JP2002159297A - プロテアーゼ活性の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 プロテアーゼ阻害剤に対する耐性度の評価に
利用できる、ウイルス等に由来するプロテアーゼ活性の
測定方法の提供。 【解決手段】被検プロテアーゼ、プロテアーゼ基質、そ
してマーカー遺伝子を共通のプロモーターの制御下に発
現させ、生成するマーカー遺伝子とプロテアーゼによる
切断生成物を測定する。マーカー遺伝子の発現量が基質
蛋白質の発現量を反映するので、正確な測定が可能とな
る。HIVのプロテアーゼ阻害剤耐性度の評価に有用であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、プロテアーゼ活性
の測定方法、並びにこの測定方法を利用したプロテアー
ゼのプロテアーゼ・インヒビター耐性度の測定方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】ヒト免疫不全ウイルス(Human Immunodef
iciency Virus; HIV)を病原ウイルスとするAIDSは、か
つては治療薬が無いとまで言われていたウイルス性疾患
であった。しかしウイルス増殖を抑制することができる
逆転写酵素阻害剤やウイルスプロテアーゼ阻害剤の発見
により、様々な角度から、その発症や進行を遅らせるこ
とができるようになった。特に、複数種の逆転写酵素阻
害剤とプロテアーゼ阻害剤(protease inhibitor)を組み
合わせる多剤併用療法は、高い有効性が認められてい
る。現在多剤併用療法には、たとえば以下のような薬剤
が用いられている。逆転写酵素阻害剤： ジドブシン(AZT, ZDV) ジダノシン(ddl) ザルシタビン(ddC) ラミブジン(3TC) スタブジン(d4T) 硫酸アバカビル(ABV) ネビラピン(NVP) エファビレンツ(EFV) プロテアーゼ阻害剤： ネルフィナビル(NFV) リトナビル(RTV) サキナビル(SQV) インジナビル(IDV) アンプレナビル(APV) 多剤併用療法は、高活性抗レトロウイルス療法(Highly
Active Antiretroviral Therapy; HAART)とも呼ばれ、
現在のところ最も一般的なエイズ治療方法となってい
る。

【０００３】HAARTが導入されて以来、感染者の予後は
著明に改善された。特に、治療効果の改善におけるプロ
テアーゼ阻害剤の貢献は大きい。HIV等のレトロウイル
スは、もともと変異を起こしやすいウイルスである。そ
のため、逆転写酵素のみを標的とする薬物治療には、薬
剤耐性ウイルスの出現が大きな障害となっていた。これ
に対して、プロテアーゼという逆転写酵素とは異なる標
的に対する薬剤を組み合わせることにより、その相乗効
果によって、プロテアーゼ阻害剤による治療効果を高め
ていると考えられている。しかしながら、プロテアーゼ
阻害剤についても、耐性ウイルスの出現が治療の成否を
左右することは逆転写酵素阻害剤と同様である。また、
体内に存在するウイルスの薬剤耐性度をもとに投与薬剤
を選択すると予後を改善するという報告もあり、HIVの
薬剤耐性度試験法の確立が待たれている。

【０００４】ウイルスの薬剤耐性試験の原理は、遺伝子
型に基づくgenotypingと、実際に薬剤に対する耐性を観
察するphenotypingに大別できる。プロテアーゼ阻害剤
については、そのアミノ酸変異と耐性との関係はかなり
解析されている。しかし、プロテアーゼ遺伝子の変異が
多様なため、genotypingのみによる耐性の正確な予測は
困難である。したがって、phenotypingの方法も必要で
ある。またphenotypingはより直接的な耐性試験法であ
ることから、ウイルスの薬剤に対する挙動を総合的に判
定することができる。

【０００５】現在、多くの研究者らが試みているのは組
み換えHIV-1を作製し耐性試験を行う方法である。この
方法では、まず治療の標的遺伝子（たとえばプロテアー
ゼ遺伝子）を患者から得られた血液などのサンプルから
RT-PCR法により増幅し、HIV-1ベクターに組み込んで、
ウイルスを作製する。HIV-1ベクターは、HIV-1のプロウ
イルスゲノムをベースに構築されたベクターで、プロウ
イルスゲノムを構成する遺伝子の一部を任意の遺伝子に
組み換えることができる。遺伝子が組み換えられたHIV-
1ベクターを適当な宿主細胞に形質転換すれば、遺伝子
を人為的に組み換えられたウイルスゲノムRNAを有する
感染性のウイルス粒子を発現させることができる。この
ウイルス粒子を回収してT細胞などに感染させ、薬剤存
在下で培養し、ウイルスの増殖の度合で耐性度を判定す
るものである。しかしながら、この従来の方法には、以
下のような問題点がある。 1) 制限酵素を使用した場合、組み換えウイルスベクタ
ーの作製に時間がかかる。またレトロウイルスの持つ高
い変異性のために、標的遺伝子内に制限酵素認識部位が
存在する可能性が否定できない。 2) ウイルスの回収と耐性試験のためのウイルスの培養
に数週間を要する。 3) 感染性ウイルスを扱うための施設（BSL3）が必要で
ある。 すなわち、患者検体を得てから最終的な結論を得るまで
に１ヵ月以上の時間を要し、特殊な設備を有する施設以
外での試験が不可能である。また、多検体の処理も困難
である。

【０００６】さらにこの試験を困難にしている要因とし
て、組み換えウイルスを作製した場合、野生型(wild ty
pe)に比較してプロテアーゼ遺伝子に変異を含むウイル
スでは酵素活性が低いため、著しくそのウイルスの増殖
能が劣る点がある。従って、この方法に基づいて耐性試
験を行うと、しばしば試験期間中には検出限界以下の増
殖しか示さないため、耐性を有していても耐性なしとい
う結果が得られることになる。すなわち、ウイルスの増
殖に大きく依存している従来の方法では、組み換え変異
ウイルスのプロテアーゼ阻害剤に対する耐性試験は極め
て困難である。

【０００７】HIVの増殖に依存しないでプロテアーゼの
活性を測定する方法として、プロテアーゼによるgag蛋
白質の切断生成物を指標とする方法が報告されている(A
ntonucci T. et al., J. Virological Methods 49, 247
-256, 1994)。この方法では、活性を評価すべきHIVプロ
テアーゼの遺伝子を非感染性クローンであるX19(Ratner
L., AIDS Res. Human Retroviruses 7, 287-294, 199
1)に組み込み、培養中に生成するp24蛋白質を指標とし
てプロテアーゼ活性を求めている。p24は、gag蛋白質が
プロテアーゼによって切断されて生成するウイルス蛋白
質である。更にp24に対する反応性が高いELISAを利用す
ることにより、p24の選択的な測定を可能とした。ウイ
ルスの増殖ではなく、プロテアーゼ遺伝子の発現と、プ
ロテアーゼによるgag蛋白質の切断を指標とした点で、
この方法はウイルスのプロテアーゼ阻害剤耐性をより容
易に評価できる方法と言うことができる。

【０００８】さて、この方法に基づいてプロテアーゼ活
性を測定するときには、生成物であるp24の量をその前
駆蛋白質(gag precursor)の量と対比させなければなら
ない。しかし公知の方法では、前駆蛋白質の量は内部標
準としてコトランスフェクトしたβガラクトシダーゼ活
性に基づいて推定されていた。この方法においては、２
つの異なるベクターを常に正確に混合し、同じ条件で形
質転換しなければならない。また、増殖後の全ての細胞
で２つの発現ベクターが同等に発現しているかどうかは
不明である。したがって、前駆蛋白質と、その発現レベ
ルを反映すべきβガラクトシダーゼの産生状況が、異な
っている可能性が常に伴っていた。言いかえれば、公知
のプロテアーゼ活性測定方法においては、前駆蛋白質
と、その発現レベルを反映すべきβガラクトシダーゼの
発現レベルの関係が安定しないので、正確な測定が期待
できない可能性がある。更に、公知の方法に用いられた
ベクターは、env遺伝子を欠損するものの、LTRや逆転写
酵素遺伝子(RT)やインテグラーゼ遺伝子(IN)などが残っ
ているため感染の危険性が残る。加えて、プロテアーゼ
遺伝子を制限酵素を用いてベクターに組み込む手法を利
用しているため、プロテアーゼ発現ベクターの構築には
クローニングのステップが必要となり、時間がかかる欠
点がある。また標的遺伝子内に使用予定の制限酵素認識
部位が存在する場合にはクローニングそのものが行えな
い恐れがある。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、プロテアー
ゼ活性の測定において、前駆蛋白質の産生量をより正確
に反映することができる方法の提供を課題としている。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明者は、プロテアー
ゼの役割が、ウイルス粒子の構築から成熟までの、いわ
ゆる後期過程に集約されていることに着目した。生成さ
れるp24を測定することにより、ウイルスを実際に増殖
させること無く、プロテアーゼ活性を求められることは
既に報告されている(Antonucci T. et al., J. Virolog
ical Methods 49, 247-256, 1994)。この方法は、プロ
テアーゼ活性とp24の生成量が以下のような関係にある
ことを利用している。

【００１１】

【数１】

【００１２】このとき、薬剤存在下でウイルスを産生さ
せると、薬剤濃度依存的にプロテアーゼ活性が阻害さ
れ、gagの切断活性が低下して、p24産生量が少なくなる
ことが示されている。しかし公知の方法は、内部標準が
前駆蛋白質の産生量を正確に反映できない可能性などの
問題点を残していた。

【００１３】そこで本発明者らは、ウイルス蛋白質を発
現するベクターにマーカー遺伝子も組み込み、前駆蛋白
質と共通のプロモーターの制御下に発現させることによ
り、より正確に前駆蛋白質の発現レベルを反映させるこ
とができるのではないかと考えた。そして、HIVのプロ
ウイルスゲノムにおけるnef遺伝子を適当なマーカー遺
伝子に組み換えることによって、gag前駆蛋白質、プロ
テアーゼ、そしてマーカー遺伝子を共通のプロモーター
の制御下に発現させることに成功した。更に、このよう
な発現ベクターを用いることによって、前駆蛋白質の発
現量がマーカー遺伝子に正確に反映され、その結果プロ
テアーゼ活性を正しく測定できることを見出し本発明を
完成した。

【００１４】また本発明者らは、プロテアーゼ活性の測
定に影響の無いウイルス遺伝子を選択して除去、あるい
は変異させることにより、公知のベクターで心配された
感染の危険性をより低くすることができることを見出し
た。加えて、発現ベクターの構築におけるクローニング
の工程を省略しうる遺伝子導入方法を応用することによ
って、容易にプロテアーゼ活性の測定が行えることを明
らかにし本発明を完成した。すなわち本発明は、以下の
プロテアーゼ発現ベクター、およびプロテアーゼ活性の
測定方法、並びにプロテアーゼ阻害剤に対するウイルス
プロテアーゼの耐性度評価方法に関する。

【００１５】〔１〕以下の要素を含み、各遺伝子および
クローニングサイトに組み込まれるプロテアーゼをコー
ドする遺伝子が、いずれも下記プロモーターの制御下に
発現するように下記要素を配置したプロテアーゼ活性測
定用の発現ベクター。 (a)プロモーター、(b)活性を測定すべきプロテアーゼに
よって切断される蛋白質をコードする遺伝子、(c)クロ
ーニングサイト；ただしこのクローニングサイトに組み
込まれたプロテアーゼ遺伝子は前記プロモーターの制御
下に発現し、かつ発現したプロテアーゼは(b)の蛋白質
を切断することができる、および(d)マーカー遺伝子 〔２〕前記クローニングサイトが、λファージのattR1
およびattR2である〔１〕に記載のベクター。 〔３〕attR1およびattR2の間に第２のマーカー遺伝子を
保持した〔２〕に記載のベクター。 〔４〕第２のマーカー遺伝子がlacZαペプチドをコード
する遺伝子である〔３〕に記載のベクター。 〔５〕活性を測定すべきプロテアーゼがHIVに由来する
プロテアーゼであり、前記プロテアーゼによって切断さ
れる蛋白質が、少なくともp24を含むHIVgag蛋白質断片
である〔１〕に記載のベクター。 〔６〕前記発現ベクターが、次の群から選択される少な
くとも一つの方法によってHIVの感染性を抑制されてい
る〔５〕に記載のベクター。 (a)HIVプロウイルスゲノムに由来する5'LTRの少なくと
も一部を欠いている、(b)HIVプロウイルスゲノムに由来
する3'LTRの少なくとも一部を欠いている、(c)HIVプロ
ウイルスゲノムに由来する遺伝子のうちpol遺伝子の少
なくとも一部を欠いているか、または蛋白質コード領域
にストップコドンを含む、(d)HIVプロウイルスゲノムに
由来する遺伝子のうちenv遺伝子の少なくとも一部を欠
いているか、または蛋白質コード領域にストップコドン
を含む 〔７〕プロモーターの下流にHIVプロウイルスゲノムが
挿入され、このプロモーターの制御下にウイルス蛋白質
を発現することができ、かつ下記の改変(1)および(2)が
施されている〔５〕に記載のベクター。 (1)プロテアーゼ遺伝子を前記クローニングサイトに組
み換える、(2)nef遺伝子の少なくとも一部をマーカー遺
伝子に組み換える、 〔８〕更に下記(3)〜(6)に記載の少なくとも１つの改変
が施されている〔７〕に記載のベクター。 (3)5'LTRの少なくとも一部をCMVプロモーターに組み換
えて前記プロモーターとする、(4)pol遺伝子の少なくと
も一部を欠いているか、または蛋白質コード領域にスト
ップコドンを含む、(5)env遺伝子の少なくとも一部を欠
いているか、または蛋白質コード領域にストップコドン
を含む、(6)3'LTRをSV40由来のpolyAシグナルに組み換
える

〔９〕発現ベクターがSV40 oriを含む〔１〕に記載のベ
クター。 〔１０〕以下の工程を含む、プロテアーゼ活性の測定方
法。 １）活性を測定すべきプロテアーゼをコードする遺伝子
を得る工程、 ２）以下の要素を含む発現ベクターのクローニングサイ
トに１）で得た遺伝子を組み込んでプロテアーゼ発現ベ
クターとする工程、ここで該発現ベクターの各遺伝子お
よびクローニングサイトに組み込まれるプロテアーゼを
コードする遺伝子は、いずれも下記プロモーターの制御
下に発現するように配置されている、(a)プロモータ
ー、(b)前記プロテアーゼによって切断される蛋白質を
コードする遺伝子、(c)クローニングサイト；ただしこ
のクローニングサイトに組み込まれたプロテアーゼ遺伝
子は前記プロモーターの制御下に発現し、かつ発現した
プロテアーゼは(b)の蛋白質を切断することができる、
および(d)マーカー遺伝子 ３）工程２）で得たプロテアーゼ発現ベクターを宿主細
胞に形質転換しプロテアーゼを発現可能な条件下で培養
する工程、 ４）培養物に含まれる前記蛋白質のプロテアーゼによる
切断産物、およびマーカー遺伝子の発現生成物を測定す
る工程、および ５）マーカー遺伝子の発現生成物の量に対する切断産物
の量の比をプロテアーゼ活性と関連付ける工程、 〔１１〕工程１）におけるプロテアーゼをコードする遺
伝子がλファージのattB1を5'側に付加したフォワード
プライマー、およびλファージのattB2を5'側に付加し
たリバースプライマーを用いたPCR法の増幅生成物であ
り、かつ前記クローニングサイトが、λファージのattR
1およびattR2である〔１０〕に記載の方法。 〔１２〕前記プロテアーゼがHIVに由来するものであ
り、前記プロテアーゼによって切断される蛋白質が少な
くともp24を含むHIVのgag蛋白質断片であり、プロテア
ーゼによる切断生成物としてp24を測定する〔１０〕に
記載の方法。 〔１３〕発現ベクターがSV40 oriを含み、宿主細胞とし
てCOS7細胞を用いる〔１０〕に記載の方法。 〔１４〕プロテアーゼ阻害剤の存在下で〔１０〕に記載
の工程３）の培養を行うことを特徴とする、プロテアー
ゼ阻害剤存在下におけるプロテアーゼの活性を測定する
方法。 〔１５〕次の工程を含む、プロテアーゼのプロテアーゼ
阻害剤に対する耐性度を測定する方法。 ａ）〔１４〕に記載の方法によって、プロテアーゼ阻害
剤存在下におけるプロテアーゼの活性を測定する工程 ｂ）プロテアーゼ阻害剤非存在下におけるプロテアーゼ
活性値と、ａ）の活性値の比を求める工程、 〔１６〕同一のプロテアーゼについて、異なるプロテア
ーゼ阻害剤に対する耐性度を〔１５〕に記載の方法によ
って求め、ある耐性度に対応する各プロテアーゼ阻害剤
の濃度を比較する工程を含む、プロテアーゼ阻害剤の有
効性の比較方法。 〔１７〕候補化合物の存在下で〔１０〕に記載の工程
３）の培養を行うことを特徴とする、候補化合物のプロ
テアーゼの阻害作用を測定する方法。 〔１８〕〔１７〕に記載の方法によってプロテアーゼ阻
害作用を測定し、プロテアーゼ阻害作用を有する化合物
を選択する工程を含む、プロテアーゼ阻害剤をスクリー
ニングする方法。 〔１９〕以下の要素からなる、プロテアーゼ活性の測定
用キット。 (a)〔１〕に記載のプロテアーゼ活性測定用の発現ベク
ター、(b)プロテアーゼをコードする遺伝子を増幅する
ことができるプライマーセット 〔２０〕以下の要素からなる、プロテアーゼ活性の測定
用キット。 (a)〔２〕に記載のプロテアーゼ活性測定用の発現ベク
ター、(b) λファージのattB1を5'側に付加したフォワ
ードプライマー、およびλファージのattB2を5'側に付
加したリバースプライマーからなるプロテアーゼをコー
ドする遺伝子を増幅することができるプライマーセット 〔２１〕更にλファージ部位特異的組み換え酵素を含む
〔２０〕に記載のキット。 〔２２〕〔１９〕、または〔２０〕に記載のプロテアー
ゼ活性の測定用キットに、プロテアーゼ阻害剤を組み合
わせたプロテアーゼ阻害剤に対するプロテアーゼの耐性
度を測定するためのキット。 〔２３〕以下の要素からなる外来遺伝子発現ベクター。 (a)λファージのattR1およびattR2からなる、外来遺伝
子を挿入するためのクローニングサイト、および(b)前
記クローニングサイトに配置される外来遺伝子の発現を
制御することができるプロモーター、(c)前記クローニ
ングサイトに保持されたLacZαペプチドをコードする遺
伝子、および(d)前記LacZαペプチドをコードする遺伝
子の発現を制御することができるプロモーター、 〔２４〕外来遺伝子がプロテアーゼをコードする遺伝子
である〔２３〕に記載の外来遺伝子発現ベクター。 〔２５〕更に(e)前記プロテアーゼによって切断される
蛋白質をコードする遺伝子を含む〔２４〕に記載の発現
ベクター。 〔２６〕以下の工程を含む、プロテアーゼ活性の測定方
法。 ａ）λファージの部位特異的組み換え酵素認識配列を付
加したプロテアーゼをコードする遺伝子を合成する工
程、 ｂ）〔２４〕に記載の外来遺伝子発現ベクターに前記プ
ロテアーゼをコードする遺伝子を組み込んでプロテアー
ゼ発現ベクターとする工程、 ｃ）前記プロテアーゼ発現ベクターをプロテアーゼ遺伝
子の発現が可能な宿主細胞に形質転換する工程、 ｄ）前記形質転換体を、前記プロテアーゼ遺伝子の発現
が可能な条件下で培養する工程、および ｅ）発現生成物であるプロテアーゼの活性を測定する工
程 〔２７〕外来遺伝子発現用ベクターが〔２５〕に記載の
ベクターであり、当該ベクターが発現する前記プロテア
ーゼによって切断される蛋白質の切断生成物を測定する
ことによって、プロテアーゼ活性を測定する工程を含
む、〔２６〕に記載の方法。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明のプロテアーゼ活性測定用
の発現ベクターは、以下の要素を含み、各遺伝子および
クローニングサイトに組み込まれるプロテアーゼをコー
ドする遺伝子が、いずれも下記プロモーターの制御下に
発現するように配置される。 (a)プロモーター、(b)活性を測定すべきプロテアーゼに
よって切断される蛋白質をコードする遺伝子、(c)クロ
ーニングサイト；ただしこのクローニングサイトに組み
込まれたプロテアーゼ遺伝子は前記プロモーターの制御
下に発現し、かつ発現したプロテアーゼは(b)の蛋白質
を切断することができる、および(d)マーカー遺伝子

【００１７】本発明において測定の対象となるプロテア
ーゼは限定されない。プロテアーゼと、被検プロテアー
ゼによって切断される蛋白質とをコードする遺伝子を取
得することができれば、いずれも本発明によるプロテア
ーゼ活性測定用ベクターに応用することができる。本発
明において、特に好ましいプロテアーゼは、ウイルスの
プロテアーゼである。ウイルスの中でも、レトロウイル
スに由来するプロテアーゼは、ウイルス増殖を制御する
ための標的分子として重要である。加えて、変異が激し
いレトロウイルスのプロテアーゼの活性とプロテアーゼ
阻害剤に対する耐性度の評価は、ウイルス増殖を抑える
ための治療において重要な情報である。

【００１８】特に、HIVのコントロールにおいては、プ
ロテアーゼ阻害剤は必須の薬剤と言って良い。このよう
なウイルスのプロテアーゼは、本発明における被検プロ
テアーゼとして重要である。HIVには、遺伝子型に基づ
いてタイプ１やタイプ２等が報告されているが、これら
いずれのHIVもプロテアーゼの重要性は共通しているの
で、本発明における望ましいプロテアーゼと言うことが
できる。中でもHIVタイプ１は感染者が最も多いHIVであ
り、重要性は大きい。本発明において、特にことわらな
い限りHIVと記載するときには、HIVタイプ１を意味す
る。HIVの他、サル免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウ
イルス、あるいはヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプIや
タイプII等のレトロウイルスに由来するプロテアーゼ
も、本発明によってその活性を測定することができる。

【００１９】本発明のベクターを構成するプロモーター
は、測定に用いる宿主細胞において前記構成要素の発現
を導くことができるものであれば、特に限定されない。
たとえばHIVのプロテアーゼ活性を測定するためには、
一般に動物細胞でベクターを発現させることから、動物
細胞で作用するプロモーターを利用する。より具体的に
は、CMVプロモーター、βアクチンプロモーター、ある
いはエロンゲーションファクタープロモーター等を挙げ
ることができる。その他、HIVプロウイルスゲノムが有
する5'LTRのプロモーター作用を利用することもでき
る。ただし、5'LTRはウイルスの感染性の維持に必要な
領域である。したがって、5'LTRをプロモーターとして
利用する場合には、5'LTR以外の感染性の維持に必要な
領域を修飾して感染性を抑制するのが望ましい。たとえ
ばpol遺伝子へのストップコドンの導入は、感染性のウ
イルス粒子の生成を妨げるための手法として好適であ
る。

【００２０】本発明のベクターを構成する活性を測定す
べきプロテアーゼによって切断される蛋白質をコードす
る遺伝子には、プロテアーゼによって切断(processing)
される蛋白質をコードする任意の遺伝子を利用すること
ができる。なお本発明においては、プロテアーゼによっ
て切断される蛋白質を、前駆蛋白質と記載することがあ
る。たとえばHIV-1のプロテアーゼの活性を測定する場
合には、HIV-1プロテアーゼによって切断されるウイル
ス蛋白質や、この蛋白質の切断領域を含む断片をコード
する遺伝子を利用すれば良い。

【００２１】本発明においては、プロテアーゼによって
切断された蛋白質を測定しなければならないことから、
容易に測定することができる蛋白質を生成する蛋白質を
用いるのが有利である。具体的には、生成する蛋白質を
前駆蛋白質と容易に識別できる蛋白質が好ましい。たと
えば、抗体を用いて、イムノアッセイの原理によって両
者を識別することができる蛋白質は、本発明の前駆蛋白
質として好ましい。このような蛋白質としては、たとえ
ばHIVのgag蛋白質を示すことができる。通常HIVは、そ
の成熟過程において、分子量５５kDaのgag蛋白質(p55)
がプロテアーゼに切断されて、p17(MA)、p24(CA)、p9(N
C)、そしてp6の４つの断片となる。これらの断片を利用
してウイルス粒子が構成(assemble)される。これらの断
片のうちp24をイムノアッセイによって検出することに
より、HIV感染の診断が行われている。

【００２２】ところでp24は、イムノアッセイの原理に
よって前駆蛋白質と識別することができる。より具体的
には、p24との反応性に優れ、前駆蛋白質との反応性が
低いモノクローナル抗体の利用によって、前駆蛋白質存
在下でもp24を特異的に測定することができるのであ
る。したがって、本発明に基づいてHIVプロテアーゼの
活性を測定するとき、HIVgag蛋白質、またはそのp24を
含む断片は、前駆蛋白質として望ましい。その他、pol
の翻訳産物も、プロテアーゼによって逆転写酵素(RT)や
インテグラーゼ(IN)を生じる。したがって、pol領域か
ら選択される、RTやINを生じるための切断領域を含む断
片は、本発明における前駆蛋白質として用いることがで
きる。更に、Fluorescence Resonance Energy Transfer
(FRET)の現象を測定法として用いる基質蛋白質を利用
することもできる。すなわち、たとえばEGFPとEBFPをプ
ロテアーゼの基質ペプチドでつないだ融合蛋白質(Trend
s Cell Biol. 1999 Feb;9(2):57-60. Review.)を本発明
の前駆蛋白質として用いる。このような融合蛋白質は、
プロテアーゼの作用によってFRETによって検出すること
ができる蛋白質を生成する。

【００２３】本発明のベクターを構成するクローニング
サイトは、測定すべきプロテアーゼ遺伝子を組み込むこ
とができるものであれば特に限定されない。一般に外来
遺伝子の挿入には、特定の制限酵素認識配列が用いられ
る。しかし制限酵素による切断と外来遺伝子のライゲー
ションに基づく方法は、DNAの分離精製やクローニング
の工程を必要とするので、ベクターの構築に時間を要す
る。また対象遺伝子内に使用予定の制限酵素認識部位が
存在する場合にはクローニングできなくなるという欠点
がある。したがって本発明のクローニングサイトには、
外来遺伝子の導入にあたって制限酵素を必要としないも
のが望ましい。このような遺伝子の組み換え方法として
GATEWAY cloning（GATEWAYはLifetechnology社の登録商
標）、Cre-LoxP系(Liu,Q. et al. Current Bio. 8: 130
0-1309.1998)、あるいは相同組み換え(Kellam Pand Lar
der B.A. Antimicrobial Agent and Chemotherapy 38.2
3-30, 1994)などを挙げることができる。

【００２４】Cre-LoxP系は、バクテリオファージP1のCr
e蛋白質によって、Lox Pサイトが組み換えられる現象を
利用した、in vitroで実施可能な遺伝子の組み換え技術
である。CLONTECH社が、Cre-LoxP系を利用した遺伝子組
み換えに必要なキット「Creator^(TM) Gene Cloning & E
xpression System」を販売しているので、これを本発明
に応用することができる。Cre-LoxP系に基づいて本発明
のクローニングサイトをデザインするには、たとえばht
tp://www.clontech.com/archive/APR00UPD/creator.htm
lに記載されているように目的遺伝子（本発明における
プロテアーゼ遺伝子）をLox Pサイトによって挟みこ
み、これを組み込み先のベクターに挿入する。組み込み
先のベクターのクローニングサイトにLox Pサイトを配
置しておけば、Cre蛋白質により組み換えが起き、目的
のコンストラクトを作成できる。LoxPサイトは、８bpの
スペーサーを挟んだ１組の１３bpの逆向きリピート(inv
erted repeat)塩基配列で構成される。８bpのスペーサ
ー部分で、その塩基配列の方向性を保って、目的遺伝子
の組み換えが起きる。

【００２５】相同組み換えは、真核細胞において、類似
する塩基配列からなる領域が組み換えられる現象を利用
した遺伝子組み換え方法である。相同組み換えの原理に
基づいて本発明のクローニングサイトをデザインすると
きには、組み換えに必要な塩基配列をベクターに配置す
る。たとえば、プロテアーゼ遺伝子の塩基配列、あるい
は人為的に導入した任意の塩基配列をクローニングサイ
トとして利用することができる。このクローニングサイ
トにプロテアーゼ遺伝子を導入するには、プロテアーゼ
遺伝子の5'末端と3'末端にクローニングサイトに対応す
る組み換え用の塩基配列を付加しておけば良い。

【００２６】相同組み換えが細胞内で行われる反応であ
るのに対して、GATEWAY cloningではin vitroでの遺伝
子組み換えが可能である。GATEWAY cloningは、λファ
ージの大腸菌ゲノムへの組み込みの際に起きる反応を利
用した組み換え反応である。λファージは、ファージの
attPサイトとattBサイトの部位特異的組換え酵素により
大腸菌の染色体に組込まれる。この反応をin vitroで行
うために、GATEWAYのシステムでは、２種類の組換え酵
素ミックスが用いられる。ひとつは、BPクロナーゼ酵素
でattPサイトとattBサイトに作用して、attLサイトとat
tRサイトを作る（組込み反応）。この酵素混合物は、In
t(Integrase)とIHF(IntegrationHostFactor)から成って
いる。一方の酵素混合物は、LRクロナーゼ酵素で、attL
サイトとattRサイトに作用して、attBサイトとattPサイ
トを作る（切出し反応）。この酵素混合物は、Int、IHF
とさらにXis(Excisionase)から成っている(http://www.
lifetech.com/gateway、およびhttp://biotech.nikkeib
p.co.jp/netlink/lto/gateway/introduction/index2.ht
ml)。これらの酵素混合物は、Lifetechnology社で販売
されている。

【００２７】GATEWAY cloning technologyに基づいて本
発明におけるクローニングサイトをデザインする場合に
は、いわゆる「目的ベクター」(Destination vector)の
構造を参照すると良い。すなわち、クローニングサイト
の5'側にはattR1を、3'側にattR2を配置するのである。
ここでattR1とattR2の塩基配列としては以下に示す塩基
配列を利用する。 attR1:5'-ATCACAAGTTTGTACAAAAAA-3'（配列番号：６） attR2:5'-ATCACCACTTTGTACAAGAAA-3'（配列番号：７）

【００２８】GATEWAY cloning 用のクローニングサイト
にプロテアーゼ遺伝子を組み込むためには、まず目的遺
伝子のN末端側にattB1を、C末端側にattB2を付加した遺
伝子断片を用意する。このような遺伝子断片は、必要な
塩基配列を5'側に付加したプライマーを利用したPCR法
によって容易に合成することができる。HIVのプロテア
ーゼ遺伝子を組み込む場合には、患者の血液試料からウ
イルスゲノム(RNA)を抽出し、これを鋳型としてRT-PCR
を行えば必要な遺伝子断片を得ることができる。

【００２９】プライマーに付加する塩基配列は、N末端
側のattB1と、C末端側のattB2である。より具体的に
は、センスプライマーの5'側にはattB1のセンス配列
を、アンチセンスプライマーの5'側にはattB2のアンチ
センス配列を付加する。attB1とattB2は、それぞれ２５
bの塩基配列からなっているので、プロテアーゼ遺伝子
の増幅に必要なプライマーの塩基配列と合わせても５０
b前後の長さである。このような長さのオリゴヌクレオ
チドを合成する方法は公知である。ここでattB1とattB2
の塩基配列としては以下に示す塩基配列を利用する。 attB1:5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3'（配列番
号：８） attB2:5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3'（配列番
号：９）

【００３０】本発明において、被検ウイルスのプロテア
ーゼ遺伝子は、患者の血漿中のウイルスから抽出された
ウイルスRNAを鋳型として、RT-PCRによって容易に得る
ことができる。あるいはクローン化されたプロウイルス
ゲノムや、更にそのプロテアーゼ遺伝子をPCRにより増
幅して本発明の発現ベクターに組み込むこともできる。
クローニングサイトとして前記GATEWAYシステムのクロ
ーニングサイトを応用したときには、PCR産物を酵素反
応によって簡単にプロテアーゼ活性発現用ベクターに組
み込むことができる。更にこれらのプロテアーゼ遺伝子
が、GATEWAYシステムの導入クローンとしてクローニン
グされているときには、クローニング済みのプロテアー
ゼ遺伝子を本発明の発現ベクターのクローニングサイト
に容易に組み込むことができる。いずれにせよ、GATEWA
Yシステムの応用により、HIV感染者に由来するHIVのプ
ロテアーゼについて、そのプロテアーゼ阻害剤の耐性度
を、きわめて迅速に明らかにすることができる。同様の
原理に基づく公知のプロテアーゼ活性の測定用発現ベク
ターの構築に比べ、はるかに容易に、そして迅速に結果
を得ることができる。

【００３１】PCR産物（プロテアーゼ遺伝子）を目的ベ
クターのクローニングサイトに組み込むには、BP反応に
よる導入クローン(entry clone)の作成、そしてLR反応
による導入クローンから目的ベクターへの組み換えが必
要である。しかし実際には、これらの反応は単一の反応
容器内で数時間のうちに完了することができる。以下
に、より具体的な操作（図４）について記載する。attB
1とattB2を末端に付加されたPCR産物は、BPクロナーゼ
によりpDONRベクターに組み込まれて導入クローンとな
る。BPクロナーゼによる反応は、PCR産物がpDONRベクタ
ーに対して一定方向に組み込まれ、しかも両者が１分子
づつ反応した導入クローンを生成する。導入クローンに
は、プロテアーゼ遺伝子がその両端をattL1とattL2に挟
まれた状態で組み込まれている。続いてこの反応液に目
的ベクターとLRクロナーゼを加える。LRクロナーゼは、
いったん導入クローンと目的ベクターを１：１で結合
し、続いてattL1/attR1、attL2/attR2間を結合すること
によって、導入クローンと目的ベクターのインサートを
入れ替える。その結果、導入クローンに保持されていた
プロテアーゼ遺伝子の１分子が、正しい方向で目的ベク
ターのクローニングサイトに組み込まれる。

【００３２】続いて本発明におけるマーカー遺伝子につ
いて説明する。本発明のマーカー遺伝子は、先に述べた
前駆蛋白質と同じプロモーターの制御下に発現し、前駆
蛋白質の発現量を反映するマーカー(surrogate marker)
として利用するために発現ベクターに組み込まれる。し
たがって、まず、発現量を容易に測定することができる
蛋白質をコードしていることが望ましい。このような遺
伝子としては、たとえば緑色蛍光蛋白質(Green Fluores
cent Protein)のように蛋白質自身が蛍光シグナルを発
する蛋白質や、ルシフェラーゼやβ−ガラクトシダーゼ
のような酵素蛋白質をコードする遺伝子を示すことがで
きる。酵素蛋白質は、適当な基質化合物と反応させるこ
とにより、容易にその発現レベルを測定することができ
る。

【００３３】本発明においては、前駆蛋白質として発現
した蛋白質に対する切断活性を指標としてプロテアーゼ
の活性を評価している。したがって、前駆蛋白質の発現
レベルを把握することは大切な条件である。本発明にお
けるマーカー遺伝子は、前駆蛋白質の発現レベルを反映
しなければならないが、必ずしも前駆蛋白質と同程度の
発現レベルを維持する必要はない。重要なことは、前駆
蛋白質遺伝子とマーカー遺伝子の発現レベルが相対的に
同じ水準で推移することである。本発明においては、共
通のプロモーターの制御下に両者の発現を誘導するの
で、少なくとも相対的な発現レベルは一定に推移するこ
とが期待できる。これに対して、前駆蛋白質とマーカー
遺伝子とを別々の発現系で発現させた場合には、各発現
系の形質転換効率等によって両者の発現レベルの相対的
な関係が変動する可能性がある。マーカー遺伝子が前駆
蛋白質の発現レベルを正確に反映できなければ、プロテ
アーゼ活性の正確な評価は期待できない。

【００３４】さて、本発明においては、活性を測定すべ
きプロテアーゼと、このプロテアーゼによって切断され
る蛋白質、そしてマーカー遺伝子とを、共通のプロモー
ターの制御下に発現させなければならない。そのために
は、プロウイルスゲノムを保持した発現ベクターをもと
に、必要な遺伝子やクローニングサイト等を組み込んだ
コンストラクトを用いるのが有利である。プロウイルス
ゲノムを発現可能な形で保持した発現ベクターは、共通
のプロモーターの制御下にウイルスの各蛋白質を発現可
能に保持している。したがって、少なくともプロテアー
ゼ遺伝子と、プロテアーゼによって切断される蛋白質を
コードする遺伝子を発現可能な状態にある。

【００３５】このようなプロウイルスゲノム組み込みベ
クターは、公知である。たとえば、最初に分離された感
染性クローンHXB2を含むpSP65HXB2Ecogpt(Ratner L, Fi
sherA, Jagodzinski LL, Mitsuya H, Liou RS, Gallo R
C, Wong-Staal F. AIDS ResHum Retroviruses. 1987 Sp
ring;3(1):57-69.)を出発材料として用い、クローニン
グサイト、マーカー遺伝子の付加等の必要な修飾を施し
て本発明の発現ベクターとすることができる。HXB2以外
の感染性分子クローンを含む他の発現ベクターも利用す
ることができる。先に述べたAntonucciらの方法で用い
られたクローンX19(Ratner L., AIDS Res. Human Retro
viruses 7, 287-294, 1991)は、env領域に２４１塩基の
欠損を有する、pSP65HXB2Ecogpt由来の発現ベクターで
ある。

【００３６】以下に感染性分子クローンを含むプラスミ
ドベクターに本発明に必要なエレメントを付加する方法
について、具体的に述べる。まず、プロウイルスゲノム
のプロテアーゼ遺伝子に相当する領域に、クローニング
サイトを組み込む。ウイルスゲノム本来のプロテアーゼ
遺伝子に相当する領域に、本発明における被検プロテア
ーゼ遺伝子を組み込むことで、被検プロテアーゼが生理
的にin vivoに近い形で発現される。その結果、プロテ
アーゼ活性をより高感度に検出することができる。さ
て、プロテアーゼ遺伝子を実際にクローニングサイトに
変換するには、公知の制限酵素とライゲーションに基づ
く一般的な方法を利用することができる。たとえばクロ
ーニングサイトとして市販のGATEWAY（登録商標）シス
テムを用いるときには、プロテアーゼ遺伝子に代えてク
ロナーゼ認識配列を導入すれば良い。

【００３７】GATEWAY（登録商標）システムは、導入ク
ローンに保持された目的遺伝子を、発現ベクターのクロ
ーニングサイトに組み換える反応に基づいている。その
組み換え効率は９０％を越える高い確率で起きるとされ
ているが、それでも組み換えに成功したクローンを選択
する工程は必要である。遺伝子組み換え体の選択には、
一般に薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子が利用され
る。本発明のクローニングサイトに、このマーカー遺伝
子の原理を利用することができる。すなわち、発現ベク
ターのクローニングサイトに予めマーカー遺伝子を挿入
しておくのである。

【００３８】GATEWAYシステムにおいては、導入クロー
ンから発現ベクターへの遺伝子の組み換えが起きると
き、同時に発現ベクターがクローニングサイトに保持し
ていた塩基配列が導入クローンの目的遺伝子が存在して
いた領域に組み換えられる。したがって、発現ベクター
のクローニングサイトにマーカー遺伝子を配置しておけ
ば、その脱落を指標としてGATEWAYシステムによる遺伝
子組み換えが起きたことを知ることができる。マーカー
遺伝子が宿主の生育を阻害するものであるときには、遺
伝子組み換えに成功したものだけが正常な生育が許され
ることになる。あるいは、発色や蛍光といった可視的な
シグナルを生成する遺伝子をマーカー遺伝子としたとき
には、このシグナルを生成しないものが、遺伝子組み換
えに成功した発現ベクターを保持していることになる。
本発明において、遺伝子組み換え体の選択を目的として
発現ベクターのクローニングサイトに組み込まれるマー
カー遺伝子を、第２のマーカー遺伝子という。

【００３９】第２のマーカー遺伝子は、発現ベクターの
選択を目的として組み込まれるものであるから、発現ベ
クターのクローニングに用いる宿主細胞において発現さ
れるように設計する。たとえば大腸菌でクローニングベ
クターを選択するときには、大腸菌において発現を誘導
できるプロモーターの下流に第２のマーカー遺伝子を配
置する。第２のマーカー遺伝子としては、たとえばLacZ
のαペプチドをコードする遺伝子を用いることができ
る。一般にLacZαペプチドは、alpha complementation
によって発現するβガラクトシダーゼ活性を指標とする
セレクションに用いられる。βガラクトシダーゼ活性
は、発色基質X-Galの青い発色として検出される。した
がって、青いコロニーは組み換えが起きておらず、LacZ
のαペプチドを発現していることがわかる。

【００４０】ただ実際には、後に示す実施例において
は、大腸菌での発現を誘導するtacプロモーターをLacZ
のαペプチド遺伝子と組み合わせた場合、LacZのαペプ
チドを大量発現した大腸菌が死滅している。その結果、
組み換えに失敗してプロテアーゼ遺伝子が導入されてい
ないクローンは生えてこないことになる。つまり本発明
におけるLacZαペプチドは、βガラクトシダーゼ活性を
利用することなく、ポジティブセレクションマーカーと
して機能することもできる。したがって本発明において
は、LacZαペプチドの利用により、たとえばDB3.1のよ
うな特殊な大腸菌株は不要である。あるいは市販のGATE
WAYシステムにおいては、目的ベクターのクローニング
サイトにccdB遺伝子が導入されている。この遺伝子を発
現した野生型DNAジャイレースを有する大腸菌はDNAジャ
イレースの活性が阻害されて死滅することから、ccdBを
マーカー遺伝子に利用することもできる。ccdBを第２の
マーカー遺伝子としてクローニングに利用する場合に
は、ccdB遺伝子産物に抵抗性を持つ変異したDNAジャイ
レースを有する大腸菌（DB3.1株など）を用いる必要が
ある。ただしpSP65HXB2Ecogptのプロテアーゼ遺伝子を
含む領域に相当する部分にccdBを組み込んでDB3.1株に
形質転換する方法では良好な結果を得ることができなか
った。原因は不明であるが、プラスミドの一部が欠損す
るといったプラスミドの不安定性が観察された。このた
めccdBに代えてLacZαペプチドの導入を試みた。LacZα
ペプチドを使ったクローニングでは、ccdBとDC3.1株の
組み合わせで見られたようなプラスミドの不安定性は見
られなかった。

【００４１】すなわち本発明は、以下の要素からなる外
来遺伝子発現ベクターを提供する。 (a)λファージのattR1およびattR2からなる、外来遺伝
子を挿入するためのクローニングサイト、および(b)前
記クローニングサイトに配置される外来遺伝子の発現を
制御することができるプロモーター、(c)前記クローニ
ングサイトに保持されたLacZαペプチドをコードする遺
伝子、および(d)前記LacZαペプチドをコードする遺伝
子の発現を制御することができるプロモーター、本発明
の外来遺伝子発現ベクターは、特にHIVのプロウイルス
ゲノムをベースとするベクターにλファージの部位特異
的組み換え酵素のためのクローニングサイトを導入する
ときに有用である。λファージの部位特異的組み換え酵
素による遺伝子の組み換え技術として、GATEWAYクロー
ニングが公知である。しかしGATEWAYクローニングにお
いて一般に用いられているマーカー遺伝子であるccdB
は、HIVプロウイルスゲノムをベースとする外来遺伝子
発現ベクターに応用した場合、プラスミドを安定に保持
できないなどの問題点があった。本発明の外来遺伝子発
現ベクターでは、マーカー遺伝子としてccdBに代えてLa
cZαペプチドを用いたことにより、この問題を解消し
た。

【００４２】本発明においてLacZαペプチドとは、たと
えばアミノ酸配列MTEYKLDAMIPGNSRAVVLQRRDWENPGVTQLNR
LAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGからなるペプチドを示
すことができる。このアミノ酸配列は大腸菌におけるal
pha complementationが可能であり、かつ本発明の発現
ベクターに用いたときには、tacプロモーターによる発
現によって大腸菌の生育を阻害するポジティブセレクシ
ョンマーカーとして機能する。LacZαペプチドには、こ
の他にも多くの変異配列が公知である。つまり一般にLa
cZαペプチドは、大腸菌におけるalpha complementatio
n(Welply JK.,et al., beta -Galactosidase alpha-com
plementation. Overlapping sequences. J. Biol. Che
m. 1981;256:6804-10)が可能なペプチド全般を意味する
用語として使用されている。本発明のLacZαペプチドに
は、これら公知のアミノ酸配列からなるペプチドを利用
することもできる。一方LacZαペプチドをコードする遺
伝子の発現に必要なプロモーターは、本発明による外来
遺伝子発現ベクターのセレクションを行う宿主において
当該遺伝子の発現を誘導しうるものであれば限定されな
い。大腸菌を宿主とする場合には、たとえばtacプロモ
ーターを利用することができる。

【００４３】本発明の外来遺伝子発現ベクターにλファ
ージの部位特異的組み換え酵素を利用して外来遺伝子を
組み込むときには、LacZαペプチドの発現が消失するこ
とを指標として、組み換えに成功したクローンを選択す
ることができる。本発明の外来遺伝子発現ベクターは、
マーカー遺伝子が安定に保持されているので、目的とす
る組み換え体を確実に選択することができる。外来遺伝
子としては、たとえば活性を測定すべきHIVプロテアー
ゼをコードする遺伝子を応用することができる。このよ
うにして得ることができるプロテアーゼ発現ベクター
は、当該プロテアーゼの発現と、活性測定に有用であ
る。

【００４４】本発明における発現ベクターを用いてプロ
テアーゼの活性を測定する場合、プロテアーゼ遺伝子お
よびプロテアーゼによって切断される前駆蛋白質遺伝子
と共通のプロモーターの制御下に発現することができる
マーカー遺伝子を組み込む必要がある。マーカー遺伝子
も、クローニングサイトと同様にプロウイルスゲノムの
遺伝子を置換することによって導入すると良い。そうす
ることによって、ウイルス蛋白質の発現と生理的に近い
状態でマーカー遺伝子の発現を誘導することができる。
その結果、前駆蛋白質の発現量をより正確に反映するこ
とができる。具体的には、たとえば、pol、env、あるい
はnefといった各遺伝子に代えて、マーカー遺伝子を組
み込むことができる。特にnef遺伝子はゲノムの3'に位
置するので、マーカー遺伝子を挿入することによるスプ
ライシングなどへの影響が少ないと考えられる。またne
fは細胞株でのウイルスゲノムの複製には必須でないの
で、他の遺伝子を挿入しても問題が少ない等の点から過
去においてもしばしば外来遺伝子の挿入部位として用い
られてきている。したがってnefは、マーカー遺伝子の
組み込みに好適である。

【００４５】プロウイルスゲノムを保持する発現ベクタ
ーを、以上の構成要素で組み換えることによって、本発
明の発現ベクターを得ることができる。さて、生理的な
条件下では、プロウイルスゲノムの発現には、ベクター
が有するプロモーター以外にも、いくつかの調節遺伝子
の作用が必要とされている。たとえばrev 遺伝子はHIV
の調節遺伝子の一つである。プロウイルスウイルスゲノ
ムから転写されたRNAのスプライシングにより、約１７k
Daの蛋白質をコードするrev mRNAとなる。rev蛋白質
は、ウイルス粒子の構築においては、ウイルスRNAのプ
ロセッシングを制御し、プロテアーゼの発現に必要であ
る。本発明のベクターにおいても、pol遺伝子の産物と
して発現するプロテアーゼや、前駆蛋白質として機能す
るgagの発現には、revが関与している。revは、これら
の構造蛋白質をコードするmRNA上に存在するrev応答領
域(rev responsive element; RRE)と呼ばれる塩基配列
に作用して、その核外輸送を行うとされている。以下に
述べる実施例においても、revを含む形でプロウイルス
ゲノムを改変している。しかし本発明においては、プロ
テアーゼおよびその基質の発現を可能とすることができ
る限り、プロウイルスゲノムのrevは必須ではない。

【００４６】たとえば、revを他の発現系によって供給
する方法も可能である。また、Mason-Pfizer monkey vi
rus で見出されたcis elementであるconstitutive tran
sportelement(CTE)をpolやgagのmRNAの一部として発現
させることによって、revの機能を代替することもでき
る。更に、これらの調節遺伝子の助けが無くても真核細
胞における発現が可能なように、gagやpolのコドンを至
適化することによって、revを用いないベクターとする
こともできる。つまり、polやgagを構成する塩基配列
を、宿主細胞として用いる真核細胞において使用頻度の
高いコドンに置換するのである。このとき、コーディン
グ配列には変化が無いように塩基配列に変異を与える。
このような変異を与えた遺伝子は、ウイルスの蛋白質で
ありながら、もはやrev非依存的に 蛋白質への翻訳が行
われ、本発明によるプロテアーゼ活性の測定を可能とす
る。

【００４７】本発明で用いられる発現ベクターには、プ
ロモーターに加えて、各種の発現制御領域を導入してお
くこともできる。たとえば、SV40 oriのような発現増強
活性を有する制御遺伝子を導入しておくことによって、
SV40のLarge T抗原を発現している細胞内でのプロテア
ーゼの発現レベルを高く維持することができる。また通
常SV40oriとして用いられているDNA断片はエンハンサー
活性を有することが知られている。したがって、これら
の発現制御領域の付加は、本発明のプロテアーゼ活性の
測定方法の感度を向上させる方法として有効である。更
に本発明においては、SV40以外に由来するエンハンサー
を使用することもできる。エンハンサーは、他の遺伝子
や発現制御領域を分断しないように、ベクター上の任意
の領域に配置すれば良い。エンハンサーの他にも、発現
増強を期待できる発現制御領域としては、ターミネータ
ーを挙げることができる。

【００４８】ところで非感染性とされている公知のプロ
ウイルスクローンであるX19は、env遺伝子の欠損によっ
てのみ、その感染性が抑制された状態にある。本発明の
プロテアーゼ活性の測定用発現ベクターにおいても、同
様の欠損を導入することができる。更に付加的に、プロ
テアーゼ活性の測定に必要が無く、かつ感染の可能性に
つながる領域を改変し、その感染性を更に弱めることが
できる。このような領域として、5'LTR、3'LTR、nef、
そしてpolを示すことができる。

【００４９】5'LTRと3'LTRは、ウイルスゲノムの複製に
必要な領域であるが、本発明によるプロテアーゼ活性の
測定には5'LTRの持つプロモーター活性および3'LTRのも
つpolyAシグナル活性だけで十分である。したがって、
この領域を欠損、あるいは変異させることによって、プ
ロウイルスクローンの感染性を奪うことができる。たと
えばプロウイルスゲノムの5'LTRに相当する領域を、プ
ロテアーゼ遺伝子等を発現させるためのプロモーターに
置換することができる。一方、3'LTRは、たとえばSV40
poly Aシグナルへの置換によって、プロウイルスクロー
ンの感染性を抑制できる。感染性の抑制を目的とするこ
れらの変異は、必ずしもその両方を同時に導入する必要
は無く、任意の一方のみを導入することもできる。

【００５０】pol領域は、ウイルス粒子の複製に必要な
プロテアーゼ遺伝子や逆転写酵素遺伝子を含んでいる。
このうちプロテアーゼ遺伝子に相当する部分は、本発明
においては、たとえば被検プロテアーゼの遺伝子を組み
込むためのクローニングサイトに改変される。このと
き、プロテアーゼ遺伝子の下流にストップコドンを配置
することができる。このような改変をpol領域に加える
ことにより、プロテアーゼより下流に位置する逆転写酵
素および組み込み酵素の翻訳を阻止することができる。
更にnef領域は、たとえば本発明におけるマーカー遺伝
子に置換することができる。nefはHIVの感染初期に感染
細胞のCD4の発現などに影響を与える遺伝子とされてい
る。nef(-)のSIVはその増殖能力が低下することが知ら
れている。HIVにおいても同様に、nefを欠くウイルスは
増殖能に劣ると考えられる。

【００５１】このようにして構築された発現ベクター
は、適当な宿主細胞に形質転換される。たとえば実施例
で用いたような本発明によるプロテアーゼ活性発現ベク
ターpVLP3（図１）の場合には、COS7細胞(CV-1 origin,
SV40)のような哺乳動物細胞株に形質転換すれば良い。
pVLP3のようなSV40 ori断片（SV40 ori断片はエンハン
サー活性をも有する）を導入した発現ベクターは、COS7
細胞に形質転換することによって、一時的に強力な発現
誘導をもたらす。したがって、プロテアーゼと前駆蛋白
質、そしてマーカー遺伝子の発現を強力に誘導し、プロ
テアーゼ活性を高感度に測定することができる。その
他、293T細胞を形質転換に用いることもできる。293T細
胞はSV40 large T抗原を発現しているヒトに由来する細
胞である。形質転換効率に優れる細胞として広く使われ
ている。更にCOS7細胞と同様に、pVLP3が有するSV40 or
iを介してDNA増殖が増強される。ベクターの哺乳動物細
胞への形質転換には、公知の方法を利用することができ
る。具体的には、たとえばリポフェクション法、DEAEデ
キストラン法、あるいはエレクトロポレーション等が一
般に利用されている。

【００５２】形質転換した宿主細胞は、細胞に適した培
養条件で培養する。プロテアーゼ遺伝子が十分に発現す
るまで培養を継続して、培養物中に蓄積する前駆蛋白質
のプロテアーゼによる切断生成物が測定される。切断生
成物は、その理化学的性質を利用して、公知の方法によ
り測定することができる。蛋白質の代表的な測定方法で
あるイムノアッセイは、感度と特異性の点で、有利な測
定方法である。たとえば前駆蛋白質としてgagを用いた
ときには、p24をイムノアッセイの原理で測定するのが
有利である。p24は、その前駆蛋白質であるgag蛋白質よ
りも、切断生成物であるp24に対して反応性の高い抗体
を利用することにより、前駆体存在下でp24を特異的に
測定することができる。なお、現在市販されているp24
アッセイキットはこの性質を有している。この他、p24
とgagをウエスタンブロット法などの分子量の差を利用
した分析方法によって測定することもできる。こうして
測定されるp24の生成量は、発現ベクターに導入した遺
伝子によってコードされるプロテアーゼの活性を反映し
ている。

【００５３】しかし実際の測定系においては、アッセイ
するプロテアーゼを含む発現ベクター毎に形質転換効率
が変動する可能性を考慮しなければならない。またプロ
テアーゼの基質となる前駆蛋白質の発現量を正確に推定
する必要がある。そのため本発明においては、基質前駆
蛋白質と同じプロモーターから発現されるマーカー遺伝
子をその指標とする。すなわち、マーカー遺伝子は形質
転換効率の補正だけでなく前駆蛋白質の発現レベルを反
映していることを利用し、p24の生成量をマーカー遺伝
子の発現レベルで除算するのである。マーカー遺伝子と
してEGFPルシフェラーゼ融合遺伝子を用いた場合には、
紫外線照射によるEGFPの蛍光を観察することによりその
発現レベルを知ることができる。そのため、形質転換効
率をルシフェラーゼアッセイを行う前に容易に推測する
ことができる。また、ATPとルシフェリンを加えれば、
発光反応によってルシフェラーゼ活性を測定することも
できる。

【００５４】本発明のプロテアーゼ活性の測定方法は、
HIVのプロテアーゼ阻害剤に対する耐性度の評価に用い
ることができる。プロテアーゼ阻害剤に対するHIVの耐
性度の評価は、HIV感染者の発症や症状の進行を遅らせ
るために必要なプロテアーゼ阻害剤の選択において、重
要な情報である。

【００５５】理論的には、試験株プロテアーゼの耐性度
は、あるプロテアーゼ阻害剤濃度下でその試験株の持つ
プロテアーゼ活性を野生株プロテアーゼの持つ活性と比
較することによって得ることができる。ただし試験株、
野生株プロテアーゼの阻害剤非存在下で示す固有の活性
（intrinsic protease activity)は、それぞれの蛋白質
の持つ一次構造によって変化する。一般に薬剤耐性プロ
テアーゼにおいては、固有の活性が野生株に比較して低
下していることが多い。そのため、単にある阻害剤濃度
下での両者の活性の比を測定することでは耐性度を決定
できない。測定すべきは、阻害剤濃度の増加に対するプ
ロテアーゼ活性の低下の度合、すなわち耐性度である。

【００５６】したがって、阻害剤非存在下での活性を１
００％としたときに、たとえばその活性を５０％あるい
は９０％阻害するのに必要な阻害剤の濃度を比較すれば
よい。一般に、活性を５０％阻害するのに必要な阻害剤
の濃度はIC₅₀、同様に９０％阻害するのに必要な濃度は
IC₉₀と呼ばれる。IC₅₀やIC₉₀が野生株に比べて高値を示
すプロテアーゼは、その阻害剤に対して高い耐性度を持
つと考えられる。このように、固有のプロテアーゼ活性
に対して、一定の割合まで活性を低下させるのに必要な
薬剤濃度を求めることによってそれぞれの試験株プロテ
アーゼの薬剤耐性度を知ることができる。プロテアーゼ
阻害剤候補物質を同じ原理によってスクリーニングする
場合には、より低い濃度でプロテアーゼ活性の顕著な低
下をもたらすような化合物を選べばよい。本発明の方法
はこの目的に応用することもできる。

【００５７】本発明に基づいて、HIVのプロテアーゼ阻
害剤に対する耐性度を評価するには、候補薬物の存在下
で、前記形質転換された宿主細胞を培養し、候補薬物を
加えない場合のプロテアーゼ活性と比較することによっ
て行われる。候補薬物存在下でのプロテアーゼ活性が、
被検ウイルスのプロテアーゼ阻害剤に対する耐性度を反
映する。つまり、候補薬物の存在下でプロテアーゼ活性
の阻害の程度が小さいとき、そのウイルスは、候補薬物
に対して高い耐性を有していると判断される。逆に、候
補薬物存在の添加によって野生株と同等以上のプロテア
ーゼ活性の低下が見られる場合には、耐性度が低いと判
定される。一般に耐性度が低いことを、感受性を有する
と言う。できるだけ少量の薬物で、プロテアーゼ活性の
顕著な低下が見られる薬物を選択することによって、よ
り効果的なプロテアーゼ阻害剤を選択することができ
る。言いかえれば、ウイルスプロテアーゼが感受性を示
すプロテアーゼ阻害剤を見出すことによって、候補薬物
を選択することができる。

【００５８】本発明において、プロテアーゼの阻害剤に
対する耐性度の評価は、たとえば図７に示すような方法
に基づいて行うことができる。以下、プロテアーゼ阻害
剤に対する耐性度の評価方法について、図７を参照しな
がら説明する。図７に示したのは、実施例において得ら
れた、プロテアーゼの阻害剤ネルフィナビル(Nelfinavi
r)に対する耐性度の測定結果である。図７の（ａ）にお
いて、wt(野生型）とD30N(ネルフィナビル耐性であるこ
とがわかっている耐性変異型）とを比較すると、阻害剤
非存在下でのプロテアーゼの固有活性においてD30Nが野
生型に比較して低値（野生型の86.4%)を示していること
がわかる（両者の差を図中のAとして表示)。また両者と
もネルフィナビル濃度の上昇に依存して活性の低下が見
られるが、D30Nではその低下のしかたが野生型よりゆる
やかである。

【００５９】一方図７の（ｂ）は縦軸をプロテアーゼの
比活性として、図７の（ａ）のデータを表したグラフで
ある。比活性とは、阻害剤非存在下での活性を１００％
とした酵素活性を意味する。この形式に基づく比較で
は，耐性を有するプロテアーゼのグラフは右方に変位す
る。D30Nのグラフは野生型に比べて右方向に遷移し（図
中Bで表示）、野生型に比べて耐性度が高いことが明ら
かである。ここでそれぞれのプロテアーゼ活性を阻害剤
を加えないときの５０％にまで減少させるのに必要なプ
ロテアーゼ阻害剤濃度（IC₅₀）をグラフより求め比較す
ると、耐性変異株のIC₅₀は野生型の3.1倍に増している
ことがわかる。同様にして、あるプロテアーゼの、複数
のプロテアーゼ阻害剤に対するIC₅₀を比較することによ
って、そのプロテアーゼの各薬剤に対する耐性度を比較
することができる。

【００６０】ここで、D30Nに由来するプロテアーゼの活
性が野生型に比較して低くなっている点に注意が必要で
ある。多くの薬剤耐性プロテアーゼにおいて、その活性
が野生型に比べて低下していることが知られている。こ
のような変異ウイルスは、プロテアーゼ活性の検出感度
が低い耐性度の評価方法では、しばしばプロテアーゼ活
性の検出そのものができない場合がある。その結果、耐
性度の評価ができない、あるいは耐性度を有しているの
にもかかわらず誤って感受性と判定されてしまう恐れが
ある。本発明の方法では、プロテアーゼ活性を高い感度
で鋭敏に検出することができることから、このようなプ
ロテアーゼ活性が低いプロテアーゼであっても、正確に
耐性度を評価することができる。

【００６１】更に、本発明のプロテアーゼ活性の測定方
法に基づいて、新たなプロテアーゼ阻害剤の効果を評価
することができる。たとえば、現行のプロテアーゼ阻害
剤に対して耐性を示すHIVプロテアーゼの遺伝子を被検
プロテアーゼ遺伝子として本発明の発現ベクターに組み
込む。由来の異なる複数のクローンを用意して、プロテ
アーゼ阻害剤耐性ウイルス株パネルとすることもでき
る。このようなプロテアーゼ阻害剤耐性を持つプロテア
ーゼ遺伝子に対して、新規なプロテアーゼ阻害剤の候補
化合物を加えて本発明のプロテアーゼ活性の測定方法を
実施し、候補化合物に対する各プロテアーゼの耐性度を
評価することができる。こうして、本発明に基づいて、
阻害剤耐性プロテアーゼの候補化合物に対する感受性を
評価することができる。更に、この評価方法に基づい
て、プロテアーゼが感受性を示した候補化合物を選択す
ることにより、阻害剤耐性プロテアーゼに対して有効な
新たな阻害剤の候補化合物をスクリーニングすることが
できる。更に本発明は、こうしてスクリーニングするこ
とができる候補化合物を主成分として含有する、HIVプ
ロテアーゼの阻害剤に関する。

【００６２】また本発明は、本発明のプロテアーゼ活性
測定用発現ベクターを利用した、プロテアーゼ活性の測
定用キット、あるいはプロテアーゼ阻害剤の耐性度評価
用キットに関する。本発明に基づくこれらのキットは、
次の構成要素(a)および(b)からなる。 (a)本発明の前記プロテアーゼ活性測定用の発現ベクタ
ー、(b)プロテアーゼをコードする遺伝子を増幅するこ
とができるプライマーセット本発明のキットにおいて、
プロテアーゼ活性測定用の発現ベクターにおけるクロー
ニングサイトは、λファージのattR1およびattR2で構成
することができる。このクローニングサイトを利用する
ことで、被検プロテアーゼ遺伝子をGATEWAYシステムを
利用して容易に、しかも迅速に組み込むことができる。
このとき、被検プロテアーゼ遺伝子を増幅するためのプ
ライマ-として、λファージのattB1を5'側に付加したフ
ォワードプライマー、およびλファージのattB2を5'側
に付加したリバースプライマーからなるプロテアーゼを
コードする遺伝子を増幅することができるプライマーセ
ットを利用するのが有利である。本発明のキットにGATE
WAY テクノロジーを応用するときには、PCR産物を前記
発現ベクターに組み込むのに必要なλファージ部位特異
的組み換え酵素や、プロテアーゼ遺伝子の組み換えに用
いられるドナーベクターを更に含むことができる。

【００６３】また本発明は、本発明に基づいてプロテア
ーゼ阻害剤に対するプロテアーゼの耐性度を測定する方
法のためのキットに関する。本発明のキットには、前記
プロテアーゼ活性測定用キットに加えて、各種のプロテ
アーゼ阻害剤が組み合わせられる。プロテアーゼ阻害剤
には、任意の薬剤を用いることができる。たとえば、現
在臨床応用されているプロテアーゼ阻害剤として、次の
薬剤を示すことができる。 ネルフィナビル(NFV) リトナビル(RTV) サキナビル(SQV) インジナビル(IDV) アンプレナビル(APV) 本発明に基づく耐性度を測定するためのキットは、予め
薬剤や培地を分注したプレートとして供給することがで
きる。図６に薬剤を分注したプレートを示した。図６に
示したプレートデザインでは、プロテアーゼ阻害剤(PI-
1、PI-2....)を１０００nM〜７．８nMまで段階希釈した
希釈系列と、プロテアーゼ阻害剤を含まない対照とが予
め用意されている。このようなプレートを用いれば、プ
ロテアーゼ発現ベクターで形質転換した宿主細胞をプレ
ートに撒くだけで、本発明に基づく耐性度の測定方法を
実施することができる。以下実施例に基づいて本発明を
更に具体的に説明する。

【００６４】

【実施例】１．発現ベクターの構築 まず本発明によるプロテアーゼ活性測定法の発現ベクタ
ーを構築した。以下で使用するcodonの番号は、原則と
してHIVクローンHXB2のものである（プロウイルスの5'L
TRの最初の塩基を１番とする）。ただし、env遺伝子に
関する記述のなかで、Afl IIIサイトとMfe Iサイトのco
donの番号については、NL4-3のものである。発現ベクタ
ーは、Flossie Wong-Staalから分与された公知の非感染
性HIVプロウイルスクローンであるpSP65HXB2Ecogpt（Ra
tner L, Fisher A, Jagodzinski LL, Mitsuya H, Liou
RS, Gallo RC, Wong-Staal F. AIDS Res Hum Retroviru
ses. 3(1):57-69, 1987）を改変することによって構築
した。このうち、Spe Iサイト(codon 1507)からSwa Iサ
イトまではNL4-3由来である。Swa Iサイトは部位特異的
変異導入によりcodon 3710に挿入したものである。

【００６５】［CMVプロモーター］まず、ウイルス蛋白
質やマーカー蛋白質の発現を誘導することができるプロ
モーターを導入した。プロモーターには、サイトメガロ
ウイルス(CMV)由来のプロモーター（以下CMVプロモータ
ーと記載する）を用いた。Hpa IサイトとBssH IIサイト
を付加したプライマーでPCRによりpEGFPN1(Clontech, 1
020 East MeadowCircle, Palo Alto, CA 94303 USA)か
らCMV promoterを合成した。得られたPCR産物を、pSP65
HXB2EcogptのHpa IサイトからBss HIIサイトと置き換え
た。この領域はプロウイルスゲノムの5'LTRおよびその
下流のリーダー配列の一部に相当する。

【００６６】［SV40polyAシグナル］次に、SV40polyAシ
グナルを導入した。95bpsのSV40polyAシグナルをふくむ
オリゴヌクレオチドを合成し、pSP65HXB2EcogptのXho I
サイトからフランキング配列の終わりのXba Iサイトと
置き換えた。この操作によりプロウィルスの3'LTRはこ
のオリゴヌクレオチドによって完全に置換された。

【００６７】［env遺伝子の欠失］Sal Iサイト(codon 5
768)からBam HIサイト (codon 8475)まではHIV-1分子ク
ローンの１つであるNL4-3株由来である。Afl IIIサイト
(codon 6054)からMfe Iサイト(codon 7645)までの約1.5
kbpsを切り出し、XbaI リンカーを組み込んだ。

【００６８】［EGFPルシフェラーゼ融合遺伝子］本発明
におけるマーカー遺伝子として、EGFPルシフェラーゼ融
合遺伝子（図２）を発現ベクターに組み込んだ。ルシフ
ェラーゼをコードする遺伝子を、BglIIサイトとBamHIサ
イトを付加したプライマーでPCRによりpGL3(Promega)か
ら増幅した。これをpEGFPC2(Clontech, 1020 East Mead
ow Circle, Palo Alto, CA 94303 USA)のBglIIサイトか
らBamHIサイトに組み込んでEGFPルシフェラーゼ融合遺
伝子とした。このEGFPルシフェラーゼ融合遺伝子を、5'
末端に ClaIサイト、そして3'末端にSalIサイトを付加
したプライマーでPCRにより増幅し、pSP65HXB2Ecogptの
ClaIとXhoIに組み込んだ。この領域は、プロウイルスゲ
ノムのnef 領域に相当する。

【００６９】［GATEWAY用クローニングサイト］本発明
の発現ベクターにおけるクローニングサイトとして、GA
TEWAY用クローニングサイトを導入した。Lifetech社か
ら提供されているrfAカセット（図３の上）をそのまま
用いた場合、rfAカセットに含まれるccdB geneの影響を
抑えるため大腸菌株DB3.1を用いる必要がある。予備的
な実験により、この条件ではベクターが極めて不安定に
なる場合があることが判明した。そこで、 rfA fragmen
tを改変し、ccdB遺伝子をtac プロモーターで誘導され
るlacZαペプチドで置き換えた。以上の操作によりDB3.
1を使用する必要性は無くなり、同時にベクターの不安
定性も観察されなくなった。LacZαペプチドをコードす
る遺伝子は、本発明における第２のマーカーとして機能
する。p806(Yu XF, Matsuda M, Essex M, Lee TH.,J Vi
rol. 1990 Nov;64(11):5688-93.)のTacプロモーターの
下流のHindIIIからBamHIの部分にpSV PCR β-galのHind
IIIからBamHIの部分を組み込んだ。ここで用いたpSV PC
R β-galは、pSV-β-galactosidase( Promega社製)のβ
-galactosidaseの5'側に一部変更を加えたものである。
変更された部分を含むLacZαのアミノ酸配列は下記のと
おりである。 （MTEYKLDAMIPGNSR)AVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNS
EEARTDRPSQQLRSLNG 前記アミノ酸配列中、（）内のアミノ酸配列は人為的に
付加された配列であり、それ以降のアミノ酸配列が本来
のβ-galactosidaseの８番目から５６番目のアミノ酸配
列に一致する。さらにそのtacプロモーターから上記Lac
Zαペプチドを含む部分をPCRで増幅した。このとき、5'
末端に BssHII、そして3'末端にSalIサイトを付加し
た。得られたPCR産物をLifetech社から提供されているr
fAカセットのBssHIIサイトとSalIサイトの部分に組み込
んだ。

【００７０】pSP65HXB2EcogptにおいてpVLP3の場合はco
don2175からcodon2982、pVLP4の場合はcodon2148からco
don2982部分を改変rfAカセットに置き換えた。こうし
て、GATEWAYシステムに必要なattR1を5'側に、そしてat
tR2を3'側に備え、かつ第２のマーカー遺伝子を含むGAT
EWAY用のクローニングサイトを導入した。ここで組み込
まれた改変rfAカセットを図３の下に示した。なお図３
において、rfAカセット中に含まれるCm^rは、rfAカセッ
トを有する形質転換体のポジティブセレクションのため
に配置されたクロラムフェニコール耐性遺伝子である。
こうして構築された本発明に基づくプロテアーゼ活性測
定用の発現ベクターの構造を図１に示した。図１のＡは
発現ベクターのマップ、Ｂは発現ベクター中に組み込ま
れているプロウイルスゲノムにおける本発明に必要なエ
レメントの配置および、改変rfAの置換部位を示してい
る。

【００７１】２．被検プロテアーゼ遺伝子の発現ベクタ
ーへの組み込み １で構築した発現ベクターに、実際に被検プロテアーゼ
遺伝子を組み換んだ。図４に反応の模式図を示す。まず
以下に示す塩基配列からなるプライマーを使って、HIV
感染患者の血液検体からRT-PCRによってp6からRTにかけ
ての１５アミノ酸残基をコードする塩基配列を含む領域
を増幅した。また薬剤耐性を有する耐性変異株の一つの
例としてD30Nについても、同じ領域についてPCRを行っ
た。D30Nは、プロテアーゼ蛋白質の３０番目アスパラギ
ン酸(D)がアスパラギン(N)に変化した既知のネルフィナ
ビル(nelfinavir)耐性変異株である(Kurt Hertogs et a
l., Testing for HIV-1 drugresistance : New Develop
pments and clinical implications Recent Res. Devl.
Antimicrob. Agent & Chemother., 3: 83-104, 199
9)。PCRには、アウタープライマーとインナープライマ
ーによるnested PCRを利用した。GATEWAYシステムを利
用してPCR産物をベクターに組み込むために、インナー
プライマーのフォワードの5'側にはattB1の２５塩基
が、リバース側にはattB2の２５塩基が付加されてい
る。 アウタープライマー フォワード（配列番号：１）:AGACAGGYTAATTTTTTAGGGA リバース（配列番号：２）:TATGGATTTTCAGGCCCAATTTTTG
A インナープライマー pVLP3用フォワード（配列番号：３）:GGGGACAAGTTTGTAC
AAAAAAGCAGGCTTCAGAAGCAGGAGCCGATAGACAAG インナープライマー pVLP4用フォワード（配列番号：４）:GGGGACAAGTTTTGTA
CAAAAAAGCAGGCTCCAGAGCCAACAGCCCCACCAG pVLP3とpVLP4に共通のリバース（配列番号：５）:GGGGA
CCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTACCCGGGCTTTAATTTTACTGGT
AC

【００７２】得られたPCR産物を用いて、BP反応、およ
びLR反応を同一の反応容器で続けて行った。各反応に
は、Lifetech社のBPクロナーゼ、およびLRクロナーゼを
用いた。反応の条件は、指示書にしたがった。BP反応
（３時間）でPCR産物のattB1/attB2が、それぞれドナー
ベクターpDONRのattL1/attL2と組み換えられる。続けて
LR反応を行うことにより、最終的に発現ベクターのattR
1/attR2にPCR産物が組み込まれる。図５に、組み換え反
応後のpol領域の模式図を示す。プロテアーゼ遺伝子のP
CRに用いたインナープライマーのリバース側は、RTの15
アミノ酸残基の後に終止コドンが入るように設計した。
そのため、RT、およびINは翻訳されない。この修飾によ
って、この発現ベクターから産生されるウイルス様粒子
の感染性は完全に消失する。

【００７３】組み換え反応後、プロテアーゼ遺伝子を組
み込んだ発現ベクターをTop10 chemical competent cel
lに形質転換し、X-galを塗布したアンピシリン含有培地
にまき３７℃で培養した。組み換えがおこらなかった場
合には、第２のマーカー遺伝子であるLacZαペプチドの
tacプロモーターによる強力な発現が宿主の生育を阻害
する。したがって、培地に生育するコロニーは、クロー
ニングサイトに配置されたLacZαペプチドが脱落した発
現ベクターを有する細胞に限られる。本来、LacZαペプ
チド遺伝子は、大腸菌にβガラクトシダーゼ活性を付与
し、X-galを塗布した培地で青いコロニーを生じさせる
ことでセレクションマーカーとして機能する遺伝子であ
る。しかし本発明においてはtacプロモーターの強力な
発現誘導のために、結果的にポジティブセレクションマ
ーカーとして機能している。培養後、白色のコロニーを
拾い、液体培養し制限酵素で目的の遺伝子が組み込まれ
ていることを確認した。

【００７４】３．ウイルスプロテアーゼのプロテアーゼ
阻害剤に対する耐性度の評価 図６に示す操作に従い、２で構築した本発明のプロテア
ーゼ発現ベクターを用い本発明に基づいてプロテアーゼ
阻害剤の有効性を評価した。患者血液および耐性株D30N
由来のプロテアーゼ発現ベクターを、FuGENE6（Roche
製）を用いてそれぞれCOS7細胞に形質転換した。すなわ
ち、トリプシンで処理し、５００μLのDMEMに再懸濁し
た２×１０⁶のCOS7細胞を５０mL tubeに移した。これに
DNA４μg、FuGENE6を20μL、DMEM２００μLの混合物を
加えて３７℃、５%CO₂で３０分インキュベートした。イ
ンキュベートの後、全量１０mLになるようにDMEMを加え
た。得られたCOS7細胞懸濁液１００μLを、種々の濃度
のプロテアーゼ阻害剤（ネルフィナビル）１００μLを
分注した９６well-plateに加えて全量２００μLとし、
３７℃、５%CO₂で４８時間培養した。ネルフィナビル
は、終濃度７．８nM〜１０００nMの希釈系列とした。

【００７５】培養後、１００μLの上清を取り、上清に
含まれるp24を測定した。p24は、「p24 assay kit」（C
ellulartech製）を用いて、ELISA法により定量した。EL
ISA法はキットの指示書にしたがって行った。更に、上
清採取後のwellに１００μLのluciferase assay reagen
t（Promega製、steady GIO luciferase assay system）
を加えて撹拌し、その５０μLを別のELISA plateに移し
てルミノメーターで発光測定しルシフェラーゼ活性を決
定した。

【００７６】各wellごとに以下の式（２）にしたがって
１０００RLU/1second（相対ルシフェラーゼ活性; relat
ive luciferase activity/1second）あたりのp24量を求
め、protease活性の指標（p24補正値；Ａ）を求めた。p
24補正値A(n)は、プロテアーゼ阻害剤の濃度がｎのとき
のp24補正値の値を、またp24(n)はプロテアーゼ阻害剤
の濃度がｎのときのp24の測定値を示している。

【００７７】

【数２】

【００７８】以上の測定を、各濃度ごとに、３重で実施
し、結果の平均を求めて、最終的に１薬剤濃度における
プロテアーゼ活性を決定した。更に各発現ベクターのそ
れぞれについて、阻害剤非存在下におけるプロテアーゼ
活性Ｃを下記式（３）に基づいて決定した。このプロテ
アーゼ活性Ｃを各プロテアーゼ固有のプロテアーゼ活性
(intrinsic Protease Activity)とした。

【数３】 また変異株D30N固有のプロテアーゼ活性を、野生型のプ
ロテアーゼ活性で除算して、プロテアーゼ活性の比(fol
d of protease activity)とした。

【００７９】次に、各プロテアーゼのネルフィナビルに
対する耐性度を評価するために、以下のような解析を行
った。図７に野生型と、変異株D30Nの耐性度を求めた結
果を示す。上のグラフ（ａ）は、p24補正値と薬剤濃度
の関係を示している。縦軸方向への変化はプロテアーゼ
活性の変化をあらわす。野生型に比較して活性が低いも
のは下方にプロットされる。実測値を元に次の式によ
り、耐性変異株D30Nの固有のプロテアーゼ活性は、野生
株の８６．４％であることがわかる。

【数４】

【００８０】一方下のグラフ（ｂ）は、薬剤存在下での
酵素活性（比活性）と薬剤濃度の関係を示している。比
活性は式「比活性＝｛１−Ａ(n)／Ｃ｝×１００」によ
って決定される。下のグラフでは、横軸方向の変化がプ
ロテアーゼの耐性度（薬剤耐性の度合）を示す。耐性を
増した場合は右方に、感受性を増した場合は左方にプロ
ットされる。実際にIC₅₀を求める場合はこのグラフから
求める。すなわち比活性５０%に対応する薬剤濃度が、
そのプロテアーゼのIC₅₀である。また以下に示す式のよ
うに、変異型のIC₅₀を野生型のIC₅₀で除算して、耐性度
の比(fold of drug resistance)を求めることもでき
る。

【００８１】

【数５】 このグラフによれば、D30Nの場合、活性は野生型の８
６．４%に低下するが、耐性度は３．１倍に増すことが
明らかになった。このように、プロテアーゼ活性をグラ
フ化することにより、変異型のプロテアーゼ活性と耐性
度の差を視覚的に同時に明らかにすることができる。

【００８２】

【発明の効果】本発明においては、プロテアーゼによっ
て切断される前駆蛋白質とマーカー遺伝子を同一の発現
系で発現させるために、正確な測定が可能となる。プロ
テアーゼの活性を求めるには、マーカー遺伝子によって
その前駆蛋白質の発現レベルを決定する工程が必要であ
る。マーカー遺伝子が前駆蛋白質と同一のプロモーター
の制御下に発現する本発明によれば、マーカー遺伝子が
前駆蛋白質の発現レベルを正確に反映することができ
る。その結果、プロテアーゼ活性を正しく評価すること
ができる。

【００８３】更に、本発明にGATEWAYシステムのよう
な、制限酵素を用いない手法でプロテアーゼ遺伝子を組
み込む方法を応用する場合には、プロテアーゼ活性を迅
速に測定することができる。より具体的には、患者の血
液を試料とするとき、検体を得てから７日以内にpプロ
テアーゼ阻害剤に対する耐性試験を行うことができる。
制限酵素を利用した組み込み工程を含むリコンビナント
ウイルスを作成する従来の方法では、より多くのステッ
プを必要とするため、同様の原理に基づく耐性試験に１
ヶ月以上を要する。加えて従来の方法においては、標的
遺伝子内に該当制限酵素認識部位が存在する場合には実
行不可能である。したがって、本発明にGATEWAYシステ
ムを組み合わせることによって、正確でしかも迅速なプ
ロテアーゼ活性の測定方法、そしてこの方法に基づくプ
ロテアーゼ阻害剤に対する耐性試験方法を実施すること
ができる。

【００８４】更に、本発明者らが構築したプロテアーゼ
活性測定用発現ベクターは、プロウイルスゲノムをベー
スとして構築したものでありながら、さまざまな手法に
よってその感染性が排除されている。したがって、本発
明の発現ベクターとして、本発明者らが構築したベクタ
ーを利用することにより、プロテアーゼ活性の測定方
法、あるいはこの方法に基づくプロテアーゼ阻害剤の耐
性度の評価方法を安全に実施することができる。

【００８５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Director-General of National Institute of Infectious Diseases The Organization for Pharmaceutical Safety and Research <120> Method for determining of protease activity <130> OPS-A0003 <140> <141> <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 1 agacaggyta attttttagg ga 22 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 2 tatggatttt caggcccaat ttttga 25 <210> 3 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 3 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cagaagcagg agccgataga caag 54 <210> 4 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 4 ggggacaagt tttgtacaaa aaagcaggct ccagagccaa cagccccacc ag 52 <210> 5 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 5 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc ctacccgggc tttaatttta ctggtac 57 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:attR1 sequence <400> 6 atcacaagtt tgtacaaaaa a 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:attR2 sequence <400> 7 atcaccactt tgtacaagaa a 21 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:attB1 sequence <400> 8 ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:attB2 sequence <400> 9 ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明によるプロテアーゼ発現ベクタ
ーpVLP3のマップを示す図。図中、「T insertion Vpr t
o cause a flameshift」は、HXB2のVprに本来存在する
１塩基（T）の挿入部位を示す。またRREはenv領域にお
ける「rev responsive element」、「PR」はプロテアー
ゼ遺伝子、そして「deletion」はenv領域における欠損
位置を示す。

【図２】図２はマーカー遺伝子として用いたEGFP−ルシ
フェラーゼ融合遺伝子の構造を示す模式図である。

【図３】図３は、GATEWAYクローニングシステムとして
市販されている目的ベクター用のrfAカセット（上）、
および本発明において用いた改変rfAカセット（下）の
構造を示す模式図である。

【図４】図４は、本発明の発現ベクターに、実際に被検
プロテアーゼ遺伝子を組み換むための工程を示す模式図
である。

【図５】図５は、本発明の発現ベクターのpol領域に配
置したGATEWAYシステム用クローニングサイトに被検プ
ロテアーゼ遺伝子を組み込む反応を示す模式図である。

【図６】図６は、本発明のプロテアーゼ発現ベクターを
用い本発明に基づいてプロテアーゼ阻害剤の有効性を評
価する工程を示す模式図である。

【図７】図７は、プロテアーゼ阻害剤ネルフィナビル存
在下での野生型、および変異株D30Nのプロテアーゼを測
定した結果を示すグラフである。上のグラフ（ａ）は、
種々のネルフィナビル濃度におけるp24補正値（プロテ
アーゼ活性を表す）を示す。縦軸はp24補正値の濃度(lo
g)を、横軸はネルフィナビルの濃度を表している。下の
グラフ（ｂ）は、種々のネルフィナビル濃度における各
プロテアーゼの活性を、ネルフィナビル非存在下の値を
１００％とする比活性で表したものである。縦軸がプロ
テアーゼの比活性、横軸がネルフィナビルの濃度を表し
ている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/50 (Ｃ１２Ｑ 1/02 //(Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/37 (Ｃ１２Ｑ 1/37 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｑ 1/66 (Ｃ１２Ｑ 1/66 Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｒ 1:91） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 横幕 能行 埼玉県所沢市並木２−２、４−607 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB20 BB41 BB50 DA13 DA20 DA36 FB01 FB02 FB03 FB07 FB12 GC15 4B024 AA11 BA14 CA04 DA02 EA04 FA02 FA04 GA11 GA18 HA01 HA12 4B063 QA01 QA18 QQ02 QQ20 QQ36 QR32 QR59 QR62 QR77 QR80 QS05 QS28 QX02

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の要素を含み、各遺伝子およびクロー
   ニングサイトに組み込まれるプロテアーゼをコードする
   遺伝子が、いずれも下記プロモーターの制御下に発現す
   るように下記要素を配置したプロテアーゼ活性測定用の
   発現ベクター。 (a)プロモーター、(b)活性を測定すべきプロテアーゼに
   よって切断される蛋白質をコードする遺伝子、(c)クロ
   ーニングサイト；ただしこのクローニングサイトに組み
   込まれたプロテアーゼ遺伝子は前記プロモーターの制御
   下に発現し、かつ発現したプロテアーゼは(b)の蛋白質
   を切断することができる、および(d)マーカー遺伝子
2. 【請求項２】前記クローニングサイトが、λファージの
   attR1およびattR2である請求項１に記載のベクター。
3. 【請求項３】attR1およびattR2の間に第２のマーカー遺
   伝子を保持した請求項２に記載のベクター。
4. 【請求項４】第２のマーカー遺伝子がlacZαペプチドを
   コードする遺伝子である請求項３に記載のベクター。
5. 【請求項５】活性を測定すべきプロテアーゼがHIVに由
   来するプロテアーゼであり、前記プロテアーゼによって
   切断される蛋白質が、少なくともp24を含むHIVgag蛋白
   質断片である請求項１に記載のベクター。
6. 【請求項６】前記発現ベクターが、次の群から選択され
   る少なくとも一つの方法によってHIVの感染性を抑制さ
   れている請求項５に記載のベクター。 (a)HIVプロウイルスゲノムに由来する5'LTRの少なくと
   も一部を欠いている、(b)HIVプロウイルスゲノムに由来
   する3'LTRの少なくとも一部を欠いている、(c)HIVプロ
   ウイルスゲノムに由来する遺伝子のうちpol遺伝子の少
   なくとも一部を欠いているか、または蛋白質コード領域
   にストップコドンを含む、(d)HIVプロウイルスゲノムに
   由来する遺伝子のうちenv遺伝子の少なくとも一部を欠
   いているか、または蛋白質コード領域にストップコドン
   を含む
7. 【請求項７】プロモーターの下流にHIVプロウイルスゲ
   ノムが挿入され、このプロモーターの制御下にウイルス
   蛋白質を発現することができ、かつ下記の改変(1)およ
   び(2)が施されている請求項５に記載のベクター。(1)プ
   ロテアーゼ遺伝子を前記クローニングサイトに組み換え
   る、(2)nef遺伝子の少なくとも一部をマーカー遺伝子に
   組み換える、
8. 【請求項８】更に下記(3)〜(6)に記載の少なくとも１つ
   の改変が施されている請求項７に記載のベクター。(3)
   5'LTRの少なくとも一部をCMVプロモーターに組み換えて
   前記プロモーターとする、(4)pol遺伝子の少なくとも一
   部を欠いているか、または蛋白質コード領域にストップ
   コドンを含む、(5)env遺伝子の少なくとも一部を欠いて
   いるか、または蛋白質コード領域にストップコドンを含
   む、(6)3'LTRをSV40由来のpolyAシグナルに組み換える
9. 【請求項９】発現ベクターがSV40 oriを含む請求項１に
   記載のベクター。
10. 【請求項１０】以下の工程を含む、プロテアーゼ活性の
    測定方法。 １）活性を測定すべきプロテアーゼをコードする遺伝子
    を得る工程、 ２）以下の要素を含む発現ベクターのクローニングサイ
    トに１）で得た遺伝子を組み込んでプロテアーゼ発現ベ
    クターとする工程、ここで該発現ベクターの各遺伝子お
    よびクローニングサイトに組み込まれるプロテアーゼを
    コードする遺伝子は、いずれも下記プロモーターの制御
    下に発現するように配置されている、(a)プロモータ
    ー、(b)前記プロテアーゼによって切断される蛋白質を
    コードする遺伝子、(c)クローニングサイト；ただしこ
    のクローニングサイトに組み込まれたプロテアーゼ遺伝
    子は前記プロモーターの制御下に発現し、かつ発現した
    プロテアーゼは(b)の蛋白質を切断することができる、
    および(d)マーカー遺伝子 ３）工程２）で得たプロテアーゼ発現ベクターを宿主細
    胞に形質転換しプロテアーゼを発現可能な条件下で培養
    する工程、 ４）培養物に含まれる前記蛋白質のプロテアーゼによる
    切断産物、およびマーカー遺伝子の発現生成物を測定す
    る工程、および ５）マーカー遺伝子の発現生成物の量に対する切断産物
    の量の比をプロテアーゼ活性と関連付ける工程、
11. 【請求項１１】工程１）におけるプロテアーゼをコード
    する遺伝子がλファージのattB1を5'側に付加したフォ
    ワードプライマー、およびλファージのattB2を5'側に
    付加したリバースプライマーを用いたPCR法の増幅生成
    物であり、かつ前記クローニングサイトが、λファージ
    のattR1およびattR2である請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】前記プロテアーゼがHIVに由来するもの
    であり、前記プロテアーゼによって切断される蛋白質が
    少なくともp24を含むHIVのgag蛋白質断片であり、プロ
    テアーゼによる切断生成物としてp24を測定する請求項
    １０に記載の方法。
13. 【請求項１３】発現ベクターがSV40 oriを含み、宿主細
    胞としてCOS7細胞を用いる請求項１０に記載の方法。
14. 【請求項１４】プロテアーゼ阻害剤の存在下で請求項１
    ０に記載の工程３）の培養を行うことを特徴とする、プ
    ロテアーゼ阻害剤存在下におけるプロテアーゼの活性を
    測定する方法。
15. 【請求項１５】次の工程を含む、プロテアーゼのプロテ
    アーゼ阻害剤に対する耐性度を測定する方法。 ａ）請求項１４に記載の方法によって、プロテアーゼ阻
    害剤存在下におけるプロテアーゼの活性を測定する工程 ｂ）プロテアーゼ阻害剤非存在下におけるプロテアーゼ
    活性値と、ａ）の活性値の比を求める工程、
16. 【請求項１６】同一のプロテアーゼについて、異なるプ
    ロテアーゼ阻害剤に対する耐性度を請求項１５に記載の
    方法によって求め、ある耐性度に対応する各プロテアー
    ゼ阻害剤の濃度を比較する工程を含む、プロテアーゼ阻
    害剤の有効性の比較方法。
17. 【請求項１７】候補化合物の存在下で請求項１０に記載
    の工程３）の培養を行うことを特徴とする、候補化合物
    のプロテアーゼの阻害作用を測定する方法。
18. 【請求項１８】請求項１７に記載の方法によってプロテ
    アーゼ阻害作用を測定し、プロテアーゼ阻害作用を有す
    る化合物を選択する工程を含む、プロテアーゼ阻害剤を
    スクリーニングする方法。
19. 【請求項１９】以下の要素からなる、プロテアーゼ活性
    の測定用キット。 (a)請求項１に記載のプロテアーゼ活性測定用の発現ベ
    クター、(b)プロテアーゼをコードする遺伝子を増幅す
    ることができるプライマーセット
20. 【請求項２０】以下の要素からなる、プロテアーゼ活性
    の測定用キット。 (a)請求項２に記載のプロテアーゼ活性測定用の発現ベ
    クター、(b) λファージのattB1を5'側に付加したフォ
    ワードプライマー、およびλファージのattB2を5'側に
    付加したリバースプライマーからなるプロテアーゼをコ
    ードする遺伝子を増幅することができるプライマーセッ
    ト
21. 【請求項２１】更にλファージ部位特異的組み換え酵素
    を含む請求項２０に記載のキット。
22. 【請求項２２】請求項１９、または請求項２０に記載の
    プロテアーゼ活性の測定用キットに、プロテアーゼ阻害
    剤を組み合わせたプロテアーゼ阻害剤に対するプロテア
    ーゼの耐性度を測定するためのキット。
23. 【請求項２３】以下の要素からなる外来遺伝子発現ベク
    ター。 (a)λファージのattR1およびattR2からなる、外来遺伝
    子を挿入するためのクローニングサイト、および(b)前
    記クローニングサイトに配置される外来遺伝子の発現を
    制御することができるプロモーター、(c)前記クローニ
    ングサイトに保持されたLacZαペプチドをコードする遺
    伝子、および(d)前記LacZαペプチドをコードする遺伝
    子の発現を制御することができるプロモーター、
24. 【請求項２４】外来遺伝子がプロテアーゼをコードする
    遺伝子である請求項２３に記載の外来遺伝子発現ベクタ
    ー。
25. 【請求項２５】更に(e)前記プロテアーゼによって切断
    される蛋白質をコードする遺伝子を含む請求項２４に記
    載の発現ベクター。
26. 【請求項２６】以下の工程を含む、プロテアーゼ活性の
    測定方法。 ａ）λファージの部位特異的組み換え酵素認識配列を付
    加したプロテアーゼをコードする遺伝子を合成する工
    程、 ｂ）請求項２４に記載の外来遺伝子発現ベクターに前記
    プロテアーゼをコードする遺伝子を組み込んでプロテア
    ーゼ発現ベクターとする工程、 ｃ）前記プロテアーゼ発現ベクターをプロテアーゼ遺伝
    子の発現が可能な宿主細胞に形質転換する工程、 ｄ）前記形質転換体を、前記プロテアーゼ遺伝子の発現
    が可能な条件下で培養する工程、および ｅ）発現生成物であるプロテアーゼの活性を測定する工
    程
27. 【請求項２７】外来遺伝子発現用ベクターが請求項２５
    に記載のベクターであり、当該ベクターが発現する前記
    プロテアーゼによって切断される蛋白質の切断生成物を
    測定することによって、プロテアーゼ活性を測定する工
    程を含む、請求項２６に記載の方法。