ES2726530T3 - Sonda para analizar tejido biológico y método para utilizar la misma - Google Patents

Abstract

Método para analizar un tejido biológico, que comprende aplicar dos o más sondas respectivamente, conteniendo cada una un dominio de unión a sustrato de una proteasa a través del cual dicha proteasa se une a proteínas de la matriz intercelular de un componente biológico predeterminado, a un tejido biológico aislado y analizar las cantidades de unión de las sondas al tejido biológico; en el que las sondas se marcan con una molécula de visualización.

Description

DESCRIPCIÓN

Sonda para analizar tejido biológico y método para utilizar la misma

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para obtener células o poblaciones de células que tienen una alta actividad biológica con alto rendimiento de un tejido biológico mediante aislamiento enzimático, y a sondas para el método.

Técnica anterior

El aislamiento enzimático de células y agrupaciones de células a partir de tejido biológico es útil para diversos propósitos incluyendo trasplante de las células y establecimiento de cepas celulares y en una amplia variedad de usos en los campos de terapia, diagnóstico y examen. Sin embargo, para disociar un tejido biológico y aislar células o agregados de células que constituyen el tejido, es necesario separar las células o los agregados celulares hasta un nivel deseado y aislarlos del tejido celular. Al separar las células y agrupaciones de células de un tejido biológico, la matriz intercelular se degrada mediante una mezcla de proteasas tales como colagenasa.

Un tejido biológico está constituido por células y la matriz intercelular. La matriz intercelular, que es una sustancia para anclar las células, incluye materiales estructurales y materiales no estructurales. Los primeros incluyen fibras tales como una fibra colágena, una fibra elástica y una fibra reticular; mientras que los últimos incluyen las denominadas sustancias de base formadas por materiales de sol o gel tales como una glicoproteína y proteoglicano, para rellenar el espacio entre las fibras. Un ejemplo típico de la matriz intercelular es una proteína denominada colágeno, que ocupa aproximadamente 1/3 del peso de las proteínas totales en un organismo vivo. El colágeno tiene una estructura fibrosa, que se denomina formalmente fibra de colágeno.

Los tejidos se clasifican a grandes rasgos en cuatro categorías: el tejido epitelial, el tejido de soporte, el tejido muscular y el tejido nervioso. El tejido epitelial es el tejido que cubre la superficie del cuerpo, en el que las células se disponen densamente sin matriz intercelular entre ellas. El tejido de soporte, que funciona para el soporte de órganos, células y similares, incluye el tejido conjuntivo, el tejido de cartílago, el tejido óseo, la sangre y la linfa. El tejido muscular es una integración de células diferenciadas para el propósito de movimiento de contracción, en el que la matriz intercelular ocupa una razón extremadamente baja.

El tejido muscular está constituido por células musculares, tejido conjuntivo, vasos sanguíneos y nervios; sin embargo, está formado principalmente por fibras musculares. El tejido nervioso está constituido principalmente por el endoneuro y el perineuro, que contienen cada uno una gran cantidad de matriz intercelular (colágeno). El tejido conjuntivo, que es una clase de tejido de soporte, está constituido por tejido adiposo y tejido conjuntivo fibroso (constituido por fibras de colágeno y fibras elásticas) y se divide a grandes rasgos en tejido conjuntivo hidrófobo y tejido conjuntivo denso. El tejido conjuntivo hidrófobo es tejido conjuntivo fibroso que tiene fibras de colágeno dispuestas irregularmente en el mismo y distribuidas en el tejido subcutáneo, tejido mucoso, nervios, membrana externa de vasos sanguíneos y tejido interlobular.

El contenido de colágeno en la matriz intercelular varía dependiendo de la especie, la edad, el sexo, el tejido y el entorno en que se vive. Sin embargo, aún no se ha dilucidado suficientemente qué tipo de colágeno está incluido en qué tejido y en qué estado de la matriz y en qué cantidad. La característica del colágeno reside en que los aminoácidos que constituyen una cadena peptídica de una proteína tienen una estructura primaria en la que aparece repetidamente glicina cada tercer residuo como “glicina-aminoácido X-aminoácido Y”. Se ha notificado que hay aproximadamente más de 30 tipos de proteínas de colágeno en el cuerpo humano. El colágeno presente más abundantemente en el cuerpo es colágeno tipo I fibroso. El colágeno tipo IV no fibroso también está contenido abundantemente y conectado mutuamente por medio de un enlace disulfuro intermolecular, que contribuye a la formación de un tejido reticular (documento no de patente 1). Se notifica que el colágeno tipo IV está presente entre los islotes pancreáticos y el tejido endocrino (documentos no de patente 2 y 3).

Puede ser teóricamente posible determinar la presencia de un tipo predeterminado de colágeno en una matriz diana mediante inmunotinción usando anticuerpos contra tipos de colágenos individuales. Sin embargo, están presentes muchos tipos de colágenos en una amplia variedad de tipos de animales multicelulares. Por tanto, es difícil producir anticuerpos contra colágenos. Esto hecho supone un obstáculo y hace difícil realizar la determinación de colágeno mediante inmunotinción.

Las enzimas que degradan el tejido, es decir, diversos tipos de colagenasas en bruto derivadas de Clostridium histolyticum, contienen no solo dos tipos de colagenasas sino también diversos tipos de proteasas (que tienen actividad de degradación de colágeno y actividad de degradación de proteínas no específicas) y componentes distintos de proteasas (por ejemplo, fosfolipasa). En virtud de la colagenasa en bruto, se separan enzimáticamente células y poblaciones de células de un tejido biológico.

En la separación enzimática de células individuales o poblaciones de células de un tejido biológico, se notifica que dos tipos de colagenasas (ColG y ColH) tienen papeles importantes en el logro del rendimiento y el mantenimiento de la actividad biológica de las células y poblaciones de células que van a separarse, y por tanto la razón cuantitativa de las mismas tiene un efecto significativo sobre el rendimiento y la actividad (documento no de patente 4). Además, en la separación de islotes pancreáticos del tejido pancreático, se usan dos tipos de colagenasas producidas por Clostridium histolyticum (documento no de patente 5, documentos de patente 1 y 2). Los presentes inventores han encontrado hasta ahora que pueden separarse islotes pancreáticos con alta calidad optimizando la razón cuantitativa de los dos tipos de colagenasas.

Se ha notificado que diferentes colagenasas tienen dominios de unión a colágeno mutuamente diferentes (documento no de patente 6). Hasta el presente, se han preparado diversas proteínas de fusión formadas por una proteína funcional y un dominio de unión a colágeno para sistemas de direccionamiento y administración (DDS). Los ejemplos de los mismos incluyen un factor de crecimiento celular que puede unirse a colágeno (documento no de patente 7) preparado uniendo bFGF o EGF a un dominio de unión a colágeno de una colagenasa derivada de Clostridium histolyticum; una proteína de fusión formada por decapéptido de unión a colágeno derivado de factor de von Willebrand y TGF-p (documentos no de patente 8 y 9); y un agente de suministro de factor de crecimiento celular de liberación sostenida (documento de patente 3) preparado uniendo un péptido funcional a un dominio de unión a colágeno de fibronectina. Tal como se describió anteriormente, se han preparado proteínas de fusión con un dominio de unión a colágeno para la selección como diana y visualización de tejidos; sin embargo, nunca se han usado para el análisis y la separación de un tejido biológico.

Con el fin de aislar un tejido específico y células sin dañarlas, es necesario degradar la matriz intercelular presente alrededor del tejido y las células. Sin embargo, no resulta fácil degradar la matriz intercelular sola sin degradar y dañar la superficie de las células deseadas. Particularmente, en el caso de un órgano humano, la degradabilidad proteolítica varía dependiendo de, por ejemplo, la edad, el sexo, el hábito y los antecedentes patológicos. Por tanto, el aislamiento tiene que realizarse empíricamente determinando el tipo de enzima y el tiempo de reacción de la misma.

A los pacientes diabéticos se les aplica una terapia (trasplante de islotes pancreáticos) para trasplantar islotes pancreáticos aislados del páncreas. Para el trasplante de islotes pancreáticos, es esencial separar grupos de células denominados islotes pancreáticos presentes en el tejido pancreático. El tejido pancreático debe degradarse sin producir ningún daño en los islotes pancreáticos para separarlos. Sin embargo, el estado de la matriz intercelular varía significativamente dependiendo del tipo de animal, el sitio del tejido, la edad o el sexo de un organismo individual y entorno de crecimiento. Particularmente, las propiedades físicas del colágeno cambian significativamente dependiendo de la edad. No obstante, para tejidos pancreáticos en estado diferente, se aplica una razón cuantitativa predeterminada de enzimas según un protocolo (excepto porque se cambia el tiempo de degradación solo) y se realiza un tratamiento enzimático al tiempo que se comprueba visualmente el grado de degradación del páncreas. Por este motivo, la cantidad y calidad de los islotes pancreáticos así obtenidos varían dependiendo de la institución médica, los profesionales médicos y el estado del páncreas diana.

Si el tipo y la cantidad de proteasa que va a usarse pueden determinarse de manera precisa y fácil a partir de la composición de proteínas de la matriz extracelular u órgano que va a degradarse, pueden aislarse células diana y similares al tiempo que se mantiene una alta actividad.

Lista de menciones

Documentos de patente

Documento de patente 1: WO96/00283

Documento de patente 2: WO98/24889

Documento de patente 3: WO02/014505

Documentos no de patente

Documento no de patente 1: Inoue et al., J Cell Biol, 97, 1524-1537 (1983)

Documento no de patente 2: SJ Hughes, P McShane, Transplant Proceedings, 37, 3444-34445 (2005)

Documento no de patente 3: SJ Hughes, A Clark, P McShane, Transplantation, 81(3) 423-426 (2006)

Documento no de patente 4: D Brandhorst et al., Transplantation Proceedings, 37(8), 3450-3451 (2005)

Documento no de patente 5: E Linetsky et al., Diabetes, 46, 1120-1123 (1997)

Documento no de patente 6: K Watanabe, Appl Microbiol Biotechnol, 63, 520-526 (2004)

Documento no de patente 7: N Nishi, O Matsushita, K Yuube, H Miyanaka, A Okabe, F Wada, Proc Natl Acad Sci USA.; 95(12):7018-7023 (1998)

Documento no de patente 8: Tuan et al., Connective Tissue Research, 34(1), 1-9 (1996)

Documento no de patente 9: Han et al., Protein Expression and Purification 11, 169-178 (1997)

Krahn et al., Analytical Biochemistry 350 (2006), 177-185 se refiere a “proteínas de unión a colágeno marcadas fluorescentemente que permiten la visualización específica de colágeno en tejidos y cultivo de células vivas”.

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un medio para separar rápida y eficazmente células y poblaciones de células que tienen una alta actividad biológica de un tejido biológico; más específicamente, para obtener células diana y poblaciones de células con alto rendimiento sin disminuir la actividad fisiológica de sustancias fisiológicamente activas en un tejido biológico, células o/y órganos.

Solución al problema

Los inventores prepararon sondas para analizar componentes biológicos usando proteínas de fusión de dominios de unión a sustrato (dominios de unión a componentes biológicos) que tienen dos tipos de enzimas, y proteínas de visualización. Los inventores encontraron que pueden separarse más eficazmente células diana y poblaciones de células al tiempo que se mantiene una alta actividad biológica analizando las cantidades de unión de sondas y prediciendo la acción de la enzima en un tejido biológico, determinando de ese modo, por ejemplo, una razón cuantitativa óptima de enzimas y tiempo de acción.

En resumen, la presente invención se refiere a un método para analizar un tejido biológico, que incluye aplicar dos o más sondas que contienen respectivamente un dominio de unión a sustrato de una proteasa a través del cual dos o más proteínas se unen a un componente biológico específico, a un tejido biológico aislado y analizar las cantidades de unión de las sondas al tejido biológico, en el que las sondas se marcan con una molécula de visualización.

Las sondas que van a usarse en la presente invención están diseñadas para visualizarse mediante una técnica de obtención de imágenes de moléculas conocida en la técnica. Más específicamente, las sondas se marcan con moléculas de visualización tales como una molécula fluorescente, una molécula luminiscente, un núclido positrónico y un radioisótopo.

Los ejemplos de las moléculas de visualización incluyen moléculas fluorescentes tales como GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato y RFP, y moléculas luminiscentes tales como una proteína luciferasa, pero no se limitan a estas. La proteína luciferasa tiene preferiblemente una longitud de onda pico y una intensidad luminiscente diferentes de las de una luciferasa de tipo natural presente en la naturaleza.

Una molécula fluorescente y una molécula luminiscente pueden usarse solas. Alternativamente, una molécula fluorescente (proteína receptora de energía) puede usarse en combinación con una molécula autoluminiscente (proteína generadora de energía) tal como luciferasa. En este caso, ambas moléculas están unidas preferiblemente entre sí con un ligador apropiado interpuesto entre ellas.

Como dominio de unión a componentes biológicos que va a usarse en una sonda, pueden mencionarse un dominio de unión de una proteasa o un dominio de unión a colágeno de una proteína in vivo tal como fibronectina. Los ejemplos específicos del primero incluyen un dominio de unión a colágeno que tiene la colagenasa derivada de Clostridium, tal como dominios de unión a colágeno de colagenasa G y colagenasa H derivadas de Clostridium histolyticum.

Obsérvese que el dominio de unión a colágeno que va a usarse en una sonda puede ser una parte del dominio (secuencia parcial) siempre que puedan lograrse el objeto y efecto de la presente invención. Una parte del dominio de unión a colágeno de este tipo se incluye en el término de “dominio de unión a colágeno”.

Las secuencias de aminoácidos de dominios de unión a colágeno de colagenasa G y colagenasa H derivadas de Clostridium histolyticum, que son ejemplos específicos del dominio de unión a sustrato que va a usarse en la presente invención, se describen en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2.

Cuando la molécula de visualización es una proteína, puede fusionarse un dominio de unión a componentes biológicos con la molécula de visualización (proteína) y usarse como proteína de fusión.

En una sonda, la secuencia de un dominio de unión a componentes biológicos se repite de 1 a 100 veces, y preferiblemente de 1 a 20 veces.

En el método de análisis de la presente invención, dos o más sondas pueden aplicarse por separado o simultáneamente a un tejido biológico. Además, las cantidades de unión de sondas individuales pueden medirse por separado o simultáneamente. Preferiblemente, dos o más sondas se marcan con moléculas de visualización diferentes y se aplican simultáneamente, y las cantidades de unión de las mismas se miden simultáneamente.

La presente divulgación también proporciona un método para separar células o poblaciones de células de un tejido biológico mediante el método de análisis de la presente invención. El método de separación de la presente invención se caracteriza por el análisis de un tejido biológico mediante el método de análisis anterior, la determinación de la razón cuantitativa de enzimas (enzimas a partir de las cuales se derivan los dominios de unión a sustrato contenidos en las sondas) basándose en los resultados del análisis y la aplicación de las enzimas en la razón cuantitativa al tejido biológico, separando de ese modo células diana o poblaciones de células.

La presente invención proporciona además un conjunto de sondas para analizar un tejido biológico, constituido por las dos o más sondas mencionadas anteriormente, y un kit de separación de tejidos biológicos que contiene, por ejemplo, el conjunto de sondas y enzimas.

Efectos ventajosos de la invención

Cada una de las sondas que van a usarse en la presente invención contiene un dominio de unión a componentes biológicos. Se une específicamente a sitios de unión de una enzima predeterminada en un tejido biológico y emite fluorescencia o luminiscencia. Basándose en la observación de fluorescencia o luminiscencia emitida a partir de cada una de las sondas correspondientes a la enzima predeterminada, puede analizarse la afinidad de la enzima por un tejido biológico y las acciones de la enzima. Para describirlo más específicamente, se incuban sondas junto con una pequeña cantidad de trozos congelados de un tejido diana para teñirlos. Los estados de unión de las sondas se analizan basándose en el tono de color e intensidad fluorescente en los trozos de tejido. Basándose en el análisis, pueden obtenerse informáticamente la razón cuantitativa y tiempo de acción de las enzimas adecuadas para la degradación.

Más específicamente, según la presente invención, el tipo y la cantidad de proteasa que va a usarse puede determinarse de manera precisa y fácil basándose en las propiedades de unión de sondas a la matriz extracelular o de la proteína de un tejido que va a separarse. De esta manera, pueden aislarse células diana y poblaciones de células de manera rápida y fácil de un tejido biológico al tiempo que se mantiene una alta actividad. Por ejemplo, en el caso del trasplante de islotes pancreáticos, puede realizarse un tratamiento enzimático según el estado del tejido pancreático diana, y puede establecerse la indexación del estado de un tejido pancreático para lograr la separación de islotes pancreáticos de alta calidad de manera constante en una gran cantidad.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra las constituciones de (A) CBD de ColG y (B) CBD de ColH.

[Figura 2] La figura 2 muestra una vista esquemática de la secuencia de tdTomato CBD de ColH.

[Figura 3] La figura 3 muestra la SDS-PAGE de la fracción de elución de Ni-NTA.

[Figura 4] La figura 4 muestra la SDS-PAGE de fracción de elución de cromatografía de intercambio aniónico.

[Figura 5] La figura 5 muestra los espectros fluorescentes y de excitación de tdTomato CBD de ColH.

[Figura 6] La figura 6 muestra vistas esquemáticas de los cebadores usados para la amplificación de un gen de luciferasa y un gen de CBD.

[Figura 7] La figura 7 muestra plásmidos de expresión de proteína de fusión de dominio de unión a colágenoluciferasa.

[Figura 8] La figura 8 muestra la detección de la expresión de la proteína de sonda (SDS-PAGE).

[Figura 9] La figura 9 muestra la detección de luminiscencia de luciferasa (espectro luminiscente y un cambio de intensidad de luz a 550 nm con el tiempo).

[Figura 10] La figura 10 muestra la SDS-PAGE de la fracción de elución de columna de agarosa Ni-NTA (M: marcador proteico, S: PGV_CBD de ColH en bruto, FT: fracción no retenida, de 50 a 500 mM: fracción de elución de imidazol a concentraciones individuales (la primera fracción de elución de imidazol 200 mM se usó como disolución enzimática purificada)).

[Figura 11] La figura 11 muestra un experimento de confirmación para la unión a un trozo de tejido pancreático. [Figura 12] La figura 12 muestra los resultados del análisis de componentes de un trozo de páncreas porcino mediante sonda de EGFP-CBD de ColG.

[Figura 13] La figura 13 muestra la razón de brillo fluorescente de GFP CBD de ColG y tdTomato CBD de ColH en un trozo de tejido de rata (H/G: razón de brillo fluorescente de tdTomato CBD de ColH en relación con GFP CBD de ColG, W: rata Wister-Furth, L: rata Lewis, SD: rata SD).

[Figura 14] La figura 14 muestra el efecto de la diferencia en la razón de composición de colagenasas G y H sobre la cantidad y calidad de los islotes pancreáticos (A: rendimiento, B: ATP/ADN, C: prueba de tolerancia a hidratos de carbono in vitro, D: insulina/ADN).

Descripción de realizaciones

1. Método de análisis para tejido biológico

En la presente invención, se usan dos o más sondas que contienen respectivamente dominios de unión a componentes biológicos a través de los cuales se unen dos o más proteínas a un componente biológico predeterminado para analizar las cantidades de unión (afinidad) de un tejido biológico a las sondas. Los resultados se aplican a la degradación del tejido biológico y el aislamiento de células y poblaciones de células.

En el presente documento, las “dos o más proteínas que se unen a un componente biológico específico predeterminado” se refieren a proteínas de la matriz intercelular tales como fibronectina e integrina, y a enzimas tales como una proteasa. Estas proteínas tienen cada una un sitio (dominio) que se une específicamente al ligando y sustrato correspondiente. El sitio se describirá como “un dominio de unión a componente biológico” en la memoria descriptiva.

En el aislamiento de células y poblaciones de células de un tejido biológico, en la mayoría de los casos, se usan habitualmente una pluralidad de enzimas. Sin embargo, la acción de cada enzima (sensibilidad de un tejido) varía significativamente dependiendo del sitio y estado del tejido biológico al que va a aplicarse la enzima. Por tanto, para separar rápida y eficazmente células diana y poblaciones de células al tiempo que se mantiene una alta actividad biológica, se determinan deseablemente de antemano el consumo óptimo, razón de uso, tiempo de acción de la enzima y otros. Las sondas de la presente invención permiten una fácil determinación del consumo óptimo, razón de uso y tiempo de acción de la enzima de este tipo.

El “tejido biológico” diana que va a usarse en la presente invención no está particularmente limitado, e incluye una amplia variedad de tejidos de animales multicelulares (por ejemplo, mamíferos, aves, reptiles y peces) tales como hígado, páncreas, riñón, tejido de regazo del diente, hígado, páncreas, piel, cartílago, hueso y tejido nervioso. Además, no solo se incluyen tejidos aislados de un organismo vivo sino que también se incluyen tejidos construidos artificialmente, tales como tejido de células ES y un tejido de células de fibroblastos que sirve como material para células iPS.

La presente invención emplea “dos o más sondas” que contienen respectivamente dominios de unión a componentes biológicos (por ejemplo, diferentes sitios de unión a enzima-sustrato) a través de los cuales dos o más proteínas se unen a un componente biológico predeterminado. Los dominios de unión a componentes biológicos que van a usarse en las sondas se seleccionan apropiadamente dependiendo del propósito del análisis.

Por ejemplo, en el análisis de un tejido biológico antes de la digestión enzimática (degradación) del tejido biológico y la separación de células y poblaciones de células, se usan sondas que comprenden un dominio de unión a sustrato de la proteasa que va a usarse para tal digestión enzimática y separación de células.

Los ejemplos de la proteasa que va a usarse en la degradación de un tejido incluyen colagenasa, tripsina, quimotripsina, dispasa, elastasa, papaína, pronasa, termolisina, subtilisina, bromelaína, fitina y termitasa. Los ejemplos de colagenasa incluyen particularmente colagenasa G y colagenasa H derivadas de Clostridium histolyticum, colagenasa derivada de Actinomyces y colagenasa derivada de Clostridium perfringens. La mayoría de las estructuras primarias de los sitios de unión a sustrato de estas enzimas ya se han analizado. Usando la información estructural, los expertos en la técnica pueden diseñar una sonda.

La sonda unida a un tejido biológico se visualiza mediante una técnica de obtención de imágenes moleculares conocida en la técnica. Debido a la visualización, la cantidad de unión de la sonda puede determinarse fácilmente sin dañar el tejido. La sonda se marca mediante una molécula de visualización apropiada tal como una molécula fluorescente, una molécula luminiscente y un radioisótopo tal como un núclido positrónico. En la siguiente sección se describirá más específicamente cómo diseñar una sonda.

Dos o más sondas pueden aplicarse por separado o simultáneamente a un tejido biológico. Además, las cantidades de unión de las sondas pueden medirse por separado o simultáneamente. Sin embargo, en vista de una medición rápida y simple, es preferible que dos o más sondas se marquen con diferentes moléculas de visualización y se apliquen simultáneamente a un tejido biológico, y que las cantidades de unión de las mismas se midan simultáneamente.

En la presente invención, las dos o más sondas mencionadas anteriormente se aplican un tejido biológico aislado, y las cantidades de unión (afinidad) de las sondas al tejido biológico se analizan. Los resultados se aplican a la degradación de un tejido biológico y al aislamiento de células y poblaciones de células. Para describir más específicamente, mediante el análisis se obtiene la razón de cantidad de unión de dos o más sondas a un tejido biológico. Basándose en la razón de cantidad de unión, se determina la razón cuantitativa óptima de enzimas que van a usarse para la degradación del tejido biológico y el aislamiento de células y poblaciones de células. La razón de unión de las sondas tiene una correlación con la razón cuantitativa de enzimas. Cuanto mayor es la razón de unión, mayor es la razón cuantitativa óptima de enzimas. Sin embargo, puesto que las enzimas difieren mutuamente en el número de unidades, título (unidad de eficacia/mg), temperatura óptima, pH óptimo y tiempo de acción, la razón cuantitativa de las enzimas que van a usarse se determina finalmente considerando de manera exhaustiva estos factores y la razón de unión de sondas. Si la razón de unión de sondas puede obtenerse mediante la presente invención, los expertos en la técnica pueden determinar una razón cuantitativa óptima de este tipo.

2. Conjunto de sondas para el análisis de tejido biológico

El conjunto de sondas de la presente invención está constituido por dos o más sondas. Cada una de las sondas contiene un dominio de unión a componentes biológicos diferente (uno de los dominios de unión a componentes biológicos de dos o más proteínas que se unen a un componente biológico predeterminado) y una molécula de visualización seleccionada de una molécula fluorescente, una molécula luminiscente y un radioisótopo incluyendo un núclido positrónico.

El dominio de unión a sustrato de una enzima se selecciona apropiadamente según el propósito del análisis. En el análisis de un tejido biológico antes de la digestión enzimática (degradación) de un tejido biológico y la separación de células y poblaciones de células, se usan sondas que comprenden un dominio de unión a sustrato de una proteasa usada en tal digestión enzimática y separación de células.

Los ejemplos de una proteasa de este tipo incluyen colagenasa, tripsina, quimotripsina, dispasa, elastasa, papaína, pronasa, termolisina, subtilisina, bromelaína, fitina y termitasa. Los ejemplos de colagenasa incluyen particularmente colagenasa G y colagenasa H derivadas de Clostridium histolyticum y colagenasa derivada de Actinomyces y colagenasa derivada de Clostridium perfringens. La mayoría de las estructuras primarias de los sitios de unión al sustrato de estas enzimas ya se han analizado. Usando la información estructural, los expertos en la técnica pueden diseñar sondas. Como ejemplos, las secuencias de aminoácidos de colagenasa G y colagenasa H derivadas de Clostridium histolyticum se describen en SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente.

Es preferible que una sonda contenga de 1 a 100 repeticiones, particularmente de 1 a 20 repeticiones de un dominio de unión a sustrato (por ejemplo, dominio de unión a colágeno) o una parte del mismo.

Como molécula de visualización, pueden usarse una molécula fluorescente, una molécula luminiscente y un núclido positrónico que van a usarse en la técnica de obtención de imágenes de moléculas.

Como molécula fluorescente, puede usarse para la visualización una proteína fluorescente tal como GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato y RFP o un marcador fluorescente tal como Alexa350, dimetilaminocumarina, 5/6-carboxi-fluoresceína, Alexa488, ATTO488, DY-505, 5/6-carboxifluoresceína, Alexa488, Alexa532, Alexa546, Alexa555, ATTO488, ATTO532, tetrametilrodamina, Cy3, DY-505, DY-547, Alexa635, Alexa647, ATTO600, ATTO655, DY-632, Cy5, DY-647, Cy5.5.

Como molécula luminiscente, puede usarse una enzima luminiscente tal como luciferasa. Como luciferasa, puede mencionarse luciferasa derivada de diversos organismos luminiscentes tales como Cypridina, Hoplophoridae, insectos luminiscentes (por ejemplo, luciérnaga, Pityobiinae), gusanos luminiscentes, Latia, pus shiitake, Aequorea victoria (aecuorina). Se usa preferiblemente una luciferasa modificada que tiene una longitud de onda pico e intensidad luminiscente diferentes de una luciferasa de tipo natural.

Una proteína fluorescente tal como GFP requiere una fuente de luz externa para emitir fluorescencia; sin embargo, la luciferasa oxida la luciferina para emitir luz por sí misma. También se desarrolla una técnica de emisión de luz a partir de GFP sin una fuente de luz externa uniendo la luciferasa a GFP, y por tanto puede aplicarse una técnica de este tipo (documentos WO2004/22600, WO2004/052934).

Distintas a estas, se conocen muchas técnicas con respecto a la visualización de una proteína (documento WO01/46694, publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2006-518209, publicación nacional de solicitud de patente internacional n.° 2005-525111, patente japonesa abierta a consulta por el público n.° 2008­ 283959). Pueden usarse estas técnicas conocidas.

Como radioisótop 1o, 1 puede usarse un núclid1oC1 pos1iOtróni1c1o em1Qp1lea ¿ Íd Oo en ¿>Q obtenció Q On de imág ^ enes usando PET. Los ejemplos del núclido positrónico incluyen O, N, C, F, Cu, Ga y Rb. Puede usarse una etiqueta convencional conocida en la técnica y frecuentemente usada en una sonda de PET.

Si se usa una molécula de proteína como molécula de visualización, puede fusionarse un dominio de unión a componentes biológicos (dominio de unión a colágeno) con la molécula de visualización para constituir una proteína de fusión. Se conoce en la técnica un método para producir una proteína de fusión (tal como se describió anteriormente, N Nishi, et al., Proc Natl Acad Sci USA.; 95(12):7018-7023 (1998), Tuan et al., Conective Tissue Research, 34(1), 1-9 (1996), Han et al., Protein Expression and Purification 11, 169-178). Por tanto, los expertos en la técnica pueden producir fácilmente una proteína de fusión según estas técnicas convencionales.

3. Método para separar células o poblaciones de células de tejido biológico

La presente divulgación también proporciona un método para separar eficazmente células o poblaciones de células deseadas de un tejido biológico, analizando el tejido biológico mediante el uso del método de análisis mencionado anteriormente y determinando la razón cuantitativa y el tiempo de acción de enzimas que van a usarse, basándose en los resultados del análisis.

Puesto que la afinidad del tejido por una enzima se sugiere mediante la cantidad de unión de la sonda, la razón cuantitativa y el tiempo de acción de enzimas según el propósito pueden predecirse basándose en la afinidad de cada una de las enzimas.

4. Kit de separación de tejido biológico

La presente divulgación también proporciona un kit que va a usarse en el método mencionado anteriormente para separar células o poblaciones de células de un tejido biológico.

El kit de la presente divulgación consiste en uno o dos o más elementos seleccionados de reactivos y herramientas usados en el método para separar un tejido biológico de la presente divulgación, tal como el conjunto de sondas de la presente invención, una enzima usada en la separación de un tejido biológico y que tiene un dominio de unión a sustrato usado como elemento de constitución de una sonda, y un tampón, como elementos constitutivos.

Ejemplos

Ahora, la presente invención se describirá más específicamente por medio de ejemplos a continuación; sin embargo, la presente invención no se limita a estos ejemplos.

[Ejemplo 1] Preparación de sonda mediante el uso de EGFP

[Preparación de sonda de EGFP-CBD de ColG]

(1) Método para construir EGFP-CBD de ColG

En primer lugar, se describirá la preparación de una sonda (EGFP-CBD de ColG) para colagenasa G derivada de Clostridium histolyticum marcada con EGFP.

En primer lugar, basándose en la secuencia de FLAG, se sintetizaron dos ADN de oligonucleótido: 5'-TCGACGATTATAAAGATGATGATGATAAAT-3' (SEQ ID NO: 3) y 5'-CTAGATTTATCATCATCATCTTTATAATCG-3' (SEQ ID NO: 4). Cada uno de los ADN de oligonucleótido se disolvió en TE para obtener una concentración de 100 |iM. Luego, se mezclaron 10 |il de ADN de oligonucleótido, 3 |il de tampón de polinucleótido cinasa de T4 10 x (fabricado por Nippon Gene), 0,3 |il de ATP 0,1 M, 2 |il de polinucleótido cinasa de T4 (20 U, Nippon Gene) y 14,7 |il de H2O y se mantuvo a 37 °C durante una hora. Se tomó una alícuota (10 |il) de cada una de las disoluciones de reacción y se mezclaron las alícuotas. Se mantuvo la mezcla de disolución a 100 °C durante 5 minutos y se enfrió directamente de manera gradual hasta temperatura ambiente. Se designó esto como disolución 1 de inserto.

A 10 |il de pCold2 (TAKARA Bio), se le añadieron 10 |il de tampón Tango 10 x (fabricado por Fermentas), 1 |il de SalI (Fermentas), 1 |il de XbaI (Fermentas) y 28 |il de H2O, y se llevó a cabo una reacción a 37 °C durante 5 horas. Tras la finalización de la reacción, a la disolución de reacción se le añadieron 150 |il de TE; además se le añadieron 250 |il de una disolución fenólica/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y se agitó suficientemente. Después de eso, se centrifugó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos y a 16000 g, y se recogió el sobrenadante. Al sobrenadante recogido se le añadieron 20 |il de una disolución de acetato de sodio 3 M, y se le añadieron 450 |il de etanol frío. Se permitió que la mezcla reposara todavía sobre hielo durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 16000 g ya 4 °C durante 5 minutos para recoger una precipitación.

Se lavó la precipitación con etanol frío al 70 %, y luego se disolvió en 40 |il de H2O. Para esto, se añadieron 5 |il de tampón BAP 10 x (fabricado por TOYOBO CO. LTD.) y 5 |il de fosfatasa alcalina bacteriana (TOYOBO). Se llevó a cabo la reacción a 65 °C durante una hora. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8%. Tras la finalización de la electroforesis, se realizó tinción con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 40 |il de EB según el protocolo adjunto.

El eluido así obtenido se designó como disolución 1 de vector. Se mezclaron disolución 1 de vector (9 |il), 1 |il de disolución 1 de inserto y 10 |il de disolución de conveniencia de ligación (Nippon gene) y se mantuvieron a 16 °C durante 30 minutos. Se transformó Escherichia coli DH5a con esta disolución. Se inoculó la Escherichia coli así transformada en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. A 10 |il de una alícuota tomada del eluido, se le añadieron 2 |il de tampón Tango 10 x, 1 |il de XbaI y 7 |il de H2O y se mantuvieron a 37 °C durante 3 horas. Se sometió la disolución de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, y se cortó una única banda que surgió en las proximidades de 4 kpb. Se realizó la recuperación mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 50 |il de EB. A 10 |il del eluido, se le añadieron 10 |il de disolución de conveniencia de ligación y se mantuvieron a 16 °C durante 30 minutos.

Usando la disolución, se transformó de nuevo Escherichia coli DH5a. Se inoculó la Escherichia coli así transformada en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. A 10 |il de una alícuota tomada del eluido, se le añadieron 3 |il de tampón K 10 x (TAKARA Bio), 1 |il de BamHI (TAKARA Bio), 1 |il de EcoRI (TAKARA Bio) y 15 |il de H2O y se hicieron reaccionar a 37 °C durante la noche. Tras la finalización de la reacción, se realizó la extracción con una cantidad igual de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico. A la capa superior obtenida, se le añadieron 3 |il de acetato de sodio 3 M, y se le añadieron 70 |il de etanol frío. Se permitió que la mezcla reposara todavía sobre hielo durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 16000 g y a 4 °C durante 5 minutos para recoger una precipitación. Se lavó la precipitación con etanol frío al 70 %, y luego se disolvió en 40 |il de H2O. A esto, se le añadieron 5 |il de tampón BAP 10 x (TOYOBO) y 5 |il de fosfatasa alcalina bacteriana (TOYOBO). Se realizó una reacción a 65 °C durante una hora. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 % con tampón TAE, y se realizó tinción con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido resultante como disolución 2 de vector.

Mientras tanto, se mezclaron 0,5 |il de 5'-AAAGAACGGATCCACAACAACACCTATAACTAAAG-3' 100 |iM (cebador 1: SEQ ID NO: 5), y 0,5 |il de 5'-AAGCAGAGATGAATTCTTTATTTACCCTTAACTCATAG-3' 100 |iM (cebador 2: SEQ ID NO: 6), 1 |il de un plásmido que ya se había clonado y contenía la longitud completa de un gen que codifica colagenasa G de Clostridium histolyticum, 8 |il de mezcla de dNTP (TAKARA Bio), 1,0 |il de PrimeStar HS (TAKARA Bio), 20 |il de betaína 5 M y 49 |il de H2O, y se realizó la reacción que consistía en 98 °C, 2 min (la primera etapa), 98 °C, 10 s (la segunda etapa), 55 °C, 5 s (la tercera etapa) y 72 °C y 90 s (la cuarta etapa), y se repitió de manera continua el procedimiento de la segunda etapa a la cuarta etapa 35 veces.

Se purificaron los fragmentos de PCR resultantes mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 50 |il de EB. A la alícuota (10 |il) del eluido resultante, se le añadieron 3 |il de tampón K 10 x (TAKARA Bio), 1 |il de BamHI (TAKARA Bio), 1 |il de EcoRI (TAKARA Bio) y 15 |il de H2O, y se realizó una reacción a 37 °C durante la noche. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8% con tampón TAE, y se tiñó con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido como disolución 2 de inserto.

A 5 |il de disolución 2 de vector y 5 |il de disolución 2 de inserto, se le añadieron 10 |il de disolución de conveniencia de ligación. Se realizó la reacción a 16 °C durante 30 minutos. Tras la finalización de la reacción, usando la disolución de ligación, se transformó Escherichia coli DH5a. Se inoculó la cepa transformada resultante en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. A 10 |il de una alícuota tomada del eluido, se le añadieron 3 |il de tampón Tango 10 x, 1 |il de SacI (Fermentas), 1 |il de KpnI (Fermentas) y 15 |il de H2O y se hicieron reaccionar a 37 °C durante la noche. Tras la finalización de la reacción, se realizó la extracción con una cantidad igual de disolución fenólica/cloroformo/alcohol isoamílico. A la capa superior, se le añadieron 3 |il de acetato de sodio 3 M y 70 |il de etanol frío. Se permitió que la mezcla reposara todavía sobre hielo durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 16000 g y a 4 °C durante 5 minutos para recoger una precipitación. Se lavó la precipitación con etanol frío al 70 %, y luego se disolvió en 40 |il de H2O. A esto, se le añadieron 5 |il de tampón BAP 10 x (TOYOBO) y 5 |il de fosfatasa alcalina bacteriana (TOYOBO). Se hizo reaccionar la disolución de reacción a 65 °C durante una hora. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 % con tampón TAE, y se realizó tinción con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido como disolución 3 de vector.

Se usó el gen que codifica EGFP como molde. Se usaron 5'-CGAAGGTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCG-3' (cebador 3: SEQ ID NO: 7) y 3'-AGACTGCGGTACCGATCGATCTGAGTCCG-3' (cebador 4: SEQ ID NO: 8) como cebadores. Entonces, se mezclaron 20 |il de tampón PrimeStar 5 x (TAKARA Bio), 1,0 |il de pET-EGFP, 0,5 |il de cebador 3100 |iM, 0,5 |il de cebador 4100 |iM, 8,0 |il de mezcla de dNTP, 1,0 |il de PrimeStarHS, 20 |il de betaína 5 M y 49 |il de H2O, y se sometieron a la reacción que consistía en 98 °C, 2 min (la primera etapa), 98 °C, 10 s (la segunda etapa), 55 °C, 5 s (la tercera etapa) y 72 °C y 90 s (la cuarta etapa), y se repitió de manera continua el procedimiento de la segunda etapa a la cuarta etapa 35 veces.

Se purificaron los fragmentos de PCR resultantes mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 50 |il de EB. A la alícuota (10 |il) del eluido resultante, se le añadieron 3 |il de tampón Tango, 1 |il de SacI (Fermentas), 1 |il de KpnI (Fermentas) y 15 |il de H2O, y se realizó una reacción a 37 °C durante la noche. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 % con tampón TAE y se tiñó con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido como disolución 3 de inserto.

A 5 |il de disolución 3 de vector y 5 |il de disolución 3 de inserto, se le añadieron 10 |il de disolución de conveniencia de ligación. Se realizó la reacción a 16 °C durante 30 minutos. Tras la finalización de la reacción, usando la disolución de ligación, se transformó Escherichia coli DH5a. Se inoculó la cepa transformada resultante en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. Usando el eluido resultante, se transformó la cepa de Escherichia coli BLR (fabricada por Novagen). La cepa transformada resultante se designó como cepa de E. coli BLR/pCold2-EGFP-CBD de ColG.

(2) Purificación de EGFP-CBD de ColG

Cultivo

Se inoculo la cepa de Escherichia coli BLR transformada con pCold2-EGFP-CBD de ColG en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, y se cultivó mientras se agitaba a 37 °C durante la noche. Se designó esto como disolución de precultivo. Se inoculó la disolución de precultivo en el mismo medio (170 ml) preparado en 500 ml de volumen de un matraz cónico equipado con un deflector, de modo que fuese una cantidad de 1/1000. Se realizó el cultivo en agitación a 37 °C hasta que la DO660 alcanzó de aproximadamente 0,6 a 1,0. A esto, se le añadió IPTG esterilizado mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 1 mM. Se cultivó la mezcla resultante mientras se agitaba a 15 °C durante 24 horas.

Recuperación

Tras la finalización del cultivo, se recogieron células bacterianas mediante centrífuga a 10000 g durante 5 minutos, se suspendieron en un tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) (la misma cantidad que la disolución de cultivo) que contenía NaCl 0,3 M, y se recogieron de nuevo mediante centrífuga a 10000 g durante 5 minutos. Se repitió adicionalmente la misma operación dos veces para lavar las células bacterianas. Se suspendieron las células bacterianas lavadas en 25 ml del tampón, y luego se trituraron mediante un homogeneizador ultrasónico a una potencia de 200 W durante un minuto en hielo. Tras la finalización de la trituración, se centrifugaron las células bacterianas a 10000 g durante 10 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante.

Purificación

El sobrenadante obtenido de manera centrífuga a partir de las células bacterianas trituradas se sometió a cromatografía en columna de Cosmosil His-accept (diámetro: 2,5 * 10 cm). Tras lavarse la columna suficientemente con tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 0,3 M, se aplicó un tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 10 mM y NaCl 0,3 M a la columna en una cantidad equivalente a la de la columna. Posteriormente, se aplicaron el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 20 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 30 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 40 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 50 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 100 mM y el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 500 mM, y se eluyó la proteína adsorbida. Se comprobaron fracciones de elución individuales mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-His6 (Santa Cruz). Como resultado, se confirmó que estaba contenida una proteína deseada en la fracción de elución de imidazol 20-30 mM. Se designó esta proteína como proteína EGFP-CBD de ColG. CBD de ColG se muestra en la figura 1 (A), y la secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos de EGFP-CBD de ColG se muestran respectivamente en SEQ ID NO: 9 y 10 de la lista de secuencias.

[Ejemplo 2] Preparación de sondas mediante el uso de DsRed

[Preparación de sondas de DsRed-CBD de ColH]

(1) Método para construir DsRed-CBD de ColH

A continuación, se describirá la preparación de una sonda (DsRed-CBD de ColH) para colagenasa H derivada de Clostridium histolyticum marcada con DsRed.

Basándose en la secuencia de Cmyc, se sintetizaron dos ADN de oligonucleótido: 5'-TCGACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGT-3' (SEQ ID NO: 11) y 5'-CTAGACAGATCTTCTTCGCTAATCAGTTTCTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 12). Cada uno de los ADN de oligonucleótido se disolvió en TE para obtener una concentración de 100 |iM. Entonces, se mezclaron 10 |il de ADN de oligonucleótido, 3 |il de tampón de polinucleótido cinasa de T4 10 x (Nippon Gene), 0,3 |il de ATP 0,1 M, 2 |il de polinucleótido cinasa de T4 (20U, Nippon Gene) y 14,7 |il de H2O, y se mantuvieron a 37 °C durante una hora. Se tomó una alícuota de 10 |il de cada una de las disoluciones de reacción, y se mezclaron las alícuotas. Se mantuvo la mezcla de disolución a 100 °C durante 5 minutos y se enfrió directamente de manera gradual hasta temperatura ambiente. Se designó esto como disolución 4 de inserto.

A 10 |il de pCold2 (TAKARA Bio), se le añadieron 10 |il de tampón Tango 10 x (fabricado por Fermentas), 1 |il de Salí (Fermentas), 1 |il de Xbal (Fermentas) y 28 |il de H2O, y se llevó a cabo una reacción a 37 °C durante 5 horas. Tras la finalización de la reacción, a la disolución de reacción se le añadieron 150 |il de TE; además, se le añadieron 250 |il de una disolución fenólica/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), y se agitó suficientemente. Después de eso, se centrifugó la mezcla a temperatura ambiente durante 5 minutos a 16000 g, y se recogió el sobrenadante. Al sobrenadante así recogido se le añadieron 20 |il de una disolución de acetato de sodio 3 M, y se le añadieron 450 |il de etanol frío. Se permitió que la mezcla reposara todavía sobre hielo durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 16000 g ya 4 °C durante 5 minutos para recoger una precipitación.

Se lavó la precipitación con etanol frío al 70 %, y luego se disolvió en 40 |il de H2O. A esto, se le añadieron 5 |il de tampón BAP 10 x (fabricado por TOYOBO CO. LTD.) y 5 |il de fosfatasa alcalina bacteriana (TOYOBO). Se realizó una reacción a 65 °C durante una hora. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 %. Tras la finalización de la electroforesis, se realizó tinción con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 40 |il de EB según el protocolo adjunto. El eluido así obtenido se designó como disolución 4 de vector. Se mezclaron disolución 4 de vector (9 |il), 1 |il de disolución 4 de inserto y 10 |il de disolución de conveniencia de ligación (Nippon gene) y se mantuvieron a 16 °C durante 30 minutos.

Usando esta disolución, se transformó Escherichia coli DH5a. Se inoculó la Escherichia coli así transformada en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. A 10 |il de una alícuota tomada del eluido, se le añadieron 2 |il de tampón Tango 10 x, 1 |il de Xbal y 7 |il de H2O y se mantuvieron a 37 °C durante 3 horas. Se sometió la disolución de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 0,8 %, y se cortó una única banda que surgió en las proximidades de 4 kpb. Se realizó la recuperación mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 50 |il de EB. A 10 |il del eluido, se le añadieron 10 |il de disolución de conveniencia de ligación y se mantuvo a 16 °C durante 30 minutos. Usando la disolución, se transformó de nuevo Escherichia coli DH5a. Se inoculó la Escherichia coli así transformada en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. A 10 |il de una alícuota tomada del eluido, se le añadieron 3 |il de tampón K 10 x (TAKARA Bio), 1 |il de BamHI (TAKARA Bio), 1 |il de EcoRI (TAKARA Bio) y 15 |il de H2O y se hicieron reaccionar a 37 °C durante la noche. Tras la finalización de la reacción, se realizó la extracción con una cantidad igual de fenol/cloroform/alcohol isoamílico. A la capa superior obtenida, se le añadieron 3 |il de acetato de sodio 3 M y se le añadieron 70 ml de etanol frío. Se permitió que la mezcla reposara todavía sobre hielo durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 16000 g ya 4 °C durante 5 minutos para recoger una precipitación. Se lavó la precipitación con etanol frío al 70 %, y luego se disolvió en 40 |il de H2O. A esto, se le añadieron 5 |il de tampón BAP 10 x (TOYOBO) y 5 |il de fosfatasa alcalina bacteriana (TOYOBO). Se realizó la reacción a 65 °C durante una hora. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 % con tampón TAE, y se realizó tinción con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido resultante como disolución 5 de vector.

Mientras tanto, se mezclaron 0,5 |il de 5'-GAATCTTCAGGATCCACTACTACTGCAGAAATAAAG-3' 100 |iM (cebador 5: SEQ ID NO: 13) y 0,5 |il de 5'-AAGCAGAGATGAATTCTCTTCCTACTGAACCTTCTATATTAATTC-3' 100 |iM (cebador 6: SEQ ID NO: 14), 1 |il de un plásmido, pCold2-ColH-His, que ya se había clonado y contenía la longitud completa de un gen que codifica colagenasa H de Clostridium histolyticum, 8 |il de mezcla de dNTP (TAKARA Bio), 1,0 |il de PrimeStar HS (TAKARA Bio), 20 |il de betaína 5 M y 49 |il de H2O, y se realizó la reacción que consistía en 98 °C, 2 min (la primera etapa), 98 °C, 10 s (la segunda etapa), 55 °C, 5 s (la tercera etapa) y 72 °C y 90 s (la cuarta etapa), y se repitió de manera continua el procedimiento de la segunda etapa a la cuarta etapa 35 veces.

Se purificaron los fragmentos de PCR resultantes mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 50 |il de EB. A la alícuota (10 |il) del eluido resultante, se le añadieron 3 |il de tampón K 10 x (TAKARA Bio), 1 |il de BamHI (TAKARA Bio), 1 |il de EcoRI (TAKARA Bio) y 15 |il de H2O, y se realizó una reacción a 37 °C durante la noche. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8% con tampón TAE, y se tiñó con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido como disolución 5 de inserto.

A 5 |il de disolución 5 de vector y 5 |il de disolución 5 de inserto, se le añadieron 10 |il de disolución de conveniencia de ligación. Se realizó la reacción a 16 °C durante 30 minutos. Tras la finalización de la reacción, se transformó Escherichia coli DH5a mediante el uso de la disolución de ligación. Se inoculó la cepa transformada resultante en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. A 10 |il de una alícuota tomada de esto, se le añadieron 3 |il de tampón Tango 10 x, 1 |il de SacI (Fermentas), 1 |il de KpnI (Fermentas) y 15 |il de H2O y se hicieron reaccionar a 37 °C durante la noche. Tras la finalización de la reacción, se realizó la extracción con una cantidad igual de disolución fenólica/cloroformo/alcohol isoamílico. A la capa superior obtenida, se le añadieron 3 |il de acetato de sodio 3 M, y se le añadieron 70 |il de etanol frío. Se permitió que la mezcla reposara todavía sobre hielo durante 5 minutos, y luego se centrifugó a 16000 g ya 4 °C durante 5 minutos para recoger una precipitación. Se lavó la precipitación con etanol frío al 70 %, y luego se disolvió en 40 |il de H2O. A esto, se le añadieron 5 |il de tampón BAP 10 x (fabricado por TOYOBO CO., LTD.) y 5 |il de fosfatasa alcalina bacteriana (TOYOBO). Se realizó la reacción a 65 °C durante una hora. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 % con tampón TAE, y se realizó tinción con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido como disolución 6 de vector.

Como molde, se usó pDsRed-monomer (fabricado por Clontech). Se usaron 5'-GTACCGGTCGAGCTCATGGACAACACCGAGG-3' (cebador 7: SEQ ID NO: 15) y 3'GTCGCGGCCGGTACCCTGGGAGCCGGAGTGGC-3’ (cebador 8: SEQ ID NO: 16) como cebadores. Entonces, se mezclaron 20 |il de tampón PrimeStar 5 x (TAKARA Bio), 1,0 |il de pDsRed-monomer (fabricado por Clontech), 0,5 |il de cebador 7100 |iM, 0,5 |il de cebador 8100 |iM, 8,0 |il de mezcla de dNTP, 1,0 |il de PrimeStar HS, 20 |il de betaína 5 M y 49 |il de H2O, y se sometieron a la reacción que consistía en 98 °C, 2 min (la primera etapa), 98 °C, 10 s (la segunda etapa), 55 °C, 5 s (la tercera etapa) y 72 °C y 90 s (la cuarta etapa) y se repitió de manera continua el procedimiento de la segunda etapa a la cuarta etapa 35 veces.

Se purificaron los fragmentos de PCR resultantes mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 50 |il de EB. A la alícuota (10 |il) del eluido resultante, se le añadieron 3 |il de tampón Tango, 1 |il de SacI (Fermentas), 1 |il de KpnI (Fermentas) y 15 |il de H2O, y se realizó una reacción a 37 °C durante la noche. La cantidad total de la disolución de reacción se sometió a electroforesis en agarosa al 0,8 % con tampón TAE, y se tiñó con una disolución de bromuro de etidio. Tras comprobarse la posición de una banda, se cortó el gel de agarosa. Se realizó la recuperación del gel de agarosa mediante el uso del kit de purificación de gel/PCR fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 30 |il de EB según el protocolo adjunto. Se designó el eluido como disolución 6 de inserto.

A 5 |il de disolución 6 de vector y 5 |il de disolución 6 de inserto, se le añadieron 10 |il de disolución de conveniencia de ligación. Se realizó la reacción a 16 °C durante 30 minutos. Tras la finalización de la reacción, se transformó Escherichia coli DH5a mediante el uso de la disolución de ligación. Se inoculó la cepa transformada resultante en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,22 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, se cultivó a 37 °C durante la noche y luego se centrifugó a 10000 g durante un minuto para recoger células bacterianas. A partir de las células bacterianas así recogidas, se recuperaron plásmidos mediante el uso del kit de extracción de ADN de plásmido Mini Plus fabricado por Viogene. Se realizó la elución con 100 |il de EB. Usando el eluido resultante, se transformó la cepa de Escherichia coli BLR (DE3) pLys (fabricada por Novagen). La cepa transformada resultante se designó como cepa de E. coli BLR/pCold2-DsRed-CBD de ColH.

(2) Purificación de DsRed-CBD de ColH

Cultivo

Se inoculó la cepa de Escherichia coli BLR transformada con pCold2-DsRed-CBD de ColH en 2 ml de medio LB esterilizado mediante un autoclave y que contenía ampicilina, que se esterilizó mediante un filtro esterilizado de 0,25 |im para obtener una concentración final de 100 |ig/ml, y se cultivó mientras se agitaba a 37 °C durante la noche. Se designó esto como disolución de precultivo. Se inoculó la disolución de precultivo en el mismo medio (170 ml) preparado en 500 ml de volumen de un matraz cónico equipado con un deflector para que fuese una cantidad de 1/1000. Se realizó el cultivo en agitación a 37 °C hasta que la DO660 alcanzó de aproximadamente 0,6 a 1,0. A esto, se le añadió IPTG esterilizado mediante un filtro esterilizado de 0,25 |im para obtener una concentración final de 1 mM. Se cultivó la mezcla resultante mientras se agitaba a 15 °C durante 24 horas.

Recuperación

Tras la finalización del cultivo, se recogieron células bacterianas mediante centrífuga a 10000 g durante 5 minutos, se suspendieron en un tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) (la misma cantidad que la disolución de cultivo) que contenía NaCl 0,3 M, y se recogieron de nuevo mediante centrífuga a 10000 g durante 5 minutos. Se repitió la misma operación adicionalmente dos veces para lavar las células bacterianas. Se suspendieron las células bacterianas lavadas en 25 ml del tampón, y luego se trituraron mediante un homogeneizador ultrasónico a una potencia de 200 W durante un minuto en hielo. Tras la finalización de la trituración, se centrifugaron las células bacterianas a 10000 g durante 10 minutos a 4 °C, y se recogió el sobrenadante.

Purificación

El sobrenadante obtenido de manera centrífuga a partir de las células bacterianas trituradas se sometió a cromatografía en columna de Cosmosil His-accept (diámetro: 2,5 * 10 cm). Tras lavarse la columna suficientemente con tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) que contenía NaCl 0,3 M, se aplicó un tampón fosfato 50 mM (pH 8,0) que contenía imidazol 10 mM y NaCl 0,3 M a la columna en una cantidad equivalente a la de la columna. Posteriormente, se aplicaron el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 20 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 30 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 40 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 50 mM, el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 100 mM y el mismo tampón que anteriormente excepto porque estaba contenido imidazol 500 mM, y se eluyó la proteína adsorbida. Se comprobaron fracciones de elución individuales mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia usando un anticuerpo anti-His6 (Santa Cruz). Como resultado, se confirmó que estaba contenida una proteína deseada en la fracción de elución de imidazol 20-30 mM. Se designó esta proteína como proteína DsRed-CBD de ColH. CBD de ColH se muestra en la figura 1 (B), y la secuencia de nucleótidos y secuencia de aminoácidos de DsRed-CBD de ColH se muestran respectivamente en SEQ ID NO: 17 y 18 de la lista de secuencias.

[Ejemplo 3] Preparación de sondas mediante el uso de tdTomato

(1) Preparación de ADN de tdTomato CBD de ColH e inserción en el vector de expresión pColdII

Como molde, se usó ADN del gen de tdTomato, el vector ptdTomato (Clontech). En la PCR para la amplificación del ADN, como cebador N-terminal, se usó una secuencia de 34 bases (TomatoF) que contenía un sitio de reconocimiento de Nde I situado en el sentido de 5' de tdTomato. Como cebador C-terminal, se usó una secuencia complementaria a 34 pb (TomatoR) que tenía un sitio de reconocimiento de BamHI en lugar de un codón de terminación situado en el sentido de 3' de tdTomato. Las secuencias de cebadores individuales se muestran en negrita.

Secuencia de cebador:

TomatoF: 5'-CCGGTCGCCcatATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3' (SEQ ID NO: 19)

TomatoR: 5'-AGAGTCGCGGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCA-3' (SEQ ID NO: 20)

Posteriormente, se trató pCold II que tenía un inserto de ADN de DsRed-CBD de ColH con enzimas de restricción, BamH I y Xba I, para obtener un fragmento de ADN de CBD de Col H de aproximadamente 1000 pb.

Se trató ADN de tdTomato de aproximadamente 1500 pb preparado mediante PCR con Nde I y BamHI y se insertó junto con ADN de CBD de ColH en el vector de expresión pCold II tratado con Nde I, Xba I. Se realizaron análisis de datos de secuencias y PCR de colonias para confirmar que se construye un plásmido tal como se diseñó. Obsérvese que el análisis de la secuencia de ADN se pidió a Operon Biotechnologies. Cuando se insertó ADN de tdTomato CBD de ColH en pCold II, se expresó como una proteína que tenía una secuencia de etiqueta de His en el extremo N-terminal (figura 2). Los residuos del tdTomato CBD de ColH diseñado incluyendo estas secuencias de aminoácidos se convierten en 726 (cantidad de moléculas 82 k).

(2) Preparación de bacterias de expresión e inducción de la expresión de proteínas

Se transformó Escherichia coli BLR con el plásmido de expresión de tdTomato CBD de ColH construido en el método mencionado anteriormente. Se usó un método de choque térmico general para la transformación. La Escherichia coli BLR transformada se propagó sobre una placa de LB que contenía ampicilina (Amp) 100 |ig/ml y se cultivó a 37 °C durante la noche. Se subcultivaron las colonias que crecieron sobre un medio líquido LB/Amp y se incubaron a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0,5-0,7. Se enfrió la disolución de cultivo sobre hielo durante 30 minutos, y luego se añadió isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para obtener una concentración de 0,1 mM. Se continuó el cultivo a 15 °C durante 24 horas para inducir la expresión de una proteína.

Después de 24 horas, se centrifugó la disolución de cultivo de Escherichia coli para recoger las células bacterianas. Se lavaron las células bacterianas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y se suspendieron de nuevo en PBS. A esto, se le añadió fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) para obtener una concentración de 0,1 mM. Se trituraron las células bacterianas mediante una onda ultrasónica mientras se enfriaban en hielo. La disolución resultante de células bacterianas trituradas se centrifugó a 12000 rpm durante 20 minutos para separar una precipitación y un sobrenadante. Se realizó un análisis de SDS-PAGE para confirmar que una proteína deseada se expresa en una fracción soluble. A la disolución cultivada de Escherichia coli, se le añadió dimetilsulfóxido (DMSO) hasta el 8 % y se almacenó a -80 °C en un congelador. Se usó esto como reserva de células bacterianas congeladas para expresar tdTomato CBD de ColH.

(3) Purificación de tdTomato CBD de ColH

A la columna de Ni-NTA agarosa (^2 cm * 5,0 cm, volumen de columna de 15 ml, empresa: QIAGEN) equilibrada con un tampón NaCl 300 mM/fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), se le aplicó una disolución preparada diluyendo la fracción soluble de células bacterianas trituradas tres veces con un tampón de equilibración. Después de que la fracción no retenida no adsorbida al portador se eliminara por lavado con el tampón de equilibración, se realizó la elución con tampones que contenían imidazol 50 mM, 200 mM y 500 mM. Cada una de las fracciones eluidas por los tampones diferentes en la concentración de imidazol se sometió a SDS-PAGE para confirmar que el tdTomato CBD de ColH se eluyó en una fracción de elución de imidazol 200 mM (figura 3). La fracción se recuperó y se dializó frente a Tris-HCl 50 mM (pH 8,0).

Después del diálisis, se aplicó la disolución resultante a una columna de intercambio aniónico (HiTrap DEAE FF, C.V. = 1 ml, GE Healthcare), y se realizó la elución con el gradiente de concentración de NaCl lineal 0-400 mM. Se recuperó una fracción en la que se confirmó la presencia de tdTomato CBD de ColH mediante SDS-PAGE de las fracciones de elución (figura 4) y se concentró mediante ultrafiltración usando Amicon 30k (fabricado por Millipore) hasta 5 mg/ml. Se usó esto como tdTomato CBD de ColH purificado.

(4) Medición del espectro fluorescente.

Se notifica que tdTomato tiene la misma longitud de onda de excitación (554 nm) y longitud de onda fluorescente (581 nm) que las de DsRed. El espectro de excitación y fluorescente de la disolución de enzima purificada de tdTomato CBD de ColH se midió mediante un espectrofluorómetro F-2500 (Hitachi High-Technologies Corporation) (figura 5). A partir del espectro, se confirmó que ni un desplazamiento de la longitud de onda fluorescente ni extinción se producen al expresarse como una proteína de fusión con CBD. Además, se confirmó que se emite una fluorescencia más intensa en comparación con la que usa DsRed.

[Ejemplo 4] Preparación de una sonda usando luciferasa

[Método para preparar PGV_CBD de Col G y PGV-CBD de Col H (sondas de proteína de fusión de dominio de unión a colágeno-luciferasa)]

(1) Método para construir PGV_CBD de Col G

1) Preparación de ADN de proteína de fusión de dominio de unión a colágeno-luciferasa

Inserción en el vector de expresión pCold I

Como plantilla de ADN de un gen de luciferasa, se usó la secuencia de una región codificante de luciferasa (PGV) de un vector de control PicaGene (PGV_control). En la PCR para la amplificación de ADN, como cebador N-terminal, se usó una secuencia de 27 bases (PGVctrl_Nterm) que tenía un sitio de reconocimiento de Nde I (CATATG) situado en el sentido de 5' de PGV. Como cebador C-terminal, se utilizó una secuencia de 30 pb (PGV_CF_r) complementaria a un sitio de reconocimiento de BamHI (GGATCC) situada en el sentido de 3' de PGV en lugar de un codón de terminación.

Para los dominios de unión a colágeno (CBD) de colagenasas (Col) G y H, se usó un plásmido que tenía el ADN de longitud completa de Col G y H insertado en pCold III como ADN molde. En la PCR para la amplificación de ADN, se usó un ADN de 35 bases (ColG_Nterm, ColH_Nterm) que tenía un sitio de reconocimiento de BamH I añadido al extremo N-terminal de CBD como cebador N-terminal. Como cebador C-terminal, se usaron respectivamente una secuencia (ColG_CtermStrep_comp) en la que se añadieron secuencialmente una secuencia de aminoácidos etiquetada con Strep y un sitio de reconocimiento de Xba I (TCTAGA) en este orden a CBD de Col G, y un ADN complementario de 49 bases para la secuencia (ColH_CtermFLAG_comp) en la que la secuencia de aminoácidos etiquetada con FLAG y un sitio de reconocimiento de Xba I se añadieron secuencialmente en este orden a CBD de Col H (figura 6).

Se trató ADN de PGV de aproximadamente 1700 pb preparado por PCR con Nde I y BamHI, y se trató ADN de CBD de aproximadamente 1000 pb con BamH y Xba I, y se insertó en un vector de expresión, pCold I que se había tratado con Nde I y Xba I (figura 7).

Se realizaron análisis de datos de secuencias y PCR de colonias para confirmar que el plásmido se construyó tal como se diseñó. Obsérvese que el análisis de la secuencia de ADN se pidió a Operon Biotechnologies. Si el a Dn se insertó en pCold I, se expresó como una proteína que tenía una etiqueta de His en el extremo N-terminal y una secuencia de reconocimiento para el factor Xa. El tamaño de la proteína de fusión diseñada incluyendo estas secuencias de aminoácidos se convierte en 911 residuos (cantidad de moléculas: 101 k) en el caso de PGV CBD de Col G y 883 residuos (cantidad de molécula: 98 k) en el caso de PGV CBD de Co1H.

2) Preparación de bacterias de expresión e inducción de la expresión de proteínas.

Se transformó Escherichia coli Rosetta 2 (DE3) con el plásmido de expresión en el que se insertaron PGV y ADN de CBD de Col G o CBD de Col H. Se usó un método de choque térmico general para la transformación. Se indujo la expresión de una proteína de fusión de dominio de unión a colágeno-luciferasa mediante la cepa transformada. La Escherichia coli Rosetta 2 transformada se propagó sobre una placa de LB que contenía 100 |ig/ml de ampicilina (Amp) y 34 |ig/ml de cloranfenicol (Cm) y se cultivó a 37 °C durante la noche. Las colonias cultivadas se subcultivaron sobre un medio líquido de LB/Amp/Cm y se incubaron a 37 °C hasta que la DO600 alcanzó 0,5-0,7. La disolución de cultivo se enfrió en hielo durante 30 minutos y luego se añadió isopropil-p-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para obtener una concentración de 0,1 mM. El cultivo se continuó a 15 °C durante 48 horas para inducir la expresión de una proteína.

Después de 48 horas, se centrifugó la disolución de cultivo de Escherichia coli para recoger células bacterianas. Se lavaron las células bacterianas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces y se suspendieron de nuevo en PBS. A esto, se le añadió fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF) para obtener una concentración de 0,1 mM. Después de eso, se trituraron las células bacterianas mediante una onda ultrasónica en condiciones: la potencia máxima, pulso de intervalo de 2 segundos y durante 15 minutos. Se centrifugó la disolución resultante de células bacterianas trituradas a 12000 rpm durante 20 minutos para separar una precipitación y un sobrenadante. Se realizó análisis de SDS-PAGE para confirmar la expresión de una proteína. Como resultado de SDS-PAGE, se detectaron bandas de proteínas que tenían tamaños presumiblemente correspondientes a PGV_CBD de Col G (101 k) y PGV_CBD de Col H (98 k) (figura 8). Estas bandas también se detectaron mediante transferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-etiqueta de His. A la solución cultivada de Escherichia coli en la que se confirmó que se expresaba una proteína deseada, se añadió dimetilsulfóxido (DMSO) hasta el 8 % y se almacenó a -80 °C en un congelador. Se usó esto como reserva de células bacterianas congeladas de PGV_CBD de Col G o PGV_CBD de Col H.

3) Determinación de la actividad luciferasa.

En el sobrenadante obtenido después de que se trituraran las células bacterianas de la cepa transformada, se confirmó la presencia de una proteína que tenía actividad luciferasa. La luciferasa usada en la presente invención tiene un espectro luminiscente que tiene un valor máximo a 550 nm. Después de mezclar Tris-HCl 50 mM (pH 8,0) con el producto en bruto, se añadió una disolución de sustrato (reactivo de ensayo de luciferasa Tripluc, TOYOBO CO., lTd .). Inmediatamente después, se midió la luminiscencia a 550 nm con el paso del tiempo. La luminiscencia de la luciferasa alcanzó el máximo inmediatamente después de añadir una disolución de sustrato, y luego disminuyó. La medición se continuó hasta que la luminiscencia disminuyó y aparentemente alcanzó casi una meseta. Después de eso, se midió el espectro luminiscente (figura 9). También cuando se expresó una proteína de fusión con CBD, se mostró la misma luminiscencia que la de PGV individual. En el producto en bruto obtenido inmediatamente después de la trituración, se observó una luminiscencia intensa a 550 nm. En el caso del producto en bruto almacenado en un congelador a -80 °C, se confirmó que la luminiscencia disminuyó gradualmente y que la inactivación se suprimió más en comparación con los productos en bruto almacenados a 4 °C y -20 °C.

(2) Método de purificación

A una columna de Ni-NTA agarosa (diámetro: 2,0 cm * 5,0 cm, volumen de columna 15 ml, QIAGEN) equilibrada con un tampón de NaCl 300 mM/fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), se le aplicó una disolución que se preparó diluyendo el producto en bruto (obtenido después de que se trituraran las células bacterianas) 10 veces con un tampón de equilibración. Después de que la fracción no retenida no adsorbida al portador se eliminara por lavado con el tampón de equilibración, se realizó la elución con tampones que contenían 50 mM, 200 mM y 500 mM de imidazol. Cada una de las fracciones eluidas mediante los tampones diferentes en la concentración de imidazol se verificó mediante SDS-PAGE. Se determinó una fracción de elución de imidazol 200 mM como una fracción que contenía PGV_CBD de ColG o PGV_CBD de ColH purificado (figura 10).

[Ejemplo 5] Determinación de la unión al tejido pancreático

Se mezclaron trozos de tejido pancreático porcino suspendidos en 100 |il de Tris-HCl 50 mM/CaCh 5 mM (pH 7,5) con una disolución enzimática purificada (100 |il) y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos, y luego se centrifugaron para separar una precipitación y un sobrenadante (sob. 1). La precipitación resultante se suspendió en un tampón de ácido acético 50 mM (pH 5,0) y se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos, y luego se centrifugó para separar una precipitación y un sobrenadante (sob. 2). La precipitación y el sobrenadante resultantes se sometieron a SDS-PAGE para verificar la unión del tejido pancreático a tdTomato ^c B^d de ColH (figura 11). Como resultados de SDS-PAGE, se observó una banda de tdTomato CBD de ColH en la precipitación. A partir de esto, se confirmó la unión al tejido pancreático. Se encontró que el tdTomato CBD de ColH unido al tejido pancreático se fraccionó en una precipitación y el tdTomato CBD de ColH no unido se fraccionó en el sob. 1. Además, dado que no se detectó ninguna banda en el sob. 2, se encontró que el tdTomato CBD de ColH aún se une a una fibra de colágeno en condiciones de pH ácido.

[Ejemplo 6] Método para analizar un componente de tejido biológico usando una sonda

[Método para medir un componente biológico]

Se describirá un método para medir un componente biológico de la presente invención.

(1) Método para medir un componente biológico mediante EGFP-CBD de ColG y DsRED-ColH

De un cerdo muerto por exanguinación, se extirpó el páncreas y se cortó en trozos de 5 mm2. Cada trozo de páncreas se incrustó en el compuesto OCT (fabricado por Sakura Finetek Co., Ltd.) y se congeló mediante nitrógeno líquido. Posteriormente, se cortó el trozo de páncreas en trozos delgados de 8 |im de espesor con un instrumento Cryostat CM 3050S (fabricado por Leica). Cada uno de los trozos delgados se unió sobre portaobjetos (fabricados por Matsunami Glass Ind., Ltd.). El portaobjetos preparado se empapó en una disolución de formalina (fabricada por WAKO), cuya concentración se controló para que fuera del 10 % con una disolución de tampón fosfato (PBS (-)) que no contenía ni ión de calcio ni ión de magnesio, y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos, y luego se secó durante 30 minutos. En una cubeta de vidrio, se vertió PBS (-) y el portaobjetos se incubó en la cubeta durante 5 minutos a temperatura ambiente. El portaobjetos preparado se almacenó en una caja de humedad de manera que el portaobjetos no se secara. El portaobjetos preparado se empapó en una solución de EGFP-CBD de ColG (200 |il) y se incubó a 37 °C durante una hora. Tras la finalización de la incubación, se realizó el lavado con PBS (-) durante 5 minutos. El portaobjetos preparado se lavó con PBS (-) en una botella de lavado y se cubrió con VECTORSHELD (fabricado por Vector). Posteriormente, el portaobjetos preparado se observó mediante un microscopio de fluorescencia BIOLE^v O BZ 9000 (fabricado por KEYENCE CORPORATION), y se fotografió una imagen.

(2) Resultados de la medición

Los resultados se muestran en la figura 12. En comparación con un control negativo, en la muestra de tejido teñida mediante EGFP-CBD de ColG, la región donde está presente el tejido se tiñó satisfactoriamente.

[Ejemplo 7] Método para medir un trozo de tejido

(1) Metodo de observación

Un portaobjetos preparado sobre el que se fijó el trozo de tejido pancreático de la rata y almacenado a -80 °C se empapó en CaCl25 mM/TBS a temperatura ambiente durante 10 minutos y se lavó con Milli-Q. Para bloquear una unión no específica, se añadieron gota a gota 100 |il de mioglobina (Myb) al 2% al portaobjetos preparado, que luego se preincubó a 37 °C durante 30 minutos y luego se lavó con Milli-Q. Se mezclaron cada una de las disoluciones de proteína (control de GFP, GFP CDB de ColG, control de tdTomato, tdTomato CBD de ColH) (40 |il) y Myb al 2 % (40 |il). Luego, cada una de las mezclas se añadió gota a gota sobre los trozos de tejido y se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Las concentraciones de las soluciones de proteínas se controlaron de la siguiente manera: control de GFP: 10 mg/ml, GFP CBD de ColG: 10 mg/ml, control de tdTomato: 5 mg/ml, tdTomato CBD de ColH: 5 mg/ml.

El portaobjetos preparado se empapó en CaCl25 mM/TBS a temperatura ambiente durante 10 minutos y se lavó con Milli-Q. Después de repetir este procedimiento dos veces, se observó el portaobjetos preparado mediante un microscopio de fluorescencia BI^o R^eVO BZ-9000 (fabricado por KEYENCE CORPORATION) con un aumento de 200 x. Se seleccionaron adecuadamente varias regiones y se fotografiaron las imágenes con un tiempo de exposición de 0,5 segundos.

Usando la función de medición del software adjunto al microscopio, se preparó un histograma del brillo de toda la fotografía. En control de GFP y GFP CBD de ColG, se seleccionó el brillo de fluorescencia verde solo, mientras que en control de tdTomato y tdTomato CBD de ColH, se seleccionó el brillo de fluorescencia roja solo.

A partir del histograma, se calcularon y organizaron las diferencias del valor de brillo promedio (brillo promedio delta) entre el control de GFP y el GFP CBD de ColG, y entre el control de tdTomato y el tdTomato CDB de ColH para cada linaje. A medida que aumenta el valor de brillo promedio delta así calculado, el número de enlaces entre el CDB y el tejido aumenta, lo que indica que la intensidad fluorescente difiere significativamente del control. Como resultado de que los valores de brillo promedio delta se compararon entre sí, la unión de CBD de ColG y CBD de ColH al tejido pancreático difiere dependiendo del linaje y la edad en la semana.

(2) Método para separar el islote pancreático de rata

Basándose en la “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (revisada en 1996)” publicada por los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos, se llevaron a cabo experimentos con animales. Se usaron ratas Lewis macho (Slc, Japón) que tenían un peso corporal de 239-268 g, ratas SD macho (Slc, Japón) que tenían un peso corporal de 255-301 g y ratas Wistar-Furth macho (Slc, Japón) que tenían un peso corporal de 197-231 g. Se establecieron grupos experimentales sin cambiar la cantidad de termolisina (0,322 mg) que servía como proteasa neutra de la siguiente manera: un grupo que proporciona un producto de alta pureza de tipo recombinante: Col G (5,46 mg) y Col H (2,02 mg) en una razón de cantidad de enzima patrón de (razón H/G) de 3,7; un grupo de 10 veces (Col G (4,96 mg), Col H (18,34 mg), termolisina (0,322 mg), (razón H/G = 3,70)); un grupo de 1/10 veces (Col G (5,51 mg), Col H (0,20 mg), termolisina (0,322 mg), (razón H/G = 0,04)); un grupo de ausencia completa de Col G y un grupo de ausencia completa de Col H. Antes de extirpar el páncreas, se inyectaron combinaciones de enzimas disueltas en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) fría a través del conducto colédoco para expandir los tejidos pancreáticos. Después de añadir 10 ml de HBSS, se colocó el páncreas en un baño caliente a 37 °C o menos durante 14 minutos para digerirlo. Posteriormente, se llevó a cabo una centrifugación en gradiente de concentración utilizando Histopaque-1119 (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, EE. UU.) y Lymphoprep™ (NycomedPharma AS, Oslo, Noruega) para tomar una capa que contenía islotes pancreáticos. El tejido obtenido por la operación de separación de islotes pancreáticos se tiñó con difeniltiocarbazona (Wako, Osaka, Japón) para distinguir los islotes pancreáticos del tejido distinto de los islotes pancreáticos, tal como una glándula exocrina y un conducto de excreción. Cada rendimiento se midió directamente bajo observación microscópica. El rendimiento de los islotes pancreáticos separados se indicó en cuanto a equivalente de islotes (IEQ) (1 IEQ corresponde al tamaño de un islote pancreático de 150 |im de diámetro. Esto está definido por la norma internacional).

(3) Resultados experimentales

1) Resultados de medición del brillo fluorescente de GFP CBD de ColG y tdTomato CBD de ColH en trozos de tejido de ratas

El brillo fluorescente de dos sondas, es decir, ColG y ColH en ratas y la razón de ellas se muestran en la figura 13 y en la tabla 1.

[Tabla 1]

2) Resultados de la separación de islotes pancreáticos en ratas

En el caso de que la razón de brillo fluorescente de dos sondas, ColG y ColH, es decir, un valor H/G sea de 0,85 o más, la razón de cantidad de adición de ColH a ColG, es decir, la razón ColH/G, debe ser un valor óptimo. Sin embargo, en el caso de que el valor H/G sea de 0,8 o menos, la razón ColH/G no tiene un efecto significativo. Se encontró que si no se añade ColG, el rendimiento de un islote pancreático no se ve afectado significativamente. Se realizó una prueba de separación de islotes pancreáticos cambiando la razón de contenido de ColH y ColG que va a usarse para la separación de los islotes pancreáticos en ratas de acuerdo con el valor numérico mencionado anteriormente. Se midió el rendimiento de los islotes pancreáticos en esta prueba. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

[Tabla 2]

En el caso de ColH/ColG = 2/10 (valor estándar)

Rendimiento del islote pancreático (IEQ) Lewis SD Wistar 2772 2836 3050 3040 3104 2224 3806 2516 2927 Valor promedio 3206 2819 2734

En el caso de ColH/ColG = 1/10

Rendimiento del islote pancreático (IEQ) Lewis SD Wistar 2049 1855 1306 2827 2669 1174 2710 2311 1997 2748 2220 1493 2752 1747

3404 3541

Valor promedio 2748 2368 1493 Valor de p 0,21 0,27 0,009 % de rendimiento 85,7 84,0 54,6

En el caso de ColH/ColG = 10/1

Rendimiento del islote pancreático (IEQ) Lewis SD Wistar 3416 1711 2015 2282 2517 2134 2707 2652 2796 3338 2821 3233 3188 2804 2269 3488 4653

Valor promedio 3070 2860 2489 Valor de p 0,71 0,95 0,52 % de rendimiento 95,8 101,5 91,0

En el caso de ColH/ColG = 10/0

Rendimiento del islote pancreático (IEQ) Lewis SD Wistar 1671 1443 1364 1807 2350 2764 Valor promedio 1739 1897 2064 Valor de p 0,04 0,11 0,36 % de rendimiento 54,2 67,3 75,5 Tal como se muestra en la tabla 2, incluso en ausencia completa de Col G, fue posible la separación de los islotes pancreáticos en todos los linajes de ratas. En cambio, en ausencia completa de Co1H, el páncreas no se digirió en absoluto en todos los linajes de ratas. A continuación, se encontró que la razón Co1H/G tiene un efecto sobre los resultados de la separación de islotes pancreáticos. En el caso en el que la razón H/G se fijó en 1/10, el rendimiento de los islotes pancreáticos separados disminuye significativamente solo en el grupo de Wistar (54,6 % de la razón de referencia, p = 0,009). Además, también en ausencia completa de Col G, se obtuvo un rendimiento suficiente de islotes pancreáticos separados en el orden de Wistar (75,5 %), SD (67,3 %) y Lewis (54,2 %). La expresión de un sustrato que requiere Col H tenía una tendencia de Wistar > SD > Lewis.

Tal como se describió anteriormente, se demostró que si la razón de cantidad de uso óptima de ColH y ColG se calculaba para optimizar las cantidades de uso de ColG y ColH, pueden separarse islotes pancreáticos con un alto rendimiento.

[Ejemplo de referencia] Efecto de la razón de colagenasa (ColH/ColG) sobre la separación de islotes pancreáticos Se realizó la separación de los islotes pancreáticos cambiando la razón de colagenasa (ColH/ColG) de dos colagenasas usadas en la separación de los islotes pancreáticos de ratas a 0, 0,05, 0,1, 0,2 y 0,4. Como resultado, en el ATP/ADN, la prueba de tolerancia a hidratos de carbono in vitro y el experimento de insulina/ADN (que muestran rendimiento y calidad), se confirmó que pueden separarse islotes pancreáticos de alta calidad con un alto rendimiento en el intervalo de razón de colagenasa de desde 0,1 hasta 0,2.

Los resultados se muestran en la figura 14. La figura 14A muestra el rendimiento. La figura 14B muestra el ATP/ADN, que es un valor corregido de la carga de energía (ATP) por el tamaño (ADN) del islote pancreático. La prueba de tolerancia a hidratos de carbono in vitro de la figura 14C muestra la capacidad de secreción de insulina de los islotes pancreáticos en respuesta a la glucosa, y representa una acción adicional de los islotes pancreáticos. La insulina/ADN que se muestra en la Figura 14D es un valor corregido de la cantidad de insulina por el tamaño (ADN) del islote pancreático. Si un reactivo o similar es tóxico para los islotes pancreáticos, a menudo se produce la desgranulación de los islotes pancreáticos. Por tanto, esto se posiciona como un tipo de prueba de toxicidad para los islotes pancreáticos.

Se ha notificado que como la enzima para separar islotes pancreáticos, son adecuadas dos tipos de colagenasas (ColG y ColH) producidas por Clostridium histolyticum y una metaloproteasa neutra (Diabetes: 46: 1120: 1997). Los resultados anteriores enseñan que la razón de combinación de dos tipos de colagenasas (ColG y ColH) es un factor importante para determinar el rendimiento y la calidad de la separación de islotes pancreáticos.

La razón de combinación óptima de colagenasas varía dependiendo del animal distinto de una rata tal como un cerdo y un ser humano, incluso si los individuos pertenecen a la misma especie, y por tanto es un factor que disminuye la tasa de éxito en el aislamiento de islotes pancreáticos. Por tanto, si la razón de combinación óptima de colagenasas que va a usarse se determina usando las sondas de la presente invención antes de separar los islotes pancreáticos, es posible calcular las cantidades de uso de colagenasas que han de emplearse y llevar a cabo la separación de islotes pancreáticos en una razón de combinación óptima, con el resultado de que pueden obtenerse islotes pancreáticos de alta calidad con un alto rendimiento.

Aplicabilidad industrial

Según la presente invención, es posible determinar de manera precisa y fácil el tipo y la cantidad de proteasa que ha de usarse a partir de la composición proteica de la matriz extracelular u órgano que va a separarse, y aislar células deseadas y similares mientras se mantiene una alta actividad. Por tanto, la presente invención es útil en una amplia variedad de usos en el campo de la terapia, el diagnóstico y el examen, incluyendo el trasplante de órganos, tal como el trasplante de islotes pancreáticos, la medicina regenerativa mediante trasplante celular y el establecimiento de cepas celulares.

Texto libre de lista de secuencias

SEQ ID NO: 3: ADN de oligonucleótido

SEQ ID NO: 4: ADN de oligonucleótido

SEQ ID NO: 5: cebador directo para CBD de ColG (cebador 1)

SEQ ID NO: 6: cebador inverso para CBD de ColG (cebador 2)

SEQ ID NO: 7: cebador directo para EGFP (cebador 3)

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   i . Método para analizar un tejido biológico, que comprende aplicar dos o más sondas respectivamente, conteniendo cada una un dominio de unión a sustrato de una proteasa a través del cual dicha proteasa se une a proteínas de la matriz intercelular de un componente biológico predeterminado, a un tejido biológico aislado y analizar las cantidades de unión de las sondas al tejido biológico;

   en el que las sondas se marcan con una molécula de visualización.
2. 2. Método según la reivindicación 1, en el que cada una de las sondas se marca con una molécula de visualización seleccionada de moléculas fluorescentes, moléculas luminiscentes y radioisótopos incluyendo un núclido positrónico, y preferiblemente, en el que la molécula de visualización es una proteína luciferasa y/o una molécula fluorescente seleccionada del grupo que consiste en GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato y RFP.
3. 3. Método según la reivindicación 2, en el que cada uno de los dominios de unión a sustrato y la molécula de visualización forman una proteína de fusión.
4. 4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que cada uno de los dominios de unión a sustrato comprende un dominio de unión a colágeno de una proteasa.
5. 5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende: aplicar las dos o más sondas por separado o simultáneamente a un tejido biológico, y medir las cantidades de unión de las sondas por separado o simultáneamente.
6. 6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende: aplicar las dos o más sondas simultáneamente a un tejido biológico, y medir las cantidades de unión de las sondas simultáneamente.
7. 7. Método para separar células o poblaciones de células de un tejido biológico, que comprende: analizar el tejido biológico mediante el método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, determinar una razón cuantitativa de proteasas basándose en los resultados del análisis y aplicar las proteasas en la razón cuantitativa al tejido biológico para separar las células o las poblaciones de células.
8. 8. Conjunto de sondas adecuado para análisis de un tejido biológico, que comprende dos o más sondas respectivamente, conteniendo cada una un dominio de unión a sustrato de una proteasa a través del cual dicha proteasa se une a proteínas de la matriz intercelular de un componente biológico predeterminado, en el que las sondas se marcan con moléculas de visualización mutuamente diferentes seleccionadas de moléculas fluorescentes, moléculas luminiscentes y radioisótopos incluyendo un núclido positrónico.
9. 9. Conjunto de sondas según la reivindicación 8, en el que las moléculas de visualización son una(s) proteína(s) luciferasa y/o una(s) molécula(s) fluorescente(s) seleccionada(s) del grupo que consiste en GFP, eGfP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato y RFP, y preferiblemente, en el que la proteína luciferasa tiene una longitud de onda pico e intensidad luminiscente diferentes de una luciferasa de tipo natural.
10. 10. Conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 9, en el que cada uno de los dominios de unión a sustrato y cada una de las moléculas de visualización forman una proteína de fusión.
11. 11. Conjunto de sondas según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que los dominios de unión a sustrato son dominios de unión a colágeno de una proteasa.
12. 12. Conjunto de sondas según la reivindicación 11, en el que los dominios de unión a colágeno son dominios de unión a colágeno de colagenasa seleccionados de colagenasas derivadas del género Clostridium.
13. 13. Conjunto de sondas según la reivindicación 12, en el que los dominios de unión a colágeno son dominios de unión a colágeno de colagenasa G y colagenasa H derivadas de Clostridium histolyticum.
14. 14. Conjunto de sondas según la reivindicación 13, en el que cada uno de los dominios de unión a colágeno comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 1, una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 o secuencias parciales de las mismas.