KR101921353B1 - 생체 조직 분석용 프로브 및 그 이용법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 생체 조직으로부터, 효소적 단리에 의해, 높은 생물 활성을 갖는 세포 또는 세포 집단을 고수량으로 얻는 방법 및 이를 위한 프로브에 관한 것이다. 구체적으로는, 특정 생체 성분에 결합하는 2종 이상의 단백질에 대해서, 상기 생체 성분 결합 도메인을 각각 포함하는 2종 이상의 프로브를 단리된 생체 조직에 적용하고, 상기 각 프로브의 생체 조직에 대한 결합량을 해석하는 것을 특징으로 하는 생체 조직의 분석 방법에 관한 것이다.

Description

생체 조직 분석용 프로브 및 그 이용법{PROBE FOR ANALYZING BIOLOGICAL TISSUE AND METHOD FOR UTILIZING SAME}

생체 조직으로부터, 효소적 단리에 의해, 높은 생물 활성을 갖는 세포 또는 세포 집단을 고수량으로 얻는 방법 및 이를 위한 프로브에 관한 것이다.

생체 조직으로부터의 세포 및 세포 클러스터의 효소적 단리는, 그 세포의 이식이나 세포주의 수립을 포함하는 여러 가지의 목적 및 치료, 진단 및 검사 등의 폭넓은 용도에 유용하다. 그러나, 생체 조직을 해리시키고, 거기에 포함되는 세포 또는 세포 집합체를 단리하기 위해서는, 세포 또는 세포 집합체를 바람직한 정도로 유리시키고, 세포 조직 부분으로부터 분리해야 한다. 생체 조직으로부터, 세포 및 세포 클러스터를 분리할 때는, 세포간 매트릭스를 콜라게나제 등의 단백질 분해 효소의 혼합물로 분해한다.

생체 조직은, 세포와 세포간 매트릭스에 의해 구성된다. 세포간 매트릭스는 세포를 고정시키는 물질로, 구조물과 비구조물이 있다. 전자는, 교원 섬유, 탄성 섬유, 세망 섬유 등의 섬유가 있고, 후자는, 섬유 사이를 메우는 성분으로 기질이라고 불리는 졸 내지 겔형의 물질로, 당단백질 및 프로테오글리칸이 있다. 세포간 매트릭스의 대표는, 콜라겐(Collagen)이라고 하는 단백질이며, 생체내 총단백질 중량의 약 1/3을 차지하고 있다. 콜라겐은 섬유 구조를 이루고 있고, 정식으로는 콜라겐 섬유, 교원 섬유라고 불리고 있다.

조직은, 상피 조직, 지지 조직, 근 조직, 및 신경 조직의 4개로 대별된다. 상피 조직은, 신체의 표면을 덮고 있는 조직으로 세포 밀도가 높고, 세포간 매트릭스가 개재되지 않는다. 지지 조직은 몸, 장기 및 세포 등을 지지하는 역활을 하고 있고, 결합 조직, 연골 조직, 골 조직, 혈액, 림프가 포함된다. 근 조직은 수축 운동을 목적으로서 분화된 세포의 융합이며, 세포간 매트릭스가 차지하는 비율은 매우 적다.

근 조직은 근세포, 결합 조직, 혈관 및 신경으로 구성되지만, 주된 구조물은근섬유이다. 신경 조직은, 신경 내막과 신경 주막을 주로서 구성되고, 어디에나 세포간 매트릭스(콜라겐)가 많이 포함된다. 결합 조직은 지지 조직의 1종으로, 지방 조직과 섬유성 결합 조직(교원 섬유 및 탄성 섬유를 구성 성분으로 함)으로 이루어지고, 소수성 결합 조직과 강인성 결합 조직으로 대별된다. 소수성 결합 조직은, 콜라겐이 불규칙한 주행을 취하고 있는 섬유성 결합 조직이며, 피하 조직, 점막 조직, 신경, 혈관 외막, 소엽간 조직 등에 분포되어 있다.

세포간 매트릭스에서의 콜라겐의 함유량은, 생물종, 연령, 성별, 조직, 생활환경 등에 따라 상태가 상이하다. 그러나, 어떤 콜라겐이, 어떤 조직의 어떤 상태의 매트릭스에, 어느 정도 포함되어 있을지는, 아직 충분히 밝혀져 있지 않다. 콜라겐의 특징은, 단백질의 펩티드쇄를 구성하는 아미노산이, 「-글리신-아미노산 X-아미노산 Y」로 글리신이 3잔기마다 반복하는 1차 구조를 갖는 점에 있다. 인간의 콜라겐 단백질은, 30종류 이상 있는 것이 보고되어 있지만, 체내에 가장 풍부하게 존재하고 있는 것은 섬유성의 I형 콜라겐이고, 비섬유성의 IV형 콜라겐도 많이 포함되어 있으며, 분자간 디술피드 결합을 통해 상호 연결되어 망상 조직의 형성에 관여되어 있다(비특허문헌 1). 췌도와 내분비 조직 사이에는, IV형 콜라겐이 존재하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 2, 3).

특정 타입의 콜라겐이, 대상으로 하는 매트릭스에 존재하거나, 각 타입의 콜라겐에 대한 항체를 이용하여 면역 염색함으로써, 이론적으로는 결정 가능하다고 생각된다. 그러나, 콜라겐의 종류는 많고, 또한 다세포 동물에 널리 존재하기 때문에, 항체의 제조가 어려운 것 등이 방해가 되어, 그 실현을 곤란하게 하고 있다.

조직 분해용 효소인, 히스톨리티쿰(histolyticum)균에 유래하는 여러 가지의 종류의 조(粗)콜라게나제는, 2종류의 콜라게나제 이외에, 여러 가지의 프로테아제 효소(콜라겐 분해 활성 및 비특이적 단백질 분해 활성)와 비프로테아제 성분(포스포리파아제 등)을 포함하고 있다. 이 조콜라게나제에 의해, 개개의 세포 및 세포 집단은 생체 조직으로부터 효소적으로 분리되어 있다.

생체 조직으로부터 개개의 세포 또는 세포 집단으로 효소적으로 분리할 때, 분리되는 세포나 세포 집단의 수율 및 그 생물 활성에는, 2종류의 콜라게나제(ColG 및 ColH)가 중요한 작용을 하고, 그 양비(量比)가 크게 영향을 미치는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 4). 췌장 조직으로부터 췌도를 분리하는 경우에서도, 히스톨리티쿰균(Clostridium histolyticum)이 생산하는 2종류의 콜라게나제가 이용된다(비특허문헌 5, 특허문헌 1 및 2). 본 발명자들은, 지금까지, 2종류의 콜라게나제의 양비의 최적화에 의해, 높은 췌도를 분리할 수 있는 것을 확인하고 있다.

콜라게나제는, 그 종류에 따라 상이한 콜라겐 결합 도메인을 갖고 있는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 6). 지금까지, 여러 가지 기능성 단백질과 콜라겐 결합 도메인과의 융합 단백질이, 타겟팅이나 드러그 딜리버리 시스템(DDS)을 목적으로서 제작되어 있다. 예컨대 히스톨리티쿰균의 콜라겐 결합 도메인에 bFGF 또는 EGF를 결합시킨 콜라겐 결합성 세포 증식 인자(비특허문헌 7), 소(牛) 폰빌레브란트 인자 유래의 콜라겐 결합 데카 펩티드와 TGF-β와의 융합 단백질(비특허문헌 8 및 9), 피브로넥틴의 콜라겐 결합 도메인에 기능성 펩티드를 결합시킨 서방성 세포 증식 인자 공급체(특허문헌 3)를 들 수 있다. 이와 같이, 콜라겐 결합 도메인과의 융합 단백질은, 타겟팅이나 조직의 가시화를 목적으로서 제작되어 있지만, 생체 조직의 분석이나 분리에 이용된 경우는 없다.

특정 조직이나 세포를 상처내지 않고 단리하기 위해서는, 그 조직이나 세포의 주위에 존재하는 세포간 매트릭스를 분해하는 것이 필요하다. 그러나 필요한 세포의 표면을 분해하거나, 상처내지 않고, 세포간 매트릭스만을 효소로 분해하는 것은 용이하지 않다. 특히 인간의 장기의 경우, 연령, 성별, 생활습관, 병력 등에 따라, 단백질 분해 효소에 의한 분해성이 상이하기 때문에, 경험적으로 효소의 종류나 효소 반응 시간을 정하여, 단리를 행하지 않을 수가 없다.

당뇨병 환자로서는, 췌장으로부터 단리된 췌도를 이식하는 치료(췌도 이식)가 행해지고 있다. 췌도 이식에는, 췌도라고 불리는 췌도 조직에 존재하는 세포 덩어리의 분리가 필수이며, 췌도를 상처내지 않고 췌장 조직을 분해하여, 췌도를 분리해야 한다. 그러나, 세포간 매트릭스의 상태는, 동물의 종류, 조직의 부위, 개체의 연령이나 성별, 생육 환경 등에 따라 크게 상이하다. 특히 콜라겐에 관해서는, 가령에 의한 물성의 변화가 현저하다. 그럼에도 불구하고, 상태가 상이한 췌장 조직에 대하여, 프로토콜에 따른 일정량비의 효소를 적용하여, 분해 시간만을 바꿔, 육안으로 췌장의 분해 정도를 확인하면서, 효소 처리를 행하고 있다. 이 때문에 의료기관, 의료 종사자, 대상이 되는 췌장의 상태에 따라, 얻어지는 췌도의 양이나 질은 제각각이다.

분리해야 하는 세포외 매트릭스 또는 장기의 단백질 조성으로부터, 사용하는 단백질 분해 효소의 종류나 양을 정확하고 간편하게 알 수 있으면, 목적의 세포 등을 고활성의 상태로, 단리하는 것이 가능해진다.

특허문헌 1: WO96/00283 특허문헌 2: WO98/24889 특허문헌 3: WO02/014505

비특허문헌 1: Inoue et al., J Cell Biol, 97, 1524-1537(1983) 비특허문헌 2: SJ Hughes, P McShane, Transplant Proceedings, 37, 3444-34445(2005) 비특허문헌 3: SJ Hughes, A Clark, P McShane, Transplantation, 81(3) 423-426(2006) 비특허문헌 4: D Brandhorst et al., Transplantation Proceedings, 37(8), 3450-3451(2005) 비특허문헌 5: E Linetsky et al., Diabetes, 46, 1120-1123(1997) 비특허문헌 6: K Watanabe, Appl Microbiol Biotechnol, 63, 520-526(2004) 비특허문헌 7: N Nishi, O Matsushita, K Yuube, H Miyanaka, A Okabe, F Wada, Proc Natl Acad Sci USA.; 95(12): 7018-7023(1998) 비특허문헌 8: Tuan et al., Connective Tissue Reserch, 34(1), 1-9(1996) 비특허문헌 9: Han et al., Protein Expression and Purification 11, 169-178(1997)

본 발명의 목적은, 생체 조직으로부터, 신속하고 고효율로, 높은 생물 활성을 갖는 세포나 세포 집단을 분리하는 수단을 제공하는 것에 있다. 구체적으로는, 생체 조직중 생리 활성 물질, 세포 또는 및 장기의 생리 활성을 저하시키지 않고, 목적으로 하는 세포나 세포 집단을 고수량으로 취득하는 것에 있다.

발명자들은, 2종류의 효소가 갖는 기질 결합 도메인(생체 성분 결합 도메인)과 가시화 단백질의 융합 단백질을 이용한 생체 조성 분석용 프로브를 제작하였다. 그리고, 이 프로브의 결합량을 해석하고, 생체 조직에 대한 효소의 작용성을 예측함으로써, 최적의 효소의 양비나 작용 시간 등을 결정하여, 목적으로 하는 세포나 세포 집단을, 보다 효율적으로, 높은 생물 활성을 갖은 상태로 분리할 수 있는 것을 발견하였다.

즉, 본 발명은, 특정 생체 성분에 결합하는 2종 이상의 단백질에 대해서, 상기 생체 성분 결합 도메인을 각각 포함하는 2종 이상의 프로브를 단리된 생체 조직에 적용하고, 상기 각 프로브의 생체 조직에 대한 결합량을 해석하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직의 분석 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용하는 프로브는, 공지의 분자 이미징 기술을 이용하여 가시화되도록 설계되어 있다. 즉, 프로브는, 형광 분자, 발광 분자, 포지트론 핵종, 및 방사성 동위체 등의 가시화 분자에 의해 라벨되어 있다.

가시화 분자로서는, GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato, RFP 등의 형광 분자나 루시페라아제 단백질 등의 발광 분자를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 루시페라아제 단백질은, 자연에 존재하는 야생형 루시페라아제와는 상이한 피크 파장 및 발광 강도를 갖는 것이 바람직하다.

형광 분자나 발광 분자는, 단독으로 이용하여도 좋고, 형광 분자(에너지 수용 단백질)와 루시페라아제와 같은 자기 발광 가능한 분자(에너지 발생 단백질)를 조합하여 이용하여도 좋다. 이 경우, 양자는 적당한 링커를 개재하여 연결하는 것이 바람직하다.

프로브에 이용되는 생체 성분 결합 도메인으로서는, 단백질 분해 효소의 콜라겐 결합 도메인, 또는 피브로넥틴 등의 생체내 단백질의 콜라겐 결합 도메인 등을 들 수 있다. 전자의 구체예로서는, 클로스트리듐속(Clostridium) 유래의 콜라게나제가 갖는 콜라겐 결합 도메인, 예컨대 히스톨리티쿰균(Clostridium histolyticum) 유래의 콜라게나제 G 및 콜라게나제 H의 콜라겐 결합 도메인을 들 수 있다.

또한, 프로브에 이용되는 콜라겐 결합 도메인은, 본 발명의 목적과 효과를 달성할 수 있는 한에 있어서, 이 도메인의 일부(부분 서열)여도 좋고, 「콜라겐 결합 도메인」이라는 표현에는, 이러한 콜라겐 결합 도메인의 일부도 포함된다.

본 발명에서 사용되는 기질 결합 도메인의 구체적인 일례로서, 전술한 히스톨리티쿰균 유래의 콜라게나제 G 및 콜라게나제 H의 콜라겐 결합 도메인의 아미노산 서열을 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 나타낸다.

가시화 분자가 단백질인 경우, 생체 성분 결합 도메인과 가시화 분자(단백질)는, 융합 단백질로서 제작할 수 있다.

프로브에는, 생체 성분 결합 도메인의 서열이, 1∼100회, 바람직하게는 1∼20회 반복하여 포함된다.

본 발명의 분석 방법에서는, 2종 이상의 프로브를 별도로 생체 조직에 작용시켜도 좋고, 동시에 작용시켜도 좋다. 또한, 각 프로브의 결합량도, 별도로 측정하여도 좋고, 동시에 측정하여도 좋다. 바람직하게는, 2종 이상의 프로브를 상이한 가시화 분자로 라벨하고, 프로브를 동시에 작용시켜, 그 결합량을 동시에 측정한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 분석 방법을 이용한, 생체 조직으로부터의 세포 또는 세포 집단의 분리 방법도 제공한다. 본 발명의 분리 방법은, 상기 분석 방법을 이용하여 생체 조직을 분석하고, 그 결과에 기초하여 효소(프로브에 포함되는 기질 결합 도메인의 유래가 된 효소)의 양비를 결정하며, 그 양비의 효소를 생체 조직에 작용시켜, 목적으로 하는 세포 또는 세포 집단을 분리하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기한 2종류 이상의 프로브로 이루어지는 생체 조직 분석용 프로브 세트나, 이 프로브 세트와 효소 등을 포함하는 생체 조직 분리용 키트도 제공한다.

본 발명에서 이용되는 프로브는, 생체 성분 결합 도메인을 포함하고, 생체 조직중에 존재하는 특정한 효소 결합 부위 등에 특이적으로 결합하여, 형광이나 발광을 발생시킨다. 각 효소에 대응한 프로브로부터 생기는 형광이나 발광 등을 관찰함으로써, 생체 조직에서의 효소의 어피니티나 작용성을 분석할 수 있다. 구체적으로 말하면, 프로브를 대상으로 하는 조직의 소량의 동결 절편과 함께 인큐베트하고, 염색시킨다. 조직의 절편상의 단백질 조성을 색조 및 그 형광 강도로부터, 프로브와의 결합 상황을 해석하여, 분해에 최적의 효소의 양비나 작용 시간을 산출할 수 있다.

즉, 본 발명에 의하면, 분리해야 하는 세포외 매트릭스 또는 조직의 단백질에 대한 프로브의 결합성으로부터, 사용하는 단백질 분해 효소의 종류나 양을 정확하고 간편하게 알 수 있다. 이것에 의해, 목적으로 하는 세포나 세포 집단을, 신속하고 간편하게, 고활성을 유지한 상태로 생체 조직으로부터 단리할 수 있다. 예컨대 췌도 이식이면, 대상이 되는 췌장 조직의 상태에 따른 효소의 처리가 가능해져, 항상 대량으로 질 좋은 췌도 분리를 실현하는 췌장 조직 상태의 인덱스를 확립하는 것이 가능해진다.

도 1의 (A)는 ColGCBD의 구성이고 (B)는 ColHCBD의 구성이다.
도 2는 tdTomatoColH CBD의 서열 개략도이다.
도 3은 Ni-NTA 용출 분획의 SDS-PAGE이다.
도 4는 음이온 교환 크로마토그래피 용출 분획의 SDS-PAGE이다.
도 5는 tdTomatoColH CBD의 여기, 형광 스펙트럼이다.
도 6은 루시페라아제 유전자와 CBD 유전자의 증폭에 이용한 프라이머의 개략도이다.
도 7은 루시페라아제-콜라겐 결합 도메인 융합 단백질(Luciferase-Collagen binding domain fusion protein) 발현 플라스미드이다.
도 8은 프로브 단백질의 발현 확인(SDS-PAGE)이다.
도 9는 루시페라아제 발광의 확인(발광 스펙트럼과 550 ㎚의 발광 강도의 시간 경과에 따른 변화)이다.
도 10은 Ni-NTA 아가로스 칼럼 용출 분획의 SDS-PAGE[M: 단백질 마커, S: PGV_ColH CBD crude, FT: 통과 분획(flow-through fraction), 50 mM∼500 mM: 각 농도의 이미다졸 용출 분획(200 mM 이미다졸 용출 분획의 1번째를 정제 효소 용액으로 하였다.)]이다.
도 11은 췌장 조직편과의 결합 확인 실험이다.
도 12는 EGFP-ColGCBD 프로브에 의한 돼지 췌장 절편의 조성 분석 결과이다.
도 13은 래트 조직 절편에서의 GFP ColG CBD와 tdTomato ColH CBD의 형광 휘도의 비(H/G: GFP ColG CBD에 대한 tdTomato ColH CBD의 형광 휘도의 비, W: Wister-Furth rat, L: Lewis rat, SD: SD rat)이다.
도 14는 콜라게나제 G 및 H의 조성비의 차이에 의한 췌도의 양·질에의 영향(A: 수량, B: ATP/DNA, C: In vitro 당부하 시험, D: 인슐린/DNA)
본 명세서는, 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2011-058080호의 명세서에 기재된 내용을 포함한다.

1. 생체 조직의 분석 방법

본 발명은, 특정 생체 성분에 결합하는 2종 이상의 단백질에 대해서, 상기 생체 성분 결합 도메인을 각각 포함하는 2종 이상의 프로브를 이용하여, 이 프로브에 대한 생체 조직의 결합량(어피니티)을 해석하고, 그 결과를 생체 조직의 분해, 세포나 세포 집단의 단리에 응용하는 것이다.

여기서, 「특정 생체 성분에 결합하는 2종 이상의 단백질」이란, 피브로넥틴이나 인테그린 등의 세포간 매트릭스 단백질이나, 단백질 분해 효소 등의 효소를 들 수 있다. 이들의 단백질은, 그 리간드나 기질에 대하여 특이적으로 결합하는 부위(도메인)을 갖고 있고, 본 명세서중에서는 이 부위를 「생체 성분 결합 도메인」으로 기재한다.

생체 조직으로부터 세포나 세포 집단을 단리하는 경우에는, 통상 복수의 효소가 사용되는 경우가 많다. 그러나, 각 효소의 작용성(조직의 감수성)은, 적용하는 생체 조직의 부위나 상태에 따라 크게 상이하다. 이 때문에 높은 생물 활성을 유지한 채, 신속하고 고효율로, 목적으로 하는 세포나 세포 집단을 분리하기 위해서는, 최적의 효소의 사용량, 사용 비율, 작용 시간 등을 사전에 결정하는 것이 바람직하다. 본 발명의 프로브는, 그와 같은 최적의 효소의 사용량, 사용 비율, 작용 시간 등을 간편히 결정하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에서 대상이 되는 「생체 조직」은 특별히 한정되지 않고, 포유류, 조류, 파충류, 어류 등 다세포 동물의 조직, 간장, 췌장, 신장, 치주 조직, 간장, 췌장, 피부, 연골, 뼈, 신경 조직을 널리 포함한다. 또한, 생체로부터 단리된 것뿐만 아니라, 인공적으로 구축된 ES 세포 조직, iPS 세포의 소재용 섬유아세포 조직 등도 포함한다.

본 발명에서는, 특정 생체 성분에 결합하는 2종 이상의 단백질에 대해서, 그 생체 성분 결합 도메인(예컨대 다른 효소의 기질 결합 부위)을 각각 포함하는 「2종 이상의 프로브」가 이용된다. 프로브에 이용되는 생체 성분 결합 도메인은, 분석의 목적에 따라 적절하게 선택된다.

예컨대 생체 조직의 효소 소화(분해)나 세포나 세포 집단의 분리에 앞서는 생체 조직의 분석이면, 이러한 효소 소화나 세포 분리에 이용되는 단백질 분해 효소의 기질 결합 도메인을 프로브에 사용한다.

조직 분해에서 이용되는 단백질 분해 효소로서는, 예컨대 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 디스파아제, 엘라스타아제, 파파인, 프로나아제, 서몰리신, 서브틸리신, 브로멜라인, 피틴, 써미타아제 등을 들 수 있다. 콜라게나제로서는, 특히, 히스톨리티쿰균(Clostridium histolyticum) 유래의 콜라게나제 G나 콜라게나제 H 외, 방선균 유래의 콜라게나제, 웰시균(Clostridium perfringens) 유래의 콜라게나제 등을 들 수 있다. 이들 효소의 기질 결합 부위의 1차 구조는 이미 해석되어 있는 것이 많고, 그 정보를 이용하여, 당업자는 프로브의 설계를 행할 수 있다.

생체 조직에 결합한 프로브는, 공지의 분자 이미징 기술을 응용하여 가시화함으로써, 조직에 손상을 부여하지 않고, 그 결합량을 간편히 측정할 수 있다. 프로브는, 이용하는 이미징 기술에 따라, 형광 분자, 발광 분자, 및 포지트론 핵종 등의 방사성 동위체 등의 적당한 가시화 분자에 의해 라벨된다. 프로브의 설계에 대해서는, 다음 항에서 상술한다.

2종 이상의 프로브는, 별도로 생체 조직에 적용하여도 좋고, 동시에 적용하여도 좋다. 또한, 그 결합량의 측정도, 별도로여도 좋고, 동시여도 좋다. 단, 측정의 신속 간편의 점에서는, 2종 이상의 프로브는 상이한 가시화 분자로 라벨하고, 동시에 생체 조직에 적용하며, 동시에 그 결합량을 측정하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는, 상기 2종 이상의 프로브를 단리된 생체 조직에 적용하고, 이 프로브의 생체 조직에의 결합량(어피니티)를 해석하며, 그 결과를 생체 조직의 분해, 세포나 세포 집단의 단리에 응용한다. 예컨대 2종 이상의 프로브의 생체 조직에의 결합량비를 구하고, 그 값으로부터 이 생체 조직의 분해, 세포나 세포 집단의 단리에 이용하는 효소의 최적량비를 결정한다. 프로브의 결합비와 이용하는 효소의 양비에는 상관 관계가 있고, 결합비가 높아지면, 효소의 최적량비도 높아진다. 단, 각 효소는 각각 unit 수, 역가(효력 unit/㎎), 최적 온도, 최적 pH, 작용 시간이 상이하기 때문에, 이들의 요소와 프로브의 결합비를 종합 고려한 후에, 이용하는 효소의 양비는 최종적으로 결정된다. 본 발명에 의해 프로브의 결합비가 구해지면, 그와 같은 최적량비의 결정은, 당업자이면 가능하다.

2. 생체 조직 분석용 프로브 세트

본 발명의 프로브 세트는, 2종류 이상의 프로브로 이루어지고, 각 프로브는, 각각 상이한 생체 성분 결합 도메인(특정 생체 성분에 결합하는 2종 이상의 단백질의 상기 생체 성분 결합 도메인)과, 형광 분자, 발광 분자, 및 포지트론 핵종을 포함하는 방사성 동위체로부터 선택되는 가시화 분자를 포함한다.

효소의 기질 결합 도메인은, 분석의 목적에 따라 적절하게 선택된다. 생체 조직의 효소 소화(분해)나 세포나 세포 집단의 분리에 앞서는 생체 조직의 분석이면, 이러한 효소 소화나 세포 분리에서 이용되는 단백질 분해 효소의 기질 결합 도메인을 프로브에 사용한다.

이러한 단백질 분해 효소로서는, 예컨대 콜라게나제, 트립신, 키모트립신, 디스파아제, 엘라스타아제, 파파인, 프로나제, 서몰리신, 서브틸리신, 브로멜라인, 피틴, 써미타아제 등을 들 수 있다. 콜라게나제로서는, 특히 히스톨리티쿰균(Clostridium histolyticum) 유래의 콜라게나제 G나 콜라게나제 H 외에, 방선균 유래의 콜라게나제, 웰시균(Clostridium perfringens) 유래의 콜라게나제 등을 들 수 있다. 이들 효소의 기질 결합 부위의 1차 구조는 이미 해석되어 있는 것이 많고, 그 정보를 이용하여, 당업자는 프로브의 설계를 행할 수 있다. 일례로서, 히스톨리티쿰균(Clostridium histolyticum) 유래의 콜라게나제 G 및 콜라게나제 H의 아미노산 서열을, 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2로 나타낸다.

프로브에는, 기질 결합 도메인(예컨대 콜라겐 결합 도메인) 또는 그 일부가, 1∼100회, 특히 1∼20회 반복하여 포함되는 것이 바람직하다.

가시화 분자로서는, 분자 이미징 기술에 이용되는 형광 분자, 발광 분자, 및 포지트론 핵종을 이용할 수 있다.

형광 분자로서는, 예컨대 GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato, 및 RFP 등의 형광 단백질, 또는 Alexa350, 디메틸아미노쿠마린, 5/6-카르복시-플루오레세인, Alexa488, ATTO488, DY-505, 5/6-카르복시플루오레세인, Alexa488, Alexa532, Alexa546, Alexa555, ATTO488, ATTO532, 테트라메틸로다민, Cy3, DY-505, DY-547, Alexa635, Alexa647, ATTO600, ATTO655, DY-632, Cy5, DY-647, Cy5.5 등의 형광 마커를 가시화 분자로서 이용할 수 있다.

발광 분자로서는, 루시페라아제 등의 발광 효소를 이용할 수 있다. 루시페라아제는, 갯반디, 오플로포루스과 새우(Hoplophoridae), 발광 곤충(반디, 왕빗살방아벌레 등), 발광 지렁이, 라티아(Latia), 바다 표고(pus shiitake), 에쿼리아 빅토리아(에쿼린) 등의 각종 발광 생물 유래의 루시페라아제를 들 수 있지만, 야생형 루시페라아제와 상이한 피크 파장 및 발광 강도를 갖는 개변형 루시페라아제도 적합하게 이용할 수 있다.

GFP 등의 형광 단백질은 형광을 발하기 때문에 외부 광원을 필요로 하지만, 루시페라아제는 루시페린을 산화하여, 스스로 발광한다. 이 루시페라아제를 GFP와 결합시키는 것에 의해, 외부 광원 없이 GFP를 빛나게 하는 기술도 개발되어 있고, 이러한 기술을 응용하여도 좋다(WO2004/22600, WO2004/052934).

그 외, 가시화 단백질에 대해서는, 많은 기술이 알려져 있고(WO01/46694, 일본 특허 공표 제2006-518209호 공보, 일본 특허 공표 제2005-525111호 공보, 일본 특허 공개 제2008-283959호 공보), 이들 공지의 기술을 이용할 수도 있다.

방사성 동위체로서는, PET을 이용한 이미징에 이용되는 포지트론 핵종 등을 이용할 수 있다. 포지트론 핵종으로서는, 예컨대 ¹⁵O, ¹³N, ¹¹C, ¹⁸F, ⁶²Cu, ⁶⁸Ga, ⁸²Rb 등을 들 수 있고, PET 프로브에 범용되는 공지의 태그를 이용할 수 있다.

가시화 분자로서 단백질 분자를 이용하는 경우는, 생체 성분 결합 도메인(콜라겐 결합 도메인)과 가시화 분자를 융합 단백질로서 구성할 수 있다. 융합 단백질의 제조 방법은 이 분야에서 공지이며(전술, N Nishi, et al., Proc Natl Acad Sci USA.; 95(12): 7018-7023(1998), Tuan et al., Connective Tissue Reserch, 34(1), 1-9(1996), Han et al., Protein Expression and Purification 11, 169-178), 당업자는 이들의 공지 기술에 따라, 융합 단백질을 용이하게 제조할 수 있다.

3. 생체 조직으로부터의 세포 또는 세포 집단의 분리 방법

본 발명은, 상기한 분석 방법을 이용하여 생체 조직을 분석하고, 그 분석 결과에 기초하여 사용하는 효소의 양비나 작용 시간을 결정하며, 생체 조직으로부터 목적으로 하는 세포 또는 세포 집단을 효율적으로 분리하는 방법도 제공한다.

프로브의 결합량은, 효소에 대한 조직의 어피니티를 시사하는 것이기 때문에, 각 효소에 대한 어피니티로부터, 목적에 따른 효소의 양비나 작용 시간 등을 예측할 수 있다.

4. 생체 조직 분리용 키트

본 발명은, 상기한 생체 조직으로부터의 세포 또는 세포 집단의 분리 방법에 이용하기 위한 키트도 제공한다.

본 발명의 키트는, 본 발명의 프로브 세트와, 생체 조직의 분리에 이용되는 효소로서, 그 기질 결합 도메인이 프로브의 구성 요소로 되어 있는 효소, 버퍼 등, 본 발명의 생체 조직의 분리 방법에 이용되는 시약이나 기구로부터 선택되는 1 또는 2 이상을 구성 요소로서 포함한다.

실시예

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것이 아니다.

〔실시예 1〕 EGFP를 이용한 프로브의 제작

[EGFP-ColGCBD 프로브의 제작]

(1) EGFP-ColGCBD의 구축 방법

처음에, EGFP로 라벨한 히스톨리티쿰균 유래의 콜라게나제 G에 대한 프로브(EGFP-ColGCBD)의 제작에 대해서 설명한다.

우선, FLAG 서열을 바탕으로 5'-TCGACGATTATAAAGATGATGATGATAAAT-3'(서열 번호 3) 및 5'-CTAGATTTATCATCATCATCTTTATAATCG-3'(서열 번호 4)의 2개의 올리고 DNA를 합성하였다. 각각의 올리고 DNA를 100 μM가 되도록 TE에 용해하여, 10 μl의 올리고 DNA, 3 μl의 10×T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 버퍼(Nippon Gene사 제조) 0.3 μl의 0.1 M ATP, 2 μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(20U, Nippon Gene), 14.7 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃, 1시간 보온하였다. 각각의 반응액으로부터 10 μl를 취하고, 혼합하였다. 혼합한 용액을 100℃에서 5분 유지한 후, 그대로 서서히 실온까지 냉각하였다. 이것을 인서트 용액 1로 하였다.

10 μl의 pCold2(TAKARA Bio)에 10 μl의 10×Tango buffer(Fermentas사 제조), 1 μl의 SalI(Fermentas), 1 μl의 XbaI(Fermentas), 28 μl의 H₂O를 가하고, 37℃에서 5시간 반응을 행하였다. 반응이 종료한 반응액에 150 μl의 TE를 가하고, 250 μl의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1) 용액을 가하여, 잘 교반한 후, 실온에서 5분간, 16,000 g으로 원심하고, 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 20 μl의 3M 아세트산나트륨 용액을 더하여, 450 μl의 냉 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분간 방치한 후에 16,000 g, 4℃에서 5분간 원심하고, 침전을 회수하였다.

침전을 냉 70% 에탄올로 세정한 후, 40 μl H₂O로 용해하였다. 이것에, 5 μl의 10×BAP 버퍼(TOYOBO사 제조), 5 μl의 세균 알칼리 포스파타아제(TOYOBO)를 가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동에 제공하였다. 영동 종료 후, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하고, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 40 μl의 EB로 행하였다.

얻어진 용출액을 벡터 용액 1로 하였다. 9 μl의 벡터 용액 1과 1 μl의 인서트 용액 1, 10 μl의 Ligation convenience solution(Nippon gene)을 혼합하고, 16℃에서 30분간 보온하였다. 이 용액을 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환한 대장균을 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 이 중 10 μl의 플라스미드 용액에 2 μl 10×Tango buffer, 1 μl XbaI, 7 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서, 3시간 유지하였다. 반응액을 0.8% 아가로오스겔 전기 영동에 제공하고, 나타난 4 kbp 부근의 단일 밴드를 잘라내었다. 회수는 Viogene 사제 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 용출은 50 μl의 EB로 행하였다. 10 μl의 용출액에 10 μl의 Ligation convenience solution을 가하고, 16℃에서 30분 유지하였다.

이 용액을 이용하여 재차, 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환한 대장균을 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 이 중 10 μl에 3μl의 10×K buffer(TAKARA Bio), 1 μl의 BamHI(TAKARA Bio), 1 μl의 EcoRI(TAKARA Bio), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 종료 후, 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출을 행하고, 얻어진 상층에, 3 μl의 3M 아세트산나트륨을 가하며, 70 μl의 냉 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분간 방치한 후에 16,000 g, 4℃에서 5분간 원심하고, 침전을 회수하였다. 침전을 냉 70% 에탄올로 세정한 후, 40 μl H₂O로 용해하였다. 이것에, 5 μl의 10×BAP buffer(TOYOBO), 5 μl의 세균 알칼리 포스파타아제(TOYOBO)를 가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 벡터 용액 2로 하였다.

한편, 0.5 μl의 100 μM 5'-AAAGAACGGATCCACAACAACACCTATAACTAAAG-3'(프라이머 1: 서열 번호 5), 및 0.5 μl의 100 μM 5'-AAGCAGAGATGAATTCTTTATTTACCCTTAACTCATAG-3'(프라이머 2: 서열 번호 6), 1 μl의 이미 클론화된 클로스트리듐 히스톨리티쿰 콜라게나제 G(Clostridium histolyticum collagenase G)를 코드하는 유전자 전장(全長)을 포함하는 플라스미드, 8 μl의 dNTP mix(TAKARA Bio), 1.0 μl PrimeStar HS(TAKARA Bio), 20 μl 5M betain, 49 μl H₂O를 혼합하고, 98℃, 2 min(제1 단계), 98℃, 10 sec(제2 단계), 55℃, 5 sec(제3 단계), 72℃, 90 sec(제4 단계)로 하며, 제2 단계로부터 제4 단계를 35회 연속하여 반복하였다.

얻어진 PCR 단편은, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 정제를 행하였다. 용출은 50 μl의 EB로 행하였다. 얻어진 용출액 중 10 μl에 3 μl의 10×K buffer(TAKARA Bio), 1 μl의 BamHI(TAKARA Bio), 1 μl의 EcoRI(TAKARA Bio), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 인서트 용액 2로 하였다.

5 μl의 벡터 용액 2와 5 μl의 인서트 용액 2에 10 μl의 Ligation convenience solution을 가하고, 16℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후의 ligation 용액을 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주를 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 이 중 10 μl에 3 μl의 Tango buffer, 1 μl의 SacI(Fermentas), 1 μl의 KpnI(Fermentas), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 종료 후, 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출을 행하고, 얻어진 상층에, 3 μl의 3M 아세트산나트륨을 가하며, 70 μl의 냉 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분간 방치한 후에 16,000 g, 4℃에서 5분간 원심하고, 침전을 회수하였다. 침전을 냉 70% 에탄올로 세정한 후, 40 μl H₂O로 용해하였다. 이것에, 5 μl의 10×BAP buffer(TOYOBO), 5 μl의 세균 알칼리 포스파타아제(TOYOBO)를 가하고, 65℃에서, 1시간 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 벡터 용액 3으로 하였다.

EGFP를 코드하는 유전자를 주형으로 하고, 5'-CGAAGGTGAGCTCATGGTGAGCAAGGGCG-3'(프라이머 3: 서열 번호 7) 및, 3'-AGACTGCGGTACCGATCGATCTGAGTCCG-3'(프라이머 4: 서열 번호 8)을 프라이머로 하며, 20 μl의 5×PrimeStar buffer(TAKARA Bio), 1.0 μl pET-EGFP, 0.5 μl의 100 μM 프라이머 3, 0.5 μl의 100 μM 프라이머 4, 8.0 μl dNTP mix, 1.0 μl PrimeStarHS, 20 μl 5M betain, 49 μl H₂O를 혼합하고, 98℃, 2 min(제1 단계), 98℃, 10 sec(제2 단계), 55℃, 5 sec(제3 단계), 72℃, 90 sec(제4 단계)로 하며, 제2 단계로부터 제4 단계를 35회 연속하여 반복하였다.

얻어진 PCR 단편은, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 정제를 행하였다. 용출은 50 μl의 EB로 행하였다. 얻어진 용출액 중 10 μl에 3 μl의 Tango buffer, 1 μl의 SacI(Fermentas), 1 μl의 KpnI(Fermentas), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 인서트 용액 3으로 하였다.

5 μl의 벡터 용액 3과 5 μl의 인서트 용액 3에 10 μl의 Ligation convenience solution을 가하고, 16℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후의 ligation 용액을 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주를 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 얻어진 용출액을 이용하여 대장균 BLR주(Novagen사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주를, E.coli BLR/pCold2-EGFP-ColGCBD주로 하였다.

(2) EGFP-ColGCBD의 정제

배양

pCold2-EGFP-ColGCBD로 형질 전환한 대장균 BLR주를 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 진탕 배양하며, 이것을 전배양액으로 하였다. 500 ml 용량의, 배플(baffle)을 갖는 삼각 플라스크에 준비한 170 ml의 동 배지에 1000분의 1량이 되도록 전배양액을 식균하고, OD₆₆₀이 0.6∼1.0 정도가 될 때까지 37℃에서 진탕 배양하며, 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 IPTG를 종농도 1 mM가 되도록 첨가하고, 15℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

회수

배양 종료 후, 10,000 g, 5분의 원심으로 균체를 회수하였다. 배양액과 등량의 0.3M NaCl을 포함하는 50 mM 인산 완충액 pH 8.0에 회수한 균체를 현탁하고, 재차 10,000 g, 5분의 원심으로 균체를 회수하였다. 같은 조작을 추가로 두번 반복하여, 균체를 세정하였다. 세정한 균체를 25 ml의 동 완충액에 현탁한 후, 200 W의 출력으로 1분간, 얼음 중에서 초음파 파쇄기에 의해 균체를 파쇄하였다. 파쇄가 종료한 균체를 10,000 g, 10 분간, 4℃에서 원심하고, 상청을 회수하였다.

정제

균체 파쇄한 상청을 Cosmosil His-accept(직경 2.5×10 ㎝) 칼럼 크로마토그래피에 제공하였다. 0.3 M NaCl을 포함하는 50 mM 인산 완충액 pH 8.0으로 칼럼을 잘 세정한 후, 10 mM 이미다졸을 포함하고 0.3 M NaCl을 포함하는 50 mM 인산 완충액 pH 8.0을 칼럼과 등량 어플라이하였다. 이어서 20 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 30 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 40 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 50 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 100 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 500 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액을 어플라이하여, 흡착된 단백질을 용출하였다. 각 용출 분획을 SDS-PAGE 및, 항His6 항체(Santa Cruz)를 이용한 면역 블롯에 의해 확인하였다. 그 결과, 20-30 mM 이미다졸 용출 분획에 목적의 단백질을 확인할 수 있기 때문에, 이것을 EGFP-ColGCBD 단백질로 하였다. ColGCBD를 도 1의 (A)에, EGFP-ColGCBD의 염기 서열과 아미노산 서열을 각각 서열표의 서열 번호 9 및 10으로 나타낸다.

〔실시예 2〕 DsRed를 이용한 프로브의 제작

[DsRed-ColHCBD 프로브의 제작]

(1) DsRed-ColHCBD의 구축 방법

다음에, DsRed로 라벨한 히스톨리티쿰균 유래의 콜라게나제 H에 대한 프로브(DsRed-ColHCBD)의 제작에 대해서 설명한다.

C-myc 서열을 바탕으로 5'-TCGACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGT-3'(서열 번호 11) 및 5'-CTAGACAGATCTTCTTCGCTAATCAGTTTCTGTTCG-3'(서열 번호 12)의 2개의 올리고 DNA를 합성하였다. 각각의 올리고 DNA를 100 μM가 되도록 TE에 용해하고, 10 μl의 올리고 DNA, 3 μl의 10×T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 버퍼(Nippon Gene), 0.3 μl의 0.1 MATP, 2 μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(20 U, Nippon Gene), 14.7 μl의 H₂O을 혼합하고, 37℃, 1시간 보온하였다. 각각의 반응액으로부터 10 μl를 취하고, 혼합하였다. 혼합한 용액을 100℃에서 5분 유지한 후, 그대로 서서히 실온까지 냉각하였다. 이것을 인서트 용액 4로 하였다.

10 μl의 pCold2(TAKARA Bio)에 10 μl의 10×Tango buffer(Fermentas사 제조), 1 μl의 SalI(Fermentas), 1 μl의 XbaI(Fermentas), 28 μl의 H₂O를 가하고, 37℃에서 5시간 반응을 행하였다. 반응이 종료한 반응액에 150 μl의 TE를 가하고, 250 μl의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올(25:24:1) 용액을 가하여, 잘 교반한 후, 실온에서 5분간, 16,000 g으로 원심하고, 상청을 회수하였다. 회수한 상청에 20 μl의 3M 아세트산나트륨 용액을 가하고, 450 μl의 냉 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분간 방치한 후에 16,000 g, 4℃에서 5분간 원심하고, 침전을 회수하였다.

침전을 냉 70% 에탄올로 세정한 후, 40 μl H₂O로 용해하였다. 이것에, 5 μl의 10×BAP buffer(TOYOBO사 제조), 5 μl의 세균 알칼리 포스파타아제(TOYOBO)를 가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동에 제공하였다. 영동 종료 후, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하고, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 40 μl의 EB로 행하였다. 얻어진 용출액을 벡터 용액 4로 하였다. 9μl의 벡터 용액 4와 1 μl의 인서트 용액 4, 10 μl의 Ligation convenience solution(Nippon gene)을 혼합하고, 16℃에서 30분간 보온하였다.

이 용액을 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환한 대장균을 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 이 중 10 μl의 플라스미드 용액에 2 μl 10×Tango buffer, 1 μl XbaI, 7 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 3시간 유지하였다. 반응액을 0.8% 아가로오스겔 전기 영동에 제공하고, 나타난 4 kbp 부근의 단일 밴드를 잘라내었다. 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 용출은 50 μl의 EB로 행하였다. 10 μl의 용출액에 10 μl의 Ligation convenience solution을 가하고, 16℃에서 30분 유지하였다. 이 용액을 이용하여 재차, 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 형질 전환한 대장균을 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 이 중 10 μl에 3 μl의 10×K buffer(TAKARA Bio), 1 μl의 BamHI(TAKARA Bio), 1 μl의 EcoRI(TAKARA Bio), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 종료 후, 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출을 행하고, 얻어진 상층에, 3 μl의 3 M 아세트산나트륨을 가하며, 70 μl의 냉 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분간 방치한 후에 16,000 g, 4℃에서 5분간 원심하고, 침전을 회수하였다. 침전을 냉 70% 에탄올로 세정한 후, 40 μl H₂O로 용해하였다. 이것에, 5 μl의 10×BAP buffer(TOYOBO), 5 μl의 세균 알칼리 포스파타아제(TOYOBO)를 가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 벡터 용액 5로 하였다.

한편, 0.5 μl의 100 μM 5'-GAATCTTCAGGATCCACTACTACTGCAGAAATAAAG-3'(프라이머 5: 서열 번호 13), 및 0.5 μl의 100 μM 5'-AAGCAGAGATGAATTCTCTTCCTACTGAACCTTCTATATTAATTC-3'(프라이머 6: 서열 번호 14), 1 μl의 이미 클론화된 클로스트리듐 히스톨리티쿰 콜라게나제 H(Clostridium histolyticum collagenase H)를 코드하는 유전자 전장을 포함하는 플라스미드 pCold2-ColH-His, 8 μl의 dNTP mix(TAKARA Bio), 1.0 μl PrimeStar HS(TAKARA Bio), 20 μl 5 M betain, 49 μl H₂O를 혼합하고, 98℃, 2 min(제1 단계), 98℃, 10 sec(제2 단계), 55℃, 5 sec(제3 단계), 72℃, 90 sec(제4 단계)로 하고, 제2 단계에서 제4 단계를 35회 연속하여 반복하였다.

얻어진 PCR 단편은, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 용출은 50 μl의 EB로 행하였다. 얻어진 용출액 중 10 μl에 3 μl의 10×K buffer(TAKARA Bio), 1 μl의 BamHI(TAKARA Bio), 1 μl의 EcoRI(TAKARA Bio), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 인서트 용액 5로 하였다.

5 μl의 벡터 용액 5와 5 μl의 인서트 용액 5에 10 μl의 Ligation convenience solution을 가하고, 16℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후의 ligation 용액을 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주를 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 이 중의 10 μl에 3 μl의 Tango buffer, 1 μl의 SacI(Fermentas), 1 μl의 KpnI(Fermentas), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 종료 후, 동량의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 추출을 행하고, 얻어진 상층에, 3 μl의 3 M 아세트산나트륨을 가하며, 70 μl의 냉 에탄올을 가하였다. 얼음상에서 5분간 방치한 후에 16,000 g, 4℃에서 5분간 원심하고, 침전을 회수하였다. 침전을 냉 70% 에탄올로 세정한 후, 40 μl H₂O로 용해하였다. 이것에, 5 μl의 10×BAP buffer(TOYOBO사 제조), 5 μl의 세균 알칼리 포스파타아제(TOYOBO)를 가하고, 65℃에서 1시간 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 벡터 용액 6으로 하였다.

pDsRed-단량체(Clontech사 제조)를 주형으로 하고, 5'-GTACCGGTCGAGCTCATGGACAACACCGAGG-3'(프라이머 7: 서열 번호 15) 및, 3'-GTCGCGGCCGGTACCCTGGGAGCCGGAGTGGC-3'(프라이머 8: 서열 번호 16)을 프라이머로 하며, 20 μl의 5×PrimeStar buffer TAKARA Bio), 1.0 μl pDsRed-단량체(Clontech사 제조), 0.5 μl의 100 μM 프라이머 7, 0.5 μl의 100 μM 프라이머 8, 8.0 μl dNTP mix, 1.0 μl PrimeStar HS, 20 μl 5M betain, 49 μl H₂O를 혼합하고, 98℃, 2 min(제1 단계), 98℃, 10 sec(제2 단계), 55℃, 5 sec(제3 단계), 72℃, 90 sec(제4 단계)로 하고, 제2 단계에서 제4 단계를 35회 연속하여 반복하였다.

얻어진 PCR 단편은, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 용출은 50 μl의 EB로 행하였다. 얻어진 용출액 중 10 μl에 3 μl의 Tango buffer, 1 μl의 SacI(Fermentas), 1 μl의 KpnI(Fermentas), 15 μl의 H₂O를 혼합하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응액을 전량, 0.8% 아가로오스 전기 영동으로써 TAE 완충액을 이용하여 영동하고, 에티듐 브로마이드 용액으로 염색하며, 밴드의 위치를 확인한 후, 잘라내었다. 아가로오스겔로부터의 회수는, Viogene사 제조 겔/PCR 정제 키트를 이용하여 행하였다. 동 프로토콜에 따라서, 용출은 30 μl의 EB로 행하였다. 이 용출액을 인서트 용액 6으로 하였다.

5 μl의 벡터 용액 6과 5 μl의 인서트 용액 6에 10 μl의 Ligation convenience solution을 가하고, 16℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 종료 후의 ligation 용액을 이용하여 대장균 DH5α를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주를 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.22 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 배양한 후, 10,000 g으로 1분간 원심하여, 균체를 회수하였다. 회수한 균체로부터 Viogene사 제조 mini plus plasmid DNA extraction kit를 이용하여 플라스미드를 회수하였다. 용출은 100 μl EB로 행하였다. 얻어진 용출액을 이용하여 대장균 BLR(DE3) pLys주(Novagen사 제조)를 형질 전환하였다. 얻어진 형질 전환주를, E.coli BLR/pCold2-DsRed-ColH CBD주로 하였다.

(2) DsRed-ColH CBD의 정제

배양

pCold2-DsRed-ColHCBD로 형질 전환한 대장균 BLR주를 오토클레이브에 의해 멸균한 2 ml의 LB 배지에 종농도 100 μg/ml가 되도록 0.25 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 암피실린을 첨가한 배지에 식균하고, 37℃에서 밤새 진탕 배양하며, 이것을 전배양액으로 하였다. 500 ml 용량의 배플을 갖는 삼각 플라스크에 준비한 170 ml의 동 배지에 1000분의 1량이 되도록 전배양액을 식균하고, OD₆₆₀이 0.6∼1.0 정도가 될 때까지 37℃에서 진탕 배양 하며, 0.25 μm의 멸균 완료 필터로 멸균한 IPTG를 종농도 1 mM가 되도록 첨가하고, 15℃에서 24시간 진탕 배양하였다.

회수

배양 종료 후, 10,000 g, 5분의 원심으로 균체를 회수하였다. 배양액과 등량의 0.3 M NaCl을 포함하는 50 mM 인산 완충액 pH 8.0에 회수한 균체를 현탁하고, 재차 10,000 g, 5분의 원심으로 균체를 회수하였다. 같은 조작을 추가로 두 번 반복하여, 균체를 세정하였다. 세정한 균체를 25 ml의 동 완충액에 현탁한 후, 200 W의 출력으로 1분간, 얼음 중에서 초음파 파쇄기에 의해 균체를 파쇄하였다. 파쇄가 종료한 균체를 10,000 g, 10분간, 4℃에서 원심하고, 상청을 회수하였다.

정제

균체 파쇄한 상청을 Cosmosil His-accept(직경 2.5×10 ㎝) 칼럼 크로마토그래피에 제공하였다. 0.3M NaCl을 포함하는 50 mM 인산 완충액 pH 8.0으로 칼럼을 잘 세정한 후, 10 mM 이미다졸을 포함하고 0.3M NaCl을 포함하는 50 mM 인산 완충액 pH 8.0을 칼럼과 등량 어플라이하였다. 이어서 20 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 30 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 40 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 50 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 100 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액, 500 mM 이미다졸을 포함하는 동 완충액을 어플라이하여, 흡착된 단백질을 용출하였다. 각 용출 분획을 SDS-PAGE 및, 항His6 항체(Santa Cruz)를 이용한 면역 블롯에 의해 확인하였다. 그 결과, 20-30 mM 이미다졸 용출 분획에 목적의 단백질을 확인할 수 있기 때문에 이것을 DsRed-ColHCBD 단백질로 하였다. ColHCBD의 구조를 도 1의 (B)에, DsRed-ColHCBD의 염기 서열과 아미노산 서열을 각각 서열표의 서열 번호의 17 및 18에 나타낸다.

〔실시예 3〕 tdTomato를 이용한 프로브의 제작

(1) tdTomatoColH CBD DNA의 제작과 발현 벡터 pCold II의 삽입

tdTomato 유전자의 주형 DNA는, ptdTomato vector(크론테크사)를 이용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR에는, N 말단의 프라이머는, tdTomato 앞에 NdeI 인식 사이트를 포함하는 서열 34 base(TomatoF)를 사용하였다. C 말단의 프라이머에는, tdTomato 뒤에 종지 코돈 대신에 BamHI 인식 사이트를 갖는 34 bp(TomatoR)의 상보쇄 서열을 사용하였다. 각 프라이머의 서열을 이하에 기재한다.

프라이머 서열:

TomatoF: 5'-CCGGTCGCCcatATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGG-3'(서열 번호 19)

TomatoR: 5'-AGAGTCGCGGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCA-3'(서열 번호 20)

다음에, DsRed-ColH CBD DNA가 삽입된 pCold II를, 제한 효소 BamH I와 Xba I로 처리하고, 약 1000 bp의 Col H CBD DNA 단편을 얻었다.

PCR로 제작된 약 1500 bp의 tdTomato DNA는 Nde I, BamHI로 처리하고, ColH CBD DNA와 함께, Nde I, Xba I로 처리한 발현 벡터 pCold II에 삽입하였다. 콜로니 PCR과 시퀀스 해석에 의해, 설계 대로의 플라스미드가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 또한 DNA 시퀀스 해석은 Operon Biotechnologies사에 의뢰하였다. tdTomatoColH CBD DNA를 pCold II에 삽입하면, N 말단에 His-tag 서열을 갖는 단백질로서 발현된다(도 2). 이들 아미노산 서열도 포함하여, 설계한 tdTomatoColH CBD는, 726 잔기(분자량 82k)가 된다.

(2) 발현균의 제작과 단백질 발현 유도

상기한 방법으로 구축된 tdTomatoColH CBD 발현 플라스미드로, 대장균 BLR을 형질 전환하였다. 형질 전환은, 일반적인 히트쇼크법을 이용하였다. 100 μg/ml의 암피실린(Amp)을 포함한 LB 플레이트에 바르고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 생겨난 콜로니를 LB/Amp 액체 배지에 계대배양하고, OD₆₀₀이 0.5-0.7에 달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양액을 얼음상에서 30분간 냉각 후, 0.1 mM가 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 가하고, 15℃에서 24시간 배양을 계속하여, 단백질의 발현을 유도하였다.

24시간 후의 대장균 배양액을 원심하여, 균체를 회수하였다. 균체를 인산 완충 식염수(PBS)로 2회 세정한 후, 재차 PBS에 현탁하고, 0.1 mM가 되도록 페닐메탄술포닐 플루오라이드(PMSF)를 첨가하며, 빙냉하면서 초음파에 의해 균체를 파쇄하였다. 그 균체 파쇄액을 12,000 rpm, 20분 원심하여, 침전과 상청으로 나눠 SDS-PAGE에 의해 가용성 분획에 목적의 단백질이 발현하고 있는 것을 확인하였다. 대장균의 배양액에, 디메틸 술폭시드(DMSO)를 8%가 되도록 첨가하고, -80℃에서 냉동 보존하였다. 이것을 tdTomatoColH CBD 발현용의 동결 스톡 균체로 하였다.

(3) tdTomatoColH CBD의 정제

300 mM NaCl/50 mM 인산Na buffer(pH 8.0)로 평형화한 Ni-NTA 아가로오스 칼럼(φ 2.0 ㎝×5.0 ㎝, 칼럼 용적 15 ml, QIAGEN사)에, 균체 파쇄 후의 가용성 분획을 평형화 buffer로 3배 희석한 용액을 어플라이하였다. 평형화 buffer로 담체에 흡착하지 않는 통과 분획을 씻어낸 후, 50 mM, 200 mM, 500 mM 이미다졸을 포함하는 buffer로 용출하였다. 각 이미다졸 농도의 분획의 SDS-PAGE를 행하여, 200 mM 이미다졸 용출 분획에 tdTomatoColH CBD가 용출되어 있는 것이 확인되었기 때문에(도 3), 그 분획을 회수하여 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)에 대하여 투석하였다.

투석 후의 용액을 음이온 교환 칼럼(HiTrap DEAE FF, C.V.=1 ml, GE 헬스케어사)에 어플라이하고, 0-400 mM의 직선적인 NaCl 농도 구배에 의해 용출하였다. 용출 분획으로부터 SDS-PAGE로 tdTomatoColH CBD가 존재하고 있는 분획을 회수하고(도 4), Amicon 30k(밀리포어사)를 이용하여 5 ㎎/ml까지 한외 여과에 의해 농축하였다. 이것을 정제 tdTomatoColH CBD로 하였다.

(4) 형광 스펙트럼 측정

tdTomato는 DsRed와 동일한 여기(554 ㎚), 형광(581 ㎚) 파장을 갖는 것으로 되어 있다. tdTomatoColH CBD 정제 효소 용액의 여기, 형광 스펙트럼을 분광 형광 광도계 F-2500(히타치 하이테크사)를 이용하여 측정하였다(도 5). 스펙트럼으로부터, CDB와의 융합 단백질로서 발현시킨 것에 의한 형광의 파장 시프트나 소광은 일어나 있지 않는 것을 확인하였다. 또한, DsRed를 이용한 것과 비교하여, 보다 강한 형광을 발하고 있는 것이 확인되었다.

〔실시예 4〕루시페라아제를 이용한 프로브의 제작

[PGV_Col G CBD 및 PGV-Col H CBD(루시페라아제-콜라겐 결합 도메인 융합 단백질) 프로브의 제작 방법]

(1) PGV_Col G CBD의 구축 방법

1) 루시페라아제-콜라겐 결합 도메인 융합 단백질 DNA의 제작 발현 벡터 pCold I에의 삽입

루시페라아제 유전자의 주형 DNA는, 피카진 컨트롤 벡터(PGV_control)의 루시페라아제 코딩 영역(Luciferase coding region)(PGV)의 서열을 이용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR에는, N 말단의 프라이머는, PGV 앞에 Nde I 인식 사이트(CATATG)를 포함하는 서열 27 base(PGVctrl_Nterm)를 사용하였다. C 말단의 프라이머에는, PGV 뒤에 종지 코돈 대신에 BamHI 인식 사이트(GGATCC)를 갖는 30 bp(PGV_CF_r)의 상보쇄 서열을 사용하였다.

콜라게나제(Col) G, H의 콜라겐 결합 도메인(collagene binding domain)(CBD)에는, pCold III에 Col G, H의 전장 DNA가 삽입된 플라스미드를 주형 DNA로서 이용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR에는, CBD의 N 말단에 BamH I 인식 사이트를 부가한 35 base(ColG_Nterm, ColH_Nterm)의 DNA를 N 말단의 프라이머로서 이용하였다. C 말단의 프라이머는, Col G CBD에 계속하여 Strep-tag의 아미노산 서열, Xba I 인식 사이트(TCTAGA)의 순으로 부가한 서열(ColG_CtermStrep_comp)과, Col H CBD에 계속하여 FLAG-tag의 아미노산 서열, Xba I 인식 사이트의 순으로 부가한 서열(ColH_CtermFLAG_comp)의 상보쇄 49 base의 DNA를 각각 사용하였다(도 6).

PCR로 제작된 약 1,700 bp의 PGV DNA는 Nde I, BamHI로, 약 1,000 bp의 CBD DNA는 BamH I, Xba I로 처리하고, Nde I, Xba I로 처리한 발현 벡터 pCold I에 삽입하였다(도 7).

콜로니 PCR와 시퀀스 해석에 의해, 설계대로의 플라스미드가 구축되어 있는 것을 확인하였다. 또한 DNA 시퀀스 해석은 Operon Biotechnologies사에 의뢰하였다. DNA를 pCold I에 삽입하면, N 말단에 His-tag와 Factor Xa의 인식 서열을 가진 단백질로서 발현된다. 이들의 아미노산 서열도 포함하여, 설계한 fusion protein의 크기는, PGV Col G CBD가 911 잔기(분자량 101 k)로, PGV Col H CBD가 883 잔기(분자량 98 k)가 된다.

2) 발현균의 제작과 단백질 발현 유도

PGV와 Col G CBD 또는 Col H CBD의 DNA가 삽입된 발현 플라스미드로, 대장균 Rosetta 2(DE3)를 형질 전환하였다. 형질 전환은, 일반적인 히트쇼크법을 이용하였다. 이 형질 전환주에 의한 Luciferase-Collagen binding domain fusion 단백질 발현 유도를 보았다.

100 μg/ml의 암피실린(Amp)과 34 μg/ml의 클로람페니콜(Cm)을 포함한 LB 플레이트에 바르고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 돋아난 콜로니를 LB/Amp/Cm 액체 배지에 계대배양하여, OD₆₀₀이 0.5-0.7에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 배양액을 얼음상에서 30분간 냉각 후, 0.1 mM가 되도록 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 가하고, 15℃에서 48시간 배양을 계속하여, 단백질의 발현을 유도하였다.

48시간 후의 대장균 배양액을 원심하여, 균체를 회수하였다. 균체를 인산 완충 식염수(PBS)로 2회 세정한 후, 재차 PBS에 현탁하고, 0.1 mM가 되도록 페닐메탄술포닐 플루오라이드(PMSF)를 첨가한 후 강도 최대, 2 sec interval pulse, 15분의 조건으로 초음파 파쇄를 행하였다. 그 균체 파쇄액을 12,000 rpm, 20분 원심하고, 침전과 상청으로 나눠 SDS-PAGE를 행하여, 단백질 발현을 확인하였다. SDS-PAGE의 결과, PGV_Col G CBD(101 k)와 PGV_Col H CBD(98k)로 생각되는 크기의 단백질의 밴드를 확인하였다(도 8). 그 밴드는, 항His-tag 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로도 검출되었다. 원하는 단백질이 발현하고 있는 것을 확인할 수 있던 대장균의 배양액에, 디메틸 술폭시드(DMSO)를 8%가 되도록 첨가하고, -80℃에서 냉동 보존하였다. 이것을 PGV_Col G CBD 또는 PGV_Col H CBD의 동결 스톡 균체로 하였다.

3) 루시페라아제 활성의 확인

형질 전환주의 균체 파쇄 후의 상청(crude)에, 루시페라아제 활성을 가진 단백질이 존재하고 있는 것을 확인하였다. 본 발명에 이용한 루시페라아제는, 550 ㎚에 극대값을 갖는 발광 스펙트럼을 나타낸다. 50 mM Tris-HCl(pH 8.0)와 crude를 혼합한 후, 기질 용액(Tripluc Luciferase Assay Reagent, 도요보)을 가하고, 즉시 550 ㎚의 발광을 시간 경과에 따라 측정하였다. 루시페라아제의 발광은, 기질 용액을 가한 직후에 최대를 나타내고, 그 후는 감쇠해 간다. 발광의 감쇠가 외관상, 대략 정상에 도달하는 시간까지 측정하였다. 그 후에 발광 스펙트럼도 측정하였다(도 9). CBD와의 융합 단백질로서 발현시켜도, 단독의 PGV와 같은 발광을 나타내었다. 파쇄 직후의 crude에서는, 550 ㎚의 강한 발광이 관측되었다. -80℃에서 냉동 보존하고 있었던 crude에서는, 서서히 발광이 약해졌지만, 4℃나 -20℃에서 보존한 것보다 실활하지 않는 것을 확인하였다.

(2) 정제 방법

300 mM NaCl/50 mM 인산Na buffer(pH 8.0)로 평형화한 Ni-NTA 아가로오스 칼럼(직경 2.0 ㎝×5.0 ㎝, 칼럼 용적 15 ml, QIAGEN)에, 균체 파쇄 후의 crude를 평형화 버퍼로 10배 희석한 용액을 어플라이하였다. 평형화 buffer로 담체에 흡착하지 않는 통과 분획을 씻어낸 후, 50 mM, 200 mM, 500 mM 이미다졸을 포함하는 buffer로 용출하였다. 각 이미다졸 농도의 분획을 SDS-PAGE에서 확인하고, 200 mM 이미다졸 용출 분획을 정제 PGV_ColG CBD 또는, PGV_ColH CBD로 하였다(도 10).

〔실시예 5〕 췌장 조직의 결합 확인

100 μl의 50 mM Tris-HCl/5 mM CaCl₂(pH 7.5)에 현탁한 돼지의 췌장 조직편과 정제 효소 용액 100 μl를 혼합하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트한 후, 원심하여 침전과 상청(sup.1)으로 나눴다. 얻어진 침전을 50 mM 아세트산 버퍼(pH 5.0)에 현탁하고, 실온에서 20분 인큐베이트한 후, 원심하여 침전과 상청(sup.2)으로 나눴다. 얻어진 침전과 상청의 SDS-PAGE를 행하여, 췌장 조직과 tdTomatoColH CBD의 결합을 확인하였다(도 11).

SDS-PAGE의 결과, 침전에 tdTomatoColH CBD의 밴드가 보여, 췌장 조직과 결합한 것이 확인되었다. 췌장 조직에 결합한 tdTomatoColH CBD는 침전으로, 그 외의 결합하지 않는 것은 sup.1으로 각각 분획되었다. 또한 sup.2에 밴드가 검출되지 않기 때문에, tdTomatoColH CBD는, 산성 pH의 조건하에서도 콜라겐 섬유에 결합한 채인 것이 확인되었다.

〔실시예 6〕 프로브를 이용한 생체 조직 성분 분석법

[생체 조성 성분의 측정 방법]

본 발명의 생체 조성 성분의 측정 방법을 설명한다.

(1) EGFP-ColGCBD 및 DsRED-ColH에 의한 생체 조성분의 측정 방법

실혈사 후의 돼지로부터 췌장을 적출하고, 5 ㎟로 절제한 췌장 단편을 OCT 컴파운드(사쿠라 파인테크사 제조)에 포매하고, 액체 질소로 동결한다. 그 후, 크라이오스탯 CM 3050S(라이카사 제조)로, 두께 8 μm로 얇게 자르고, 프레파라트(마츠나미 유리 공업 주식회사 제조)에 접착시킨다. 칼슘이온이나 마그네슘이온을 함유하지 않는 인산 완충 용액(PBS(-))으로 10%로 조정한 포르말린액(WAKO사 제조)에 침지하고, 실온에서 10분간 인큐베이트하며, 그 후 30분간 건조시킨다. 유리제의 큐벳에 PBS(-)를 넣고, 그 안에서 5분간 실온으로 인큐베이트한다. 건조에 주의하면서, 습기가 많은 상자에 프레파라트를 유치하고, 절편상에 EGFP-ColG CBD 용액 200 μl를 침지하며, 37℃에서 1시간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후, PBS(-)로 5분간 세정을 행한다. 프레파라트를 세정 병에 넣은 PBS(-)로 씻어내고, VECTORSHELD(Vector사 제조)로 봉입하였다. 그 후, 형광 현미경 BIOLEVO BZ 9000(기엔스사 제조)으로 관찰하고, 촬영을 행하였다.

(2) 측정 결과

결과를 도 12에 도시하였다. 네거티브 컨트롤에 비해, EGFP-ColGCBD로 염색한 조직은, 조직의 존재하는 영역을 양호하게 염색하였다.

〔실시예 7〕 조직 절편의 측정 방법

(1) 관찰 방법

-80℃ 보존되어 있던 래트의 췌장 조직 절편이 고정된 프레파라트를, 실온에서 5 mM CaCl₂/TBS로 10분간 침지하고, Milli-Q로 세정하였다. 비특이적 결합을 억제하기 위한 블로킹으로서, 2% 미오글로빈(Myb)를 100 μl 적하하고, 37℃에서 30분간 프리인큐베이트하며, Milli-Q로 세정하였다. 단백질(GFP control, GF PColG CBD, tdTomato control, tdTomatoColH CBD) 용액 40 μl와 2% Myb 40 μl을 혼합 후, 조직 절편상에 적하하고, 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 각 단백질 용액의 농도는, GFP control 10 ㎎/ml, GFP ColG CBD 10 ㎎/ml, tdTomato control 5 ㎎/ml, tdTomatoColH CBD 5 ㎎/ml로 조정하였다.

실온에서 5 mM CaCl₂/TBS에 10분간 침지하고, Milli-Q로 세정하였다. 이것을 2회 반복한 후, 형광 현미경 BIOREVO BZ-9000(기엔스사)을 이용하여 배율 200배로 관찰하고, 적당한 영역을 여러 지점 선택하여, 노광 시간 0.5초로 사진을 촬영하였다.

현미경 부속 소프트웨어의 계측 기능을 이용하여, 촬영한 사진 전체의 휘도를 히스토그램화하였다. GFP control과 GFP ColG CBD에서는 녹색 형광의 휘도만, tdTomato control과 tdTomatoColH CBD에서는 적색 형광의 휘도만을 추출하였다.

이 히스토그램으로부터, GFP control과 GFP ColG CBD, tdTomato control과 tdTomatoColH CBD의 휘도 평균값의 차[델타 평균 밝기(delta average brightness)]를 산출하고, 계통별로 정리하였다. 산출된 델타 평균 밝기의 수치가 커질수록, CBD와 조직의 결합이 많고, control과의 형광 강도의 차가 크게 나와 있는 것을 나타내고 있다. 이 델타 평균 밝기를 비교하여, 각 계통, 주령에 따라, 췌장 조직에 대한 ColG CBD나 ColH CBD의 결합에는 차이가 확인되었다.

(2) 래트 췌도 분리법

미국의 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 발행된 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals(1996년 개정판)"에 기초하여 동물실험을 시행하였다. 체중 239 g-268 g의 수컷 Lewis 래트(Slc, Japan), 체중 255 g-301 g의 수컷 SD 래트(Slc, Japan), 체중 197 g-231 g의 수컷 Wistar-Furth 래트(Slc, Japan)를 사용하였다.

췌장 적출 전, 총담관으로부터 중성 프로테아제로서 서몰리신(0.322 ㎎)은 변화시키지 않고, 재조합 타입의 고순도품의 Col G(5.46 ㎎) 및 Col H(2.02 ㎎)를 효소량 기준 비율(H/G비=0.37)로 설정하며, 이것에 대하여 10배군[Col G(4.96 ㎎), Col H(18.34 ㎎), 서몰리신(0.322 ㎎), (H/G비=3.70)], 1/10배군[Col G(5.51 ㎎), Col H(0.20 ㎎), 서몰리신(0.322 ㎎), (H/G비=0.04)], Col G 완전 누락군, Col H 완전 누락군을 설정하고, cold Hanks' Balanced Salt Solutions(HBSS)을 주입하여, 췌장을 확장시켰다. 10 mL의 HBSS를 가한 후, 37℃하에서 14분간 온욕시키는 것에 의해 췌장을 소화하였다. 계속해서 Histopaque-1119(Sigma Diagnostics, St.Louis, MO, USA)와 Lymphoprep^TM(NycomedPharma AS, Oslo, Norway)를 이용한 농도 구배 원심을 행하여, 췌도가 존재하는 층을 채취하였다. 췌도 분리 조작으로 얻어진 조직에 디페닐티오카르바존(Wako, Osaka, Japan) 염색을 행하여, 췌도와 외분비선이나 도관 등의 비췌도 조직을 식별하여 각각의 수량을 현미경 직시하에 계측하였다. 분리 췌도의 수량은, islet equivalent(IEQ)로 표시하였다(1 IEQ는 직경 150 μm의 췌도 1개 상당의 크기에 해당하는 것이 국제 기준으로 정해져 있다).

(3) 실시 결과

1) 각종 래트의 조직 절편에서의 GFP ColG CBD 및 tdTomatoColH CBD의 형광 휘도의 측정 결과

각종 래트에서의 ColG와 ColH의 2종류의 프로브의 형광 휘도 및 그 비를 도 13 및 표 1에 기재하였다.

2) 각종 래트에서의 췌도 분리 결과

ColG와 ColH의 2종류의 프로브의 형광 휘도비 H/G값 0.85 이상의 경우, ColG에 비해, ColH의 첨가량 즉, ColH/G비의 최적값으로 사용해야 하지만, H/G값 0.8 이하인 경우, ColH/G비의 영향은 적고, ColG 무첨가여도 췌도 수량에 크게 영향받지 않는 것을 발견하여, 그 수치에 따라, 각 래트종에 있어서, 췌도 분리에 사용하는 ColH 및 ColG의 함유량비를 바꿔, 췌도 분리 실험에서의 췌도 수량을 측정하고, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타내는 바와 같이, Col G를 완전히 누락시킨 조건하에서도, 전체 종에서 췌도 분리가 가능했지만, 대조적으로 Col H를 완전히 누락시킨 조건하에서는 전체 종에서 췌장이 전혀 소화되지 않았다. 다음에 Col H/G비가 췌도 분리 결과에 미치는 영향은, H/G비를 1/10로 설정한 케이스에서 Wistar군만 분리 췌도의 수량이 유의하게 저하(기준비의 54.6%, p=0.009)되는 것이 판명되었다. 또한 Col G를 완전히 누락시킨 케이스에서도, Wistar(75.5%), SD(67.3%), Lewis(54.2%)의 순으로 분리 췌도 수량이 확보되어 있고, Col H를 요하는 기질의 발현은 Wistar>SD>Lewis의 경향을 나타내었다.

이와 같이, ColH와 ColG의 최적 사용량비를 산출하고, 사용 ColG 및 ColH의 사용량을 최적으로 하는 것에 의해, 고수량의 췌도를 분리할 수 있는 것이 나타났다.

〔참고예〕

콜라게나제의 비율(ColH/ColG)이 췌도 분리에 미치는 영향

래트의 췌도 분리에 사용하는 2종류의 콜라게나제의 비율(ColH/ColG)을 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4로 바꿔, 췌도 분리를 행하였다. 그 결과, 수량 및 품질을 나타내는 ATP/DNA, in vitro 당부하 시험 및 인슐린/DNA 실험에서, 콜라게나제 비율이, 0.1 내지 0.2의 범위에서, 고수량으로 고품질인 췌도를 분리할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.

도 14에 결과를 도시한다. A는 수량을 나타낸다. B의 ATP/DNA는, 췌도 자신이 갖는 에너지 차지(ATP)를 췌도의 크기(DNA)로 보정한 값이다. C의 in vitro 당부하 시험은, 글루코오스에 대한 췌도의 인슐린 방출 능력을 나타내는 것으로, 췌도의 예비 기능을 반영하고 있다. D의 인슐린/DNA는, 췌도 자신이 갖는 인슐린량을 췌도의 크기(DNA)로 보정한 것이지만, 시약 등에 췌도에의 독성이 있으면, 췌도의 탈과립이 발생하는 것이 종종 확인되기 때문에, 췌도의 독성 시험의 하나로 위치한다.

췌도 분리용 산소의 조성으로서는 클로스트리듐 히스톨리티쿰(Clostridium histolyticum)이 생산하는 2종의 콜라게나제(ColG 및 ColH)와, 1종의 중성 금속 프로테아제가 최적인 것이 지금까지 보고가 있다(Diabetes:46:1120:1997). 상기한 결과는, 2종의 콜라게나제 타입(ColG 및 ColH)의 조성 비율이 췌도 분리의 수량 및 품질을 결정하는 중요 인자인 것을 나타낸다.

최적 콜라게나제 비율은, 래트 이외의 동물, 돼지, 인간에 있어서, 또한 동일한 종이어도 상이하고, 췌도 분리의 성공률을 저하시키는 하나의 요인으로 되어 있다. 그렇기 때문에, 본 발명의 프로브를 이용하여, 췌도를 분리하기 전에, 미리, 사용할 콜라게나제의 최적 비율을 측정하면, 사용해야 하는 콜라게나제의 사용량을 산출하고, 최적 비율로 췌도 분리를 행하는 것이 가능해져, 고수량으로 고품질의 췌도를 취득하는 것이 가능해진다.

본 발명에 의하면, 분리해야 하는 세포외 매트릭스 또는 장기의 단백질 조성으로부터, 사용하는 단백질 분해 효소의 종류나 양을 정확하고 간편하게 알 수 있어, 목적의 세포 등을 고활성의 상태로, 단리할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 췌도 이식 등의 장기 이식, 세포 이식에 의한 재생 의료, 세포주의 수립을 포함하는 치료, 진단 및 검사 등의 폭넓은 용도에 유용하다.

본 명세서중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서중에 포함되는 것으로 한다.

서열표 프리텍스트

서열 번호 3: 올리고 DNA

서열 번호 4: 올리고 DNA

서열 번호 5: ColGCBD용 포워드 프라이머(프라이머 1)

서열 번호 6: ColGCBD용 리버스 프라이머(프라이머 2)

서열 번호 7: EGFP용 포워드 프라이머(프라이머 3)

서열 번호 8: EGFP용 리버스 프라이머(프라이머 4)

서열 번호 9: EGFP-ColGCBD

서열 번호 10: EGFP-ColGCBD

서열 번호 11: 올리고 DNA

서열 번호 12: 올리고 DNA

서열 번호 13: ColHCBD용 포워드 프라이머(프라이머 5)

서열 번호 14: ColHCBD용 리버스 프라이머(프라이머 6)

서열 번호 15: DsRed용 포워드 프라이머(프라이머 7)

서열 번호 16: DsRed용 리버스 프라이머(프라이머 8)

서열 번호 17: DsRed-ColHCBD

서열 번호 18: DsRed-ColHCBD

서열 번호 19: tdTomato 유전자 증폭용 포워드 프라이머(TomatoF)

서열 번호 20: tdTomato 유전자 증폭용 리버스 프라이머(TomatoR)

SEQUENCE LISTING <110> Tohoku University <120> Analytical Probe for Body Tissue and Its Use <130> PTU-9008WO <150> JP2011-058080 <151> 2011-03-16 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 236 <212> PRT <213> Clostridium histolyticum <400> 1 Thr Thr Thr Pro Ile Thr Lys Glu Met Glu Pro Asn Asp Asp Ile Lys 1 5 10 15 Glu Ala Asn Gly Pro Ile Val Glu Gly Val Thr Val Lys Gly Asp Leu 20 25 30 Asn Gly Ser Asp Asp Ala Asp Thr Phe Tyr Phe Asp Val Lys Glu Asp 35 40 45 Gly Asp Val Thr Ile Glu Leu Pro Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Phe Thr 50 55 60 Trp Leu Val Tyr Lys Glu Gly Asp Asp Gln Asn His Ile Ala Ser Gly 65 70 75 80 Ile Asp Lys Asn Asn Ser Lys Val Gly Thr Phe Lys Ser Thr Lys Gly 85 90 95 Arg His Tyr Val Phe Ile Tyr Lys His Asp Ser Ala Ser Asn Ile Ser 100 105 110 Tyr Ser Leu Asn Ile Lys Gly Leu Gly Asn Glu Lys Leu Lys Glu Lys 115 120 125 Glu Asn Asn Asp Ser Ser Asp Lys Ala Thr Val Ile Pro Asn Phe Asn 130 135 140 Thr Thr Met Gln Gly Ser Leu Leu Gly Asp Asp Ser Arg Asp Tyr Tyr 145 150 155 160 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480 aaa tat tat cta ctt gtt tat aaa tac tca gga tca gga aac tat gag 1488 Lys Tyr Tyr Leu Leu Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Glu 485 490 495 tta agg gta aat aaa gaa ttc aag ctt gtc gac gat tat aaa gat gat 1536 Leu Arg Val Asn Lys Glu Phe Lys Leu Val Asp Asp Tyr Lys Asp Asp 500 505 510 gat gat aaa tct aga tag 1554 Asp Asp Lys Ser Arg 515 <210> 10 <211> 517 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> EGFP-ColGCBD <400> 10 Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Glu Leu Met Val 1 5 10 15 Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu 20 25 30 Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly 35 40 45 Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr 50 55 60 Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr 65 70 75 80 Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His 85 90 95 Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr 100 105 110 Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys 115 120 125 Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp 130 135 140 Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr 145 150 155 160 Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile 165 170 175 Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln 180 185 190 Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val 195 200 205 Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys 210 215 220 Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr 225 230 235 240 Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu 245 250 255 Arg Ser Ile Gly Thr Leu Glu Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ile Thr Lys 260 265 270 Glu Met Glu Pro Asn Asp Asp Ile Lys Glu Ala Asn Gly Pro Ile Val 275 280 285 Glu Gly Val Thr Val Lys Gly Asp Leu Asn Gly Ser Asp Asp Ala Asp 290 295 300 Thr Phe Tyr Phe Asp Val Lys Glu Asp Gly Asp Val Thr Ile Glu Leu 305 310 315 320 Pro Tyr Ser Gly Ser Ser Asn Phe Thr Trp Leu Val Tyr Lys Glu Gly 325 330 335 Asp Asp Gln Asn His Ile Ala Ser Gly Ile Asp Lys Asn Asn Ser Lys 340 345 350 Val Gly Thr Phe Lys Ser Thr Lys Gly Arg His Tyr Val Phe Ile Tyr 355 360 365 Lys His Asp Ser Ala Ser Asn Ile Ser Tyr Ser Leu Asn Ile Lys Gly 370 375 380 Leu Gly Asn Glu Lys Leu Lys Glu Lys Glu Asn Asn Asp Ser Ser Asp 385 390 395 400 Lys Ala Thr Val Ile Pro Asn Phe Asn Thr Thr Met Gln Gly Ser Leu 405 410 415 Leu Gly Asp Asp Ser Arg Asp Tyr Tyr Ser Phe Glu Val Lys Glu Glu 420 425 430 Gly Glu Val Asn Ile Glu Leu Asp Lys Lys Asp Glu Phe Gly Val Thr 435 440 445 Trp Thr Leu His Pro Glu Ser Asn Ile Asn Asp Arg Ile Thr Tyr Gly 450 455 460 Gln Val Asp Gly Asn Lys Val Ser Asn Lys Val Lys Leu Arg Pro Gly 465 470 475 480 Lys Tyr Tyr Leu Leu Val Tyr Lys Tyr Ser Gly Ser Gly Asn Tyr Glu 485 490 495 Leu Arg Val Asn Lys Glu Phe Lys Leu Val Asp Asp Tyr Lys Asp Asp 500 505 510 Asp Asp Lys Ser Arg 515 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA <400> 11 tcgacgaaca gaaactgatt agcgaagaag atctgt 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo DNA <400> 12 ctagacagat cttcttcgct aatcagtttc tgttcg 36 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for ColHCBD (primer5) <400> 13 gaatcttcag gatccactac tactgcagaa ataaag 36 <210> 14 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for ColHCBD (primer6) <400> 14 aagcagagat gaattctctt cctactgaac cttctatatt aattc 45 <210> 15 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for DsRED (primer7) <400> 15 gtaccggtcg agctcatgga caacaccgag g 31 <210> 16 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for DsRED (primer8) <400> 16 gtcgcggccg gtaccctggg agccggagtg gc 32 <210> 17 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DsRed-CoHCBD <220> <221> CDS <222> (1)..(1449) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> TEE sequence <220> <221> misc_feature <222> (16)..(33) <223> His-tag <220> <221> misc_feature <222> (43)..(717) <223> DsRed sequence <220> <221> misc_feature <222> (736)..(1392) <223> ColHCBD sequence <220> <221> misc_feature <222> (1411)..(1440) <223> C-myc sequence <400> 17 atg aat cat aaa gtg cat cat cat cat cat cat atg gag ctc atg gac 48 Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Glu Leu Met Asp 1 5 10 15 aac acc gag gac gtc atc aag gag ttc atg cag ttc aag gtg cgc atg 96 Asn Thr Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Gln Phe Lys Val Arg Met 20 25 30 gag ggc tcc gtg aac ggc cac tac ttc gag atc gag ggc gag ggc gag 144 Glu Gly Ser Val Asn Gly His Tyr Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu 35 40 45 ggc aag ccc tac gag ggc acc cag acc gcc aag ctg cag gtg acc aag 192 Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val Thr Lys 50 55 60 ggc ggc ccc ctg ccc ttc gcc tgg gac atc ctg tcc ccc cag ttc cag 240 Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln 65 70 75 80 gcc ggc tcc aag gcc tac gtg aag cac ccc gcc gac atc ccc gac tac 288 Ala Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr 85 90 95 atg aag ctg tcc ttc ccc gag ggc ttc acc tgg gag cgc tcc atg aac 336 Met Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Ser Met Asn 100 105 110 ttc gag gac ggc ggc gtg gtg gag gtg cag cag gac tcc tcc ctg cag 384 Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Glu Val Gln Gln Asp Ser Ser Leu Gln 115 120 125 gac ggc acc ttc atc tac aag gtg aag ttc aag ggc gtg aac ttc ccc 432 Asp Gly Thr Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Lys Gly Val Asn Phe Pro 130 135 140 gcc gac ggc ccc gta atg cag aag aag act gcc ggc tgg gag ccc tcc 480 Ala Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Ala Gly Trp Glu Pro Ser 145 150 155 160 acc gag aag ctg tac ccc cag gac ggc gtg ctg aag ggc gag atc tcc 528 Thr Glu Lys Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Ile Ser 165 170 175 cac gcc ctg aag ctg aag gac ggc ggc cac tac acc tgc gac ttc aag 576 His Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Asp Phe Lys 180 185 190 acc gtg tac aag gcc aag aag ccc gtg cag ctg ccc ggc aac cac tac 624 Thr Val Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Asn His Tyr 195 200 205 gtg gac tcc aag ctg gac atc acc aac cac aac gag gac tac acc gtg 672 Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Asn His Asn Glu Asp Tyr Thr Val 210 215 220 gtg gag cag tac gag cac gcc gag gcc cgc cac tcc ggc tcc cag ggt 720 Val Glu Gln Tyr Glu His Ala Glu Ala Arg His Ser Gly Ser Gln Gly 225 230 235 240 acc ctc gag gga tcc act act act gca gaa ata aag gat ctt tca gaa 768 Thr Leu Glu Gly Ser Thr Thr Thr Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ser Glu 245 250 255 aat aaa ctt cca gtt ata tat atg cat gta cct aaa tcc gga gcc tta 816 Asn Lys Leu Pro Val Ile Tyr Met His Val Pro Lys Ser Gly Ala Leu 260 265 270 aat caa aaa gtt gtt ttc tat gga aaa gga aca tat gac cca gat gga 864 Asn Gln Lys Val Val Phe Tyr Gly Lys Gly Thr Tyr Asp Pro Asp Gly 275 280 285 tct atc gca gga tat caa tgg gac ttt ggt gat gga agt gat ttt agc 912 Ser Ile Ala Gly Tyr Gln Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ser Asp Phe Ser 290 295 300 agt gaa caa aac cca agc cat gta tat act aaa aaa ggt gaa tat act 960 Ser Glu Gln Asn Pro Ser His Val Tyr Thr Lys Lys Gly Glu Tyr Thr 305 310 315 320 gta aca tta aga gta atg gat agt agt gga caa atg agt gaa aaa act 1008 Val Thr Leu Arg Val Met Asp Ser Ser Gly Gln Met Ser Glu Lys Thr 325 330 335 atg aag att aag att aca gat ccg gta tat cca ata ggc act gaa aaa 1056 Met Lys Ile Lys Ile Thr Asp Pro Val Tyr Pro Ile Gly Thr Glu Lys 340 345 350 gaa cca aat aac agt aaa gaa act gca agt ggt cca ata gta cca ggt 1104 Glu Pro Asn Asn Ser Lys Glu Thr Ala Ser Gly Pro Ile Val Pro Gly 355 360 365 ata cct gtt agt gga acc ata gaa aat aca agt gat caa gat tat ttc 1152 Ile Pro Val Ser Gly Thr Ile Glu Asn Thr Ser Asp Gln Asp Tyr Phe 370 375 380 tat ttt gat gtt ata aca cca gga gaa gta aaa ata gat ata aat aaa 1200 Tyr Phe Asp Val Ile Thr Pro Gly Glu Val Lys Ile Asp Ile Asn Lys 385 390 395 400 tta ggg tac gga gga gct act tgg gta gta tat gat gaa aat aat aat 1248 Leu Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Trp Val Val Tyr Asp Glu Asn Asn Asn 405 410 415 gca gta tct tat gcc act gat gat ggg caa aat tta agt gga aag ttt 1296 Ala Val Ser Tyr Ala Thr Asp Asp Gly Gln Asn Leu Ser Gly Lys Phe 420 425 430 aag gca gat aaa cca ggt aga tat tac atc cat ctt tac atg ttt aat 1344 Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Ile His Leu Tyr Met Phe Asn 435 440 445 ggt agt tat atg cca tat aga att aat ata gaa ggt tca gta gga aga 1392 Gly Ser Tyr Met Pro Tyr Arg Ile Asn Ile Glu Gly Ser Val Gly Arg 450 455 460 gaa ttc aag ctt gtc gac gaa cag aaa ctg att agc gaa gaa gat ctg 1440 Glu Phe Lys Leu Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 465 470 475 480 tct aga tag 1449 Ser Arg <210> 18 <211> 482 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> DsRed-CoHCBD <400> 18 Met Asn His Lys Val His His His His His His Met Glu Leu Met Asp 1 5 10 15 Asn Thr Glu Asp Val Ile Lys Glu Phe Met Gln Phe Lys Val Arg Met 20 25 30 Glu Gly Ser Val Asn Gly His Tyr Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu 35 40 45 Gly Lys Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Gln Val Thr Lys 50 55 60 Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Gln 65 70 75 80 Ala Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr 85 90 95 Met Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Thr Trp Glu Arg Ser Met Asn 100 105 110 Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Glu Val Gln Gln Asp Ser Ser Leu Gln 115 120 125 Asp Gly Thr Phe Ile Tyr Lys Val Lys Phe Lys Gly Val Asn Phe Pro 130 135 140 Ala Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr Ala Gly Trp Glu Pro Ser 145 150 155 160 Thr Glu Lys Leu Tyr Pro Gln Asp Gly Val Leu Lys Gly Glu Ile Ser 165 170 175 His Ala Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His Tyr Thr Cys Asp Phe Lys 180 185 190 Thr Val Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Asn His Tyr 195 200 205 Val Asp Ser Lys Leu Asp Ile Thr Asn His Asn Glu Asp Tyr Thr Val 210 215 220 Val Glu Gln Tyr Glu His Ala Glu Ala Arg His Ser Gly Ser Gln Gly 225 230 235 240 Thr Leu Glu Gly Ser Thr Thr Thr Ala Glu Ile Lys Asp Leu Ser Glu 245 250 255 Asn Lys Leu Pro Val Ile Tyr Met His Val Pro Lys Ser Gly Ala Leu 260 265 270 Asn Gln Lys Val Val Phe Tyr Gly Lys Gly Thr Tyr Asp Pro Asp Gly 275 280 285 Ser Ile Ala Gly Tyr Gln Trp Asp Phe Gly Asp Gly Ser Asp Phe Ser 290 295 300 Ser Glu Gln Asn Pro Ser His Val Tyr Thr Lys Lys Gly Glu Tyr Thr 305 310 315 320 Val Thr Leu Arg Val Met Asp Ser Ser Gly Gln Met Ser Glu Lys Thr 325 330 335 Met Lys Ile Lys Ile Thr Asp Pro Val Tyr Pro Ile Gly Thr Glu Lys 340 345 350 Glu Pro Asn Asn Ser Lys Glu Thr Ala Ser Gly Pro Ile Val Pro Gly 355 360 365 Ile Pro Val Ser Gly Thr Ile Glu Asn Thr Ser Asp Gln Asp Tyr Phe 370 375 380 Tyr Phe Asp Val Ile Thr Pro Gly Glu Val Lys Ile Asp Ile Asn Lys 385 390 395 400 Leu Gly Tyr Gly Gly Ala Thr Trp Val Val Tyr Asp Glu Asn Asn Asn 405 410 415 Ala Val Ser Tyr Ala Thr Asp Asp Gly Gln Asn Leu Ser Gly Lys Phe 420 425 430 Lys Ala Asp Lys Pro Gly Arg Tyr Tyr Ile His Leu Tyr Met Phe Asn 435 440 445 Gly Ser Tyr Met Pro Tyr Arg Ile Asn Ile Glu Gly Ser Val Gly Arg 450 455 460 Glu Phe Lys Leu Val Asp Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 465 470 475 480 Ser Arg <210> 19 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> forward primer for amplifying tdTomato gene (TomatoF) <400> 19 ccggtcgccc atatggtgag caagggcgag gagg 34 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reverse primer for amplifying tdTomato gene (TomatoR) <400> 20 agagtcgcgg cggatccctt gtacagctcg tcca 34

Claims (20)

1. 2종 이상의 콜라게나제에 대해서, 상기 콜라게나제의 콜라겐 결합 도메인을 각각 포함하는 2종 이상의 프로브를 단리된 생체 조직에 적용하고, 각 프로브의 생체 조직에 대한 결합량을 해석하는 것을 특징으로 하는, 생체 조직으로부터의 세포 또는 세포 집단의 분리를 위한 생체 조직의 분석 방법으로서, 각 프로브의 결합량에 기초하여 상기 2종 이상의 콜라게나제의 생체 조직에의 적용량비를 결정하는, 생체 조직의 분석 방법.
2. 제1항에 있어서, 프로브가 형광 분자, 발광 분자, 및 포지트론 핵종을 포함하는 방사성 동위체로부터 선택되는 가시화 분자에 의해 라벨되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제2항에 있어서, 가시화 분자로서, GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato, RFP 및 루시페라아제 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 콜라겐 결합 도메인과 가시화 분자가 융합 단백질을 구성하고 있는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 2종 이상의 프로브를 별도로 또는 동시에 생체 조직에 작용시키고, 각 프로브의 결합량을 별도로 또는 동시에 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 2종 이상의 프로브를 동시에 생체 조직에 작용시키고, 각 프로브의 결합량을 동시에 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 생체 조직으로부터의 세포 또는 세포 집단의 분리 방법으로서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 이용하여 생체 조직을 분석하여 2종 이상의 콜라게나제의 생체 조직에의 적용량비를 결정하고, 상기 적용량비의 콜라게나제를 생체 조직에 적용하여 세포 또는 세포 집단을 분리하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 2종 이상의 콜라게나제에 대해서, 상기 콜라게나제의 콜라겐 결합 도메인을 각각 포함하는 2종류 이상의 프로브를 포함하는 생체 조직 분석용 프로브 세트로서,
   상기 프로브 세트는 생체 조직으로부터의 세포 또는 세포 집단의 분리를 위한 생체 조직의 분석 방법을 수행하기 위한 프로브 세트이고,
   상기 콜라겐 결합 도메인이 히스톨리티쿰균(Clostridium histolyticum) 유래의 콜라게나제 G 및 콜라게나제 H의 콜라겐 결합 도메인이며,
   각 프로브가, 각각 상이한 형광 분자, 발광 분자, 및 포지트론 핵종을 포함하는 방사성 동위체로부터 선택되는 가시화 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 프로브 세트.
9. 제8항에 있어서, 가시화 분자로서, GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato, RFP 및 루시페라아제 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상을 포함하는 프로브 세트.
10. 제9항에 있어서, 상기 루시페라아제 단백질이, 야생형 루시페라아제와 상이한 피크 파장 및 발광 강도를 갖는 프로브 세트.
11. 제8항에 있어서, 콜라겐 결합 도메인과 가시화 분자가 융합 단백질을 구성하고 있는 프로브 세트.
12. 삭제
13. 삭제
14. 제8항에 있어서, 콜라겐 결합 도메인이, 서열 번호 1로 표시되는 아미노산 서열, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열, 또는 그 부분 서열을 포함하는 것인 프로브 세트.
15. 제9항에 있어서, 루시페라아제 단백질이, GFP, EGFP, YFP, BFP, CFP, DsRED, tdTomato, 및 RFP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 형광 분자와 링커를 개재하여 연결되어 있는 것인 프로브 세트.
16. 제8항에 있어서, 상기 프로브가, 콜라겐 결합 도메인을 1∼20회 반복하여 포함하는 것인 프로브 세트.
17. 제8항 내지 제11항 및 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 기재된 프로브 세트와 콜라게나제를 포함하는 생체 조직 분리용 키트.
18. 삭제
19. 삭제
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