JP2928588B2 - アルコール測定方法及び測定装置 - Google Patents
アルコール測定方法及び測定装置Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/18—Apparatus specially designed for the use of free, immobilized or carrier-bound enzymes
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、固定化アルコールオキシダーゼを用い広範
な濃度範囲のアルコール含有試料の測定に対応できる測
定方法及び測定装置に関するものである。
な濃度範囲のアルコール含有試料の測定に対応できる測
定方法及び測定装置に関するものである。
（従来の技術） 固定化酵素を用いる測定装置は、簡便性・迅速性・基
質特異性等の特徴を有し、臨床分析・食品分析・環境計
測等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつあ
る。
質特異性等の特徴を有し、臨床分析・食品分析・環境計
測等の広範な分野において、その応用範囲を広げつつあ
る。
このように固定化酵素を用いる測定装置の開発が進展
するなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食
品・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の
提案がなされている。アルコールの測定に利用できる酵
素としては、アルコール脱水素酵素（EC.1.1.1.1）とア
ルコールオキシダーゼ（EC.1.1.3.13）等が有望視され
ている。アルコール脱水素酵素は、NAD（ニコチンアデ
ニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に用
いる試薬が高価になること、及び酵素自体の安定性が低
いことから、溶液系での利用に留まっている。
するなかで、アルコール、特にエタノールの分析は、食
品・発酵・臨床分野等において開発の要望が多く各種の
提案がなされている。アルコールの測定に利用できる酵
素としては、アルコール脱水素酵素（EC.1.1.1.1）とア
ルコールオキシダーゼ（EC.1.1.3.13）等が有望視され
ている。アルコール脱水素酵素は、NAD（ニコチンアデ
ニンジヌクレオチド）を補酵素として要求し、分析に用
いる試薬が高価になること、及び酵素自体の安定性が低
いことから、溶液系での利用に留まっている。
一方、固定化酵素を用いる測定装置の中で、アンペロ
メトリックな計測を行う装置、すなわち酵素反応により
起きる電極活性物質の増減を、定電圧を印加した作用電
極からの電流出力値の変化として捉える形式の装置は、
高感度化が容易で安定性も優れるため各種の電極、装
置、方法が開発されている。アンペロメトリックな分析
方法の代表例としては、酸素電極によるものと過酸化水
素電極によるものがある。この２種は固定化酵素を用い
る測定装置に最もよく用いられているが、応答速度・S/
N比の点で過酸化水素電極を用いる方法が優れている。
このような理由で過酸化水素電極を用いる測定装置に利
用できる酵素として、アルコールオキシダーゼが注目さ
れる。
メトリックな計測を行う装置、すなわち酵素反応により
起きる電極活性物質の増減を、定電圧を印加した作用電
極からの電流出力値の変化として捉える形式の装置は、
高感度化が容易で安定性も優れるため各種の電極、装
置、方法が開発されている。アンペロメトリックな分析
方法の代表例としては、酸素電極によるものと過酸化水
素電極によるものがある。この２種は固定化酵素を用い
る測定装置に最もよく用いられているが、応答速度・S/
N比の点で過酸化水素電極を用いる方法が優れている。
このような理由で過酸化水素電極を用いる測定装置に利
用できる酵素として、アルコールオキシダーゼが注目さ
れる。
しかし臨床、食品、発酵等の各分野において対象とす
る試料中のアルコール濃度は大きく異なり、単一の固定
化酵素を用いる測定装置で対応することは困難である。
何故なら、オキシダーゼが溶存酸素を利用して基質を酸
化するために、低濃度域での感度を向上すると高濃度の
アルコール試料が注入されたときに溶存酸素が消費され
てしまい、酵素反応の進行が停止するためにアルコール
濃度と応答値との直線関係が無くなってしまう。
る試料中のアルコール濃度は大きく異なり、単一の固定
化酵素を用いる測定装置で対応することは困難である。
何故なら、オキシダーゼが溶存酸素を利用して基質を酸
化するために、低濃度域での感度を向上すると高濃度の
アルコール試料が注入されたときに溶存酸素が消費され
てしまい、酵素反応の進行が停止するためにアルコール
濃度と応答値との直線関係が無くなってしまう。
このため従来は低濃度のアルコール試料を測定できる
ように装置を構成し、高濃度のアルコール試料を測定す
る場合は希釈率を大きくするか、各種濃度の試料に対応
する装置を複数用意する以外に方法がなかった。ところ
が希釈率を大きくすることにより、希釈に伴う誤差も大
きくなり分析上好ましいものではなく、複数の装置を用
いることは分析コストの上昇をもたらし望ましいもので
はなかった。
ように装置を構成し、高濃度のアルコール試料を測定す
る場合は希釈率を大きくするか、各種濃度の試料に対応
する装置を複数用意する以外に方法がなかった。ところ
が希釈率を大きくすることにより、希釈に伴う誤差も大
きくなり分析上好ましいものではなく、複数の装置を用
いることは分析コストの上昇をもたらし望ましいもので
はなかった。
（発明が解決しようとする課題） 本発明は、広い濃度範囲のアルコール試料に対応でき
る固定化アルコールオキシダーゼカラムを用いる測定方
法、及びその方法を実現する上で、簡便性に優れた測定
装置を提供することを目的とする。
る固定化アルコールオキシダーゼカラムを用いる測定方
法、及びその方法を実現する上で、簡便性に優れた測定
装置を提供することを目的とする。
（課題を解決するための手段） 本発明者らは、担体表面に固定化したアルコールオキ
シダーゼの耐久性等に悪影響を与えることなく、測定時
にカラム中に流れる緩衝液に可逆的阻害剤としてアジ化
化合物を添加することによりその活性を制御できること
を見い出し、また可逆的阻害剤の濃度を変えることによ
り単一の固定化アルコールオキシダーゼカラムを用いて
広範な濃度領域のアルコール試料の測定を行うことがで
きることを見出し、本発明を完成するに至った。
シダーゼの耐久性等に悪影響を与えることなく、測定時
にカラム中に流れる緩衝液に可逆的阻害剤としてアジ化
化合物を添加することによりその活性を制御できること
を見い出し、また可逆的阻害剤の濃度を変えることによ
り単一の固定化アルコールオキシダーゼカラムを用いて
広範な濃度領域のアルコール試料の測定を行うことがで
きることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、担体表面にアルコールオキシダーゼを固定
化したカラムに試料を緩衝液とともに導き、カラム中に
おける酵素反応により酸素の減少量または過酸化水素の
生成量をカラムの下流で検知することによるフロー型ア
ルコール測定方法であって、前記試料中に含有されるア
ルコール濃度に応じた量のアジ化化合物を可逆阻害剤と
して前記緩衝液に添加してアルコールに対する前記固定
化アルコールオキシダーゼの活性を低下させ測定可能な
アルコール濃度範囲の上限を増大させるアルコール測定
方法である。
化したカラムに試料を緩衝液とともに導き、カラム中に
おける酵素反応により酸素の減少量または過酸化水素の
生成量をカラムの下流で検知することによるフロー型ア
ルコール測定方法であって、前記試料中に含有されるア
ルコール濃度に応じた量のアジ化化合物を可逆阻害剤と
して前記緩衝液に添加してアルコールに対する前記固定
化アルコールオキシダーゼの活性を低下させ測定可能な
アルコール濃度範囲の上限を増大させるアルコール測定
方法である。
更に本発明は、少なくとも、（ａ）緩衝液とアジ化化
合物溶液を混合送液する手段、（ｂ）担体表面にアルコ
ールオキシダーゼを固定化したカラム、及び（ｃ）酵素
電極若しくは過酸化水素電極をこの順で上流より配置し
てなり、更に、（ｄ）前記混合送液する手段における緩
衝液とアジ化化合物溶液の混合比率を設定する手段を有
する測定可能なアルコール濃度範囲の上限を増大させる
機能を持つフロー型アルコール測定装置である。
合物溶液を混合送液する手段、（ｂ）担体表面にアルコ
ールオキシダーゼを固定化したカラム、及び（ｃ）酵素
電極若しくは過酸化水素電極をこの順で上流より配置し
てなり、更に、（ｄ）前記混合送液する手段における緩
衝液とアジ化化合物溶液の混合比率を設定する手段を有
する測定可能なアルコール濃度範囲の上限を増大させる
機能を持つフロー型アルコール測定装置である。
（作用） 可逆的阻害剤は、酵素反応を阻害する阻害剤を取り除
くと、可逆的に酵素の活性がもどる性質をもっており、
アジ化化合物が挙げられる。アジ化化合物としては、ア
ザイドイオンが緩衝液中に存在すれば良いため、各種の
塩類、例えばアジ化ナトリウム、アジ化カリウム等を用
いることができる。
くと、可逆的に酵素の活性がもどる性質をもっており、
アジ化化合物が挙げられる。アジ化化合物としては、ア
ザイドイオンが緩衝液中に存在すれば良いため、各種の
塩類、例えばアジ化ナトリウム、アジ化カリウム等を用
いることができる。
緩衝液に添加するアジ化化合物量は、あらかじめ測定
濃度域の標準物を用いて検量線の直線範囲を見て決定す
る。一般にアザイドインオンの濃度が10μＭ程度で、ま
ったくアザイドイオンを含まない場合に比べて活性が低
下する現象が観察され、50mM程度までほぼ直線的に活性
低下が認められる。これを越える高濃度のアザイドイオ
ンが存在しても活性低下は進行しない。従って本発明で
は試料中のアルコール含有濃度に応じてこの範囲でアジ
化化合物の添加濃度を調整することにより、一定量のア
ルコールオキシダーゼを固定したカラムを用いて、極め
て高濃度のアルコール試料から、低濃度のものまで測定
することが可能となる。
濃度域の標準物を用いて検量線の直線範囲を見て決定す
る。一般にアザイドインオンの濃度が10μＭ程度で、ま
ったくアザイドイオンを含まない場合に比べて活性が低
下する現象が観察され、50mM程度までほぼ直線的に活性
低下が認められる。これを越える高濃度のアザイドイオ
ンが存在しても活性低下は進行しない。従って本発明で
は試料中のアルコール含有濃度に応じてこの範囲でアジ
化化合物の添加濃度を調整することにより、一定量のア
ルコールオキシダーゼを固定したカラムを用いて、極め
て高濃度のアルコール試料から、低濃度のものまで測定
することが可能となる。
アジ化化合物を緩衝液に添加し、アルコールオキシダ
ーゼの活性が低下すると、同一濃度のアルコールが固定
化アルコールオキシダーゼカラムと接触しても反応する
アルコールの割合が低下し、それに伴って溶存酸素消費
量が低下する。つまり高濃度のアルコールと接触しても
酸素消費量は低い値に留まるために検量線の飽和現象が
認められない。或いは同様に過酸化水素生成量は低い値
に留まるため、過酸化水素電極を用いる場合でも同一感
度レンジで高濃度のアルコール試料を測定することが可
能である。このことは、固定化アルコールオキシダーゼ
のアルコールに対するミカエリス定数は比較的大きく、
むしろ酸素に対するミカエリス定数が小さいために、ア
ザイドイオンが存在しない場合は検量線の直線範囲が狭
いことにより生じる現象であると考えられる。
ーゼの活性が低下すると、同一濃度のアルコールが固定
化アルコールオキシダーゼカラムと接触しても反応する
アルコールの割合が低下し、それに伴って溶存酸素消費
量が低下する。つまり高濃度のアルコールと接触しても
酸素消費量は低い値に留まるために検量線の飽和現象が
認められない。或いは同様に過酸化水素生成量は低い値
に留まるため、過酸化水素電極を用いる場合でも同一感
度レンジで高濃度のアルコール試料を測定することが可
能である。このことは、固定化アルコールオキシダーゼ
のアルコールに対するミカエリス定数は比較的大きく、
むしろ酸素に対するミカエリス定数が小さいために、ア
ザイドイオンが存在しない場合は検量線の直線範囲が狭
いことにより生じる現象であると考えられる。
従ってアルコールオキシダーゼは測定対象の中で最も
高感度な測定に必要な量を固定化すれば良い。
高感度な測定に必要な量を固定化すれば良い。
固定化カラムに送液する緩衝液にアジ化化合物を入れ
ることにより上記の効果がもたらされるが、さらにあら
かじめアジ化化合物を含まない緩衝液と、一定濃度のア
ジ化化合物を含む溶液もしくは緩衝液を準備しておき、
この二種の液を固定化アルコールオキシダーゼカラムに
入る前に混合すれば同様の効果が得られ、しかも迅速に
アルコールの定量濃度範囲を変更できる。
ることにより上記の効果がもたらされるが、さらにあら
かじめアジ化化合物を含まない緩衝液と、一定濃度のア
ジ化化合物を含む溶液もしくは緩衝液を準備しておき、
この二種の液を固定化アルコールオキシダーゼカラムに
入る前に混合すれば同様の効果が得られ、しかも迅速に
アルコールの定量濃度範囲を変更できる。
本発明のアルコール測定装置の検出手段は酸素電極ま
たは過酸化水素電極が望ましく、二液の混合により液の
屈折率等が変動し、それが定量結果に影響を与えるよう
な欠点がない。
たは過酸化水素電極が望ましく、二液の混合により液の
屈折率等が変動し、それが定量結果に影響を与えるよう
な欠点がない。
緩衝液は特に限定されず、リン酸緩衝液、トリス緩衝
液等の中性付近で強い緩衝能を有するものが用いられ
る。
液等の中性付近で強い緩衝能を有するものが用いられ
る。
さらに上記の分析について、二種の液体の混合比率を
設定する手段と、その混合を実行する混合送液する手段
を有する装置を用いることにより、極めて簡便に分析を
行える。二種の液体を混合する手段としては、例えば計
量器と撹拌機を備え、あらかじめ設定された計量値に応
じて混合を行うこともできるが、２台のポンプで各液体
を各々送液する機構をもち、２台のポンプにより送液さ
れる液体を合流させる混合送液手段が最も好ましい。こ
の場合は２台のポンプの送液量の合計が一定になるよう
にし、ポンプ送液量の比率を変えることにより容易に混
合比率を変えられる。また混合比率の設定も流速設定で
代用できるために、装置構成が簡略化できる利点があ
る。
設定する手段と、その混合を実行する混合送液する手段
を有する装置を用いることにより、極めて簡便に分析を
行える。二種の液体を混合する手段としては、例えば計
量器と撹拌機を備え、あらかじめ設定された計量値に応
じて混合を行うこともできるが、２台のポンプで各液体
を各々送液する機構をもち、２台のポンプにより送液さ
れる液体を合流させる混合送液手段が最も好ましい。こ
の場合は２台のポンプの送液量の合計が一定になるよう
にし、ポンプ送液量の比率を変えることにより容易に混
合比率を変えられる。また混合比率の設定も流速設定で
代用できるために、装置構成が簡略化できる利点があ
る。
混合比率を設定する手段としては駆動機構にパルスモ
ーターを有するポンプでは流量比をマイクロコンピュー
ターに入力しポンプ流量比を演算するマイクロコンピュ
ータを用いて入力パルス周波数を変化させることにより
容易に流速を変化させられるし、同様にDCサーボモータ
ーとコントローラーを用いる方法を例示できる。
ーターを有するポンプでは流量比をマイクロコンピュー
ターに入力しポンプ流量比を演算するマイクロコンピュ
ータを用いて入力パルス周波数を変化させることにより
容易に流速を変化させられるし、同様にDCサーボモータ
ーとコントローラーを用いる方法を例示できる。
固定化酵素カラムに利用するアルコールオキシダーゼ
は、カンディダ属、ピチア属等のメタノール資化酵母に
由来するものや担子菌に由来するものが利用できる。
は、カンディダ属、ピチア属等のメタノール資化酵母に
由来するものや担子菌に由来するものが利用できる。
固定化に用いる担体およびその固定化法としては各種
公知のものが用いられる。例えば担体としては、セルロ
ース、アガロース、デキストラン、キチン、コラーゲ
ン、アミノ酸系ポリマー、ポリスチレン樹脂、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、イオン
交換樹脂、ガラスビーズ、アルミナ、ジルコニア、セラ
ミック、砂、カーボン、活性炭、シリカゲル、モレキュ
ラーシーブ、チタニア、タンニン、シリコンゴム、酸性
白土、ケイソウ土、耐火煉瓦等が例示できる。また固定
化方法としては、担体への物理吸着法、化学結合法等が
ある。
公知のものが用いられる。例えば担体としては、セルロ
ース、アガロース、デキストラン、キチン、コラーゲ
ン、アミノ酸系ポリマー、ポリスチレン樹脂、ポリアク
リルアミド、ポリビニルアルコール、ナイロン、イオン
交換樹脂、ガラスビーズ、アルミナ、ジルコニア、セラ
ミック、砂、カーボン、活性炭、シリカゲル、モレキュ
ラーシーブ、チタニア、タンニン、シリコンゴム、酸性
白土、ケイソウ土、耐火煉瓦等が例示できる。また固定
化方法としては、担体への物理吸着法、化学結合法等が
ある。
アルコールオキシダーゼ反応の検出方法としては、カ
ラム下流に過酸化水素により発色する比色試薬を注入し
分光光度計で定量する方法や、酸素電極または過酸化水
素電極で検出する方法がある。この中で酸素電極または
過酸化水素電極を用いる方法は、試料の着色、濁り等の
影響を受けず実用上好都合である。
ラム下流に過酸化水素により発色する比色試薬を注入し
分光光度計で定量する方法や、酸素電極または過酸化水
素電極で検出する方法がある。この中で酸素電極または
過酸化水素電極を用いる方法は、試料の着色、濁り等の
影響を受けず実用上好都合である。
酸素電極の構成としてはガルバニ電池型、クラーク型
酸素電極等が例示され、また過酸化水素電極の構成は過
酸化水素選択透過膜をその表面に有する金、白金等の導
体を作用極とする電極が例示される。
酸素電極等が例示され、また過酸化水素電極の構成は過
酸化水素選択透過膜をその表面に有する金、白金等の導
体を作用極とする電極が例示される。
本発明の測定方法もしくは測定装置を用いれば、臨床
分析のように高感度を要求される場合も、清酒・ウイス
キー等の比較的低感度での測定でも、希釈率を一定にし
たまま一台の測定装置で対応できる。
分析のように高感度を要求される場合も、清酒・ウイス
キー等の比較的低感度での測定でも、希釈率を一定にし
たまま一台の測定装置で対応できる。
（実施例） 以下に実施例を示し本発明をさらに説明するが、もち
ろん本発明はこれらの例に限定されるものではない。
ろん本発明はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１ （１）過酸化水素電極の作成方法 直径2mmの白金線の側面を熱収縮テフロンで被覆し、
その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑
に仕上げる。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対
極、飽和カロメル電極（以下SCEと略す）を参照極とし
て、0.1M硫酸中、＋2.0Vで10分間の電解処理を行った。
その後白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、
10％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トル
エン溶液に１時間浸漬後、洗浄した。
その線の一端をやすりおよび1500番のエメリー紙で平滑
に仕上げる。この白金線を作用極、1cm角型白金板を対
極、飽和カロメル電極（以下SCEと略す）を参照極とし
て、0.1M硫酸中、＋2.0Vで10分間の電解処理を行った。
その後白金線をよく水洗した後、40℃で10分間乾燥し、
10％γ−アミノプロピルトリエトキシシランの無水トル
エン溶液に１時間浸漬後、洗浄した。
牛血清アルブミン（シグマ社製、Fracti on V）20mgを蒸留水1mlに溶解し、その中にグルタルア
ルデヒドを0.2％になるように加える。この混合液を手
早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、40℃で15分間
乾燥硬化して過酸化水素電極を得た。
ルデヒドを0.2％になるように加える。この混合液を手
早く先に用意した白金線上に５μｌのせ、40℃で15分間
乾燥硬化して過酸化水素電極を得た。
（２）固定化酵素カラムの作成方法 耐火煉瓦（30メッシュ〜60メッシュ分級品）150mgを
よく乾燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの
10％無水トルエン溶液1mlを加え１時間放置する。シラ
ンカップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄
後、120℃で２時間乾燥する。放冷後、５％グルタルア
ルデヒド水溶液を0.5ml加え、室温で１時間放置する。
この担体をよく水洗する。最後にpH7.0のリン酸ナトリ
ウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除く。
よく乾燥し、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの
10％無水トルエン溶液1mlを加え１時間放置する。シラ
ンカップリング剤をトルエンとメタノールでよく洗浄
後、120℃で２時間乾燥する。放冷後、５％グルタルア
ルデヒド水溶液を0.5ml加え、室温で１時間放置する。
この担体をよく水洗する。最後にpH7.0のリン酸ナトリ
ウム緩衝液で洗浄し、可能な限り緩衝液を除く。
このアミノシラン化担体に、アルコールオキシダーゼ
（シグマ社製、Pichia pastoris由来の液状酵素標品）
25μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に希釈
した酵素溶液を加え、室温で１時間放置する。放置後緩
衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3mm、
内径2mm、長さ10cmのフッ素樹脂製チューブ中に充填す
る。
（シグマ社製、Pichia pastoris由来の液状酵素標品）
25μｌをpH7.0のリン酸ナトリウム緩衝液で10倍に希釈
した酵素溶液を加え、室温で１時間放置する。放置後緩
衝液でよく洗浄する。この酵素固定化担体を外径3mm、
内径2mm、長さ10cmのフッ素樹脂製チューブ中に充填す
る。
（３）測定装置 本発明に従う測定には、第１図に示されるフロー型測
定装置を使用した。このフロー型測定装置は試料注入装
置（レオダイン社製7125型インジェクタ）（３）と上述
したように作成された過酸化水素電極（７）及び参照電
極としてのAg/AgCl電極（８）が取り付けられ対極
（９）としてステンレス鋼から成る配管が備えられた測
定用セル（６）とを含んで構成される。内径0.5mm、長
さ0.5mのフッ素樹脂製配管（４）でインジェクタ（３）
と固定化酵素カラム（５）、および固定化酵素カラム
（５）と測定用セル（６）とを接続した。測定用セル
（６）の内容積は40μｌであり、過酸化水素電極（７）
とAg/AgCl電極（８）とが緩衝液の管路を介して対向し
て配置される。過酸化水素電極（７）にはポテンシオス
タット（12）によってAg/AgCl電極に対して＋0.6Vの電
圧が印加される。これらは、恒温槽（11）の内部に設置
される。恒温槽（11）内の温度は37℃±0.2℃に保持さ
れる。緩衝液（１）の送液には高速液体クロマトグラフ
ィ用のポンプ（２）を用い1.0ml/分の流量で送液され
る。緩衝液（１）としては、100mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.0）に各種濃度のアジ化ナトリウムを添加し
たものを用いた。
定装置を使用した。このフロー型測定装置は試料注入装
置（レオダイン社製7125型インジェクタ）（３）と上述
したように作成された過酸化水素電極（７）及び参照電
極としてのAg/AgCl電極（８）が取り付けられ対極
（９）としてステンレス鋼から成る配管が備えられた測
定用セル（６）とを含んで構成される。内径0.5mm、長
さ0.5mのフッ素樹脂製配管（４）でインジェクタ（３）
と固定化酵素カラム（５）、および固定化酵素カラム
（５）と測定用セル（６）とを接続した。測定用セル
（６）の内容積は40μｌであり、過酸化水素電極（７）
とAg/AgCl電極（８）とが緩衝液の管路を介して対向し
て配置される。過酸化水素電極（７）にはポテンシオス
タット（12）によってAg/AgCl電極に対して＋0.6Vの電
圧が印加される。これらは、恒温槽（11）の内部に設置
される。恒温槽（11）内の温度は37℃±0.2℃に保持さ
れる。緩衝液（１）の送液には高速液体クロマトグラフ
ィ用のポンプ（２）を用い1.0ml/分の流量で送液され
る。緩衝液（１）としては、100mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH7.0）に各種濃度のアジ化ナトリウムを添加し
たものを用いた。
測定を備えた緩衝液は、廃液瓶（10）で捕捉される。
測定値はA/D変換器（13）でデジタル値に直された後、
通信ケーブル（14）を介してコンピュータ（15）へ送ら
れて解析される。その結果はプリンター（16）に出力さ
れる。
測定値はA/D変換器（13）でデジタル値に直された後、
通信ケーブル（14）を介してコンピュータ（15）へ送ら
れて解析される。その結果はプリンター（16）に出力さ
れる。
（４）測定方法と結果 固定化直後のカラムを測定装置に装着し、まずアザイ
ドイオンを含まないリン酸緩衝液を送液した。恒温槽温
度が平衡に達した後、０〜10.0（V/V）％のエタノール
溶液５μｌを注入した。この検量線を第２図に○印で示
す。
ドイオンを含まないリン酸緩衝液を送液した。恒温槽温
度が平衡に達した後、０〜10.0（V/V）％のエタノール
溶液５μｌを注入した。この検量線を第２図に○印で示
す。
次に、アジ化ナトリウムを0.1mM、1mM、10mMの濃度で
添加した各緩衝液で同様に検量線を作成した。この結果
も第２図に示す。
添加した各緩衝液で同様に検量線を作成した。この結果
も第２図に示す。
第２図に示されるように、アザイドイオンを含まない
場合（○）は、検量線の勾配が大きく、直線性が成立す
る範囲は0.1％までである。しかしアジ化ナトリウム濃
度が0.1mM（●）で１％まで、1mM（△）で６％まで、10
mM（×）で10％までの直線関係が得られる。したがっ
て、低濃度のエタノールを分析する際にはアザイドイオ
ン量を減らし、高濃度のエタノールを分析する際にはア
ザイドイオンの量を増量すれば測定出来ることがわかっ
た。
場合（○）は、検量線の勾配が大きく、直線性が成立す
る範囲は0.1％までである。しかしアジ化ナトリウム濃
度が0.1mM（●）で１％まで、1mM（△）で６％まで、10
mM（×）で10％までの直線関係が得られる。したがっ
て、低濃度のエタノールを分析する際にはアザイドイオ
ン量を減らし、高濃度のエタノールを分析する際にはア
ザイドイオンの量を増量すれば測定出来ることがわかっ
た。
実施例２ （１）過酸化水素電極の作成方法 実施例１と同様に作成した。
（２）固定化酵素カラムの作成方法 実施例１と同様に作成した。
（３）測定装置 第３図に示されるフロー型測定装置を使用した。この
フロー型測定装置の試料の注入、カラム、電極等は実施
例１と同様の構成であるが、ポンプと送液用ボトルそれ
ぞれを２基備えている点で異なる。
フロー型測定装置の試料の注入、カラム、電極等は実施
例１と同様の構成であるが、ポンプと送液用ボトルそれ
ぞれを２基備えている点で異なる。
緩衝液（１）は100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
0）である。アジ化ナトリウム溶液は送液ボトル（17）
に蓄えられており、これはpH7.0の100mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液に100mMになるようにアジ化ナトリウムを添加
したものである。
0）である。アジ化ナトリウム溶液は送液ボトル（17）
に蓄えられており、これはpH7.0の100mMリン酸ナトリウ
ム緩衝液に100mMになるようにアジ化ナトリウムを添加
したものである。
本実施例ではコンピュータ（15）が緩衝液とアジ化化
合物を混合送液する手段の混合比率を設定するものであ
り、アジ化ナトリウムの濃度の制御は第４図に示す流れ
図に従って行われる。
合物を混合送液する手段の混合比率を設定するものであ
り、アジ化ナトリウムの濃度の制御は第４図に示す流れ
図に従って行われる。
まず目標とするアジ化ナトリウム濃度を第３図のコン
ピュータ（15）に入力する。そしてあらかじめ記憶され
た送液ボトル（17）中のアジ化ナトリウム濃度と比較し
て、それより低ければ希釈率を求める。希釈率から、２
基のポンプの流速比が求められる。例えば10倍に希釈す
る必要があるならば、第１のポンプ（２）の流量９に対
して第２のポンプ（18）は１の比で送液する必要があ
る。この場合、合流後の流速が実施例１と同様に1.0ml/
minであるため、第１のポンプ（２）は0.9ml/min、第２
のポンプ（18）は0.1ml/minとなる。この計算後、ポン
プに接続されたコントロールケーブル（19）と（20）に
信号を送り、流速を変更する。（４）測定方法および結
果 固定化直後のカラムを測定装置に装着し、まずアザイ
ドイオンを含まないリン酸緩衝液を送液しながら、恒温
槽温度が平衡に達した後、０〜10.0（V/V）％のエタノ
ール溶液５μｌを注入した。次に、アジ化ナトリウム濃
度を0.1mM、1mM、10mMに設定して第４図の流れ図に従っ
て流速を変更後、各条件で同様に検量線を作成した。こ
の結果、実施例１と同様の結果が得られた（第５図）。
ピュータ（15）に入力する。そしてあらかじめ記憶され
た送液ボトル（17）中のアジ化ナトリウム濃度と比較し
て、それより低ければ希釈率を求める。希釈率から、２
基のポンプの流速比が求められる。例えば10倍に希釈す
る必要があるならば、第１のポンプ（２）の流量９に対
して第２のポンプ（18）は１の比で送液する必要があ
る。この場合、合流後の流速が実施例１と同様に1.0ml/
minであるため、第１のポンプ（２）は0.9ml/min、第２
のポンプ（18）は0.1ml/minとなる。この計算後、ポン
プに接続されたコントロールケーブル（19）と（20）に
信号を送り、流速を変更する。（４）測定方法および結
果 固定化直後のカラムを測定装置に装着し、まずアザイ
ドイオンを含まないリン酸緩衝液を送液しながら、恒温
槽温度が平衡に達した後、０〜10.0（V/V）％のエタノ
ール溶液５μｌを注入した。次に、アジ化ナトリウム濃
度を0.1mM、1mM、10mMに設定して第４図の流れ図に従っ
て流速を変更後、各条件で同様に検量線を作成した。こ
の結果、実施例１と同様の結果が得られた（第５図）。
本実施例に示される装置を用いた場合、さらに容易に
広範囲のアルコール濃度測定が可能であった。
広範囲のアルコール濃度測定が可能であった。
（効果） 本発明の測定方法および測定装置により、固定化アル
コールオキシダーゼを用いて、広範な分野の種々の濃度
範囲のアルコールの測定に対応できる。
コールオキシダーゼを用いて、広範な分野の種々の濃度
範囲のアルコールの測定に対応できる。
第１図は実施例１に係わるフロー型アルコール測定装置
である。図中において各番号は以下のとおりである。 （１）緩衝液 （２）ポンプ （３）インジェクタ （４）接続配管 （５）固定化酵素カラム （６）測定セル （７）過酸化水素電極 （８）Ag/AgCl参照電極 （９）対極 （10）廃液ボトル （11）恒温槽 （12）ポテンシオスタット （13）A/D変換器 （14）通信ケーブル （15）コンピュータ （16）プリンター 第２図は、実施例１の結果を示している。 ○；アジ化ナトリウム 0 mM ●；アジ化ナトリウム 0.1mM △；アジ化ナトリウム 1 mM ×；アジ化ナトリウム 10 mM 第３図は実施例２に係わるフロー型アルコール測定装置
である。 （17）アジ化ナトリウム溶液の送液ボトル （18）第２のポンプ 第４図は、濃度を制御するための流れ図である。 第５図は実施例２の結果を示している。 ○；アジ化ナトリウム 0 mM ●；アジ化ナトリウム 0.1mM △；アジ化ナトリウム 1 mM ×；アジ化ナトリウム 10 mM
である。図中において各番号は以下のとおりである。 （１）緩衝液 （２）ポンプ （３）インジェクタ （４）接続配管 （５）固定化酵素カラム （６）測定セル （７）過酸化水素電極 （８）Ag/AgCl参照電極 （９）対極 （10）廃液ボトル （11）恒温槽 （12）ポテンシオスタット （13）A/D変換器 （14）通信ケーブル （15）コンピュータ （16）プリンター 第２図は、実施例１の結果を示している。 ○；アジ化ナトリウム 0 mM ●；アジ化ナトリウム 0.1mM △；アジ化ナトリウム 1 mM ×；アジ化ナトリウム 10 mM 第３図は実施例２に係わるフロー型アルコール測定装置
である。 （17）アジ化ナトリウム溶液の送液ボトル （18）第２のポンプ 第４図は、濃度を制御するための流れ図である。 第５図は実施例２の結果を示している。 ○；アジ化ナトリウム 0 mM ●；アジ化ナトリウム 0.1mM △；アジ化ナトリウム 1 mM ×；アジ化ナトリウム 10 mM
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 27/416
Claims (2)
- 【請求項１】担体表面にアルコールオキシダーゼを固定
化したカラムに試料を緩衝液とともに導き、カラム中に
おける酵素反応による酸素の減少量または過酸化水素の
生成量をカラムの下流で検知することによるフロー型ア
ルコール測定方法であって、前記試料中に含有されるア
ルコール濃度に応じた量のアジ化化合物を可逆阻害剤と
して前記緩衝液に添加してアルコールに対する前記固定
化アルコールオキシダーゼの活性を低下させ測定可能な
アルコール濃度範囲の上限を増大させるアルコール測定
方法。 - 【請求項２】少なくとも、（ａ）緩衝液とアジ化化合物
溶液を混合送液する手段、（ｂ）担体表面にアルコール
オキシダーゼを固定化したカラム、及び（ｃ）酵素電極
若しくは過酸化水素電極をこの順で上流より配置してな
り、更に、（ｄ）前記混合送液する手段における緩衝液
とアジ化化合物溶液の混合比率を設定する手段を有する
測定可能なアルコール濃度範囲の上限を増大させる機能
を持つフロー型アルコール測定装置。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2133497A JP2928588B2 (ja) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | アルコール測定方法及び測定装置 |
| EP19910108219 EP0458288A3 (en) | 1990-05-22 | 1991-05-22 | Method and apparatus for measurement of alcohols |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2133497A JP2928588B2 (ja) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | アルコール測定方法及び測定装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0427858A JPH0427858A (ja) | 1992-01-30 |
| JP2928588B2 true JP2928588B2 (ja) | 1999-08-03 |
Family
ID=15106154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2133497A Expired - Fee Related JP2928588B2 (ja) | 1990-05-22 | 1990-05-22 | アルコール測定方法及び測定装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0458288A3 (ja) |
| JP (1) | JP2928588B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4214822C2 (de) * | 1992-05-05 | 1998-12-03 | Inst Bioanalytik Gmbh | Verfahren und Vorrichtung zur kontinuierlichen Bestimmung von Substraten von Oxidoreduktasen |
| FR2772392B1 (fr) * | 1997-12-15 | 2000-03-10 | Toulousaine De Rech Et De Dev | Procede et installation de fabrication de monoesters par alcoolyse d'huile vegetale riche en acide oleique |
| CN106670424B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-03-12 | 浙江六和轻机械有限公司 | 一种铝合金轮毂加工方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2685145B2 (ja) * | 1988-01-25 | 1997-12-03 | 王子製紙株式会社 | 酵素電極 |
-
1990
- 1990-05-22 JP JP2133497A patent/JP2928588B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1991
- 1991-05-22 EP EP19910108219 patent/EP0458288A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0458288A3 (en) | 1993-05-05 |
| EP0458288A2 (en) | 1991-11-27 |
| JPH0427858A (ja) | 1992-01-30 |
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