JPWO2012124338A1 - 生体組織分析用プローブ及びその利用法 - Google Patents

生体組織分析用プローブ及びその利用法 Download PDF

Info

Publication number
JPWO2012124338A1
JPWO2012124338A1 JP2013504573A JP2013504573A JPWO2012124338A1 JP WO2012124338 A1 JPWO2012124338 A1 JP WO2012124338A1 JP 2013504573 A JP2013504573 A JP 2013504573A JP 2013504573 A JP2013504573 A JP 2013504573A JP WO2012124338 A1 JPWO2012124338 A1 JP WO2012124338A1
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
binding domain
probe
tissue
biological
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2013504573A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5997131B2 (ja
Inventor
洋平 山形
洋平 山形
昌史 後藤
昌史 後藤
渡邉　君子
君子 渡邉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Meiji Seika Kaisha Ltd
Original Assignee
Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Meiji Seika Kaisha Ltd filed Critical Meiji Seika Kaisha Ltd
Publication of JPWO2012124338A1 publication Critical patent/JPWO2012124338A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5997131B2 publication Critical patent/JP5997131B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43595—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from coelenteratae, e.g. medusae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本発明は、生体組織から、酵素的単離により、高い生物活性を有する細胞又は細胞集団を高収量で得る方法及びそのためのプローブに関する。具体的には、特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質について、前記生体成分結合ドメインをそれぞれ含む２種以上のプローブを単離された生体組織に適用し、前記各プローブの生体組織に対する結合量を解析することを特徴とする、生体組織の分析方法に関する。

Description

生体組織から、酵素的単離により、高い生物活性を有する細胞又は細胞集団を高収量で得る方法及びそのためのプローブに関する。
生体組織からの細胞及び細胞クラスターの酵素的単離は、その細胞の移植や細胞株の樹立を含む種々の目的及び治療、診断及び検査等の幅広い用途に有用である。しかし、生体組織を解離させ、そこに含まれる細胞又は細胞集合体を単離するためには、細胞又は細胞集合体を望ましい程度に遊離させて、細胞組織部分から分離する必要がある。生体組織から、細胞及び細胞クラスターを分離する際には、細胞間マトリックスをコラゲナーゼなどのタンパク質分解酵素の混合物で分解する。
生体組織は、細胞と細胞間マトリックスによって構成される。細胞間マトリックスは細胞をつなぎとめる物質で、構造物と非構造物がある。前者は、膠原線維、弾性線維、細網線維等の線維があり、後者は、線維の間を埋める成分で基質とよばれるゾルないしゲル状の物質で、糖タンパク質及びプロテオグリカンがある。細胞間マトリックスの代表は、コラーゲン（Collagen）というタンパク質であり、生体内総タンパク質重量の約１／３を占めている。コラーゲンは線維構造をなしており、正式にはコラーゲン線維、膠原線維とよばれている。
組織は、上皮組織、支持組織、筋組織、及び神経組織の４つに大別される。上皮組織は、身体の表面を覆っている組織で細胞密度が高く、細胞間マトリックスが介在しない。支持組織は体、臓器及び細胞等を支える役目を果たしており、結合組織、軟骨組織、骨組織、血液、リンパが含まれる。筋組織は収縮運動を目的として分化した細胞の融合であり、細胞間マトリックスが占める割合は極めて少ない。
筋組織は筋細胞、結合組織、血管及び神経から構成されるが、主な構造物は筋線維である。神経組織は、神経内膜と神経周膜を主として構成され、いずれにも細胞間マトリックス（コラーゲン）が多く含まれる。結合組織は支持組織の１種で、脂肪組織と線維性結合組織（膠原線維及び弾性線維を構成成分とする）からなり、疎水性結合組織と強靭性結合組織に大別される。疎水性結合組織は、コラーゲンが不規則な走行をとっている線維性結合組織であり、皮下組織、粘膜組織、神経、血管外膜、小葉間組織等に分布している。
細胞間マトリックスにおけるコラーゲンの含有量は、生物種、年齢、性別、組織、生活環境などによって状態が異なっている。しかし、どのコラーゲンが、どの組織のどんな状態のマトリックスに、どの程度含まれているかは、まだ十分明らかにされていない。コラーゲンの特徴は、タンパク質のペプチド鎖を構成するアミノ酸が、「−グリシン−アミノ酸Ｘ−アミノ酸Ｙ」とグリシンが３残基毎に繰り返す一次構造を有する点にある。ヒトのコラーゲンタンパク質は、３０種類以上あることが報告されているが、体内に最も豊富に存在しているのは線維性のI型コラーゲンで、非線維性のIV型コラーゲンも多く含まれており、分子間ジスルフィド結合を介して相互に連結して網状組織の形成に関与している（非特許文献１）。膵島と内分泌組織との間には、IV型コラーゲンが存在することが報告されている（非特許文献２、３）。
特定のタイプのコラーゲンが、対象とするマトリックスに存在するかは、各タイプのコラーゲンに対する抗体を用いて免疫染色することで、理論的には決定可能と思われる。しかしながら、コラーゲンの種類は多く、また多細胞動物に広く存在するため、抗体の製造が難しいことなどがネックとなり、その実現を困難としている。
組織分解用酵素である、ヒストリチクス菌に由来する種々の種類の粗コラゲナーゼは、２種類のコラゲナーゼ以外に、種々のプロテアーゼ酵素（コラーゲン分解活性及び非特異的タンパク質分解活性）と非プロテアーゼ成分（ホスホリパーゼ等）を含んでいる。この粗コラゲナーゼによって、個々の細胞及び細胞集団は生体組織から酵素的に分離されている。
生体組織から個々の細胞又は細胞集団に酵素的に分離する際、分離される細胞や細胞集団の収率及びその生物活性には、２種類のコラゲナーゼ（ColG及びColH）が重要なはたらきをし、その量比が大きく影響することが報告されている（非特許文献４）。膵臓組織から膵島を分離する場合においても、ヒストリチクス菌（Clostridium histolyticum）が生産する２種類のコラゲナーゼが用いられる（非特許文献５、特許文献１及び２）。本発明者らは、これまでに、２種類のコラゲナーゼの量比の最適化によって、高い膵島を分離できることを確認している。
コラゲナーゼは、その種類によって異なったコラーゲン結合ドメインを有していることが報告されている（非特許文献６）。これまで、様々な機能性タンパク質とコラーゲン結合ドメインとの融合タンパク質が、ターゲッティングやドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）を目的として作製されている。例えば、ヒストリチクス菌のコラーゲン結合ドメインにbFGFあるいはEGFを結合させたコラーゲン結合性細胞増殖因子（非特許文献７）、牛フォンビルブランド因子由来のコラーゲン結合デカペプチドとTGF-βとの融合タンパク質（非特許文献８及び９）、フィブロネクチンのコラーゲン結合ドメインに機能性ペプチドを結合させた徐放性細胞増殖因子供給体（特許文献３）を挙げることができる。このように、コラーゲン結合ドメインとの融合タンパク質は、ターゲッティングや組織の可視化を目的として作製されているが、生体組織の分析や分離に利用されたことはない。
特定の組織や細胞を傷つけることなく単離するためには、その組織や細胞の周囲に存在する細胞間マトリックスを分解することが必要である。しかし、必要な細胞の表面を分解したり、傷つけたりすることなく、細胞間マトリックスのみを酵素で分解することは容易ではない。特にヒトの臓器の場合、年齢、性別、生活習慣、病歴等によって、タンパク質分解酵素による分解性が異なるため、経験的に酵素の種類や酵素反応時間を決めて、単離を行わざるを得ない。
糖尿病患者では、膵臓から単離された膵島を移植する治療（膵島移植）が行われている。膵島移植には、膵島と呼ばれる膵臓組織に存在する細胞塊の分離が必須であり、膵島を傷つけることなく膵臓組織を分解し、膵島を分離しなければならない。しかし、細胞間マトリックスの状態は、動物の種類、組織の部位、個体の年齢や性別、生育環境などによって大きく異なる。特にコラーゲンに関しては、加齢による物性の変化が顕著である。にもかかわらず、状態が異なる膵臓組織に対して、プロトコールに従った一定量比の酵素を適用し、分解時間のみを変えて、目視で膵臓の分解程度を確認しながら、酵素処理を行っている。そのため、医療機関、医療従事者、対象となる膵臓の状態によって、得られる膵島の量や質はバラバラである。
分離すべき細胞外マトリックスもしくは臓器のタンパク質組成から、使用するタンパク質分解酵素の種類や量を正確かつ簡便に知ることができれば、目的の細胞等を高活性の状態で、単離することが可能となる。
ＷＯ９６/００２８３ ＷＯ９８/２４８８９ ＷＯ０２/０１４５０５
Inoue et al., J Cell Biol,97,1524-1539(1983) SJ Hughes,P McShane,Transplant Proceedings,37,3444-34445(2005) SJ Hughes, A Clark,P McShane,Transplantation,81(3)423-426(2006) D Brandhorst et al.,Transplantation Proceedings,37(8),3450-3451(2005) E Linetsky et al.,Diabetes,46,1120-1123(1997) K Watanabe, Appl Microbiol Biotechnol,63,520-526(2004) N Nishi, O Matsushita, K Yuube, H Miyanaka, A Okabe, F Wada, Proc Natl Acad Sci U S A.;95(12):7018-7023(1998) Tuan et al.,Connective Tissue Reserch,34(1),1-9(1996) Han et al.,Protein Expression and Purification 11, 169-178(1997)
本発明の目的は、生体組織から、迅速かつ高効率に、高い生物活性を有する細胞や細胞集団を分離する手段を提供することにある。具体的には、生体組織中の生理活性物質、細胞又は及び臓器の生理活性を低下させず、目的とする細胞や細胞集団を高収量で取得することにある。
発明者らは、２種類の酵素が有する基質結合ドメイン（生体成分結合ドメイン）と可視化タンパク質との融合タンパク質を用いた生体組成分析用プローブを作製した。そして、このプローブの結合量を解析し、生体組織に対する酵素の作用性を予測することで、最適な酵素の量比や作用時間等を決定し、目的とする細胞や細胞集団を、より効率的に、高い生物活性を有した状態で分離できることを見出した。
すなわち、本発明は、特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質について、前記生体成分結合ドメインをそれぞれ含む２種以上のプローブを単離された生体組織に適用し、前記各プローブの生体組織に対する結合量を解析することを特徴とする、生体組織の分析方法に関する。
本発明で使用するプローブは、公知の分子イメージング技術を利用して可視化されるように設計されている。すなわち、プローブは、蛍光分子、発光分子、ポジトロン核種、及び放射性同位体等の可視化分子によってラベルされている。
可視化分子としては、GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、RFP等の蛍光分子やルシフェラーゼタンパク質等の発光分子を挙げることができるが、これらに限定されない。ルシフェラーゼタンパク質は、天然に存在する野生型ルシフェラーゼとは異なるピーク波長及び発光強度を有することが好ましい。
蛍光分子や発光分子は、単独で用いてもよいし、蛍光分子（エネルギー受容タンパク質）とルシフェラーゼのような自己発光可能な分子（エネルギー発生タンパク質）とを組み合わせて用いてもよい。その場合、両者は適当なリンカーを介して連結することが好ましい。
プローブに用いられる生体成分結合ドメインとしては、タンパク質分解酵素のコラーゲン結合ドメイン、あるいはフィブロネクチン等の生体内タンパク質のコラーゲン結合ドメイン等を挙げることができる。前者の具体例としては、クロストリジウム属（Clostridium）由来のコラゲナーゼが有するコラーゲン結合ドメイン、例えば、ヒストリチクス菌（Clostridium histryticum）由来のコラゲナーゼＧ及びコラゲナーゼＨのコラーゲン結合ドメインが挙げられる。
なお、プローブに用いられるコラーゲン結合ドメインは、本発明の目的と効果が達成できる限りにおいて、当該ドメインの一部（部分配列）であってもよく、「コラーゲン結合ドメイン」との表現には、そのようなコラーゲン結合ドメインの一部も包含される。
本発明で使用される基質結合ドメインの具体的な一例として、前述のヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＧ及びコラゲナーゼＨのコラーゲン結合ドメインのアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２に示す。
可視化分子がタンパク質の場合、生体成分結合ドメインと可視化分子（タンパク質）は、融合タンパク質として作製することができる。
プローブには、生体成分結合ドメインの配列が、１〜１００回、好ましくは１〜２０回繰り返し含まれる。
本発明の分析方法においては、２種以上のプローブを別々に生体組織に作用させてもよいし、同時に作用させてもよい。また、各プローブの結合量も、別々に測定してもよいし、同時に測定してもよい。好ましくは、２種以上のプローブを異なる可視化分子でラベルし、プローブを同時に作用させ、その結合量を同時に測定する。
本発明はまた、本発明の分析方法を利用した、生体組織からの細胞又は細胞集団の分離方法も提供する。本発明の分離方法は、上記分析方法を用いて生体組織を分析し、その結果に基づいて酵素（プローブに含まれる基質結合ドメインの由来となった酵素）の量比を決定し、その量比の酵素を生体組織に作用させて、目的とする細胞又は細胞集団を分離することを特徴とする。
本発明はまた、上記した２種類以上のプローブからなる生体組織分析用プローブセットや、このプローブセットと酵素等を含む生体組織分離用キットも提供する。
本発明で用いられるプローブは、生体成分結合ドメインを含み、生体組織中に存在する特定の酵素結合部位等に特異的に結合して、蛍光や発光を生じる。各酵素に対応したプローブから生じる蛍光や発光等を観察することにより、生体組織における酵素のアフィニティーや作用性を分析することができる。具体的に言えば、プローブを対象とする組織の少量の凍結切片と一緒にインキュベートし、染色させる。組織の切片上のタンパク質組成を色調及びその蛍光強度から、プローブとの結合状況を解析し、分解に最適な酵素の量比や作用時間を算出できる。
すなわち、本発明によれば、分離すべき細胞外マトリックスもしくは組織のタンパク質に対するプローブの結合性から、使用するタンパク質分解酵素の種類や量を正確かつ簡便に知ることができる。これにより、目的とする細胞や細胞集団を、迅速かつ簡便に、高活性を維持した状態で生体組織から単離することができる。例えば膵島移植であれば、対象となる膵臓組織の状態に応じた酵素の処理が可能となり、常に大量に質の良い膵島分離を実現する膵臓組織状態のインデックスを確立することが可能となる。
（A）ColGCBD及び（B）ColHCBDの構成 tdTomatoColH CBDの配列概略図 Ni-NTA溶出画分のSDS-PAGE 陰イオン交換クロマトグラフィー溶出画分のSDS-PAGE tdTomatoColH CBDの励起、蛍光スペクトル ルシフェラーゼ遺伝子とCBD遺伝子の増幅に用いたプライマーの概略図 Luciferase-Collagen binding domain fusion protein発現プラスミド プローブタンパク質の発現確認（SDS-PAGE） ルシフェラーゼ発光の確認（発光スペクトルと550 nmの発光強度の経時変化） Ni-NTA agaroseカラム溶出画分のSDS-PAGE（M：Protein marker、S：PGV_ColH CBD crude、FT：素通り画分、50〜500mM：各濃度のイミダゾール溶出画分（200 mMイミダゾール溶出画分の1本目を精製酵素溶液とした。）） 膵臓組織片との結合確認実験 EGFP-ColGCBDプローブによるブタ膵臓切片の組成分析結果 ラット組織切片におけるGFP ColG CBDとtdTomato ColH CBDの蛍光輝度の比（H/G: GFP ColG CBDに対するtdTomato ColH CBDの蛍光輝度の比、W:Wister-Furth rat, L:Lweis rat, SD:SD rat） コラゲナーゼＧ及びＨの組成比の違いによる膵島の量・質への影響（A:収量、B: ATP/DNA、C: In vitro糖負荷試験、D: Insulin/DNA）
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１１−０５８０８０号の明細書に記載された内容を包含する。
１．生体組織の分析方法
本発明は、特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質について、前記生体成分結合ドメインをそれぞれ含む２種以上のプローブを用いて、当該プローブに対する生体組織の結合量（アフィニティー）を解析し、その結果を生体組織の分解、細胞や細胞集団の単離に応用するものである。
ここで、「特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質」とは、フィブロネクチンやインテグリン等の細胞間マトリックスタンパク質や、タンパク質分解酵素等の酵素を挙げることができる。これらのタンパク質は、そのリガンドや基質に対して特異的に結合する部位（ドメイン）を有しており、本明細書中ではこの部位を「生体成分結合ドメイン」と記載する。
生体組織から細胞や細胞集団を単離する場合には、通常複数の酵素が使用されることが多い。しかし、各酵素の作用性（組織の感受性）は、適用する生体組織の部位や状態によって大きく異なる。そのため、高い生物活性を維持したまま、迅速かつ高効率に、目的とする細胞や細胞集団を分離するためには、最適な酵素の使用量、使用比率、作用時間等を事前に決定することが望ましい。本発明のプローブは、そのような最適な酵素の使用量、使用比率、作用時間等を簡便に決定することを可能にする。
本発明で対象となる「生体組織」は特に限定されず、哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類など多細胞動物の組織、肝臓、膵臓、腎臓、歯周組織、肝臓、膵臓、皮膚、軟骨、骨、神経組織を広く包含する。また、生体から単離されたもののみならず、人工的に構築されたＥＳ細胞組織、iPS細胞の素材用線維芽細胞組織なども含む。
本発明では、特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質について、その生体成分結合ドメイン（例えば、異なる酵素の基質結合部位）をそれぞれ含む「２種以上のプローブ」が用いられる。プローブに用いられる生体成分結合ドメインは、分析の目的に応じて適宜選択される。
例えば、生体組織の酵素消化（分解）や細胞や細胞集団の分離に先立つ生体組織の分析であれば、そのような酵素消化や細胞分離に用いられるタンパク質分解酵素の基質結合ドメインをプローブに使用する。
組織分解で用いられるタンパク質分解酵素としては、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ディスパーゼ、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、ブロメライン、フィチン、サーミダーゼ等を挙げることができる。コラゲナーゼとしては、特に、ヒストリチクス菌（Clostridium histryticum）由来のコラゲナーゼＧやコラゲナーゼＨのほか、放線菌由来のコラゲナーゼ、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のコラゲナーゼ等を挙げることができる。これらの酵素の基質結合部位の一次構造はすでに解析されているものが多く、その情報を用いて、当業者はプローブの設計を行うことができる。
生体組織に結合したプローブは、公知の分子イメージング技術を応用して可視化することで、組織に損傷を与えることなく、その結合量を簡便に測定することができる。プローブは、用いるメージング技術に応じて、蛍光分子、発光分子、及びポジトロン核種等の放射性同位体等の適当な可視化分子によってラベルされる。プローブの設計については、次項において詳述する。
２種以上のプローブは、別々に生体組織に適用してもよいし、同時に適用してもよい。また、その結合量の測定も、別々であってもよいし、同時であってもよい。但し、測定の迅速簡便の点では、２種以上のプローブは異なる可視化分子でラベルし、同時に生体組織に適用し、同時にその結合量を測定することが好ましい。
本発明では、上記２種以上のプローブを単離された生体組織に適用し、当該プローブの生体組織への結合量（アフィニティー）を解析し、その結果を生体組織の分解、細胞や細胞集団の単離に応用する。例えば、２種以上のプローブの生体組織への結合量比を求め、その値から当該生体組織の分解、細胞や細胞集団の単離に用いる酵素の最適量比を決定する。プローブの結合比と用いる酵素の量比には相関関係があり、結合比が高くなれば、酵素の最適量比も高くなる。もっとも、各酵素はそれぞれunit数、力価（効力unit/mg）、至適温度、至適ｐＨ、作用時間が異なるため、これらの要素とプローブの結合比を総合考慮したうえで、用いる酵素の量比は最終的に決定される。本発明によりプローブの結合比が求められれば、そのような最適量比の決定は、当業者であれば可能である。
２．生体組織分析用プローブセット
本発明のプローブセットは、２種類以上のプローブからなり、各プローブは、それぞれ異なる生体成分結合ドメイン（特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質の当該生体成分結合ドメイン）と、蛍光分子、発光分子、及びポジトロン核種を含む放射性同位体から選ばれる可視化分子とを含む。
酵素の基質結合ドメインは、分析の目的に応じて適宜選択される。生体組織の酵素消化（分解）や細胞や細胞集団の分離に先立つ生体組織の分析であれば、そのような酵素消化や細胞分離で用いられるタンパク質分解酵素の基質結合ドメインをプローブに使用する。
そのようなタンパク質分解酵素としては、例えば、コラゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ディスパーゼ、エラスターゼ、パパイン、プロナーゼ、サーモリシン、ズブチリシン、ブロメライン、フィチン、サーミダーゼ等を挙げることができる。コラゲナーゼとしては、特に、特に、ヒストリチクス菌（Clostridium histryticum）由来のコラゲナーゼＧやコラゲナーゼＨのほか、放線菌由来のコラゲナーゼ、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のコラゲナーゼ等を挙げることができる。これらの酵素の基質結合部位の一次構造はすでに解析されているものが多く、その情報を用いて、当業者はプローブの設計を行うことができる。一例として、ヒストリチクス菌（Clostridium histryticum）由来のコラゲナーゼＧ及びコラゲナーゼＨのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。
プローブには、基質結合ドメイン（例えば、コラーゲン結合ドメイン）あるいはその一部が、１〜１００回、特に１〜２０回繰り返し含まれることが好ましい。
可視化分子としては、分子イメージング技術に利用される、蛍光分子、発光分子、及びポジトロン核種を用いることができる。
蛍光分子としては、例えば、GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、及びRFPなどの蛍光タンパク質、あるいはAlexa350、ジメチルアミノクマリン、5/6-カルボキシ-フルオレセイン、Alexa488、ATTO488、DY-505、5/6-カルボキシフルオレセイン、Alexa488、Alexa532、Alexa546、Alexa555、ATTO488、ATTO532、テトラメチルローダミン、Cy3、DY-505、DY-547、Alexa635、Alexa647、ATTO600、ATTO655、DY-632、Cy5、DY-647、Cy5.5などの蛍光マーカーを可視化分子として利用できる。
発光分子としては、ルシフェラーゼ等の発光酵素を用いることができる。ルシフェラーゼは、ウミボタル、ヒオドシエビ、発光昆虫（ホタル、ヒカリコメツキなど）、発光ミミズ、ラチア、ウミシイタケ、オワンクラゲ（エクオリン）などの各種発光生物由来のルシフェラーゼを挙げることができるが、野生型ルシフェラーゼと異なるピーク波長及び発光強度を有する改変型ルシフェラーゼも好適に用いることができる。
GFP等の蛍光タンパク質は蛍光を発するために外部光源を必要とするが、ルシフェラーゼはルシフェリンを酸化して、自ら発光する。このルシフェラーゼをGFPと結合させることによって、外部光源なしでGFPを光らせる技術も開発されており、このような技術を応用してもよい（ＷＯ２００４/２２６００、ＷＯ２００４/０５２９３４）。
その他、可視化タンパク質については、多くの技術が知られており（ＷＯ０１/４６６９４、特表２００６−５１８２０９号公報、特表２００５−５２５１１１号公報、特開２００８−２８３９５９号公報）、これらの公知の技術を利用することもできる。
放射性同位体としては、PETを用いたイメージングに利用されるポジトロン核種等を利用することができる。ポジトロン核種としては、例えば、15O、13N、11C、18F、62Cu、68Ga、82Rbなどが挙げられ、PETプローブに汎用される公知のタグを利用することができる。
可視化分子としてタンパク質分子を用いる場合は、生体成分結合ドメイン（コラーゲン結合ドメイン）と可視化分子を融合タンパク質として構成することができる。融合タンパク質の製造方法は当該分野で公知であり（前掲、N Nishi, et al., Proc Natl Acad Sci U S A.; 95(12): 7018-7023(1998)、Tuan et al.,Connective Tissue Reserch,34（1),1-9 (1996)、Han et al.,Protein Expression and Purification 11,169-178）、当業者はこれらの公知技術にしたがって、融合タンパク質を容易に製造することができる。
３．生体組織からの細胞又は細胞集団の分離方法
本発明は、上記した分析方法を用いて生体組織を分析し、その分析結果に基づいて使用する酵素の量比や作用時間を決定し、生体組織から目的とする細胞又は細胞集団を効率よく分離する方法も提供する。
プローブの結合量は、酵素に対する組織のアフィニティーを示唆するものであるため、各酵素に対するアフィニティーから、目的に応じた酵素の量比や作用時間等を予測することができる。
４．生体組織分離用キット
本発明は、上記した生体組織からの細胞又は細胞集団の分離方法に用いるためのキットも提供する。
本発明のキットは、本発明のプローブセットと、生体組織の分離に用いられる酵素であって、その基質結合ドメインがプローブの構成要素となっている酵素、バッファー、など、本発明の生体組織の分離方法に用いられる試薬や器具から選ばれる１又は２以上を構成要素として含む。
以下、実施例を用いて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕EGFPを用いたプローブの作製
［EGFP-ColGCBDプローブの作製］
（１）EGFP-ColGCBDの構築方法
はじめに、EGFPでラベルしたヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＧに対するプローブ（EGFP-ColGCBD）の作製について説明する。
まず、FLAG 配列をもとに5'- TCGACGATTATAAAGATGATGATGATAAAT -3'（配列番号３）及び5'-CTAGATTTATCATCATCATCTTTATAATCG -3'（配列番号４）の２つのオリゴ DNAを合成した。それぞれのオリゴDNAを100μMになるようにTEに溶解し、10μlのオリゴDNA、3μlの10×T4 polynucleotide kinase buffer(Nippon Gene社製)0.3μlの0.1M ATP、2μlのT4 polynucleotide kinase(20U,Nippon Gene)、14.7μlのH2Oを混合し、37℃、１時間保温した。それぞれの反応液から10μlを取り、混合した。混合した溶液を100℃で５分保持した後、そのまま徐々に室温まで冷却した。これをインサート溶液1とした。
10μlのpCold2(TAKARA Bio)に10μlの10×Tango buffer(Fermentas社製)、1μlのSalI(Fermentas)、１μlのXbaI(Fermentas)、28μlのH2Oを加え、37℃で５時間反応を行った。反応が終了した反応液に150μlのTEを加え、250μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)溶液を加え、よく攪拌した後、室温にて5分間、16,000gで遠心し、上清を回収した。回収した上清に20μlの3M酢酸ナトリウム溶液を加え、450μlの冷エタノールを加えた。氷上で5分間放置した後に16,000g、4℃で5分間遠心し、沈殿を回収した。
沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、40μl H2Oで溶解した。これに、5μlの10×BAP buffer(TOYOBO社製)、5μlのbacterial alkaline phosphatase(TOYOBO)を加え、65℃で、１時間反応させた。反応液を全量、0.8％アガロース電気泳動に供した。泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は40μlのEBで行った。
得られた溶出液をベクター溶液1とした。9μlのベクター溶液1と1μlのインサート溶液1、10μlのLigation convenience solution(Nippon gene)を混合し、16℃で30分間保温した。この溶液を用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。形質転換した大腸菌をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。このうち10μlのプラスミド溶液に2μl 10×Tango buffer、1μl XbaI、7μlのH2Oを混合し、37℃で、3時間保持した。反応液を0.8％アガロースゲル電気泳動に供し、現れた4kbp付近の単一バンドを切り出した。回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。溶出は50μlのEBで行った。10μlの溶出液に10μlのLigation convenience solutionを加え、16℃で、30分保持した。
この溶液を用いて再度、大腸菌 DH5αを形質転換した。形質転換した大腸菌をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。このうち10μlに3μlの10×K buffer(TAKARA Bio)、1μlのBamHI(TAKARA Bio)、1μlのEcoRI(TAKARA Bio)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応終了後、同量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を行い、得られた上層に、3μlの3M酢酸ナトリウムを加え、70μlの冷エタノールを加えた。氷上で5分間放置した後に16,000g、4℃で5分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、40μl H2Oで溶解した。これに、5μlの10×BAP buffer(TOYOBO)、5μlのbacterial alkaline phosphatase(TOYOBO)を加え、65℃で、１時間反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をベクター溶液2とした。
一方、0.5μlの100μM 5'-AAAGAACGGATCCACAACAACACCTATAACTAAAG -3'(primer 1：配列番号５)、及び0.5μlの100μM 5'-AAGCAGAGATGAATTCTTTATTTACCCTTAACTCATAG -3' (primer 2：配列番号６)、1μlのすでにクローン化された Clostridium historitycum collagnease Gをコードする遺伝子全長を含むプラスミド、8μlのdNTP mix(TAKARA Bio)、1.0μlPrimeStar HS(TAKARA Bio)、20μl 5M betain、49μl H2Oを混合し、98℃、2min（第一段階）、98℃、10sec（第二段階）、55℃、5sec（第三段階）、72℃、90sec（第四段階）とし、第二段階から第四段階を35回連続して繰り返した。
得られたPCR断片は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて精製を行った。溶出は50μlのEBで行った。得られた溶出液のうち10μlに3μlの10×K buffer(TAKARA Bio)、1μlのBamHI(TAKARA Bio)、1μlのEcoRI(TAKARA Bio)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をインサート溶液2とした。
5μlのベクター溶液2と5μlのインサート溶液2に10μlのLigation convenience solutionを加え、16℃で30分間反応させた。反応終了後のligation溶液を用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。得られた形質転換株をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。このうちの10μlに3μlのTango buffer、1μlのSacI(Fermentas)、1μlのKpnI(Fermentas)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応終了後、同量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を行い、得られた上層に、3μlの3M 酢酸ナトリウムを加え、70μlの冷エタノールを加えた。氷上で5分間放置した後に16,000g、4℃で5分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、40μl H2Oで溶解した。これに、5μlの10×BAP buffer(TOYOBO)、5μlのbacterial alkaline phosphatase(TOYOBO)を加え、65℃で、１時間反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をベクター溶液3とした。
EGFPをコードする遺伝子を鋳型とし、5'-CGAAGGTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCG -3' (primer 3：配列番号７)及び、3'-AGACTGCGGTACCGATCGATCTGAGTCCG -3'(primer 4：配列番号８)をプライマーとし、20μlの5×PrimeStar buffer(TAKARA Bio)、1.0μl ｐET-EGFP、0.5μlの100μM primer 3、0.5μlの100μM primer 4、8.0μl dNTP mix、1.0μl PrimeStarHS、20μl 5M betain、49μl H2Oを混合し、98℃、2min（第一段階）、98℃、10sec（第二段階）、55℃、5sec（第三段階）、72℃、90sec（第四段階）とし、第二段階から第四段階を35回連続して繰り返した。
得られたPCR断片は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて精製を行った。溶出は50μlのEBで行った。得られた溶出液のうち10μlに3μlのTango buffer、1μlのSacI(Fermentas)、1μlのKpnI(Fermentas)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をインサート溶液3とした。
5μlのベクター溶液3と5μlのインサート溶液3に10μlのLigation convenience solutionを加え、16℃で30分間反応させた。反応終了後のligation溶液を用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。得られた形質転換株をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。得られた溶出液を用いて大腸菌BLR株（Novagen社製）を形質転換した。得られた形質転換株を、E.coli BLR/pCold2-EGFP-ColGCBD株とした。
（２）EGFP-ColGCBDの精製
培養
pCold2-EGFP-ColGCBDで形質転換した大腸菌 BLR株をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩振盪培養し、これを前培養液とした。500ml容のバッフル付き三角フラスコに用意した170mlの同培地に1000分の1量となるように前培養液を植菌し、OD660が0.6〜1.0程度になるまで37℃で振盪培養し、0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したIPTGを終濃度1mMになるように添加し、15℃で24時間振盪培養した。
回収
培養終了後、10,000g、5分の遠心で菌体を回収した。培養液と等量の0.3M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH8.0に回収した菌体を懸濁し、再び10,000g、5分の遠心で菌体を回収した。同様の操作を更に二度繰り返し、菌体を洗浄した。洗浄した菌体を25mlの同緩衝液で懸濁した後、200Wの出力で1分間、氷中で超音波破砕機によって菌体の破砕を行った。破砕が終了した菌体を10,000g、10分間、4℃で遠心し、上清を回収した。
精製
菌体破砕した上清をCosmosil His-accept(直径2.5×10cm)カラムクロマトグラフィーに供した。0.3M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH8.0にてカラムをよく洗浄した後、10mM イミダゾールを含み0.3M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH8.0をカラムと等量アプライした。ついで20mM イミダゾールを含む同緩衝液、30mM イミダゾールを含む同緩衝液、40mM イミダゾールを含む同緩衝液、50mM イミダゾールを含む同緩衝液、100mM イミダゾールを含む同緩衝液、500mM イミダゾールを含む同緩衝液をアプライし、吸着したタンパク質を溶出した。各溶出画分をSDS-PAGE及び、抗His6 抗体（Santa Cruz）を用いた免疫ブロットによって確認した。その結果、20-30mM イミダゾール溶出画分に目的のタンパク質が確認できたため、これをEGFP-ColGCBDタンパク質とした。ColGCBDを図１の（A）に、EGFP-ColGCBDの塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号９及び１０に示す。
〔実施例２〕DsRedを用いたプローブの作製
［DsRed-ColHCBDプローブの作製］
（１）DsRed-ColHCBD の構築方法
つぎに、DsRedでラベルしたヒストリチクス菌由来のコラゲナーゼＨに対するプローブ（DsRed-ColHCBD）の作製について説明する。
C-myc配列をもとに5'-TCGACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGT-3'（配列番号１１） 及び5'- CTAGACAGATCTTCTTCGCTAATCAGTTTCTGTTCG-3'（配列番号１２）の２つのオリゴDNAを合成した。それぞれのオリゴDNAを100μMになるようにTEに溶解し、10μlのオリゴDNA、3μlの10×T4 polynucleotide kinase buffer(Nippon Gene)0.3μlの0.1M ATP、2μlのT4 polynucleotide kinase(20U, Nippon Gene)、14.7μlのH2Oを混合し、37℃、１時間保温した。それぞれの反応液から10μlを取り、混合した。混合した溶液を100℃で５分保持した後、そのまま徐々に室温まで冷却した。これをインサート溶液4とした。
10μlのpCold2(TAKARA Bio)に10μlの10×Tango buffer(Fermentas社製)、1μlのSalI(Fermentas)、１μlのXbaI(Fermentas)、28μlのH2Oを加え、37℃で５時間反応を行った。反応が終了した反応液に150μlのTEを加え、250μlのフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール(25:24:1)溶液を加え、よく攪拌した後、室温にて5分間、16,000gで遠心し、上清を回収した。回収した上清に20μlの3M 酢酸ナトリウム溶液を加え、450μlの冷エタノールを加えた。氷上で5分間放置した後に16,000g、4℃で5分間遠心し、沈殿を回収した。
沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、40μl H2Oで溶解した。これに、5μlの10×BAP buffer(TOYOBO社製)、5μlのbacterial alkaline phosphatase(TOYOBO)を加え、65℃で、１時間反応させた。反応液を全量、0.8％アガロース電気泳動に供した。泳動終了後、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は40μlのEBで行った。得られた溶出液をベクター溶液4とした。9μlのベクター溶液4と1μlのインサート溶液4、10μlのLigation convenience solution(Nippon gene)を混合し、16℃で30分間保温した。
この溶液を用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。形質転換した大腸菌をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。このうち10μlのプラスミド溶液に2μl 10×Tango buffer、1μl XbaI、7μlのH2Oを混合し、37℃で、3時間保持した。反応液を0.8％アガロースゲル電気泳動に供し、現れた4kbp付近の単一バンドを切り出した。回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。溶出は50μlのEBで行った。10μlの溶出液に10μlのLigation convenience solutionを加え、16℃で、30分保持した。この溶液を用いて再度、大腸菌 DH5αを形質転換した。形質転換した大腸菌を オートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。このうち10μlに3μlの10×K buffer(TAKARA Bio)、1μlのBamHI(TAKARA Bio)、1μlのEcoRI(TAKARA Bio)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応終了後、同量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を行い、得られた上層に、3μlの3M 酢酸ナトリウムを加え、70μlの冷エタノールを加えた。氷上で5分間放置した後に16,000g、4℃で5分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、40μl H2Oで溶解した。これに、5μlの10×BAP buffer(TOYOBO)、5μlのbacterial alkaline phosphatase(TOYOBO)を加え、65℃で、１時間反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をベクター溶液5とした。
一方、0.5μlの100μM 5'- GAATCTTCAGGATCCACTACTACTGCAGAAATAAAG -3' (primer 5：配列番号１３)、及び 0.5μlの100μM 5'-AAGCAGAGATGAATTCTCTTCCTACTGAACCTTCTATATTAATTC -3' (primer 6：配列番号１４)、1μlのすでにクローン化されたClostridium historitycum collagnease Hをコードする遺伝子全長を含むプラスミド pCold2-ColH-His、8μlのdNTP mix(TAKARA Bio)、1.0μlPrimeStar HS(TAKARA Bio)、20μl 5M betain、49μl H2Oを混合し、98℃、2min（第一段階）、98℃、10sec（第二段階）、55℃、5sec（第三段階）、72℃、90sec（第四段階）とし、第二段階から第四段階を35回連続して繰り返した。
得られたPCR断片は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。溶出は50μlのEBで行った。得られた溶出液のうち10μlに3μlの10×K buffer(TAKARA Bio)、1μlのBamHI(TAKARA Bio)、1μlのEcoRI(TAKARA Bio)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をインサート溶液5とした。
5μlのベクター溶液5と5μlのインサート溶液5に10μlのLigation convenience solutionを加え、16℃で30分間反応させた。反応終了後のligation溶液を用いて大腸菌 DH5αを形質転換した。得られた形質転換株をオートクレーブにより滅菌した2 mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。このうちの10μlに3μlのTango buffer、1μlのSacI(Fermentas)、1μlのKpnI(Fermentas)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応終了後、同量のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出を行い、得られた上層に、3μlの3M 酢酸ナトリウムを加え、70μlの冷エタノールを加えた。氷上で5分間放置した後に16,000g、4℃で5分間遠心し、沈殿を回収した。沈殿を冷70%エタノールで洗浄した後、40μl H2Oで溶解した。これに、5μlの10×BAP buffer(TOYOBO社製)、5μlのbacterial alkaline phosphatase(TOYOBO)を加え、65℃で、１時間反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をベクター溶液6とした。
pDsRed-monomer(Clontech社製)を鋳型とし、5'-GTACCGGTCGAGCTCATGGACAACACCGAGG-3'(primer 7：配列番号１５)及び、3'-GTCGCGGCCGGTACCCTGGGAGCCGGAGTGGC-3'(primer 8：配列番号１６)をプライマーとし、20μlの5×PrimeStar buffer(TAKARA Bio)、1.0μl pDsRed-monomer(Clontech社製)、0.5μlの100μM primer 7、0.5μlの100μM primer 8、8.0μldNTP mix、1.0μlPrimeStar HS、20μl 5M betain、49μl H2Oを混合し、98℃、2min（第一段階）、98℃、10sec（第二段階）、55℃、5sec（第三段階）、72℃、90sec（第四段階）とし、第二段階から第四段階を35回連続して繰り返した。
得られたPCR断片は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。溶出は50μlのEBで行った。得られた溶出液のうち10μlに3μlのTango buffer、1μlのSacI(Fermentas)、1μlのKpnI(Fermentas)、15μlのH2Oを混合し、37℃で一晩反応させた。反応液を全量、0.8％ agarose電気泳動にてTAE緩衝液を用いて泳動し、エチジウムブロマイド溶液で染色し、バンドの位置を確認した後、切り出しを行った。アガロースゲルからの回収は、Viogene社製 gel/PCR purification kitを用いて行った。同プロトコールに従い、溶出は30μlのEBで行った。この溶出液をインサート溶液6とした。
5μlのベクター溶液6と5μlのインサート溶液6に10μlのLigation convenience solutionを加え、16℃で30分間反応させた。反応終了後のligation溶液を用いて大腸菌DH5αを形質転換した。得られた形質転換株をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.22μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩培養した後、10,000gで1分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体からViogene社製 mini plus plasmid DNA extraction kitを用いてプラスミドを回収した。溶出は100μl EBで行った。得られた溶出液を用いて大腸菌BLR（DE3）pLys株（Novagen社製）を形質転換した。得られた形質転換株を、E. coli BLR/pCold2-DsRed-ColHCBD株とした。
（２）DsRed-ColHCBDの精製
培養
pCold2-DsRed-ColHCBDで形質転換した大腸菌BLR株をオートクレーブにより滅菌した2mlのLB培地に終濃度100μg/mlになるように0.25μmの滅菌済みフィルターで滅菌したアンピシリンを添加した培地に植菌し、37℃で一晩振盪培養し、これを前培養液とした。500ml容のバッフル付き三角フラスコに用意した170mlの同培地に1000分の1量となるように前培養液を植菌し、OD660が0.6〜1.0程度になるまで37℃で振盪培養し、0.25μmの滅菌済みフィルターで滅菌したIPTGを終濃度1mMになるように添加し、15℃で24時間振盪培養した。
回収
培養終了後、10,000g、5分の遠心で菌体を回収した。培養液と等量の0.3M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH8.0に回収した菌体を懸濁し、再び10,000g、5分の遠心で菌体を回収した。同様の操作を更に二度繰り返し、菌体を洗浄した。洗浄した菌体を25mlの同緩衝液で懸濁した後、200Wの出力で1分間、氷中で超音波破砕機によって菌体の破砕を行った。破砕が終了した菌体を10,000g、10分間、4℃で遠心し、上清を回収した。
精製
菌体破砕した上清をCosmosil His-accept(直径2.5×10cm)カラムクロマトグラフィーに供した。0.3M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH8.0にてカラムをよく洗浄した後、10mM イミダゾールを含み0.3M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH8.0をカラムと等量アプライした。ついで20mM イミダゾールを含む同緩衝液、30mM イミダゾールを含む同緩衝液、40mM イミダゾールを含む同緩衝液、50mM イミダゾールを含む同緩衝液、100mM イミダゾールを含む同緩衝液、500mM イミダゾールを含む同緩衝液をアプライし、吸着したタンパク質を溶出した。各溶出画分をSDS-PAGE及び、抗His6 抗体（Santa Cruz）を用いた免疫ブロットによって確認した。その結果、20-30mM イミダゾール溶出画分に目的のタンパク質が確認できたため、これをDsRed-ColHCBDタンパク質とした。ColHCBDの構造を図１の（B）に、DsRed-ColHCBDの塩基配列とアミノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号の１７及び１８に示す。
〔実施例３〕tdTomatoを用いたプローブの作製
（１）tdTomatoColH CBD DNAの作製と発現ベクターpColdIIの挿入
tdTomato遺伝子の鋳型DNAは、ptdTomato vector（クロンテック社）を用いた。DNA増幅のためのPCRには、N末端のプライマーは、tdTomatoの前にNde I認識サイトを含む配列34base（TomatoF）を使用した。C末端のプライマーには、tdTomatoの後ろに終止コドンの代わりにBamHI認識サイトをもつ34bp（TomatoR）の相補鎖配列を使用した。各プライマーの配列を以下に記載する。
プライマー配列：
TomatoF：5’- CCGGTCGCCcatATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG -3’（配列番号１９）
TomatoR：5’- AGAGTCGCGGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCA -3’（配列番号２０）
次に、DsRed-ColH CBD DNAが挿入されたpCold IIを、制限酵素BamH IとXba Iで処理し、約1000bpのCol H CBD DNA断片を得た。
PCRで作製された約1500bpのtdTomato DNAはNde I, BamHIで処理し、ColH CBD DNAとともに、Nde I, Xba Iで処理した発現ベクターpCold IIに挿入した。コロニーPCRとシークエンス解析により、設計通りのプラスミドが構築されていることを確認した。なお、DNAシークエンス解析はOperon Biotechnologies社に依頼した。tdTomatoColH CBD DNAをpCold IIに挿入すると、N末端にHis-tag配列を有するタンパク質として発現される（図２）。これらのアミノ酸配列も含め、設計したtdTomatoColH CBDは、726残基（分子量82k）となる。
（２）発現菌の作製とタンパク質発現誘導
上記の方法で構築されたtdTomatoColH CBD発現プラスミドで、大腸菌BLRを形質転換した。形質転換は、一般的なヒートッショック法を用いた。100μg/mlのampicillin(Amp)を含んだLBプレートにストリークし、37°Cで一晩培養した。生えてきたコロニーをLB/Amp液体培地に植継ぎ、OD600が0.5-0.7に達するまで37°Cで培養した。培養液を氷上で30分間冷却後、0.1mMとなる様にisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を加え、15°Cで24時間培養を続け、タンパク質の発現を誘導した。
24時間後の大腸菌培養液を遠心し、菌体を回収した。菌体をPhosphate buffered saline(PBS)で2回洗浄した後、再度PBSに懸濁し、0.1mMとなる様にphenylmethanesulphonyl fluoride(PMSF)を添加し、氷冷しながら超音波によって菌体を破砕した。その菌体破砕液を12,000rpm、20分遠心し、沈殿と上清にわけてSDS-PAGEによって可溶性画分に目的のタンパク質が発現していることを確認した。大腸菌の培養液に、dimethyl sulfoxide(DMSO)を8%となる様に添加し、-80°Cで冷凍保存した。これをtdTomatoColH CBD発現用の凍結ストック菌体とした。
（３）tdTomatoColH CBDの精製
300mM NaCl/50mMリン酸Na buffer(pH8.0)で平衡化したNi-NTA agaroseカラム（φ2.0cm x 5.0cm、カラム容積 15ml、QIAGEN社）に、菌体破砕後の可溶性画分を平衡化bufferで3倍希釈した溶液をアプライした。平衡化bufferで担体に吸着しない素通り画分を洗い流した後、50mM,200mM,500mMイミダゾールを含むbufferで溶出した。各イミダゾール濃度の画分のSDS-PAGEを行い、200mMイミダゾール溶出画分にtdTomatoColH CBDが溶出していることが確認されたため（図３）、その画分を回収し50mM Tris-HCl(pH8.0)に対して透析した。
透析後の溶液を陰イオン交換カラム（HiTrap DEAE FF, C.V.=1ml、GEヘルスケア社）にアプライし、0-400mMの直線的なNaCl濃度勾配によって溶出した。溶出画分からSDS-PAGEにてtdTomatoColH CBDが存在している画分を回収し（図４）、Amicon 30k（ミリポア社）を用いて5mg/mlまで限外ろ過によって濃縮した。これを精製tdTomatoColH CBDとした。
（４）蛍光スペクトル測定
tdTomatoはDsRedと同じ励起（554nm）、蛍光（581nm）波長を持つとされている。tdTomatoColH CBD精製酵素溶液の励起、蛍光スペクトルを分光蛍光光度計F-2500（日立ハイテク社）を用いて測定した（図５）。スペクトルから、CDBとの融合タンパク質として発現させたことによる蛍光の波長シフトや消光は起きていないことを確認した。また、DsRedを用いたものと比較して、より強い蛍光を発していることが確認された。
〔実施例４〕ルシフェラーゼを用いたプローブの作製
[PGV_Col G CBD 及びPGV-Col H CBD（Luciferase-Collagen binding domain fusion protein）プローブの作製方法]
（１）PGV_Col G CBDの構築方法
１）Luciferase-Collagen binding domain fusion protein DNAの作製発現ベクターpCold Iへの挿入
Luciferase遺伝子の鋳型DNAは、ピッカジーンコントロールベクター(PGV_control)のluciferase coding region(PGV)の配列を用いた。DNA増幅のためのPCRには、N末端のプライマーは、PGVの前にNde I認識サイト(CATATG)を含む配列27base(PGVctrl_Nterm)を使用した。C末端のプライマーには、PGVの後ろに終止コドンの代わりにBamHI認識サイト(GGATCC)をもつ30bp(PGV_CF_r)の相補鎖配列を使用した。
Collagenase(Col) G, Hのcollagen binding domain(CBD)には、pCold III にCol G, Hの全長DNAが挿入されたプラスミドを鋳型DNAとして用いた。DNA増幅のためのPCRには、CBDのN末端にBamH I認識サイトを付加した35base(ColG_Nterm, ColH_Nterm)のDNAをN末端のプライマーとして用いた。C末端のプライマーは、Col G CBDに続きStrep-tagのアミノ酸配列、Xba I認識サイト(TCTAGA)の順に付加した配列(ColG_CtermStrep_comp)と、Col H CBDに続きFLAG-tagのアミノ酸配列、Xba I認識サイトの順に付加した配列(ColH_CtermFLAG_comp)の相補鎖49baseのDNAをそれぞれ使用した (図６)。
PCRで作製された約1,700bpのPGV DNAはNde I, BamHIで、約1,000bpのCBD DNAはBamH I, Xba Iで処理し、Nde I, Xba Iで処理した発現ベクターpCold Iに挿入した (図７)。
コロニーPCRとシークエンス解析により、設計通りのプラスミドが構築されていることを確認した。なお、DNAシークエンス解析はOperon Biotechnologies社に依頼した。DNAをpCold Iに挿入すると、N末端にHis-tagとFactor Xaの認識配列をもったタンパク質として発現される。これらのアミノ酸配列も含め、設計したfusion proteinの大きさは、PGV Col G CBDが911残基（分子量101k）で、PGV Col H CBDが883残基（分子量98 k）となる。
２）発現菌の作製とタンパク質発現誘導
PGVとCol G CBD又はCol H CBDの DNAが挿入された発現プラスミドで、大腸菌Rosetta 2(DE3)を形質転換した。形質転換は、一般的なヒートッショック法を用いた。この形質転換株によるLuciferase-Collagen binding domain fusionタンパク質発現誘導をみた。
100μg/mlのampicillin(Amp)と34μg/mlのchloramphenicol(Cm)を含んだLBプレートにストリークし、37℃で一晩培養した。生えてきたコロニーをLB/Amp/Cm液体培地に植継ぎ、OD600が0.5-0.7に達するまで37℃で培養した。培養液を氷上で30分間冷却後、0.1mMとなるようにisopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)を加え、15 ℃で48時間培養を続け、タンパク質の発現を誘導した。
48時間後の大腸菌培養液を遠心し、菌体を回収した。菌体をPhosphate buffered saline(PBS)で2回洗浄した後、再度PBSに懸濁し、0.1mMとなるようにphenylmethanesulphonyl fluoride(PMSF)を添加してから強度最大、2sec interval pulse、15分の条件で超音波破砕を行った。その菌体破砕液を12,000rpm,20分遠心し、沈殿と上清にわけてSDS-PAGEを行い、タンパク質発現を確認した。SDS-PAGEの結果、PGV_Col G CBD(101k)とPGV_Col H CBD(98k)と思われる大きさのタンパク質のバンドを確認した(図８)。そのバンドは、抗His-tag抗体を用いたウェスタンブロットでも検出された。目的のタンパク質が発現していることが確認できた大腸菌の培養液に、dimethyl sulfoxide(DMSO)を8%となるように添加し、-80℃で冷凍保存した。これをPGV_Col G CBD又はPGV_Col H CBDの凍結ストック菌体とした。
３）ルシフェラーゼ活性の確認
形質転換株の菌体破砕後の上清(crude)に、ルシフェラーゼ活性を持ったタンパク質が存在していることを確認した。本発明に用いたルシフェラーゼは、550nmに極大値を持つ発光スペクトルを示す。50mM Tris-HCl(pH8.0)とcrudeを混合した後、基質溶液(Tripluc Luciferase Assay Reagent,東洋紡)を加え、直ちに550nmの発光を経時的に測定した。ルシフェラーゼの発光は、基質溶液を加えた直後に最大を示し、その後は減衰していく。発光の減衰が見かけ上、ほぼ定常に達する時間まで測定した。その後に発光スペクトルも測定した(図９)。CBDとのfusion proteinとして発現させても、単独のPGVと同様の発光を示した。破砕直後のcrudeでは、550nmの強い発光が観測された。-80℃で冷凍保存していたcrudeでは、徐々に発光が弱くなったが、4℃や-20℃で保存したものより失活しないことを確認した。
（２）精製方法
300mM NaCl/50mM リン酸Na buffer(pH8.0)で平衡化したNi-NTA agaroseカラム（直径2.0cm x 5.0cm、カラム容積 15ml、QIAGEN）に、菌体破砕後のcrudeを平衡化bufferで10倍希釈した溶液をアプライした。平衡化bufferで担体に吸着しない素通り画分を洗い流した後、50mM,200mM,500mMイミダゾールを含むbufferで溶出した。各イミダゾール濃度の画分をSDS-PAGEで確認し、200mMイミダゾール溶出画分を精製PGV_ColG CBDまたは、PGV_ColH CBDとした(図１０)。
〔実施例５〕膵臓組織との結合確認
100μlの50mMTris-HCl / 5mM CaCl2(pH7.5)に懸濁したブタの膵臓組織片と精製酵素溶液100μlを混合し、37℃で30分間インキュベートした後、遠心して沈殿と上清(sup.1)に分けた。得られた沈殿を50 mM酢酸バッファー(pH5.0)に懸濁し、室温で20分インキュベートした後、遠心して沈殿と上清(sup.2)に分けた。得られた沈殿と上清のSDS-PAGEを行って、膵臓組織とtdTomatoColH CBDの結合を確認した（図１１）。
SDS-PAGEの結果、沈殿にtdTomatoColH CBDのバンドが見られ、膵臓組織と結合したことが確認された。膵臓組織に結合したtdTomatoColH CBDは沈殿に、その他の結合していないものはsup.1に、それぞれ分画された。また、sup.2にバンドが検出されてないため、tdTomatoColH CBDは、酸性pHの条件下でもコラーゲン繊維に結合したままであることが確認された。
〔実施例６〕プローブを用いた生体組織成分分析法
[生体組成成分の測定方法]
本発明の生体組成成分の測定方法を説明する。
（１）EGFP-ColGCBD及びDsRED-ColHによる生体組成分の測定方法
脱血死後のブタより膵臓を摘出し、5mm2に切除した膵臓断片をOCT コンパウンド（サクラファインテック社製）に包埋し、液体窒素で凍結する。その後、クリオスタットCM 3050S（ライカ社製）にて、厚さ8μmに薄切し、プレパラート（松浪硝子工業株式会社製）に接着させる。カルシウムイオンやマグネシウムイオンを含有しないリン酸緩衝溶液（PBS(-)）で10％に調整したホルマリン液（WAKO社製）に浸し、室温で10分間インキュベートし、その後30分間乾燥させる。硝子製のキュベットにPBS(-)を入れ、その中で５分間室温にてインキュベートする。乾燥に気を付けながら、湿潤箱にプレパラートを留置し、切片上に EGFP-ColGCBD 溶液200μlを浸し、37℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、PBS(-)にて5分間洗浄を行う。プレパラートを洗浄瓶に入れたPBS(-)で洗い流し、VECTORSHELD（Vector社製）で封入した。その後、蛍光顕微鏡 BIOLEVO BZ 9000（キーエンス社製）で観察し、撮影を行った。
（２）測定結果
結果を図１２に示した。ネガティブコントロールに比べ、EGFP-ColGCBDで染色した組織は、組織の存在する領域を良好に染色した。
〔実施例７〕組織切片の測定方法
（１）観察方法
-80°C保存してあったラットの膵臓組織切片が固定されたプレパラートを、室温で5mM CaCl2 / TBSに10分間浸し、Milli-Qで洗浄した。非特異的結合を抑えるためのブロッキングとして、2% Myoglobin(Myb)を100μl滴下し、37°Cで30分間プレインキュベートし、Milli-Qで洗浄した。タンパク質（GFP control,GFP ColG CBD,tdTomato control,tdTomatoColH CBD）溶液40μlと2% Myb 40μlを混合後、組織切片上に滴下し、37°Cで30分間インキュベートした。各タンパク質溶液の濃度は、GFP control 10mg/ml、GFP ColG CBD 10mg/ml、tdTomato control 5mg/ml、tdTomatoColH CBD 5mg/mlに調整した。
室温で5mM CaCl2 / TBSに10分間浸し、Milli-Qで洗浄した。これを２回繰り返した後、蛍光顕微鏡BIOREVO BZ-9000（キーエンス社）を用いて倍率200倍で観察し、適当な領域を数カ所選び、露光時間0.5秒で写真を撮影した。
顕微鏡付属ソフトウェアの計測機能を用いて、撮影した写真全体の輝度をヒストグラム化した。GFP controlとGFP ColG CBDでは緑色蛍光の輝度のみ、tdTomato controlとtdTomatoColH CBDでは赤色蛍光の輝度のみを抽出した。
このヒストグラムから、GFP controlとGFP ColG CBD、tdTomato controlとtdTomatoColH CBDの輝度平均値の差（delta average brightness）を算出し、系統毎にまとめた。算出されたdelta average brightnessの数値が大きくなるほど、CBDと組織との結合が多く、controlとの蛍光強度の差が大きく出ているということを示している。このdelta average brightnessを比較し、各系統、週齢によって、膵臓組織に対するColG CBDやColH CBDの結合には差異が認められた。
（２）ラット膵島分離法
米国のNational Institutes of Healthにより発行された“Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(1996年改訂版)”に基づき動物実験を施行した。体重239-268gの雄性 Lewis ラット(Slc、Japan)、体重255-301gの雄性SDラット(Slc、Japan)、体重197-231gの雄性Wistar-Furthラット(Slc、Japan)を使用した。
膵臓摘出前、総胆管より中性プロテアーゼとしてThermolysin(0.322mg)は変化させず、リコンビナントタイプの高純度品のCol G(5.46mg)および Col H(2.02mg)を酵素量基準比率（H/G比＝0.37)と設定し、それに対し10倍群 (Col G(4.96mg),Col H(18.34mg),Thermolysin(0.322mg),（H/G比＝3.70)、1/10倍群 (Col G (5.51mg), Col H (0.20mg),Thermolysin (0.322mg),（H/G比＝0.04),Col G完全欠落群、Col H完全欠落群を設定して、cold Hanks’Balanced Salt Solutions(HBSS)を注入し、膵臓を拡張させた。10mLのHBSSを加えた後、37℃下で14分間温浴させることにより膵臓を消化した。引き続きHistopaque-1119(Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA)とLymphoprepTM (NycomedPharma AS, Oslo,Norway)を用いた濃度勾配遠心を行い、膵島の存在する層を採取した。膵島分離操作にて得られた組織にdiphenylthiocarbazone(Wako,Osaka,Japan)染色を行い、膵島と外分泌腺や導管などの非膵島組織を識別しそれぞれの収量を顕微鏡直視下に計測した。分離膵島の収量は、islet equivalent(IEQ)で表示した（1IEQは直径150μmの膵島1個相当の大きさに当たることが国際基準で定められている）。
（３）実施結果
１）各種ラットの組織切片におけるGFP ColG CBDおよびtdTomatoColH CBDの蛍光輝度の測定結果
各種ラットにおけるColGとColHの２種類のプローブの蛍光輝度およびその比を図１３及び表１に記載した。
Figure 2012124338
２）各種ラットにおける膵島分離結果
ColGとColHの２種類のプローブの蛍光輝度比H/G値0.85以上の場合、ColGに比して、ColHの添加量つまり、ColH/G比の最適値で使用する必要があるが、H/G値0.8以下の場合、ColH/G比の影響は少なく、ColG無添加でも膵島収量に大きく影響されないことを見出しており、その数値に従って、各ラット種において、膵島分離に使用するColHおよびColGの含有量比を変えて、膵島分離実験における膵島収量を測定し、その結果を表２に示した。
Figure 2012124338
表２に示すように、Col Gを完全に欠落させた条件下においても、全種において膵島分離が可能であったが、対照的にCol Hを完全に欠落させた条件下では全種において膵臓が全く消化されなかった。次にCol H/G比が膵島分離結果に及ぼす影響は、H/G比を1/10に設定したケースにおいてWistar群のみ分離膵島の収量が有意に低下 (基準比の54.6%,p=0.009)することが判明した。また、Col Gを完全に欠落させたケースにおいても、Wistar(75.5%),SD(67.3%),Lewis(54.2%)の順に分離膵島収量が確保されており、Col Hを要する基質の発現はWistar>SD>Lewisの傾向を示した。
このように、ColHとColGの最適使用量比を算出し、使用ColGおよびColHの使用量を最適にすることによって、高収量の膵島を分離できることが示された。
〔参考例〕コラゲナーゼの比率（ColH/ColG）が膵島分離に与える影響
ラットの膵島分離に使用する２種類のコラゲナーゼの比率（ColH/ColG）を0、0.05、0.1、0.2、0.4と変えて、膵島分離を行った。その結果、収量及び品質を示すATP/DNA、in vitro糖負荷試験及びInsulin/DNA実験において、コラゲナーゼ比率が、0.1から0.2の範囲において、高収量で高品質な膵島を分離できることが確認できた。
図１４に結果を示す。Ａは収量を示す。ＢのATP/DNAは、膵島自身が持つエネルギーチャージ(ATP)を膵島の大きさ(DNA)で補正した値である。Ｃのin vitro糖負荷試験は、グルコースに対する膵島のインスリン放出能力を示すもので、膵島の予備機能を反映している。ＤのInsulin/DNAは、膵島自身が持つインスリン量を膵島の大きさ(DNA)で補正したものであるが、試薬等に膵島への毒性があると、膵島の脱顆粒が起こることがしばしば認められるため、膵島の毒性試験の一つと位置づけられる。
膵島分離用酵素の組成としてはClostridium histolyticumの生産する２種のコラゲナーゼ(ColG及びColH)と、１種の中性金属プロテアーゼが最適であることがこれまでに報告がある(Diabetes:46:1120:1997)。上記の結果は、２種のコラゲナーゼタイプ(ColG及びColH)の組成比率が膵島分離の収量及び品質を決定する重要因子であることを示す。
最適コラゲナーゼ比率は、ラット以外の動物、ブタ、ヒトにおいて、また、同じ種でも異なり、膵島分離の成功率を低下させる一つの要因になっている。それゆえ、本発明のプローブを用いて、膵島を分離する前に、予め、使用するコラゲナーゼの最適比率を測定すれば、使用すべきコラゲナーゼの使用量を算出し、最適比率で膵島分離を行うことが可能となり、高収量で高品質の膵島を取得することが可能となる。
本発明によれば、分離すべき細胞外マトリックスもしくは臓器のタンパク質組成から、使用するタンパク質分解酵素の種類や量を正確かつ簡便に知ることができ、目的の細胞等を高活性の状態で、単離することができる。よって、本発明は、膵島移植等の臓器移植、細胞移植による再生医療、細胞株の樹立を含む、治療、診断及び検査等の幅広い用途に有用である。
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
配列番号３：オリゴDNA
配列番号４：オリゴDNA
配列番号５：ColGCBD用フォワ−ドプライマー (プライマー1)
配列番号６：ColGCBD用リバースプライマー (プライマー2)
配列番号７：EGFP用フォワ−ドプライマー (プライマー3)
配列番号８：EGFP用リバースプライマー (プライマー4)
配列番号９：EGFP-ColGCBD
配列番号１０：EGFP-ColGCBD
配列番号１１：オリゴDNA
配列番号１２：オリゴDNA
配列番号１３：ColHCBD用フォワ−ドプライマー (プライマー5)
配列番号１４：ColHCBD用リバースプライマー (プライマー6)
配列番号１５：DsRed用フォワ−ドプライマー (プライマー7)
配列番号１６：DsRed用リバースプライマー (プライマー8)
配列番号１７：DsRed-ColHCBD
配列番号１８：DsRed-ColHCBD
配列番号１９：tdTomato遺伝子増幅用フォワ−ドプライマー（TomatoF）
配列番号２０：tdTomato遺伝子増幅用リバースプライマー（TomatoR）

Claims (20)

  1. 特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質について、前記生体成分結合ドメインをそれぞれ含む２種以上のプローブを単離された生体組織に適用し、前記各プローブの生体組織に対する結合量を解析することを特徴とする、生体組織の分析方法。
  2. プローブが、蛍光分子、発光分子、及びポジトロン核種を含む放射性同位体から選ばれる可視化分子によってラベルされていることを特徴とする、請求項１記載の方法。
  3. 可視化分子として、GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、及びRFPからなる群より選ばれる蛍光分子、及び/又はルシフェラーゼタンパク質を含む、請求項１又は２記載の方法。
  4. 生体成分結合ドメインと可視化分子が融合タンパク質を構成している、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 生体成分結合ドメインが酵素あるいは酵素の一部である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 生体成分結合ドメインがタンパク質分解酵素のコラーゲン結合ドメインである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  7. ２種以上のプローブを別々又は同時に生体組織に作用させ、各プローブの結合量を別々又は同時に測定することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ２種以上のプローブを同時に生体組織に作用させ、各プローブの結合量を同時に測定することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 生体組織からの細胞又は細胞集団の分離方法であって、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法を用いて生体組織を分析し、前記分析結果に基づいて酵素の量比を決定し、前記量比の酵素を生体組織に適用して細胞又は細胞集団を分離することを特徴とする方法。
  10. 特定の生体成分に結合する２種以上のタンパク質について、前記生体成分結合ドメインをそれぞれ含む２種類以上のプローブからなる生体組織分析用プローブセットであって、各プローブが、それぞれ異なる蛍光分子、発光分子、及びポジトロン核種を含む放射性同位体から選ばれる可視化分子を含むことを特徴とするプローブセット。
  11. 可視化分子として、GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、及びRFPからなる群より選ばれる蛍光タンパク質及び/又はルシフェラーゼタンパク質を含む、請求項１０記載のプローブセット。
  12. 前記ルシフェラーゼタンパク質が、野生型ルシフェラーゼと異なるピーク波長及び発光強度を有する、請求項１０又は１１記載のプローブセット。
  13. 生体成分結合ドメインと可視化分子が融合タンパク質を構成している、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載のプローブセット。
  14. 生体成分結合ドメインがタンパク質分解酵素のコラーゲン結合ドメインである、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. コラーゲン結合ドメインが、クロストリジウム属（Clostridium）由来のコラゲナーゼ群より選ばれるコラゲナーゼのコラーゲン結合ドメインである、請求項１４記載のプローブセット。
  16. コラーゲン結合ドメインが、ヒストリチクス菌（Clostridium histryticum）由来のコラゲナーゼＧ及びコラゲナーゼＨのコラーゲン結合ドメインである、請求項１５記載のプローブセット。
  17. コラーゲン結合ドメインが、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号２に示されるアミノ酸配列、又はその部分配列を含むものである、請求項１６記載のプローブセット。
  18. ルシフェラーゼタンパク質が、GFP、EGFP、YFP、BFP、CFP、DsRED、tdTomato、及びRFPからなる群より選ばれる蛍光分子とリンカーを介して連結されている、請求項１０〜１７のいずれか１項に記載のプローブセット。
  19. 前記プローブが、生体成分結合ドメインを１〜２０回繰り返し含むものである、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載のプローブセット。
  20. 請求項１０〜１９のいずれか１項に記載のプローブセットと酵素とを含む、生体組織分離用キット。
JP2013504573A 2011-03-16 2012-03-15 生体組織分析用プローブ及びその利用法 Expired - Fee Related JP5997131B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011058080 2011-03-16
JP2011058080 2011-03-16
PCT/JP2012/001814 WO2012124338A1 (ja) 2011-03-16 2012-03-15 生体組織分析用プローブ及びその利用法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2012124338A1 true JPWO2012124338A1 (ja) 2014-07-17
JP5997131B2 JP5997131B2 (ja) 2016-09-28

Family

ID=46830421

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2013504573A Expired - Fee Related JP5997131B2 (ja) 2011-03-16 2012-03-15 生体組織分析用プローブ及びその利用法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9354240B2 (ja)
EP (1) EP2687847B1 (ja)
JP (1) JP5997131B2 (ja)
KR (1) KR101921353B1 (ja)
CN (1) CN103562719B (ja)
AU (1) AU2012227790C1 (ja)
CA (1) CA2830140C (ja)
DK (1) DK2687847T3 (ja)
ES (1) ES2726530T3 (ja)
WO (1) WO2012124338A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11959838B2 (en) 2015-11-06 2024-04-16 Ventana Medical Systems, Inc. Representative diagnostics

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3391899T3 (da) 2011-12-14 2020-08-24 Univ Arkansas Afgivelse af terapeutiske midler ved hjælp af et kollagenbindende protein
WO2014119334A1 (ja) * 2013-02-01 2014-08-07 国立大学法人東北大学 生体組織からの細胞の分離方法
US11624060B2 (en) 2017-02-10 2023-04-11 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Collagen-binding agent compositions and methods of using the same
US11697679B2 (en) 2017-11-14 2023-07-11 University Of Tsukuba Modified collagen protein and application of same

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002159297A (ja) * 2000-11-29 2002-06-04 National Institute Of Infectious Diseases プロテアーゼ活性の測定方法
JP2005521408A (ja) * 2002-03-28 2005-07-21 デュアルシステムズ バイオテク アーゲー 膜タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法およびキット
JP2006145545A (ja) * 1996-12-12 2006-06-08 Prolume Ltd 感染性物質を検出及び同定するための方法及び装置
JP2009077714A (ja) * 2002-07-03 2009-04-16 Board Of Trustees Of The Univ Of Illinois 腫瘍老化遺伝子の発現を同定および調節するための試薬および方法
WO2010058707A1 (ja) * 2008-11-19 2010-05-27 明治製菓株式会社 アフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼおよびその製造法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0766733A4 (en) 1994-06-24 1998-06-10 Boehringer Mannheim Corp GET A CLEAN MIX OF COLLAGENASE AND TWO OTHER PROTEASES FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTICUM
US5830741A (en) 1996-12-06 1998-11-03 Boehringer Mannheim Corporation Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease
AU2137101A (en) 1999-12-22 2001-07-03 Biosignal Packard Inc. A bioluminescence resonance energy transfer (bret) fusion molecule and method ofuse
EP1314780A4 (en) 2000-08-15 2004-07-28 Terumo Corp Collagen-binding hybrid polypeptides
FR2836475B1 (fr) 2002-02-26 2007-02-23 Aventis Pharma Sa Procede de detection de ligands du recepteur de la leptine
JPWO2004022600A1 (ja) 2002-09-06 2005-12-22 独立行政法人産業技術総合研究所 分泌型又は膜結合型キメラ蛋白質
EP1580196B1 (en) 2002-12-12 2010-08-04 Japan Science And Technology Agency Monitor protein for measuring processing of protein
FR2850971B1 (fr) 2003-02-10 2006-08-11 Aventis Pharma Sa Oligonucleotide antisens inhibant l'expression de la proteine ob-rgrp et procede de detection de composes modifiant l'interaction entre la famille de la proteine ob-rgrp et le recepteur de la leptine
CN1761749A (zh) 2003-03-10 2006-04-19 独立行政法人科学技术振兴机构 检测间充质干细胞的标记和采用该标记识别间充质干细胞的方法
US7906276B2 (en) 2004-06-30 2011-03-15 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Enzymatic detection techniques
JP5283105B2 (ja) 2006-10-13 2013-09-04 独立行政法人産業技術総合研究所 高いエネルギー移動効率を有するｂｒｅｔ発現系
JP5449936B2 (ja) 2009-09-14 2014-03-19 山陽特殊製鋼株式会社 耐摩耗性、潤滑性に優れるＣｏ基合金とその製造法およびその焼結体

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006145545A (ja) * 1996-12-12 2006-06-08 Prolume Ltd 感染性物質を検出及び同定するための方法及び装置
JP2002159297A (ja) * 2000-11-29 2002-06-04 National Institute Of Infectious Diseases プロテアーゼ活性の測定方法
JP2005521408A (ja) * 2002-03-28 2005-07-21 デュアルシステムズ バイオテク アーゲー 膜タンパク質−タンパク質相互作用を検出する方法およびキット
JP2009077714A (ja) * 2002-07-03 2009-04-16 Board Of Trustees Of The Univ Of Illinois 腫瘍老化遺伝子の発現を同定および調節するための試薬および方法
WO2010058707A1 (ja) * 2008-11-19 2010-05-27 明治製菓株式会社 アフィニティタグが結合した融合コラゲナーゼおよびその製造法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KRAHN KN, BOUTEN CV, VAN TUIJL S, VAN ZANDVOORT MA, MERKX M.: "Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues", ANAL BIOCHEM., vol. 350, no. 2, JPN6016001338, 2006, pages 177 - 185, XP024942444, ISSN: 0003237058, DOI: 10.1016/j.ab.2006.01.013 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11959838B2 (en) 2015-11-06 2024-04-16 Ventana Medical Systems, Inc. Representative diagnostics

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140008411A (ko) 2014-01-21
NZ614600A (en) 2015-02-27
AU2012227790B2 (en) 2016-03-03
WO2012124338A1 (ja) 2012-09-20
US9354240B2 (en) 2016-05-31
CN103562719B (zh) 2016-01-13
EP2687847B1 (en) 2019-03-06
US20130345087A1 (en) 2013-12-26
CA2830140C (en) 2019-08-06
DK2687847T3 (en) 2019-04-15
CA2830140A1 (en) 2012-09-20
ES2726530T3 (es) 2019-10-07
AU2012227790A1 (en) 2013-09-12
KR101921353B1 (ko) 2018-11-23
CN103562719A (zh) 2014-02-05
JP5997131B2 (ja) 2016-09-28
EP2687847A4 (en) 2015-07-08
EP2687847A1 (en) 2014-01-22
AU2012227790C1 (en) 2016-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11951186B2 (en) Indicator compounds, devices comprising indicator compounds, and methods of making and using the same
Yu et al. An improved monomeric infrared fluorescent protein for neuronal and tumour brain imaging
JP5997131B2 (ja) 生体組織分析用プローブ及びその利用法
Filonov et al. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging
US9518103B2 (en) Optogenetic probes for measuring membrane potential
JP6444856B2 (ja) 蛍光特性を示す新規なポリペプチド、およびその利用
Su et al. Intracellular delivery of luciferase with fluorescent nanodiamonds for dual-modality imaging of human stem cells
US20150225467A1 (en) Novel far red fluorescent protein
EP1109931A1 (en) METHOD FOR STUDYING PROTEIN INTERACTIONS $i(IN VIVO)
CN107106707A (zh) 用于体外和体内检测革兰氏阴性细菌的分子探针
JP2011211983A (ja) タンパク質分子対、タンパク質分子対をコードする遺伝子および遺伝子導入ベクターとタンパク質分子対を産生する細胞
WO2019098246A1 (ja) 改変されたコラーゲンタンパク質およびその用途
EP3037534A1 (en) Polypeptide exhibiting fluorescent properties, and utilization of same
Wang et al. Artificial Lipid Biomembranes for Full‐Length SARS‐CoV‐2 Receptor
NZ614600B2 (en) Probe for analyzing biological tissue and method for utilizing same
Kagiya et al. Real-time visualization of intratumoral necrosis using split-luciferase reconstitution by protein trans-splicing
EP1772463A1 (en) Pleckstrin-based fusion protein and method for monitoring of enzyme activities by FRET
JP5669080B2 (ja) 特定部位のアミノ酸を置換した緑色蛍光蛋白質またはそのホモログを用いたカルシウムセンサー蛋白質
TW201118169A (en) Mutant blue fluorescent protein and method of using the same for fluorescence resonance energy transfer and blue fluorescent fish

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20150130

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20150130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20160119

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20160303

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20160809

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20160825

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5997131

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees