白金黒電極を作製した。この検出
器のディスク電極に７５０ｍＶ、外側のリング電極に０
ｍＶ、の電位を印加し、ドーパミン１００ｎｍｏｌ／リ
ットル、Ｌ−アスコルビン酸１μｍｏｌ／リットルを含
むクエン酸系標準溶液（ｐＨ３．２）を流速２０μｌ／
ｍｉｎで導入した。その結果、ディスク電極には６４ｎ
Ａの酸化電流が観測され、リング電極では−６．５ｎＡ
の電流値が観測された。次に、リング電極を７５０ｍＶ
として同様の測定を行うと、電流はほとんど観測され
ず、ドーパミン、Ｌ−アスコルビン酸共に白金黒で修飾
されたディスク電極上で酸化されたこと、リング電極を
０ｍＶとして観測される電流はドーパミンの還元電流に
基づいていることが分かった。一方、白金黒をディスク
電極に修飾せずに、ディスク電極を７５０ｍＶ、リング
電極を０ｍＶとして測定を行うとディスク電極で４５ｎ
Ａ、リング電極で−４．８ｎＡの値が観測され、リン
グ、ディスク電極の電流値は共に白金黒をディスク電極
上に修飾した時に比較し減少した。これは、ディスク電
極がクーロメトリックに反応せずＬ−アスコルビン酸、
ドーパミン共に完全に酸化されないために、リング電極
上にドーパミンの還元電流が減少したことによる。

【００１６】

【発明の効果】以上、説明したように本発明によるラデ
ィアルフロー型電気化学的検出器は、円形と単一又は複
数の同心円状のパタン、あるいは複数の同心円パタンか
らなり、その電極のうち少なくとも一つが電解重合膜か
ら作製した多孔質炭素膜電極からなるクーロメトリック
電極であることを特徴とする。その結果、上流側に多孔
質炭素膜からなるクーロメトリックな電極がある場合、
電極上で不可逆に酸化されるＬ−アスコルビン酸や尿酸
などを完全に除去して、目的物質の酵素反応により生
じ、炭素電極上では酸化しにくい過酸化水素などの目的
物質を選択的に下流側の第２の電極で検出することがで
きる。カテコールアミンなど電気化学的に可逆な目的物
質は、同時に上流側の多孔質で１００％酸化されるが妨
害物質が非可逆で還元反応が起こらないのに対して、還
元反応が下流側の電極で起るため、選択的に検出でき
る。またこの多孔質炭素からなるクーロメトリックな検
出器は、電解重合と熱分解といった薄膜技術により形成
するために従来のバルクの材料を充てんしたクーロメト
リックな検出器に比較し、セル容量を小さくすることが
可能で微量分析に有効である。またベースの薄膜電極を
微細加工技術によって作製するために、クーロメトリッ
クな電極と目的分子検出用の電極を一枚の基板の微小領
域に集積化し、安価で多量に作製することができる。し
たがってフローインジェクション分析や微少容量の分析
を目的としたオンラインバイオセンサーの電気化学検出
器として極めて利用価値が大きい等の優れた効果が期待
できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による電気化学検出器の製造方法の一実
施例を説明する工程の断面図である。

【図２】流れの系での２電極を用いた妨害物質の除去の
模式図である。

【図３】本発明の電気化学検出器の実施例１による構成
を示す平面図である。

【図４】本発明の電気化学検出器と対向電極ブロックと
の関係を示す模式図である。

【図５】本発明の検出器の特性評価を行ったフローイン
ジェクションシステムのブロックダイヤグラムを示す図
である。

【図６】本発明の実施例１の電気化学検出器のリング電
極上でのＬ−グルタミン酸、Ｌ−アスコルビン酸混合溶
液の電流応答の時間変化を示した図である。

【図７】本発明による電気化学検出器の製造方法の実施
例３の工程を示す断面図である。

【図８】本発明の電気化学検出器の実施例４の構成を示
す平面図である。

【図９】本発明の電気化学検出器の実施例５の構成を示
す平面図（ａ）、及びアセチルコリン検出のために本発
明の検出器と共に用いた薄膜電極（ｂ）の平面図であ
る。

【図１０】本発明の実施例５に示す検出器の特性評価を
行ったフローインジェクションシステムのブロックダイ
ヤグラムを示す図である。

【符号の説明】

２１：シリコン酸化膜、２２：シリコン基板、２３：炭
素膜、２４：レジストパタン、２５：多孔質炭化ポリピ
ロール膜、２６：レジスト絶縁膜、２７：メディエータ
（Ｏｓポリマーゲル）膜、４１：リン酸緩衝生理食塩水
を入れたシリンジ、４２：リン酸緩衝生理食塩水に所定
の濃度のＬ−グルタミン酸とＬ−アスコルビン酸を溶解
させた標準試料溶液を入れたシリンジ、４３：シリンジ
ポンプ、４４：リキッドスイッチ、４５：Ｌ−グルタミ
ン酸酸化酵素カラム、４６：ＬＣ４Ｃデュアルポテンシ
オスタット、４７：参照電極、４８：対向電極、４９：
薄層セル、５０：本発明の電気化学検出器、６１：ポジ
型フォトレジスト、６２：シリコン酸化膜、６３：シリ
コン基板、６４：クロム／金積層薄膜、６５：多孔質炭
素膜、６６：レジスト絶縁膜、６７：過酸化水素の還元
を促進するＯｓポリマーのメディエータ、９１：リン酸
緩衝生理食塩水を入れたシリンジ、９２：リン酸緩衝生
理食塩水に所定の濃度のアセチルコリンとコリン及びＬ
−アスコルビン酸を溶解させた標準試料溶液を入れたシ
リンジ、９３：シリンジポンプ、９４：リキッドスイッ
チ、９５：コリン酸化酵素を固定化したカラム、９６：
ＬＣ４Ｃデュアルポテンシオスタット、９７：参照電
極、９８：対向電極、９９：薄層セル１、１００：薄層
セル２、１０１：本発明の電気化学検出器、１０２：ア
セチルコリンエステラーゼとコリン酸化酵素を固定化し
たカラム、１０３：Ｏｓポリマーをコートした炭素薄膜
電極

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 絶縁性基板上に形成した薄膜型の電気化
   学検出器において、その形状が円形と単一又は複数の同
   心円状のパタン、あるいは複数の同心円パタンからな
   り、その電極のうち少なくとも一つが多孔質薄膜電極か
   らなるクーロメトリック電極であることを特徴とするラ
   ディアルフロー型電気化学検出器。
2. 【請求項２】 請求項１における多孔質薄膜が電解重合
   により薄膜を形成し、該重合膜を炭化させた膜からなる
   ことを特徴とするラディアルフロー型電気化学検出器。
3. 【請求項３】 請求項１における多孔質薄膜が白金黒の
   メッキ薄膜からなることを特徴とするラディアルフロー
   型電気化学検出器。
4. 【請求項４】 請求項１において電解重合膜から作製し
   た多孔質電極が分析対象物質あるいは試料に含まれる妨
   害物質の電子移動反応を促進させる物質により被覆され
   ていることを特徴とするラディアルフロー型電気化学検
   出器。
5. 【請求項５】 請求項１において薄膜電極を形成した基
   板がもう一枚の導電性の対向電極又は絶縁性のブロック
   と中心を打ち抜いたガスケットを挟みこむことにより薄
   層セルを形成し、測定溶液を導入する溶離液が導電性の
   対向電極又は絶縁性のブロック側から分割された円形あ
   るいは同心円の中心へ導入され、電極の外側位置で対向
   電極又は絶縁性のブロックを通して排出される構造であ
   ることを特徴とするラディアルフロー型電気化学検出
   器。
6. 【請求項６】 表面又は全体が絶縁性の基板上に導電性
   薄膜を作製する工程、円形と単一又は複数の同心円状の
   パタン、あるいは複数の同心円パタンからなる薄膜電極
   を形成する工程、該電極を絶縁性膜で被覆した後、電極
   部分のみをフォトリソグラフィ法、又はフォトリソグラ
   フィ法とエッチング法により露出させる工程、該電極の
   うち少なくとも一つの電極に電解重合膜を形成し、熱分
   解により多孔質炭素膜からなるクーロメトリック電極を
   形成する工程、該電極が形成された基板と対向ブロック
   により内部を円形に切り取った高分子フィルムを挟みこ
   んで薄層セルを形成する工程を有することを特徴とする
   ラディアルフロー型電気化学的検出器の製造方法。
7. 【請求項７】 絶縁性の基板上にレジストを用いて円形
   と単一又は複数の同心円状のパタン、あるいは複数の同
   心円パタンからなるパタンを形成する工程、該基板上に
   導電性薄膜を被覆し、次いでレジストをはく離すること
   によって請求項１に記載の形状を持つ導電性薄膜を形成
   する工程、該電極を絶縁性膜で被覆した後、電極部分の
   みをフォトリソグラフィ法、又はフォトリソグラフィ法
   とエッチング法を用いて露出させる工程、該電極のうち
   少なくとも一つの電極に電解重合膜を形成し、熱分解に
   より多孔質炭素膜からなるクーロメトリック電極を形成
   する工程、該基板と対向ブロックにより内部を円形に切
   り取った高分子フィルムを挟みこんで薄層セルを形成す
   る工程を有することを特徴とするラディアルフロー型電
   気化学的検出器の製造方法。