KR20030074702A

KR20030074702A - 모듈식 트랜스펙션 시스템

Info

Publication number: KR20030074702A
Application number: KR10-2003-7009248A
Authority: KR
Inventors: 한스-마르틴 슈미트; 루트거 알트로게; 디이트마르 렌츠; 구둘라 리멘; 헬무트 브로스터후스; 엘케 로르바흐; 율리아나 헬프리히; 카타리나 하인; 마리온 그렘제; 타트야나 말레스; 라이너 크리스티네; 그레고르 지베코텐; 보도 오르트만; 타마라 투르반스키; 안드레아 클라에스
Original assignee: 아막사 게엠베하
Priority date: 2001-01-10
Filing date: 2002-01-10
Publication date: 2003-09-19
Also published as: AU2002238376B2; JP2008200041A; EP1427837B1; CN100510087C; US7999073B2; WO2002055721B1; IL156780A0; WO2002055721A2; WO2002055721A3; CN1529759A; ATE530659T1; JP4551058B2; NO20033144D0; US20040137622A1; NO20033144L; DE10290072D2; EP1427837A2; US7320859B2; US20080220527A1; JP2005505233A

Abstract

본 발명은 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질을 사용하여 세포를 트랜스펙션시키는 방법에 관한 것으로, 상기 단백질은 1 또는 그 이상의 트랜스펙션 단계에 영향을 주는 적어도 하나의 기능적 성분들로 우선적으로 수식되고, 트랜스펙션되는 핵산은 그 다음 상기 수식된 단백질로 부하되고, 이에 따라 상기 핵산 및 단백질은 필라멘트형 복합체를 형성하고, 그리고 이 복합체는 최종적으로 트랜스펙션되는 세포에 첨가된다. 본 발명은 또한 트랜스펙션을 위한 적어도 하나의 기능적 성분들로 수식되는 적어도 하나의 핵단백질 필라멘트-형성 단백질을 갖는, 핵단백질 필라멘트(NPF)로 구성되는 트랜스펙션 제재에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간 및 동물의 유전자 치료 요법을 위한 약물의 제조를 위한 본 발명에 따른 상기 트랜스펙션 제재의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 유전자 치료에서의 이용 뿐만 아니라 킷트 내 성분으로서 이러한 트랜스펙션 제재의 이용을 위한 상응하는 학제학적 조제를 포함한다.

Description

모듈식 트랜스펙션 시스템{MODULAR TRANSFECTION SYSTEMS}

공지된 비 바이러스성 트랜스펙션 제재들은 일련의 제한을 받는다. 핵산의 비 바이러스성 트랜스펙션에 있어서, 종종 일측으로 하전되는 구상핵산(globular nucleic acid)의 크기 및 1 또는 다수의 트랜스펙션 단계들의 조절가능성의 부족 양자가 일반적으로 주된 문제점이다. 후자의 일 요인은 외부 세포막 또는 내부 구획들의 막들을 침투하는 불충분한 능력, 효소 분해(enzymatic degradation)로부터의 불충분한 보호, 낮은 생체이용율(bioavailability) 및 세포내에서 비생물학적 분자들에 의해 야기되는 불충분한 조절가능성의 생물학적 효과이다. 주로 매우 확장된 입체 구조를 포함하는 핵산들은 효소에 의해 쉽게 분해될 수 있고, 그리고 그것들의 일측으로 편향된 전하의 과잉은 기본 세포 구조와의 즉각적인 연합을 야기한다. 상기 연합된 불충분한 핵내로의 침투 능력은 현행 핵산 트랜스펙션 기술이 세포주(cell lines)와 같은 암과 유사한 수식된 세포들을 거의 배타적으로 이용하는 결과를 가져오며, 이는 이러한 세포들 내의 핵막이 세포분열 동안에 일시적으로 분해되어 상기 핵내로의 진입이 가능하기 때문이다. 그러나, 수식된 세포들은 일차 세포들의 본래의 생리학적 상태와는 비교될 수 없어서, 일차적으로 트랜스펙션된 세포들의 작용에 관한 결과는 수식된 세포들을 이용한 연구를 신뢰할만하게 기초로 할 수 없다.

일련의 트랜스펙션 제재들이 이미 공지되어 있는데, 이들 대부분은 정전기적 상호작용에 의해 핵산을 가지고 구상 복합체를 형성하며, 종종 50 nm 보다 큰 직경을 갖는다(Tang and Szoka, 1997). 이러한 복합체들은 대부분 과량의 전하를 가지고 세포 표면에 연합하며 세포내유입(endocytosis)에 의해 처리된다. 이것들은 엔도좀(endosomes)이 터질때 까지 상기 엔도좀의 산성화를 완충시키거나(예를들면, 폴리에틸렌이민으로, starburst dendrimers(Kukowska-Latello et al. 1996) 또는 클로로퀸의 첨가), 또는 막-활성 그룹(membrane-active group), 지질 또는 친지질성 펩티드의 작용에 의해 상기 엔도좀을 떠난다. 그러나, 상기 복합체들은, 상기 핵산이 유리된 후에 거기에 요구되는 효과를 나타내는 후속의 세포분열 동안에 세포핵에 단지 도달할 수 있다.

상기 분열-의존적인 핵 수송의 문제점은, 특히 시그널 매스킹(signal masking) 및 비특이성 단백질 결합(WO 00/40742, Amaxa)의 문제점에 주목할 때, NLS-펩티드(NLS = nuclear localization signal)의 사용에 의해 피할 수 있다.

미국 특허 공보 제 5,468,629 호에는 RecA 단백질의 이용 및 ssDNA(single-strand DNA)를 갖는 세포들의 트랜스펙션에서의 RecA 에 기능적인 상동관계를 갖는 다른 단백질의 가능한 이용이 기술된다. 상기 단백질 RecA 는, 분명하게 촉매에 의해, 가닥 짝짓기(strand pairing) 및 뒤따르는 가닥 교환(strand exchange)에 영향을 미침에 의해 수송된 ssDNA 와 세포 DNA 의 상동 재조합의 과정을 지지한다. 여기서 사용된 복합체들은 최대 700 뉴클레오티드의 ssDNA 뿐만 아니라 RecA 단백질을 함유하며, " RecA-coated" 복합체로서 기술된다. 이러한 ssDNA-단백질 복합체들은 안정한 나선형 프리시냅틱 필라멘트들(helical presynaptic filaments)의 형성과 함께, RecA 및 ATP- γ- S 의 존재하에서 DNA 로부터 형성된다. 이러한 복합체들은, 예를 들면, 세포주, 즉, 활성적으로 분열하는 세포, 특히 수식된 세포에 대해서는 매우 낮은 성공률을 가지고 이용된다.

본 발명은 핵산의 비 바이러스성 트랜스펙션(non-viral transfection)에 관한 것이다. 상기 트랜스펙션이란 용어는 일반적으로 외래 물질을 세포내로 도입하는 것을 의미한다. 본 발명은 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질의 도움으로 세포의 트랜스펙션을 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질과, 트랜스펙션되는 적어도 하나의 핵산으로부터 형성된 핵단백질 필라멘트(NPF)를 함유하는 트랜스펙션 제재에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 상응하는 약학적 포뮬레이션, 특히 유전자 치료, 핵산으로 세포의 트랜스펙션을 위한 킷트(kit)에의 이용을 위해 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재의 이용 및 본 발명에 따른 상기 트랜스펙션 제재를 이용하는 특별한 방법에 관한 것이다.

도 1: 발현 플라스미드의 개략도

도 1 은 실시예에 기술된 NPF-형성 단백질의 구조 및 제조의 개략도를 도시한다.

도 2: UvsX 의 이중-가닥 DNA 로의 결합

도 2 는 76 mM K₂HPO₄, 17 mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, pH=7.2, 5 mM MgCl₂및 0 또는 1 mM ATP- γ-S 내에 주어진 양의 H6UvsX 를 갖는 200 ng(각각의 경우)의 정제된 1 kb PCR 조각의 반응 혼합물을 도시하는데, 이것은 실온에서 30 분 동안 최종 부피 15㎕ 로 항온처리되며, 그 다음 0.8% TAE/아가로스 겔에 가해지고, 이것은 후에 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 착색된다.

도 3: 상이한 ATP 유사체의 존재하에서 NLS-수식된 UvsX의 이중-가닥 DNA 로의 결합

250ng 의 정제된 1 kb PCR 조각이 76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, pH=7.2, 5 mM MgCl₂및 0.5 또는 2mM 의 주어진 양의 뉴클레오티드 유사체내에 15 ㎍ UvsXH6N2 로 실온에서 30분 동안 20㎕의 최종 부피로 항온처리된다. 상기 반응 혼합물은 그 다음 분리되고 220ng 의 1.7 kb PCR 조각이 반까지 첨가되고(B), 실온에서 추가적으로 30분 동안 항온처리된다; 모든 반응 혼합물들은 그 다음 0.8% TAE/아가로스 겔에 가해지고, 이것은 후에 에티듐 브로마이로 착색된다.

도 4: UvsX 와 수식된 UvsX 혼합물의 이중-가닥 DNA 로의 결합

200ng(각각의 경우)의 정제된 1 kb PCR 조각이 주어진 양의 정제된 H6UvsX 또는 UvsXH6N2를 갖는 76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, pH=7.2, 5mM MgCl₂및 1mM의 ATP- γ-S 로 실온에서 30분 동안 항온처리되고, 그 다음 모든 반응 혼합물들은 그 다음 0.8% TAE/아가로스 겔에 가해지고, 이것은 후에 에티듐 브로마이로 착색된다. DNA의 전기영동 작용이 염, 미량의 이미다졸 또는 글리세린으로 인해 인위적이 되는 가능성을 제거하기 위해, 용출 또는 투석 완충액 샘플이 트랙 8 및 9 에 포함된다.(최종농도: 500mM 이미다졸을 갖는 1/10 부피 용출 완충액, 50% 글리세린을 갖는 3/20 부피 투석 완충액).

도 5: 전기영동과의 조합으로 NIH3T3 세포의 트랜스펙션의 FACScan 분석

도 5 a 내지 d 는 FACScan 분석을 도시한다: 5a) DNA 없이 전기 영동, 5b) UvsX 없이 벡터 DNA 의 전기영동, 5c) 벡터 DNA 가 Uvsx 내에 패키징된 상태, 5d) 벡터 DNA 가 Uvsx-NLS 내에 패키징된 상태

도 6: 전기영동과의 조합으로 NIH3T3 세포의 트랜스펙션의 추가적인 FACScan 분석

도 6 은 UvsX-NLS(UvsXH6N2-2) 내에 패키징된 벡터 DNA 및 UvsX "스크램블된(scrambled)" NLS(UvsXH6N2sc) 내에 패키징된 벡터 DNA 를 가지고 트랜스펙션의 FACSscan 의 결과를 나타낸 막대 그래프를 도시한다.

도 7: 현미주사와의 조합으로 NIH3T3 세포의 트랜스펙션의 형광 현미경 분석

형광 표지 단백질의 발현(좌측)이 현미주사된 NIH3T3 세포 내에 나타난다. BSA-Cy5는 주사 표지자로서 이용되는데, 이것은 상응하는 형광 필터에서 시각화된다(우측). 사진 1 및 2 는 세포질 내에서 DNA 및 UvsXH6N2sc 로 주사된 세포를 도시하며; 사진 3 및 4 는 DNA 및 UvsXH6N2-2 로 주사된 세포를 도시하며; 도 5 및 6 은 단지 DNA 로만 주사된 세포를 도시한다.

도 8: SASP 단백질을 위한 발현 플라스미드의 개략도

도 8 은 실시예 7 및 8 에 기술되는 SASP 단백질의 구조 및 제조의 개략도를 도시한다.

도 9: (A) SASP 단백질의 정제

(B) SASP 단백질의 DNA 결합 능력

도 9A 는 정제된 SASP 단백질을 갖는 SDS 겔을 도시하며, 도 9B 는 DNA 이동 분석에서 SASP 단백질에 의한 DNA 의 결합을 도시한다.

도 10: (A) SASP-NLS-단백질의 정제

(B) SASP-NLS-단백질의 DNA 결합 능력

도 10A 는 정제된 SASP-NLS-단백질(SASP-H6N2)을 갖는 SDS 겔을 도시하며, 도 10B 는 DNA 이동 분석에서 SASP-NLS 단백질에 의한 DNA 의 결합을 도시한다.

도 11: RGD-모티브를 갖는 펩티드의 H6UvsX 로의 커플링

도 11 은 화학적으로 커플링된 펩티드 RGD2 를 갖는 그리고 갖지않는 H6UvsX 단백질의 전기영동 분리를 도시한다. 독립적으로 준비된 2개의 H6UvsX^*(RGD2)가 도시된다. 1㎍ 단백질이 각각의 트랙에 가해진다.

도 12: 상이하게 수식된 UvsX 단백질의 이중-가닥 DNA 로의 결합

도 12 는 이중-가닥 DNA 조각으로 구성된 NPFs 의 아가로스 겔에서의 분리, 그리고 H6UvsX^*(RGD2)와 UvsXH6N2-2(트랙1)의 혼합물, 또는 UvsXH6N2-2 단독(트랙2) 또는 H6UvsX^*(RGD2) 단독(트랙3)의 경우에서의 분리를 도시한다.

도 13: UvsXH6N2 및 UvsXH6N2NIT-2 의 플로오레신-표지 DNA 로의 결합의DNA 이동 분석

도 13 은 DNA-UvsXH6N2 및 DNA-UvsXH6N2NIT-2 의 DNA 이동을 도시한다. 상기 단백질들은 실시예 10 에 기술되는 바와 같이 AlexaFluor488-표지 DNA 조각을 가지고 항온처리된다.

도 14: 세포내유입에 의한 NIH3T3 세포 내에서 NPF들의 도입의 형광 현미경 분석

도 14a 및 14b 는 NIH3T3 세포들의 형광 현미경 사진을 도시한다. 각각의 경우, 하나의 사진은 밝은 장 이미지(아래)를 도시하고 하나는 반사된 빛 형광(위) 이미지를 도시한다. 밝은 장에서, 소포성 세포내 구획을 인식할 수 있는데, 이것은 세포내유입된 플로오레신-표지 DNA로 인해 형광 빛을 발산한다.

도 15: 세포내유입된 NPF 들을 갖는 세포들의 백분율

도 15 는 적어도 하나의 형광 소포성 구획을 저해하는 세포들의 백분율을 나타내는 막대 그래프이다.

도 16: 발현 플라스미드의 개략도

도 16 은 hRad51 융합 단백질의 제조를 위한 발현 플라스미드의 구조의 개략도를 도시한다.

도 17: NLS-수식된 hRad51(hRad51H6N2)의 이중-가닥 DNA 로의 결합

도 17(A)는 니켈-킬레이트 친화 크로마토그래피로 정제후 hRad51H6N2 (12.7㎍) 및 hRad51H6 (11㎍)을 갖는 SDS/Coomassie 겔을 도시한다. 도 17(B)는 38mMK₂HPO₄, 8.5mM KH₂PO₄, 7mM NaH₂PO₄, pH=7.2, 15mM MgCl₂, 2.5mM ATP 및 25% 글리세린에 주어진 양의 hRad51H6N2 를 갖는 정화된 0.9 kb PCR 조각의 100ng(각각의 경우)의 반응 혼합물들을 도시하는데, 이것들은 37℃ 에서 10분 동안 최종 부피 30㎕로 항온처리되고 그 다음 후에 에티듐 브로마이드로 착색되는 1%의 TAE/아가로스 겔에 가해진다.

도 18: 상이하게 수식된 UvsX(UvsX-NLS-VP22 및 UvsX-NLS) 혼합물의 이중-가닥 DNA 로의 결합

도 18(A)는 UvsXH6N2VP22c50 을 갖는 SDS/Coomassie 겔을 도시한다.

도 18(B): 140ng(각각의 경우)의 정제된 1.7 kb PCR 조각이 지시된 양의 정제된 UvsXH6N2VP22c50 또는 UvsXH6N2-2를 갖는 96mM K₂HPO₄, 21.5mM KH₂PO₄, 18mM NaH₂PO₄, pH=7.2, 5mM MgCl₂및 1.3mM의 ATP- γ-S 로 실온에서 30분 동안 항온처리된다. 그 다음 모든 반응 혼합물들은 0.8% TAE/아가로스 겔에 가해지고, 이것은 후에 에티듐 브로마이로 착색된다.

도 19: DNA와 UvsX-NLS-VP22 및 UvsX-NLS 혼합물의 복합체로 처리후 트랜스펙션된 NIH3T3 세포들

NIH3T3 세포의 형광 현미경 사진, 1㎍ 발현 벡터 DNA 와, 19㎍ UvsXH6N2VP22c50 와 39㎍ UvsXH6N2-2 혼합물과의 복합체로 처리 24시간 후.

도 20: 본 발명에 따른 핵단백질 필라멘트를 기초로 하는 방법 및 트랜스펙션 제재의 기본 구조의 개략도.

본 발명의 목적은 세포내 개선된 도입을 허용하고 동시에 트랜스펙션 과정의 제어를 가능케하는, 특정한 종류의 핵산을 특정한 종류의 세포들 내부로 트랜스펙션하기 위한 방법 및 트랜스펙션 제재를 제공하는 것이다. 이러한 목적을 위한 트랜스펙션 제재는 상기 트랜스펙션 과정 동안 적당히 안정해야 하고 또한 표적세포구획에서 트랜스펙션되도록 핵산의 적합한 유리(release)를 보장해야 한다.

본 발명은 도입부에 언급된 유형의 방법을 구비하는 본 발명에 따라 해결되는데, 여기서 상기 단백질은 최초 상기 트랜스펙션의 1 또는 그 이상의 단계에 영향을 주는 적어도 하나의 기능적 성분을 가지고 수식된다. 트랜스펙션되는 핵산에는 상기 수식된 단백질이 부하되고(loaded), 상기 핵산 및 단백질은 필라멘트 형상의 복합체를 형성하며, 그리고 이 복합체는 최종적으로 트랜스펙션되는 세포에 첨가된다.

또한, 이러한 목적은 도입부에 언급된 유형의 트랜스펙션 제재에 의해 해결되는데, 여기서 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 상기 단백질은 상기 트랜스펙션에 영향을 주는 적어도 하나의 성분을 가지고 수식된다.

1 또는 다수의 동일하거나 또는 상이한 추가적인 기능적 성분들을 가지고 핵단백질 필라멘트(NPF)를 형성하는 1 또는 다수의 단백질들의 수식의 결과로서, 상기 복잡한 트랜스펙션 과정의 개별적인 단계는 트랜스펙션되는 상기 핵산 및 표적 세포에 특이적인 특히 유리한 방법으로 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 상기 방법 및 트랜스펙션 제재는 공지된 방법들과 비교하여 트랜스펙션 효율성의 확연한 증가를 가져온다.

본 발명에 따르면, 상기 NPF-형성 단백질들은 유리한 방법, 특히 작용기들을 위한 모듈식 수송 시스템으로서 이용되는데, 이것은 DNA 의 완전한 보호에 월등하다. 상기 복합체는 두가지 관점에서 공간적으로 매우 낮은 확장을 나타낸다: 이것은 구상이 아니라 필라멘트형이며 필라멘트 당 오직 하나의 핵산 분자만을 포함한다. 운반체단백질(carrier protein) 당 소량의 뉴클레오티드의 화학양론적 비율을 가져오는 조합으로 인해, 구상 복합체에서 보다 매우 더 큰, 트랜스펙션을 위한 매우 높은 밀도의 기능적 신호가 가능하다. 상기 신호 밀도 및 또한 상이한 신호의 조합은 상이한 기능화된 운반체단백질과 작용기가 없는 단백질들의 혼합에 의해 개별적으로 조절될 수 있어서, 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재는 가장 광범위한 트랜스펙션 조건을 위한 모듈식 시스템으로서 설계될 수 있다. 상기 공간상에서의 낮은 확장 및 높은 신호 밀도는 또한 추가적으로 작은 분자들에 특이적인 내재 수송 시스템의 이용을 가능하게 한다. 이것의 필라멘트적 특성, 간단한 구조 및 조절가능하며 매우 높은 신호 밀도로 인해, 본 발명에 따른 방법, 또는 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재는, 내지 메카니즘을 이용하여, 발현벡터와 같이 큰 핵산 분자의 특이적인 수송을 가능하게 한다.

추가적인 기능적 성분들이 예를들면 상기 NPF 단백질에 직접적으로 결합되거나, 스페이서를 통하여 비기능성 분리 유닛에 결합될 수 있다. 이러한 유형의 스페이서들은 상기 NPF 와 기능적 성분들 간의 매우 큰 거리를 야기하고, 이것은 상호 입체적 장해를 방지하며 상기 NPF 단백질 및 기능적 성분들의 보다 나은 공간적인 유용성을 보장한다. 이에 따라 본 발명에 따른 상기 제재의 구조는 그 다음 상기 기능적 성분들의 은폐(masking)를 대부분 방지한다.

NPF-형성 단백질들은 대부분 협동결합(cooperating binding)에 의해 핵산들을 갖는 핵단백질 필라멘트를 형성하는데, 여기서 단백질 및 핵산은 공지된 구상 트랜스펙션 제재들 보다 매우 더 작은 크기 및 직경을 갖는 복합체를 형성한다. 이러한 유형의 NPF 는 예를 들면 상기 RecA 족 단백질들에 의해 형성될 수 있는데, 이것은 예를 들면 이중 가닥 DNA(Bianco et al., 1998)에서 3개의 염기 당 1개의 단백질의 총 밀도 부하를 갖는, ATP(adenosine triphosphate)와 같은 뉴클레오시드 트리포스페이트들의 존재하에서, DNA-의존 ATPases 이다. 이렇게 높은 단백질 밀도는 핵산의 효소성 가수분해로부터의 뛰어난 보호를 제공하는데 이는 효소의 공격이 가능한 자리가 크게 감소하기 때문이다. 상기 NPF 는 상기 복합체가 적당히 안정되게 할 뿐만 아니라 예를 들면 핵 내에서 상기 수송된 핵산의 적당한 유리를 또한 가능케한다. 예를 들면 ATP- γ-S 또는 GTP - γ-S 와 같은 ATP 및/또는 GTP 의 예로서, 비가수분해성 또는 낮은 가수분해성 뉴클레오시드 트리포스페이트 유사체의 이용은, 상기 RecA 족과 같은 ATP-형성 단백질을 가지고 형성되는 NPF 들에 추가적인 안정성을 제공하는 가능성을 제공한다.

본 발명에 따르면, NPF 들을 형성할 수 있는 단백질들은 또한 유도 NPF 단백질들을 포함한다. 예를 들면, 융합 단백질이 형성될 수 있다. 또한, NPF-형성 단백질들은 끝이 잘려지거나 또는 신장되고, 개별적인 절편 또는 아미노산들은 본 발명에 필수적인 핵산을 가지고 NPF 들을 구조적으로 형성하는 그것들의 기능이 유지되는 한 결손, 도입 또는 화학적으로 변형될 수 있다.

본 발명의 특히 유리한 점은 핵 수송의 자연적인 메카니즘의 이용을 가능케 하는 상기 NPF 들의 공간적인 구조이다. 상기 트랜스펙션 제재의 최대 직경은 핵공(nuclear pores)의 크기에 의해 결정되고 심지어는 매우 긴 핵산을 가지고도 초과되지 않는데, 즉, NPF 들은 트랜스펙션되는 핵산의 길이에 독립적으로 트랜스펙션 제재로서 사용된다. 상기 핵공을 통한 수송에 대한 크기적 한계는 약 25 nm (Feldherr and Akin, 1997) 또는 50 nm (SV40-Virus)(Yamada and Kasamatsu, 1993)인 것으로 나타났다. 구상 구조를 가지며 및/또는 트랜스펙션 성분 당 다수의 핵산 분자들의 비특이성 결합을 갖는 종래의 트랜스펙션 제재에 의한 핵막을 통한 수송이 저지된 핵산들은 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재들을 이용하여 이러한 한계 아래에 쉽게 놓일 수 있다. 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재의 구조는 심지어, 사용된 NPF-형성 단백질에 의존하는, 11 nm 이하의 최초 직경에 대해 이용하는 것을 가능케한다. NPF 단백질들의 이용에 의해 조합된 필라멘트형 구조는 따라서 길이에 있어서 수 킬로베이스의 더 긴 핵산의 수송에 또한 적합하다. 본 발명에 따른 방법 및 본 발명에 따른 상기 트랜스펙션 제재들은 결과적으로 특히 큰 핵산 서열을 갖는 세포들의 트랜스펙션에 매우 적합하다. 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재들은 적어도 700 뉴클레오티드를 포함하는 트랜스펙션되는 핵산을 함유하는 것이 바람직하다.

본 발명은 이러한 핵산들의 트랜스펙션을 위해 또는 다른 트랜스펙션 방법들 및 물질들과 조합하여 사용되는 것이 바람직하다. NPF-형성 단백질들로의 높은 정도의 부하는 가수분해 대한 안정도를 증가시키고 상기 NPF 의 작은 직경은, 예를 들면 핵 수송 시스템의 수송 메카니즘과 같이, 충분히 작은 분자들에 대해서만 단지 이용가능한 내재 세포 수송 메카니즘의 이용을 가능케한다. 또한, 트랜스펙션되는 핵산의 세포 구획내, 바람직하게는 핵내에서의 충분한 유리가 보장된다.

본 발명에 따른 "트랜스펙션 제재" 라는 용어는 핵산들 또는 트랜스펙션되는상기 핵산을 이미 포함하는 그것들의 유도체들을 위한 수송 운반체로서 이해된다. 본 발명의 관점에서 트랜스펙션 제재는 트랜스펙션의 복잡한 과정 중 적어도 단일 단계를 수행한다.

본 발명과 관련하여, "핵단백질 필라멘트(NPF)" 라는 용어는, 핵산(들), 또는 핵산 유도체들, 그리고 비공유성이며 대부분 협동결합의 결과로 인해, 바람직하게는 단지 단일 핵산 분자 또는 이것의 유도체를 포함하는 필라멘트형 또는 실 형상의 복합체를 형성하는 단백질들로 구성되는 분자 구조를 의미한다. 예들들면, 단일 또는 이중 가닥 DNA (Di Capua et al., 1982)를 갖는 RecA 로부터 형성되는것과 같은, 나선형 핵단백질 필라멘트들이 특히 바람직하다.

상기 "트랜스펙션되는 핵산" 은 이중 또는 단일 가닥 DNA 일 수 있고, 또는 이중 또는 단일 가닥 RNA 일 수도 있고, 또는 단일 가닥 말단을 갖는 이중 가닥 DNA, 또는 DNA/RNA 하이브리드, 안티센스 DNA, 안티센스 RNA 또는 화학적으로 변형된 핵산 유도체들일 수 있는데, 여기서, 예를 들면, 가수분해에 대한 저항은 증가되고(펩티트 핵산, PNA), 또는 반응성 분자 그룹들이 공유결합 및/또는 표적 핵산의 수식을 위해 도입되었다. 트랜스펙션 가능한 핵산들의 유도체들은 서열-특이성 또는 고유적으로 결합된 단백질을 가지고 이용된 핵산의 수식을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 바람직한 핵산은 DNA 이고, 특히 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다. 지금까지, NPF-형성 단백질들은, 예를 들면, 재조합을 위해서, 대부분 단일 가닥 DNA 와 함께 사용되었다. 놀랍게도, 본 발명과 관련하여 많은 NPF-형성 단백질들은 적당한 조건하에서 이중 가닥 DNA 를 가지고 안정한 복합체를 또한 형성라고 본 발명에 따라 이중 가닥 DNA 의 트랜스펙션을 위해 이용될 수 있는 것으로 판명되었다. 따라서, 본 발명의 또다른 장점은 이중 가닥 DNA 를 가지고 효율적인 트랜스펙션이 또한 가능하다는 것이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 기능적 성분에 의해 수식된 NPF 들은 본래의 NPF-형성 단백질들 또는 그들의 유도체들의 수식에 의해 형성된다. 이러한 수식은 아미노산 및/또는 단백질 영역의 결손 및 삽입일 수 있다. 상기 수식은 아미노산 및/또는 다른 분자 그룹들의 화학적인 변형에 의해 제공되거나 및/또는 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자들의 상기 NPF-형성 단백질 또는 이것의 유도체로의 화학적 커플링에 의해 또한 제공될 수 있다. 이러한 수식들은 스페이서의 이용으로 발생할 수 있다.

트랜스펙션에 대한 첫번째 장애는 상기 트랜스펙션 복합체가 세포 표면으로 회합된다는 데 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법 및 트랜스펙션 제재의 바람직한 실시예는, 상기 복합체 또는 제재의 세포 표면으로의 회합을 야기하는 적어도 하나의 작용기를 가지고 수식된 NPF 를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질을 이용한다. 이것은, 1 또는 단지 몇개의 세포 유형들에 발현되는 세포 유형에 특이적인 표면 구조로의 결합에 의해 상기 세포 유형에 특이적으로 수행될 수 있고, 또는 예를 들면, 정전기적 상호작용에 의해, 비특이적으로 수행될 수 있다. 자연적으로 발생하거나 또는 합성에 의해 형성되는 모든 물질들이, 예를 들면, Epstein Barr Virus 수용체 CD21(Delcayre, 1991) 또는 Listeria monocytogenes receptor E-cadherin(Mengaud, 1996)와 같이, 바이러스 또는 박테리아에 의해 세포 진입을 위해 사용되는 수용체들과 같은, 수용체에 세포 표면에서 결합하는 세포 유형-특이성 결합을 위해 사용될 수 있다. 리간드-수용체 쌍들의 이용에 대한 다른 예들은, 많은 철분을 필요로하는 세포들을 위한 트랜스페린 수용체/트랜스페린 시스템을 포함하며, 간세포를 위한 아시알로글리코프로테인 수용체/갈락토오스를 포함하며, RGD(Harbottle 1998) 또는 몰로신(Collins 2000), 또는 인슐린(Rosenkranz 1992), EGF(피부 성장 인자) 또는 인슐린과 유사한 성장 인자 I (Feero, 1997)과 같이 호르몬 수용체에 결합하는 호르몬과 같은 인테그린/인테그린-결합 펩티드들을 포함하며 그리고 렉틴(Midoux et al., 1993)에 결합하는 올리고사카라이드들을 포함한다. 세포-특이성 항체들(Fominaya, 1996) 또는 단백질 A 또는 이것의 lgG-결합 영역(Ohno, 1997) 뿐만 아니라 바이오틸화된 단백질(biotinylated proteins; 세포 표면상에서 바이오틸화된 단백질 또는 바이오틸화된 단클론 항체들)을 스트랩타비딘(Schoeman, 1995)과의 조합으로 이용하는 것 또한 가능하다. 본 발명과 관련하여 "항원결정기 표지(epitope tagging)" 을 이용하는 것이 특히 적합한데, 이것은 즉, 한편으로 상기 NPF-형성 단백질들 또는 그것들의 유도체에, 다른 한편으로는 특이성 세포 표면 구조에 유전자 공학에 의해 커플링 또는 융합된 인플루엔자 응집소(Surdej, 1994) 또는 c-myc 단백질(Evan, 1985)로부터 나오는 것과 같은 짧은 펩티드인 항원결정기를 인식할 수 있는 생체특이성 항체들을 이용한 세포 유형 특이성 트랜스펙션을 이용하는 것이 다. 정전기적 힘에 의한 트랜스펙션 복합체의 비세포특이성 상호작용응 위해, 예를들면, 추가적인 아미노산(리신, 아르기닌, 히스티딘)을 갖는 양전하를 도입하는 것이 가능하다.

본 발명에 따른 방법 및 트랜스펙션 제재의 특히 바람직한 또다른 실시예에 있어서, 상기 기능적 성분들이 상기 복합체 또는 제제의 세포막을 통과하는 비-엔도좀 막 통과를 일으키도록 의도된다. 상기 비-엔도좀 막 통과는 상기 제재가 시토졸 내에서 즉시 사용가능하고 리소좀의 가수분해성 활성 환경에 노출되지 않는 장점을 갖는다. 이러한 유형의 막 통과는 막 활성 분자들을 가지고 달성될 수 있다. 이것들은 예를 들면 HIV 텟(tat), VP22, HBV 표면 항체와 같은 바이러스성 펩티드와 같이 대부분 지방족 또는 암피필릭(amphiphilic)인 자연적으로 발생하고, 수식된 또는 합성 펩티드들일 수 있고; 예를 들면, 안테나페디아의 호메오도메인(Thoren et al 2000), 톱니모양으로된, HOXA-5 와 같은 전사 인자로부터의 펩티드들일 수 있고; 예를 들면, IL-1 β, FGF-1, FGF-2 와 같은 사이토카인으로부터의 펩티드들일 수 있고, 예를 들면, 카포시(Kaposi) 섬유아세포 성장 인자와 같은 세포 신호 서열, 예를 들면, mab 3E10(Weisbart et al 2000)과 같이 살아있는 세포를 침투하는 단클론 항체들, 예를 들면, 암피필릭 모델 펩티드들 또는 트랜스포테인(transportane)(Pooga et al. 1998)과 같이 합성 또는 키메라적 펩티드들로부터의 펩티드들일 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예는 본 발명에 따른 적어도 하나의 기능적 성분을 이용하는데 이것은 상기 엔도좀 또는 리소좀으로부터의 제재 또는 상기 복합체를 유리시킨다. 예를 들면, 세포막을 통한 통과는 세포내유입을 통하여 발생할 수 있다. 세포내유입 후에, 상기 핵단백질 복합체들은 상기 엔도좀으로부터 유리되어야 한다. 이러한 목적을 위해, endosomolytic 활성을 갖는 모든 물질들이 사용될수 있다. 이들은, 예를 들면, 펩티드일 수 있으며, 이들의 유도체일 수 있으며, 또는 박테리아 또는 바이러스로부터의 합성 유사체일 수 있으며, 또는 당업자에게 알려져있는 다른 합성 물질들일 수 있다. 박테리아로부터의 endosomolytic 물질들은, 예를 들면, 스트랩톨리신 O(streptolysin O), 뉴몰리신(pneumolysin), 스타필로코칼 α- 톡신(staphylococcal α- toxin), 리스테리올리신 O(listeriolysin O; Provoda, 2000)를 포함한다. 바이러스성 펩티드는, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스의 N-터미날 헤마글루티닌 HA-2 펩티드(Steinhauer et al., 1995), 리노바이러스 HRV2 의 VP-1 단백질의 N-터미너스(Zauner et al., 1995) 또는 아데노바이러스의 캡시드 성분 Ad2(Hong, 1999)를 포함한다. 합성 물질들은, 예를 들면, 암피패틱 펩티드들(GALA, KALA, EGLA, JTS1)(Wagner, 1999) 또는 이미다졸-(Pack, 2000) 또는 폴리아미도아민-수식된 폴리머(Richardson, 1999)를 포함한다.

일반적으로 세포분열에 의존하여 발생하고, 가능하게는 상기 세포의 자극 후에 발생하는 핵내로의 통과(유입)는 모든 트랜스펙션 제재에 대한 특별한 장애이다. 따라서, 본 발명의 특히 바람직한 실시예에 있어서, 상기 세포 핵 내로의 상기 복합체 또는 제재의 수송을 일으키는 기능적인 성분을 이용하는 것이 의도된다. 핵수송에 있어서의 필수적인 것들은 우선적으로 핵공의 한계 직경, 그리고 두번째로 수송을 위해 사용되는 신호 분자들이다. 본 발명과 관련하여 핵수송을 위한 신호들은 핵 소용체에 결합하는 핵 리간드들이다. 특히 적합한 핵 리간드들은 NLS(nuclear localization signals; 핵 국부 신호) 또는 핵수송 수단의 다른 성분들이다. 이용에 특히 바람직한 상기 핵 국부 신호는 그들 자체 및/또는 그들의 인접 부위와 함께 양전하 과잉이 적거나 또는 없는 신호들인데, 이는 전하 과잉이 비특이성 핵산 결합을 일으킬 수 있고, 이에 따라 상기 신호의 마스킹(masking)을 일으킬 수 있기 때문이다. 펩티드의 총 전하가 인접의 음으로 하전된 아미노산에 의해 적어도 대략적으로 균형잡혀질 수 있을 때, 적합한 것은 소위 고전적 NLS 의 연장된 시퀀스이다. 이러한 아미노산들은 이러한 위치에서 상기 펩티드/단백질 내에서 자연적으로 발생할 수 있거나 또는 구조적인 고려를 기초로 거기에 도입될 수 있다. 소위 비고전적 NLS 가 또한 사용될 수 있는데, 예를 들면, 인플루엔자 바이러스 "핵단백질" 로부터의 NLS(Wang et al., 1997, Neumann et al., 1997) 또는 다량의 과잉 양전하가 없거나 비고전적인 수송 루트에 의해 핵 내로 통과되는 외래 핵 RNP(hnRNP) A1 단백질로부터의 시퀀스 M9 이다. 본 발명의 실시예에 사용될 수 있는 상기 NLS 의 불완전하지만 좋은 전망은 T. Boulikas(1993, 1996, 1997)에 의해 주어진다. 전하-중성 시퀀스들은, 예를들면, 자연적으로 발생하거나 또는 인공적으로 도입된 인접의 음전하들을 갖는 시미안 바이러스 40 으로부터의 큰 T-항원을 포함한다(WO 00/40742 Amaxa 를 또한 참조).

따라서, 본 발명의 특히 유리한 점은, 분열하지 않거나 또는 단지 약하게 분열하는 진핵세포, 특히 일차 진핵세포의 핵산들의 트랜스펙션의 확연한 개선이다. 생물학적 또는 의학적 정보를 제공하는 것은 그것들의 능력을 아직 상실하지 않은 바로 이러한 세포들이며, 이는 그것들이, 예를들면, 혈액 샘플링 또는 조직 생체검사에 의해 신체로부터 직접적으로 얻어질 수 있기 때문이며, 당업자들에게 결정적으로 중요한것이다. 거의 완전하게 해독된 인간 게놈의 예상되는 분석에 있어서,이것은 세포 시스템에서 조사되는 유전자의 특이적인 발현이며 최종적으로 충분한 생리학적 타당성을 갖는 가능한 기술적인 적용가능성의 투명한 증거를 제공할 것이다. 또한, 일차 세포의 트랜스펙션은 생체 내외 모두에서의, 비바이러스성 유전자 치료를 위한 필수적인 전제조건이다.

본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 본 발명에 따른 방법 및 트랜스펙션 제재는, 상이한 기능의 수개의 기능적 성분들을 가지고 수식된 핵단백질 필라멘트들을 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질과 및/또는 상이한 기능의 단백질을 가지고 수식된 상이한 단백질들을 각각 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재들은, 상술한 바와 같이, NPF 들 또는 그것들의 유도체를 형성할 수 있는 다수의 단백질들을 가지고 실현될 수 있는데, 이것들은 그것들 본래의 형태 또는 기능적으로 수식된 형태에 존재할 수 있다. NPF 들을 형성할 수 있는 단일 또는 수개의 상이한 단백질들이 사용될 수 있고, 이것들은 트랜스펙션의 특정한 요구조건에 따라, 동일하거나 또는 상이한 기능을 하는 1 또는 수개의 기능적 성분들을 가지고 수식될 수 있다. 의도된 목적에 따라, 상이한 모듈이 이러한 방법으로 이용자에 의해 조립될 수 있다. 이것은 모듈식 시스템의 근원이 되며 이것으로부터 상기 트랜스펙션 전략의 트랜스펙션되는 핵산 및 표적세포로의 최적의 적용을 달성하기 위해 동일하거나 또는 상이한 기능을 갖는 수식되지 않거나 또는 수식된 NPF 단백질들이 선택될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시예에서는 상기 단백질에 다수의 기능적 성분들이 부하되도록 의도된다. 이러한 방법으로, 총 신호 밀도는 여전히 더욱 증가될 수있고, 따라서 트랜스펙션 효율이 증가되며 더욱 우수한 트랜스펙션의 조절이 가능하다.

많은 NPF-형성 단백질들은 보조인자로서 ATP와 같은 뉴클레오시드 트리포스페이들트의 존재하에서 상기 NPF 구조를 형성한다. 여기서 뉴클레오시드 트리포스페이트들의 첨가는 상기 NPF 를 안정화시킨다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 NPF 구조는 따라서 뉴클레오시드 트리포스페이트들 및/또는 이것들의 비-가수분해성 유사체, 특히 ATP(아데노신 트리포스페이트) 및/또는 GTP(구아노신 트리포스페이트) 및/또는 그것들의 비-가수분해성 유사체들에 의해 유리하게 형성되거나 또는 안정화될 수 있다. 이것은 광화학 반응 후에 공유결합에 의해 또한 발생할 수 있다. 비-가수분해성 뉴클레오시드 트리포스페이트 유사체들은, 예를들면, ATP- γ- S(아데노신 5'-O-3-치오트리포스페이트) 및 GTP - γ- S(구아노신 5'-O-3-치오트리포스페이트)(Ellouze, 1999)를 포함한다. 광화학 반응 후에 NPF-ATPases 를 수식시키는 가능한 ATP 는 8N₃ATP (8-아지도아데노신 5'-트리포스페이트) 및 5'FSBA (5'-p-플루오로술포닐벤조일아데노신)(Knight, 1985)를 포함한다.

본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시예에 있어서, 이것은, 리포좀-매개 트랜스퍼(liposome-mediated transfer), 미세주입(microinjection), 전기천공(electroporation), 면역천공(immunoporation), 발리스틱 방법(ballistic method), 양이온성 지질들, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민 또는 pH-민감성 하이드로겔로의 트랜스퍼와 같이, 생물학적으로 활성인 분자들을 위한다른 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리학적 트랜스펙션 방법들과의 조합하여 이용될 수 있다. 이러한 종류의 트랜스퍼 방법, 특히 전기천공법은, 예를 들면, 세포의 세포질으로의 유입과 같은, 트랜스펙션 과정에서의 개별적인 단계들을 유리하게 지원할 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 트랜스펙션 제재는, NPF-형성 단백질로서, RecA, RadA, ScRad51, RAD51, hDmc1, SASP, ICP8, 바람직하게는 UvsX, 더욱 바람직하게는 hRAD51 또는 이러한 그룹 내 단백질 중 적어도 2개의 혼합물 또는 이러한 단백질들의 1 또는 수개의 유도체들을 포함하는 단백질의 그룹으로부터 선택되는 단백질을 포함한다. 본 발명의 실시예를 위한 NPF-형성 단백질들은, 예를 들면, 대장균으로부터의 RecA 를 포함하며 그리고 박테리오파아지 T4 로부터의 UvsX(Mosig, 1987), 아르케박테리아(archebacteria)로 부터의 RadA(Seitz et al., 1998), 빵효모(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 ScRad51, 포유동물로부터의 RAD51, 특히, 인간으로부터의 hRad51 과 같은, 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물로부터의 그것의 기능적 동족체들을 포함한다. RecA 에 대한 동족 단백질들이 적어도 60개의 상이한 종류의 박테리아(Roca and Cox, 1990, Karlin 및 Brocchieri, 1996, Karlin et al., 1995), 아르케아(archaea)(Sandler et al. 1996), 조사된 모든 진핵생물들(Ogawa et al. 1993), 미토콘드리아(Thyagarajan et al., 1996) 및 플라스티드(Cerutti et al., 1992) 내에서 검출되었다. 단일- 또는 이중-가닥 DNA 에 있어서, RecA 및 이것의 동족체는 약 11nm 의 직경을 갖는 나선형 NPF 를 형성한다. 상기 RecA 의 결합은 협동적이며 DNA 나선의 부분적인 풀림을 가져온다. RecA,UvsX, ScRad51 및 hRad51 은 모노머당 3 개의 염기쌍(이중-가닥 DNA) 또는 모노머 당 3 내지 6 개의 뉴클레오티드(단일-가닥 DNA)의 결합 화학양론으로 NPF 를 형성한다(Bianco et al. 1998, Baumann and West 1998). 감수분열-특이성 재조합효소 hDMC1 이 바람직하다; 이것은 적층된 단백질 링의 선형 열로 구성되는 이중-가닥 DNA 를 갖는 필라멘트를 형성한다(Masson et al., 1999). 또한, 바실러스(Bacillus) 및 클로스트리듐(Clostridium) 종의 포자들로부터의 SASP 단백질(small acid-soluble spore proteins) 그룹이 또한 바람직하다. 상기 SASP 들은 약 6.6 nm 의 직경을 갖는 나선형 NPF 를 형성하는 이중-가닥 DNA 에 또한 결합한다(Griffith et al. 1994). 단순 포진으로부터의 단백질 ICP8 과 같은, 단일- 및/또는 이중-가닥 DNA 를 갖는 필라멘트를 형성할 수 있는 바이러스성 단백질들이 NPF-형성 단백질(Lee & Knipe, 1985)로서 또한 바람직하다.

3 개의 염기쌍 당 1 개의 모노머 단백질의 결합 화학양론이, 상기 NPF-형성 단백질 UvsX, Rad51 및 RecA 의 이중-가닥 DNA 로의 완전한 결합에 대한 것으로 증명되었다(Bianco et al 1998). 이러한 종류의 완전한 결합은, 예를 들면, 사용된 결합 완충제, 핵산의 입체구조 및 온도에 따라, 3 내지 5 배의 과량의 단백질을 이용하여 UvsX 를 가지고 달성될 수 있다(Yu and Egelman 1993); 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)로 부터의 α/β타입의 SASP 에 있어서 대응하는 단백질:DNA 의 비율은 약 5:1 이다(Griffith et al 1994). 본 발명과 관련하여 상기 핵산의 단백질로의 부하는 가능한한 완전하게 수행되는 것이 특히 바람직한데, 이것은 상기 바람직한 NPF-형성 단백질들의 각각에 대해 독립적으로 결정된다. 그러나,특정한 NPF-형성 단백질에 대한 절대적으로 높은 부하 정도 이하의 상기 핵산의 불완전한 부하가 본 발명과 관련하여 가능하다. NPF-형성 단백질로의 상기 핵산의 더욱 낮아진 부하는, 예를 들면, 추가적인 DNA-결합 단백질이 상기 트랜스펙션에서 결정된 단계들에 대해 이용되는 경우 또는 완충 조건이 NPF-형성 단백질로의 핵산의 완전한 부하를 위한 최적이 아닌 특정한 적용을 위해 선택되어야 하는 경우에 바람직하다.

본 발명에 따르면, NPF-형성 단백질들은 자연적인 NPF-형성 단백질들 및 그것들의 유도체들 모두를 포함하는 것으로 이해된다. NPF-형성 단백질들의 유도체들에 관하여, 당업자는 우선적으로 결실에 의한 수식 또는 추가적인 아미노산 시퀀스의 삽입 또는 재조합 단백질내 단백질 영역의 삽입에 의한 수식 및/또는 이미 존재하는 분자 그룹의 화학적인 변형 및/또는 단백질, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자들의 화학적인 커플링에 의한 작용기들의 도입으로 이해한다.

본 발명에 따른 트랜스펙션 제재는 또한 인간 및 동물의 유전자 요법 치료를 위한 약물의 제조에 유리하게 사용될 수 있다. 상기 치료요법적으로 유용한 핵산은 일차세포 및 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재의 형태로 복합 트랜스펙션 방법에 이용될 수 있도록 만들어질 수 있다.

본 발명의 또다른 관점은, 가능하게는 종래의 보조약 및 케리어와 함께, 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재를 포함하는 약제학적 조제에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 관점은, 핵산을 갖는 세포의 트랜스펙션에 적합하며 본 발명에 따른 NPF 들을 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질을 포함하며, 본 발명에따른 적어도 하나의 기능적인 성분을 포함할 뿐만 아니라 다음 성분들 중 적어도 하나를 포함하는 키트에 관한 것이다:

(a) 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 뉴클레오시드 트리포스페이트 유사체

(b) 트랜스펙션 되는 적어도 하나의 핵산

(c) 보조약 및 첨가제

이러한 킷트는 전문가들의 상이한 요구조건에 맞도록 특이적으로 구성될 수 있는데, 예를 들면, 이것들은 특정한 NPFs, 특정한 NPF 수식체들 또는 개별적인 보조약들 또는 첨가제들의 선택에 의해, 특정한 핵산, 표적세포 또는 안정성 조건에 대해 최적화될 수 있다. 상기 단백질은 여기서 기능적 성분(들)로 이미 부하될 수 있으며, 상기 단백질들 또는 기능적 성분들은 상기 킷트 내에 독립적으로 포함될 수 있다.

본 발명의 또다른 관점은, 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재를 세포 선별시험, 특히 유사분열 비활성이거나 또는 약하게 활성인 세포들, 일차 세포들 그리고 제한된 수명의 다른 세포들에서의 상기 트랜스펙션 제재의 발현 산물(들)의 활성자들 또는 저해제의 동정(identification)을 위해 사용하는 것에 관한 것이다. 이러한 유형의 선별시험은 약제학 산업에서 활성 물질의 동정에서 인가되거나 또는 인가되지 않은 표적 단백질의 활성자 또는 저해제들의 동정을 위한 기본적인 방법이다. 이러한 선별시험 방법들은 일반적으로 외래 핵산들로 안정하게 트랜스펙션된 세포들이 잠재적인 저해제 및/또는 활성자에 노출되고 상기 세포들의 생리기능에관한 이것들의 영향이 가능하게는 비교 세포와 비교하여 결정되도록 계획된다. 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재는, 심지어 유사분열 비활성이거나 또는 약하게 활성인 세포들, 일차 세포들 그리고 제한된 수명의 다른 세포들에서도, 활성자 또는 저해제들의 첨가 직전에 외래 핵산의 삽입에 적합하고, 이에 따라 이러한 세포들을 시험 세포로서 이용가능하게 만드는데 적합하다.

본 발명의 또다른 관점은, 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재들을 생리학적으로 활성인 핵산들의 동정에 이용하는 것에 관한 것이다. 이것은 과학계 및 약제학계에 이용가능한 게놈 데이타의 신속하며 생리학적으로 적합한 평가를 위해 특히 중요한 것이다. 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재로의 트랜스펙션은 세포분열 및/또는 세포내유입에 의존하지 않기 때문에, 트랜스펙션과 분석 사이의 시간은 매우 단축된다. 이것은 매우 높은 샘플 산출량을 가능케한다. 심지어 트랜스펙션시키기 어려운 세포들 및 비분열 세포들도 본 발명에 따른 트랜스펙션 제재를 가지고 이용가능하다. 결과하는 트랜스펙션 및 조절 세포들과 비교한 변화의 생리학적 평가는 생리학적으로 활성인 핵산들의 동정을 가능하게 만든다.

이하 실시예들은 본 발명을 자세히 기술하기 위한 것이며, 예로서 개시된 물질 및 방법에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : NPF 형성 단백질로서 재조합 UvsX의 형성

상기 단백질 UvsXH6, UvsXH6-2, H6UvsX 및 H6UvsX-2 는 NPF 형성 단백질로서 이용된다(도 1 참조).

단백질 구조:

UvsXH6(400 아미노산):

아미노산 1-391: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 392-394: 아미노산 G³⁹²GS³⁹⁴로 구성되는 링커(linker), 아미노산 395-400: 니켈 킬레이트 친화 크로마토그래피에 의한 정제를 위한 H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰, 아미노산 교환: L⁴³→P.

UvsXH6-2(403 아미노산):

아미노산 1-391: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 392-394: S³⁹²YG³⁹⁴로 구성되는 링커, 아미노산 395-400: H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰, 아미노산 401-403: 아미노산 M⁴⁰¹YS⁴⁰³으로 구성되는 C-터미너스.

H6UvsX(404 아미노산):

아미노산 1-4: 아미노산 M¹SYS⁴로 구성되는 N-터미너스, 아미노산 5-10: H⁵HHHHH¹⁰, 아미노산 11-13: 아미노산 S¹¹YG¹³으로 구성되는 링커, 아미노산 14-404:파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 교환: Q³⁴⁰→L.

H6UvsX-2(404 아미노산):

아미노산 1-4: 아미노산 M¹GYS⁴로 구성되는 N-터미너스, 아미노산 5-10: H⁵HHHHH¹⁰, 아미노산 11-13: 아미노산 S¹¹YG¹³으로 구성되는 링커, 아미노산 14-404:파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391).

발현 플라스미드의 클로닝

적합한 대장균 세포내에서 상술한 단백질들의 발현을 위해, lac 프로모터의 통제하에서 UvsXH6, UvsXH6-2, H6UvsX 또는 H6UvsX-2 에 대한 암호 서열을 포함하는 플라스미드들이 구성되었다 (pExH-UvsXH6, pExH-UvsXH6-2, pExH-H6UvsX 또는 pExH-H6UvsX-2, 도 1 참조). 상기 플라스미드들은 2개의 PCR 산물의 연결(ligation)에 의해 형성되었다. 첫번째 PCR 산물은 pMCS5(MoBiTec,Goettingen, Germany)으로부터 증폭되었다. pMCS5 는 pBluescript SK(-)(Stratagene)와 유사한 방법으로 구성되고 단지 lacZα조각의 암호 서열의 5' 영역에서만 다르다. 따라서 pMCS5 는 lac 오퍼레이터가 뒤따르는 lac 프로모터를 포함하며, 이것에 의해 삽입된 암호 서열의 발현은 활성 lac 리프레서의 부재를 기초로 한다. 어떠한 경우에도구성발현을 달성하기 위해, 상기 PCR 산물에 상기 lac 오퍼레이터가 더이상 존재하지 않는 방법으로 증폭 프라이머들이 선택되었다. 결과적인 PCR 산물은 위치 992 부터 664 까지 pMCS5 에 제한 오버행(restriction overhangs)을 더한것에 해당한다. 뉴클레오티드 GAATTC(EcoRI 제한 부위) 뿐만 아니라 TGTGTG 가 위치 992(lac에 대해 3') 전에 첨가되고, 그리고 뉴클레오티드 ACTAGT(Spe I 제한 부위) 및 CACACA 가 제한효소 EcoRI 및 Spel로 소화후에 연결을 가능케 하기 위하여 위치 664 뒤에 첨가되었다. UvsXH6, UvsXH6-2, H6UvsX 및 H6UvsX-2 에 대한 암호 서열은, 요구되는 제한 부위, 리보솜 결합 부위 및 추가적인 코돈들을 포함하는 프라이머를 이용하여 T4 DNA 의 PCR 증폭에 의해 얻어졌다. 개시 코돈 전의 그들의 5' 말단에는, 상기 PCR 산물들은 추가적인 뉴클레오티드 5'-CACACAGAATTCATAAAGGAAGATATCAT-3'를 포함하고, 뿐만 아니라 종결 코돈 뒤 그들의 3' 말단에는 추가적인 뉴클레오티드 5'-ACTAGTTGTGTG-3' 를 포함한다.

정제:

DH5 에서 pExH-H6UvsX 의 하룻밤 배양은 1.5 내지 3 IdYT/암피실린(200㎍/㎖) 1:1000 으로 접종되었고, 그리고 250 UPM 으로 37℃ 에서 밤동안 성장되었다. 상기 배양은 7000 ×g 에서 채취되었고, 약 5 내지 15 g 박테리아 침전이 수득되었다. 이것은 -20℃ 에서 1 내지 3 일 동안 동결되었다. 상기 침전은 얼음상에서 해동되고 10 내지 20㎖ 의 차가운 개시 완충액에서 재현탁되었다. 용해(lysis)는 10㎖ 리소짐(Serva, 190.000 u/㎎) 및 약 4g 유리 방울(beads)(Sigma, G-8893)을 이용하여 4℃ 에서 1시간 동안 느린 교반하에서 수행되었다. 그 다음, 50㎕ DNAse I(Serva, 2 ㎎/㎖)가 첨가되고 추가적으로 30분 동안 더 항온처리되었다. 상기 용해물의 원심분리 후(45분, 11.000 ×g, 4℃), 상기 상충액은 살균 필터(기공 크기 0.45㎛)를 통하여 여과되고 Ni⁺⁺이온으로 예비부하된 평형된 1㎖ HiTrap TM 킬레이팅 컬럼(Pharmacia)에 부하되었다. 추가적인 정체 단계가 히스티딘 헥사머를 포함하는 단백질을 위한 각각의 Pharmacia protocol 에 따라 수행되었다. 다양한 용출 분획의 분별체(aliquots)가 SDS/Coomassie 겔에 첨가된다. 가장 순수한 분획들은 조합되었고 각각의 프로토콜에 따라 센트리플러스 YM30 컬럼(Millipore)에서 더욱 농축된다. 그 다음, 4℃ 에서 적어도 1시간 동안 ZI 완충액의 적어도 천배 부피에 대해서 2회 투석되고(투석 튜브: Spectra/Por, MWCO: 25.000), 그 다음 ZI 완충액/50% 글리세린에 대해서 4℃에서 밤동안 투석된다. 상기 투석물은 30 내지 50㎕ 분획에서 분별되고 -80℃에서 저장된다.

사용된 완충액들:

ZI 완충액: 76 mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, pH=7.2

개시 완충액: 20 mM Pi, 0.5 M NaCl, 10 mM 이미다졸, pH=7.4

세척 완충액: 20 mM Pi, 0.5 M NaCl, 20 내지 50 mM 이미다졸, pH=7.4

용출 완충액: 20 mM Pi, 0.5 M NaCl, 100 내지 500 mM 이미다졸, pH=7.4

농도의 결정:

상기 UvsX 단백질의 농도는 Gene Inspector™(Textco, Inc.)로 계산된 흡수계수를 이용하여 OD₂₈₀을 측정함에 의해 결정되었다. H6UvsX 에 대해서, 이것은2.5 내지 3.5 ㎍/㎕ 였다.

실험의 설명:

Ni⁺⁺세파로스를 통하여 정제된 H6UvsX 는 200 ng 의 1 kb PCR 조각(1mM ATP- γ-S 를 가지고 그리고 가지지 않고)으로 항온처리되었다.

단백질 결합에 의해 야기된 아가로스 겔에서의 DNA의 이동은, H6UvsX 가 상기 농도를 기초로 이중-가닥 DNA 와 결합하고, 그리고 이러한 결합은 ATP- γ-S 에 의해 강화된다.

ATP- γ-S 를 가지고, 단백질-DNA 복합체가 형성되는데, 이것은 ATP- γ-S 가 없을 때 보다 에티듐 브로마이드로 더욱 강하게 착색될 수 있고, 이는 뉴크레오티드 유사체에 의한 핵단백질의 위상적인 변화를 지시한다.

실시예 2: 기능적인 성분으로서 핵 국부 신호를 가지고 단백질을 형성하는 NPF 로서 UvsX 를 기초로한 트랜스펙션 제재의 형성.

실시예 1 에서와 같이, 플라스미드가 형성되었고 이것은 상기 융합 단백질 UvsXH6N2, UvsXH6N2-2, N2H6UvsX 및 N2H6UvsX-2 의 발현을 허용하며, 이것은 실시예 1 에 기술된 단백질들을 기초로 하며, 그리고 추가적으로 핵 국부 신호를 포함한다(도 1 참조).

단백질 구조:

UvsXH6N2(426 아미노산):

아미노산 1-391: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 392-394: 아미노산 G³⁹²GS³⁹⁴로 구성되는 링커, 아미노산 395-400: H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰, 아미노산 401-403: 아미노산 G⁴⁰¹GS⁴⁰³으로 구성되는 링커, 아미노산 404-417: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 418-421: 파아지 T4로부터의 UvsX 의 C-터미너스(NCBI 단백질 어세션 번호: AAD42669, 아미노산 388-391), 아미노산 422-426: 아미노산 K⁴²²LVTG⁴²⁶으로 구성되는 C-터미너스, 아미노산 교환: Y²³⁸→V.

UvsXH6N2-2(420 아미노산):

아미노산 1-391: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 392-394: 아미노산 S³⁹²YG³⁹⁴로 구성되는 링커, 아미노산 395-400: H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰, 아미노산 401-403: 아미노산 M⁴⁰¹YS⁴⁰³으로 구성되는 링커, 아미노산 404-417: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 418-420: 아미노산 G⁴¹⁸YP⁴²⁰으로 구성되는 C-터미너스.

N2H6UvsX(420 아미노산):

아미노산 1-3: 아미노산 M¹SY³으로 구성되는 N-터미너스, 아미노산 4-17: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 18-20: 아미노산 L¹⁸YS²⁰으로 구성되는 링커, 아미노산 21-26: H²¹HHHHH²⁶, 아미노산 27-29: 아미노산 S²⁷YG²⁹로 구성되는 링커, 아미노산 30-420: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 교환: Q356 →L.

N2H6UvsX-2(421 아미노산):

아미노산 1-4: 아미노산 M¹GYP⁴로 구성되는 N-터미너스, 아미노산 5-18: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 19-21: 아미노산 S¹⁹YS²¹으로 구성되는 링커, 아미노산 22-27: H²²HHHHH²⁷, 아미노산 28-30: 아미노산 S²⁸YG³⁰로 구성되는 링커, 아미노산 31-421: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391).

발현 플라스미드의 클로닝:

적합한 대장균 세포내에서의 발현을 위해, lac 프로모터의 통제하에서 UvsXH6N2, UvsXH6N2-2, N2H6UvsX 또는 N2H6UvsX-2 에 대한 암호 서열을 포함하는 플라스미드들이 구성되었다 (pExH-UvsXH6N2, pExH-UvsXH6N2-2, pExH-N2H6UvsX 또는 pExH-N2H6UvsX-2, 도 1 참조). 상기 플라스미드들은 실시예 1 에 기술된 바와 같이 2개의 PCR 산물의 연결에 의해 형성되었다(도 1 참조).

정제:

UvsXH6N2의 정제는 H6UvsX에 대해 실시예 1 에 기술된 바와 같이 수행된다.

농도: 10 내지 20 ㎍/㎕.

실험의 설명:

UvsXH6N2 는 이중-가닥 DNA 에 결합된다. 상기 결합은 ATP- γ-S 에 의해 안정화된다:

다양한 ATP 유사체가 UvsXH6N2의 DNA에 결합하는 작용에 끼치는 영향을 조사하기 위해, 상기 단백질은 1 kb DNA 조각 및 다양한 ATP 유사체들을 가지고 먼저 항온처리되었다. 그 다음, 1.7 kb DNA 조각이 경쟁을 위해 첨가되었다. 상기 단백질의 DNA 로의 결합이 ATP 유사체의 첨가에 의해 안정화되는 경우, 어떠한 평형도 존재하지 않는 한 UvsXH6N2 는 경쟁 DNA 조각에 덜 반응할 것으로 기대될 수 있다. 도 3 에 도시된 바와 같이, 1 kb 조각 및 UvsXH6N2 로 형성된 단백질-DNA 복합체는 ATP- γ-S 및 1.7 kb 조각의 부재하에서 안정하게 유지되고, 모든 다른 사용된 ATP 유사체들과 비교해서, 즉, 상기 1.7 kb 조각은 명백하게 관찰 시간내에 유리된 UvsXH6N2 분자들에 의해 점유되지 않거나 단지 불충분하게 점유된다.

실시예 3: 수식된 그리고 수식되지 않은 NPF-형성 단백질의 혼합물로 트랜스펙션 제재의 형성

실험의 설명:

다양한 비율의 H6UvsX 및 UvsXH6N2 가 1 kb DNA 조각으로 항온처리되었다. 상기 2개의 단백질은 상이한 정도로 DNA 를 지연시켰는데, 이는 그들의 상이한 분자량 때문이다(도 4 의 컬럼 2 및 3 참조). 상기 단백질들이 DNA 첨가 전에 혼합되는 경우, 중간 복합체들이 H6UvsX 대 UvsXH6N2 의 비율을 기초로 형성되는데, 이것은 선명한 띠를 형성하고 따라서 같은 평균 분자량을 같는다. 이것은 DNA 가 양 단백질에 의해 통계적으로 동일하게 점유된다는 것을 보여준다.

실시예 4: 전기영동과의 조합으로 UvsX-NLS로 세포주(NIH3T3)의 트랜스펙션

NIH3T3-Zellen(점착성, 70 내지 80% 융합 까지 배양)은 뮤린 MHC 클래스 I 단백질 H-2K^K의 중사슬을 위한 벡터 코딩으로 트랜스펙션된다. 1 ×10⁶세포들은, 실온에서 30분 동안 14㎍ UvsX 또는 UvsX-NLS 를 가지고 뿐만 아니라 1mM ATP- γ-S 를 갖거나 갖지 않고 결합 완충액(76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, 5mM MgCl₂pH 7.21) 내에서 미리 항온처리된 25ng 벡터 DNA 로 전기영동되었다. 이를 위해, 상기 세포들이 총 부피 100㎕의 전기영동 완충액(103mM NaCl, 5.36mM KCl, 0.41mM MgCl₂, 23.8 mM NaHCO₃, 5.64mM Na₂HPO₄, 11.2mM 글루코오스, 0.42 mM Ca(NO₃)₂, 20mM HEPES, 3.25 μM 글루타치온)에 첨가되었고, 2mm 전극 간격을 갖는 큐벳에서 전기영동되었다. 상기 전기영동은 240V 전압 및 450㎌ 전기용량에서 급격한 방전에 의해 수행되었다. 상기 전압 강하의 반감기는 전형적으로 12 msec 였다. 상기 전기영동 직후, 상기 세포들은 배양 배지(10% FCS 를 갖는 RPMI)로 큐벳으로부터 흘러나오고, 37℃ 에서 10분 동안 항온처리되며, 그 다음 예열된 배양 배지와 함께 배양 접시에 전송된다. 6시간의 항온처리 후에, 상기 세포들은 채취되고 PBS 로 2회 세척되었고, Cy5-커플링된 anti-H-2K^K항체로 항온처리되고 유동세포계측법적으로 분석된다(FACScan). 죽은 세포들의 수는 프로피듐 아이오다인으로의 착색에의해 결정되었다. 상기 전기영동 6시간 후, 자유 벡터 DNA 로 트랜스펙션된 세포들의 7.4% 또는 8.7%가 상기 H-2K^K단백질을 발현시킨다(평균적으로 0.25%의 바탕 제외). 비교상으로, 벡터 UvsX로 트랜스펙션된 세포들의 발현 비율은 2.9% 또는 3.8% 였다. 벡터 UvsX-NLS 로 트랜스펙션된 후의 발현 비율은 19.2% 또는 18.9% 였다(도 5a 내지 도 5d 참조).

핵 수송의 조사를 위해, 전기영동의 물리적 절차가 선택되었고 이에 따라 UvsX 이외의 다른 어떤 생화학적 성분들도 상기 트랜스펙션에 영향을 주지않았다. 그러나, ATP- γ-S를 가지고 UvsX의 DNA 로의 단단한 결합은 전기장에서 상기 복합체의 이동도(mobility)를 감소시키고 따라서 상기 전기영동의 효율을 약 60% 만큼 감소시킨다. 핵 수송 신호를 단독으로 부여하는 것은 상기 트랜스펙션 직후 상기 시스템에서 평균적으로 5.7 정도의 인자만큼 발현의 증가를 가져온다. UvsX와 비교되는 UvsX-NLS에 의한 발현 비율의 증가는 따라서 기능적 성분으로서 핵 수송 신호를 이용하는 경우, DNA가 UvsX에 의해 핵내로 수송된다는 것을 증명한다. 상기 트랜스펙션 직후 수행된 분석은 상당히 개선되고 이것은 심지어 세포들이 트랜스펙션 과 분석 사이에서 나누어지지 않게 접근가능해지기 때문이다.

실시예 5: 전기영동과의 조합으로 UvsX-scrambled-NLS 또는 UvsX-NLS 로의 세포주(NIH3T3)의 트랜스펙션

UvsX-scrambled-NLS 의 형성

상기 핵 국부 신호가 트랜스펙션에 미치는 영향을 시험하기 위해, UvsX 유도체가 비교목적으로 형성되었는데 이것은 이것의 알짜 전하에 있어서 NLS 를 갖는 UvsX 단백질에 상응하며, 그러나 그자체는 기능적인 NLS 를 포함하지 않는다.

부분적으로 상동인 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 이용하여, 상기 UvsX 유전자가 플라스미드 pExH-UvsXH6N2-2(도 1 과 비교)로부터 증폭되어서, 상기 아미노산 서열 SEQ ID NO:1("scrambled", 즉, 혼합된 NLS 서열)이 아미노산 서열 EEDTPPKKKRKVED("nls-2", SEQ ID NO: WO 00/40742 로부터의 9 로부터의 아미노산 2-15에 대응) 대신에 결과하는 단백질 UvsXH6N2sc의 C-터미너스에서 발현된다. 상기 스크램블된 아미노산은 그들의 조성에 관하여 상기 기술된 nls-2 에 상응하지만 그들의 순서에 대해서는 그러하지 아니하다. UvsXH6N2-2 및 UvsXH6N2sc 의 알짜 전하는 따라서 동일하고, 그러나 단지 UvsXH6N2-2 만이 완전한 핵 국부 신호를 포함한다.

상기 단백질 UvsXH6N2sc 는 실시예 1 의 단백질들에 대해 기술된 바와 같이 정제된다.

NIH3T3 세포들(점착성, 70 내지 80% 융합까지 배양)은 형광 표지 단백질을 위한 이러한 벡터 코딩으로 트랜스펙션되었다. 이러한 목적으로, 결합 완충액(실시예 1 참조)에서 25ng 벡터 DNA 는 1.5mM ATP- γ-S 및 16 내지 18㎍ 의 상술한 단백질들로 30분 동안 실온에서 우선적으로 항온처리되었다. 상기 단백질-DNA 복합체들은 각각 3 ×10⁵NIH3T3-Zellen 에 첨가되었고, 80㎕ 전기영동 완충액(140mM Na₂HP₄/NaH₂PO₄, 10mM MgCl₂, 5mM KCl, pH 7.2)에서 재현탁되었다. 상기 전기 영동은240 V 의 전압 및 450 ㎌ 의 전기용량에서 급격한 방전에 의해 2mm 전극 간격을 갖는 큐벳에서 수행되었고, 상기 전압 강하의 반감기는 전형적으로 12 msec 였다. RPMI 1640, Gibco company, 5% FCS, 2mM 글루타맥스(L-알라닐-L-글루타민, 인비트로겐), 100 U/㎖ 페니실린/스트랩토마이신, 0.5mM β- 메르캡토에타놀(β- mercaptoethanol)로 구성된 400㎕ 배지의 첨가후, 상기 세포들은 1㎖의 예열된 배지와 함께 배양접시(6-웰(well) 플레이트)에 첨가되고 37℃ 및 5% CO2 에서 항온처리되었다. 6 시간 후, 상기 유동-사이토메트리(flow/cytometry) 분석이 수행되었다(FACScan).

상기 결과는 도 6 에 그래프로 나타난다: 자유 벡터 DNA 로 트랜스펙션된 세포들 중 9% 가 상기 표지된 단백질을 발현시킨다. 벡터-UvsX-NLS(DNA+UvsXH6N2-2)로 트랜스펙션된 상기 세포들의 발현율은, 그러나, 21% 였다. 비교상으로, 벡터-UvsX-scrambled-NLS(DNA+UvsXH6N2sc)로 트랜스펙션된 후 상기 세포들의 발현율은 단지 4% 였다.

핵 국부 신호에 의해 수식된 UvsX 는 따라서 자유 DNA 와 비교하여 그리고 또한 비-기능성 핵 국부 신호에 의한 수식과 비교하여 현저하게 증가된 효율을 가져온다. 후자의 트랜스펙션이 조절을 나타내기 때문에, 이것은 트랜스펙션 효율이 상기 UvsX 의 수식에 의해 5배로 증가될 수 있다. 따라서, 상기 트랜스펙션 효율은 본 발명에 따른 방법 또는 트랜스펙션 제재에 의해 증가될 수 있다. 또한, 여기서, 예를 들면, 핵 내로의 지시와 같은 트랜스펙션 방법의 목표된 조절이 상기 NPF-형성 단백질이 수식되는 경우에 유리한 방법으로 가능하다(역시 실시예 6 참조).

실시예 6: 미세주입과의 조합으로 세포주(NIH3T3)의 트랜스펙션

140 ng 의 1.7 kb 발현 벡터 DNA 조각이 9㎍의 수식된 UvsX 단백질로 상술한 바와 같이 결합 완충액 그리고 1mM ATP- γ-S 에서 최종 부피 20㎕로 실온에서 30분 동안 항온처리되었다. BSA-Cy5 가 약 1㎍/㎕ 의 농도로 주입되기 직전 주입 표지로서 사용되었다.

CELLocate coverslips(Eppendorf) 전날에 부융합(subconfluency)에 도입된 NIH3T3 세포들은 역 형광 현미경(Leica DMIL) 하에서 미세조작기 및 트랜스젝터(Eppendorf)를 이용하여 펨토팁스(Eppendorf) 상에 부하된 샘플들을 통하여 미세주입되었다.

상기 분석은 형광 현미경(올림퍼스 BX 60 형광 현미경, Diagnostic Instruments Inc. 로부터의 디지털 b/w 카메라 SPOT-RT, 분석 소프트웨어: Universal Imaging Corporation 으로부터의 메타뷰 이메징 시스템)에서 37℃ 및 5% CO2 에서 상기 세포들의 5시간의 추가적인 항온처리 후에 수행되었다.

도 7 은 미세주입된 NIH3T3 세포들을 도시한다. 이미지 1 및 2 는 DNA 및 UvsXH6N2sc 로 세포질 내에 주입된 세포들을 나타내고, 이미지 3 및 4 는 DNA 및 UvsXH6N2-2 로 주입된 세포들을 나타내며, 그리고 이미지 5 및 6 은 단지 DNA 로만 주입된 세포들을 나타낸다. 발현은 단지 상기 단백질-DNA 복합체가 UvsXH6N2-2, 즉, 핵 국부 신호로 수식된 UvsX 단백질(도 7, 이미지 3)을 포함한 경우에만 관찰되었다. 미세주입 동안에 핵내가 아닌 단지 세포질 내에 완전하게 주입되는 조절 의 세포들(도 7, 이미지 5: 단지 DNA 만 포함, 또는 도 7, 이미지 1: DNA 와 UvsX-scrambled-NLS)에 있어서는, 심지어 매우 긴 노출을 이용하였음에도, 어떠한 발현도 관찰되지 않았다.

실시예 7: NPF-형성 단백질로서 재조합 SASP 의 형성

B. subtilis 로부터의 SASP의 클로닝, 발현 및 정제

SASP("smallacid-solublesporeprotein")에 대해 암호화하는 Bacillus subtilis 로부터의 SspC 유전자가 코라나법(Khorana method)(Bertram and Gassen에 기재됨: Gentechnische Methoden, Gustav Fisher Verlag, 1991, p.212-213)에 따라 8 올리고뉴클레오티드로부터 합성되었다고 플라스미드 pARA13의 Ncol 과 Bglll 제한 부위 사이에 연결된다(Cagnon et al., 1991; Protein Engng. 4:843-847). 이것은 NCBI 단백질 어세션 번호: NP 389876 을 갖는 단백질 서열을 기초로 하였다. DNA에 대한 역 전사가, E. coli 내에 강하게 발현되고 (Andersson and Kurland 1990; Microbiol. Rev. 54: 98-210)에 기술된 유전자의 코돈 선호도를 이용하여 수행된다. 결과하는 플라스미드 pARA13-SASP는 2개의 다른 플라스미드의 클로닝을 위한 매트릭스로서 이용되고, 이것은 SASP 단백질에 대해 암호화하고, N-터미너스(H6-SASP) 또는 C-터미너스(SASP-H6)에서 6 히스티딘의 폴리히스티딘 서열을 운반한다(도 8). 상기 플라스미드들은 E.coli 스트레인 BL21(DE3) pLysS(Novagen, Madison) 내부로 전환되고 LB/암피실린/글루코오스(0.2%) 상에 평판 배양된다.

20㎖ M9 최소배지(0.2% 글루코오스) 각각은 단일 콜로니로 접종되었고 37℃및 220 rpm 으로 밤동안 배양되었다. 그 다음날, 상기 배양물들은 약 1.0의 OD₆₀₀에서 0.2% 아라비노스로 유도되었고 추가로 6 시간동안 배양되었다. 원추출물(PBS/부하 완충액에서 펠렛트된(pelleted)0.5㎖ 배양물들이 높은 해상(resolution) SDS 겔에 적용되고(Schaegger and von Jagow 1987 에 따라; Anal. Biochem. 166:368-79) Coomassie Blue 로 착색되었다(도 9A).

조제용 정제를 위해, 2 L M9/글루코오스가 1:200 으로 밤새 배양에 의해 접종되었다. 또 다시, 상기 배양물은 약 1,0, 의 OD₆₀₀에서 0.2% 아라비노스로 유도되었고 추가적으로 6시간동안 배양되었다. 박테리아가 그 다음 펠렛트되고 약 -20℃ 에서 동결되었다. 이하, SASP-HP의 정제가 예로서 기술된다. 약 7g 의 상기 펠렛트가 해동되고 14㎖ 개시 완충액(실시예 1 참조)에서 재현탁되고, 완전히 EDTA를 포함하지 않는 프로테아제 억제제 칵테일, Roche, Mannheim 의 타블렛(tablet)으로 보충되며, 얼음에서 3분동안 280 와트로 음파처리된다(Labsonic U, Braun Biotech, Melsungen repeating duty puls; 0.5 sec). 상기 추출물은 4℃ 에서 원심분리되었다. 이러한 것은 별도로 하고, 상기 정제는 HiTrap 킬레이팅 컬럼(Amersham Pharmacia, Uppsala)을 통한 UvsX 단백질에 대해 기술된 바와 같이 수행되었다. 높은 농도로 단백질을 함유하는 200mM 과 500mM 이미다졸사이의 분획들이 조합되고 centriplus 컬럼(YM-3, Millipore, Eschborn)을 이용하여 약 3㎖로 농축되었다. 상기 SASP 단백질들은 그 다음 1 ×ZI 완충액에 의해 3회 투석되고(실시예 1 참조), 분별체들은 약 5 ㎍/㎕의 농도로 -80℃ 에서 동결되었다.

SASP 단백질의 DNA-결합 능력의 시험

125 ng(각각의 경우)의 1.7 kb DNA 조각이 1 ×ZI 완충액 또는 1/10 ×ZI 완충액에서 상이한 양의 SASP-H6 단백질로 실온에서 30분간 미리 항온처리되었고, 그 다음 0.8% TAE-아가로스 겔에 가해졌다. 도 9B 는 상기 DNA가 단백질에 의해 완전히 결합된 것을 보여준다. DNA-단백질 띠의 왁산된 모습은 상기 겔이 작용되는 동안 DNA 로부터의 상기 단백질들의 해리때문일 수 있다.

실시예 8: 수식으로서 핵 국부 신호를 갖는 NPF-형성 단백질로서의 SASP를 기초로 하는 트랜스펙션 제재의 형성

기능적인 성분으로서 핵 국부 신호(NLS)를 갖는 SASP의 제조를 위해, 핵 국부 신호("nls-2", 아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742 로부터의 9)를 위한 DNA 서열 코딩이 PCR 증폭에 의해 이미 이용가능한 클론 pARA13-SASP-H6(도 8 참조)의 C-터미너스에 첨가되었다. 상술된 플라스미드가 PCR 틀(template)로서 이용된다. 결과하는 플라스미드 pARA13-SASP-H6N2(도 8 참조)가 실시예 7 에 기술된 바와 같이 변환되고, 그리고 그다음 상기 단백질 SASP-H6N2 가 그에 따라 정제되었다.

SASP-NLS 단백질의 결합 능력의 시험

각각 125 ng의 1.7 kb DNA 조각이 1 ×ZI 완충액에서 상이한 양의 SASP-H6N2 단백질로 실온에서 30분간 미리 항온처리되었고, 그 다음 0.8% TAE-아가로스 겔에 가해졌다.

도 10B 는 상기 DNA 가 마찬가지로 NLS-수식된 SASP에 의해 거두어지는 것을 보여준다. DNA 단백질 밴드는 확산되게 나타난다.

실시예 9: 상기 복합체를 기능적 성분으로서 셀표면에 회합시키기 위한 인테그린 결합 모티프를 갖는 트랜스펙션 제제의 형성

인테그린은 세포 표면상의 막-고정 부착 단백질로서 이것 중 몇몇은 결합 파트너로서 세개의 아미노산(아르기닌-글리신-아스파르트산 또는 "RGD" 모티프) 중 펩티드 모티프를 인식한다. 상기 결합은 세포 표면 및 세포내유입에서 수개의 인테그린 분자들의 밀집(clustering)을 가져온다(Plow et al., 2001). NPF-형성 단백질로서 RGD 모티프로의 UvsX 의 수식에 의해, 상기 트랜스펙션 제재가 인테그린을 통하여 세포들의 엔도좀 구획 내부로 특이적으로 도입될 수 있다는 것이 달성될 수 있다.

단백질의 구조

이용된 단백질 H6UvsX 및 UvsXH6N2-2 는 도 1 에 도시되고 실시예 1 및 2 에 기술된 것들과 동일하다.

단백질 H6UvsX^*(RGD2)는 화학적 커플링에 의해 형성되었다. RGD2 라는 이름의 단백질은 아데노바이러스 타입 7(Bal et al., 2000)의 팬톤 베이스 단백질로 구성된 노나펩티드(NITRGDTYI)인데, 이것은 화학적으로 활성인 그룹이 N-터미널 아미노 그룹(SMCC, 숙신이미딜 4[N-마레이미도메틸]-사이클로헥산-1-카복실레이트)는데 이것은 상기 커플링이 UvsX 단백질에서 시스테인 SH 그룹을 유리시키도록 하는 방법으로 합성되었다.

상기 커플링을 위해, 6 nmol H6UvsX 가 76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mMNaH₂PO₄, pH=7.2 에서 37℃ 에서 1시간 동안 60nmol 펩티드로 항온처리되었고, 그리고 그 다음 과잉 펩티드를 제거하기 위해 마이크로콘 필터(10kDa 컷오프)를 통하여 항온처리 완충액으로 수회의 세척 단계에 의해 정제되었다. 성공적인 커플링이 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에서 변화된 영동 수행에 의해 감지되었다. 도 11 은 SDS 폴리아크릴아미드 겔에서 2개의 독립적으로 형성된 H6UvsX^*(RGD2)의 조제를 보여준다. 커플링된 펩티드는 분자량의 증가를 가져오고 따라서 SDS 겔에서의 영동 수행의 변화를 가져온다.

실험의 설명

UvsX-NLS 및 UvsX-RGD의 이중-가닥 DNA 로의 결합 및 혼합된 NPF들의 형성:

15㎍ H6UvsX^*(RGD2) 및 4㎍ UvsXH6N2-2 혼합물을 갖는 140 ng(각각의 경우)의 정제된 1.6 kb PCR DNA 조각과의 반응, 단지 4㎍ UvsXH6N2-2 과의 반응, 그리고 단지 15㎍ H6UvsX^*(RGD2) 과의 반응이 76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, pH 7.2, 5mM MgCl₂그리고 1mM ATP- γ-S 에서, 최종 부피 20㎕로 실온에서 30분 동안 항온처리되었고 그 다음 0.8% TAE/아가로스 겔로 변환되었고 이것은 후에 에티듐 브로마이드로 착색되었다. 전기영동은 100 V 에서 1시간 동안 수행되었다.

도 12 는 2개의 상이하게 수식된 단백질들이 그것들의 영동 수행에 있어서 현저하게 다른 DNA 로 NPF들을 형성하는 것을 보여준다. 이중-가닥 DNA 조각 및H6UvsX^*(RGD2) 및 UvsXH6N2-2의 혼합물로 구성된 NPF들(레인 1), 또는 단지 UvsXH6N2-2 로만 구성된 NPF들(레인 2), 또는 단지 H6UvsX^*(RGD2)로만 구성된 NPF들(레인 3)이 아가로스 겔에서 전기영동적으로 분리되었다. 단백질이 적은 양으로 존재하기 때문에, 자유 DNA 조각이 마찬가지로 존재한다. 반응에 있어서의 양 단백질들은 DNA 조각에 함께 결합하고 분자량이 순수한 단백질의 NPF들의 분자량 사이에 존재하는 혼합된 NPF 를 가져온다(레인 1). 이것으로부터 UvsX-NLS 및 UvsX-RGD 가 이중-가닥 DNA 에 결합하고 혼합된 NPF들을 형성할 수 잇는 것으로 추론될 수 있다.

실시예 10: 인테그린-매개 세포내유입에 의한 NPF들의 특이적 도입

단백질의 구조

실시예 1 에서와 같이, UvsX의 융합 단백질 및 인테그린-결합 RGD 모티프의 발현을 허용하는 플라스미드 UvsXH6N2NIT-2(도 1)가 재조합으로 형성되었다.

아미노산 1-391: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 392-394: 아미노산 S³⁹²YG³⁹⁴로 구성되는 링커, 아미노산 395-400: H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰, 아미노산 401-403: 아미노산 M⁴⁰¹YS⁴⁰³으로 구성되는 링커, 아미노산 404-417: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 418-420: 아미노산 G⁴¹⁸YP⁴²⁰으로 구성되는 C-터미너스 그리고 아미노산 421-432: RGD 모티프 "NIT": N⁴²¹ITRGDTYIPYP⁴³².

실험의 설명

형광-표지 DNA 및 UvsX 유도체들로부터 NPF들의 형성:

dTTP 대신에 AlexaFluor488-표지 dUTP(Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)를 포함하는 각각 1㎍의 정제된 1.6 kb PCR DNA 조각이, 76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, pH 7.2, 5mM MgCl₂그리고 1mM ATP- γ-S 에서, 100㎍의 정제된 UvsXH6N2 또는 UvsXH6N2NIT-2 를 가지고 최종 부피 200㎕로 실온에서 30분 동안 항온처리되었다. 그 다음 각각 10㎕의 NPF 반응물이 0.8% TAE/아가로스 겔에 가해졌고 이것은 그 후에 에티듐 브로마이드로 착색되었다. 전기영동은 100 V 에서 1시간 동안 수행되었다. 도 13 은 DNA 가 완전히 지연된것을 보여준다. 따라서, 상기 단백질들의 DNA 결합은 DNA의 플로오레신 표지에 의해 방해받지 않는다.

세포내유입에 의해 NIH3T3 내 NPF들의 도입:

NIH3T3 세포들은 6 웰 플레이트(3 ×10⁵)에서 평판 배양되었고, 밤동안 37℃ 및 5% CO₂에서 항온처리되었고, 그 다음날 예열된 FCS를 포함하지 않는 배지로 새척되었고; 그 후 2㎖의 FCS를 포함하지 않는 배지가 첨가되었다. 190㎕의 NPF 반응물이 첨가되었고(위 참조), 실온에서 30분간 항온처리되었으며, 상층액은 제거되었고, 세포들은 세척되고 3㎖ 배지(10% FCS)로 덮여졌다. 인큐베이터에서 37℃로 1 시간동안 추가적인 항온처리 후에, 형광 현미경 하에서 분석이 수행되었다. 도 14a및 14b에 있어서, 각각 하나의 사진은 밝은장(아래) 및 반사광 형광(위)으로 보여진다.

밝은장에서, 소포성 세포내 구획들이 보이고 이것들은 세포내유입된 DNA 때문에 형광빛에서 반짝인다(도 14a,b,위).

각각의 웰로부터, 수개의 사진들이 촬영되었다. 세포들이 카운트되었고 적어도 하나의 형광 소포성 구획을 포함하는 세포들의 비율이 퍼센트로 결정되었다(도 15에 도시됨). 각 사진은 35 세포들의 평균을 보여준다. UvsXH6N2NIT-2를 갖는 반응에 대해, 9개의 사진이 분석되었고, UvsXH6N2-2를 갖는 반응에 대해, 5개의 사진이 분석되었다.

결과는 기능적 성분으로서 인테그린-결합 모티프로의 UvsX 의 수식(UvsXH6N2-NIT-2)은 조절(UvsXH6N2-2)과 비교하여 세포들 내에서 트랜스펙션 제재의 현저하게 증가된 세포내유입에 의한 도입을 가져온다는 것을 보여준다.

실시예 11: NPF-형성 단백질로서 hRad51을 기초로하는 트랜스펙션 제재의 형성

단백질 hRad51H6 및 hRad51H6N2 가 NPF-형성 단백질로서 이용되었다(도 16 참조).

단백질의 구조

hRad51H6(352 아미노산):

아미노산 1-339: 인간 Rad51(NCBI 단백질 어세션 번호:Q06609, 아미노산 1-339), 아미노산 340-343: 아미노산 Y³⁴⁰SYG³⁴³로 구성되는 링커, 아미노산 344-349: 니켈 킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 위한 H³⁴⁴HHHHH³⁴⁹, 아미노산 350-352: 아미노산 M³⁵⁰YS³⁵²으로 구성되는 C-터미너스.

hRad51H6N2(369 아미노산):

아미노산 1-339: 인간 Rad51(NCBI 단백질 어세션 번호:Q06609, 아미노산 1-339), 아미노산 340-343: 아미노산 Y³⁴⁰SYG³⁴³로 구성되는 링커, 아미노산 344-349: 니켈 킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의한 정제를 위한 H³⁴⁴HHHHH³⁴⁹, 아미노산 350-352: 아미노산 M³⁵⁰YS³⁵²으로 구성되는 링커, 아미노산 353-366: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 367-369: 아미노산 G³⁶⁷YP³⁶⁹으로 구성되는 C-터미너스.

발현 플라스미드의 클로닝

적합한 대장균 세포내에서 상술한 단백질들의 발현을 위해, lac 프로모터의 통제하에서 hRad51H6 또는 hRad51H6N2 에 대한 암호 서열을 포함하는 플라스미드들이 구성되었다 (pExH-hRad51H6 또는 pExH-hRad51H6N2, 도 16 참조). pExH-UvsXH6-2 와 pExH-UvsXH6N2-2 는 소스 플라스미드로 이용된다(도 16참조). UvsX 에 대한 암호화 영역은 EcoR V 및 BsiW I로 절단되고, 동일한 방법으로 절단된 hRad51에 대한 암호화 영역을 갖는 PCR 조각에 의해 대체된다. 이것은 요구되는 제한 부위를 포함하는 hRad51-특이성 프라이머를 이용하여 인간 cDNA 라이브러리로부터 증폭되었다. 개시코돈 전의 5'-말단에서, 상기 PCR 산물들은 추가적인 뉴클레오티드 5'-CACACATCTAGACGTACGGATATCAT-3', 그리고 그것들의 3'-말단에서, 그것들은 종결코돈 대신에 추가적인 뉴클레오티드 5'-TACTCGTACGGAGGTGGCGGCCGCTGTGTG-3'을 포함한다.

정제:

5㎖ dYT/암피실린(100㎍/㎖)의 배양전구물이 DH5 에서 pExH-Rad51H6 또는 pExH-Rad51H6N2 의 콜로니로 접종되었고, 250 rpm 으로 37℃ 에서 5시간 동안 배양되었다. 10 I dYT/암피실린(100㎍/㎖)이 이러한 배양전구물로 접종되었으며, 그리고 210 UPM 으로 37℃ 에서 추가적으로 24 시간 동안 배양되도록 하였다. 상기 배양물들은 7000 ×g 에서 채취되었고, 그리고 약 30 내지 50 g 의 박테리아 펠렛트를 얻었다. 이것은 -20℃ 에서 1 내지 3 일 동안 동결되었다. 상기 펠렛트는 얼음에서 해동되었고, 100㎖의 차가운 개시 완충액에서 재현탁되었다. 상기 세포들은 그 다음 B.Braun Labsonic U(큰 조사, 파라미터: 300 와트, 초당 0.5 초 펄스 지속, 8분 음파처리)를 이용하여 초음파에 의해 용해되었다. 그 다음 이것은 4℃ 에서 1시간 동안 10㎎의 리소짐(Serva, 190.000 u/㎎)으로 항온처리되고, 50㎕의 DNAse I(Serva, 2㎎/㎖) 첨가후에 추가적으로 30분 동안 천천히 저어주면서 항온처리되었다. 원심분리(45분, 18000 ×g, 4℃)에 의해 용해물을 제거한 후, 상기 상층액은 살균 필터(기공 크기 0.45㎛ 그리고 0.2㎛)를 통하여 필터링되었고, Ni⁺⁺로 미리 부하된 평형된 1㎖ HiTrapTM 킬레이팅 컬럼(Pharmacia)에 부하되었다. 추가적인정제 단계는 히스티딘 헥사머가 제공된 단백질을 위한 각각의 Pharmacia 프로토콜에 따라 수행되었다. 다양한 용출 분획의 분별체가 SDS/Coomassie 겔에 가해졌다. 가장 순수한 분획들은 조합되고, 각각의 프로토콜에 따라 센트리플러스 YM30 컬럼(Millipore)을 통하여 더욱 농축되었다. 그 다음, 이것은 적어도 천배 부피의 ZI 완충액에 대해서 각각 4℃ 에서 1시간 동안 2회 투석되었고(투석 튜빙: Spectra/Por, MWCO: 25.000), 그 다음 밤동안 4℃ 에서 ZI 완충액/50% 글리세린에 대해 투석되었다. 상기 투석 산물은 30 내지 50㎕ 분획에서 분별되고 -80℃ 에서 저장되었다. 도 17A 는 정제된 hRad51-H6 및 hRad51-H6N2 단백질을 보여준다.

이용된 완충액:

실시예 1 에서와 같음, 그러나 상이한 용출 완충액: 20mM Pi, 0.5 M NaCl,

100-1000 mM imidazole, pH=7.4

농도의 결정:

상기 hRad51 단백질의 농도는 Gene InspectorTM 소프트웨어(Texaco,Inc.)로 계산된 흡수계수를 이용하여 OD₂₈₀ 의 측정에 의해 결정되었다.

hRad51H6 및 hRad51H6N2 에 있어서 이것은 11 내지 13 ㎍/㎕ 였다.

실험의 설명:

NLS-수식된 hRad51의 이중-가닥 DNA 로의 결합:

Ni⁺⁺-세파로스를 통하여 정제된 hRad51H6N2가 각각 100ng 의 0.9 kb PCR 조각으로 항온처리되었다.

단백질 결합에 의해 야기되는 아가로스 겔에서의 DNA 이동은 hRad51H6N2 가 농도를 기초로 이중-가닥 DNA 에 협동적으로 결합한다는 것을 보여준다(도 17B). 심지어 적은 양의 hRad51H6N2 에 있어서, 단일 DNA 분자들은 hRad51H6N2 에 의해 완전하게 결합되고, 따라서 최대로 지연되어, 상기 DNA 의 지연은 단백질의 양을 증가시킴에 의해 더이상 증가하지 않는다. hRad51H6N2는 dsDNA와 결합하는 것으로 추론된다.

실시예 12: 비-엔도좀 막 투과를 위한 신호 및 기능적 성분으로서의 핵 국부 신호를 가지고 UvsX 를 기초로 트랜스펙션 제재의 형성

실시예 1 에서와 같이, 플라스미드가 융합 단백질 UvsXH6N2VP22c50(도 1 참조)의 발현을 허용하도록 형성되고, 이것은 인간의 헤르페스 바이러스 1 의 피막 단백질 VP22(유전자 UL49)의 부분을 추가적으로 포함하며 실시예 2 에 기술된 단백질 UvsXH6N2-2를 기초로 한다. 여기서 사용된 VP22 펩티드는 세포막을 통한 비-엔도좀 투과를 위한 신호로서 작용한다. 따라서, 융합 단백질 UvsXH6N2VP22c50는 핵 국부 신호(NSL) 이외에 막 형질도입 신호를 포함한다.

단백질의 구조

UvsXH6N2VP22c50(474 아미노산):

아미노산 1-391: 파아지 T4 로부터의 UvsX(NCBI 단백질 어세션 번호:AAD42669, 아미노산 1-391), 아미노산 392-394: 아미노산 S³⁹²YG³⁹⁴로 구성되는 링커, 아미노산 395-400: H³⁹⁵HHHHH⁴⁰⁰, 아미노산 401-403: 아미노산 M⁴⁰¹YS⁴⁰³으로 구성되는 링커, 아미노산 404-417: 핵 국부 신호 nls-2(아미노산 2-15, SEQ ID NO: WO 00/40742로부터 9), 아미노산 418-422: 아미노산 G⁴¹⁸YPGS⁴²²으로 구성되는 링커,아미노산 423-472: 인간 헤르페스 바이러스 1 (NCBI 단백질 어세션 번호: NP 044651, 아미노산 252-301)의 피막 단백질 VP22(유전자 UL49)의 부분, 아미노산 473-474: 아미노산 P⁴⁷³R⁴⁷⁴로 구성된 C-터미너스.

발현 플라스미드의 클로닝:

적합한 대장균 세포에서의 발현을 위해, pExHUvsXH6N2-2(실시예 1 및 도 1 참조)는 Acc65 I 및 Spe I 로의 제한 효소 소화에 의해 개방되었고, 그리고 Acc65 I 및 Nhe I 로 PCT 산물 절단부와 연결되고, 이것은 인간 헤르페스 바이러스 1 (NCBI 단백질 어세션 번호: NC 001806, 뉴클레오티드 105486-106391의 보충 서열)(도 1 참조)의 피막 단백질 VP22(유전자 UL49)의 마지막 50 아미노산을 위한 암호 서열 이외에, 5'-말단에 추가적인 뉴클레오티드 5'-CACACAGGTACCCGGGATCC-3' 그리고 그것의 3'-말단에 추가적인 뉴클레오티드 5'-CCTAGGTAATAATAAGCGGCCGCGCTAGCTGTGTG-3'를 포함한다.

정제:

UvsXH6N2VP22c50 의 정제가 H6UvsX에 대해서 실시예 1 에 기술된 바와 같이 수행되었다(도 18A 참조).

농도: 1.8 ㎍/㎕.

실험의 설명:

다양한 수식된 UvsX(UvsX-NLS-VP22 및 UvsX-NLS)의 혼합물의 이중-가닥 DNA로의 결합:

140 ng(각각의 경우)의 정제된 1.7 kb PCR 조각들이 96mM K₂HPO₄, 21.5mM KH₂PO₄, 18mM NaH₂PO₄, pH 7.2, 5mM MgCl₂그리고 1.3mM ATP- γ-S 에서, 정제된 UvsXH6N2VP22c50 또는 UvsXH6N2-2 의 도 18B에 따른 양으로 실온에서 30분 동안 항온처리되었다. 그 다음, 모든 반응물들이 0.8% TAE/아가로스 겔에 가해졌고 이것은 후에 에티듐 브로마이드로 착색되었다. 상기 2개의 단백질들은 그들의 분자량 및 알짜 전하에 대해 상이하였고, 따라서, 겔 포켓에 끼워지고 더이상 이동하지 않는(도 18B의 레인 1 및 7 참조) UvsXH6N2VP22c50 을 갖는 복합체로, 전기영동 동안에 DNA 를 상이하게 지연시켰다. 상기 단백질들은 DNA 에 첨가되기 전에 혼합되었고, 중간 복합체들이 UvsXH6N2-2 및 UvsXH6N2VP22c50 의 비에 따라 형성되었고, 이것의 이동 성능은 혼합되지 않은 복합체들의 그것 사이에 있다(도 18B). 이것은 DNA 가 양 단백질들에 의해 점유된다는 것을 보여준다. 상이하게 수식된 또는 1 또는 2 회 수식된 NPF-형성 단백질들의 혼합물 또한 가능하다.

실시예 13: DNA 복합체와 UvsX-NLS-VP22 및 UvsX-NLS 의 혼합물로의 세포주(NIH3T3)의 트랜스펙션

실험의 설명:

2.5 ×10⁵세포들(NIH3T3)이 6-웰 플레이트의 각 웰에 평판 배양되었고, 그 다음날 형광 리포터 단백질의 발현을 위한 유전자를 포함하는 벡터로 트랜스펙션되었다. 이를 위해, 0 ㎍ 내지 1 ㎍의 선형 또는 1 ㎍의 원형 DNA 가 결합 완충액(76mM K₂HPO₄, 17mM KH₂PO₄, 14mM NaH₂PO₄, 5mM MgCl₂, 1mM ATP- γ-S, pH 7.21)에서 36㎍ UvsXH6N2VP22c50 또는 19㎍ UvsXH6N2VP22c50 및 39㎍ UvsXH6N2-2의 혼합물로 실온에서 30분간 미리 항온처리되었고, 그리고 전에 PBS/BSA 로 1회 세척된 세포에 1㎖ RPMI 와 함께 첨가되었다. 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 항온처리 후, 1㎖ RPMI/20% FCS가 각각 첨가되었고 인큐베이터에서 추가적으로 항온처리되었다. 4시간 또는 24시간 후, 상기 세포들은 형광 현미경으로 분석되었다. 세포들은 선형 또는 원형 DNA의 복합체 및 UvsXH6N2VP22c50 및 UvsXH6N2-2의 혼합물로 처리후 상기 리포터 유전자를 발현시키는 것으로 관찰되었다(도 19 참조). 상기 트랜스펙션된 세포드의 수는 사용된 DNA 또는 DNA-단백질 복합체들의 양과 함께 증가되었다.

그러나, 상기 리포터 유전자의 어떠한 발현도 단지 UvsXH6N2VP22c50 만을 포함하는 DNA 복합체를 가지고, 또는 DNA의 부재하에서는 달성되지 않았다.

따라서 NPF-형성 단백질, 여기서는 UvsX, 의 수식에 의해, 막-활성 펩티드, 여기서는 VP22, 를 가지고, 세포들의 트랜스펙션 그리고 여기서 특히 막의 투과가 촉진된다. 본 발명에 따른 방법 및 트랜스펙션 제재의 모듈식 특성은 상이하게 수식된 단백질들, 여기서는 VP22 및 NLS 로의 수식,의 조합에 의해 분명히 나타난다(역시 도 20 참조). VP22-수식 UvsX 가 비-엔도좀 막 투과를 허용함에 반하여, NLS-수식 UvsX는 트랜스펙션된 DNA를 세포질로부터 핵으로 보낸다; 상기 트랜스펙션된DNA 는 그 다음 거기서 발현될 수 있다.

따라서, 복잡한 트랜스펙션 절차의 개별적인 단계들이, 특히 유리한 방법으로 유연성있고 높은 효율을 갖도록 특이적으로 조절될 수 있다.

상술한 바와 같이 본 발명은 핵산의 비 바이러스성 트랜스펙션에 관한 것으로, 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질의 도움으로 세포의 트랜스펙션에 이용할 수 있다.

Claims

단백질이 1 또는 그 이상의 트랜스펙션 단계에 영향을 주는 적어도 하나의 기능적 성분들로 우선적으로 수식되고, 트랜스펙션되는 핵산이 그 다음 상기 수식된 단백질로 부하되고, 상기 핵산 및 단백질은 필라멘트형 복합체를 형성하며, 그리고 상기 복합체는 최종적으로 트랜스펙션되는 세포에 첨가되는 것을 특징으로 하는, 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질을 이용하여 세포를 트랜스펙션하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 단백질은 아미노산들 및/또는 단백질 부위의 결실 또는 삽입에 의해 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 단백질은 아미노산들 및/또는 다른 분자 그룹의 화학적 변형에 의해 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 단백질은 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자들의 화학적 커플링에 의해 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분들은 상기 복합체를 세포 표면에 회합시키는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분들은 상기 복합체를 세포막을 통하여 비-엔도좀 통과를 가능케 하는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분들은 엔도좀/리소좀으로부터 상기 복합체의 유리를 가능케하는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분들은 상기 복합체를 핵 내로 수송하게 하는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 단백질은 상이한 기능을 갖는 수개의 기능적 성분들로 수식되고, 그리고/또는 상이한 단백질들은 각각 상이한 기능을 갖는 성분들로 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 단백질은 다수의 기능적 성분들로 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 복합체는 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 그것의 비-가수분해성 유사체의 첨가, 특히 ATP(아데노신트리포스페이트) 및/또는 GTP(구아노신트리포스페이트) 및/또는 그것들의 비-가수분해성 유사체들의 첨가에 의해 안정화되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

핵산에 대한 다른 생물학적 및/또는 화학적 및/또는 물리적 트랜스펙션 방법과의 조합으로, 특히 전기영동법과의 조합으로 이용되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 방법.
핵단백질 필라멘트를 포함하며, 트랜스펙션되는 적어도 하나의 핵산 및 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질로 형성되고, 핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 상기 단백질은 상기 트랜스펙션에 영향을 주는 적어도 하나의 기능적 성분으로 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항에 있어서,

상기 단백질은 상이한 기능을 갖는 수개의 기능적 성분으로 수식되고, 그리고/또는 상이한 단백질들은 각각 상이한 기능을 갖는 성분들로 수식되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

상기 단백질은 다수의 기능적 성분들로 부하되는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

필라멘트-형성 단백질로서, 단백질 RecA, RadA, RAD51, hDmc1, SASP, ICP8, 바람직하게는 UvsX, 더욱 바람직하게는 hRAD51 의 그룹으로부터 선택된 단백질 또는 상기 열거된 단백질 중 적어도 2개의 혼합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분들은 상기 제재를 세포 표면에 회합시키는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분은 상기 제재를 세포막을 통하여 비-엔도좀 통과시키는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분은 상기 제재를 엔도좀/리소좀으로부터 유리시키는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
제 13 항 내지 제 16 항 중 어느 하나의 항에 있어서,

상기 기능적 성분은 상기 제재를 핵 내부로 수송시키는 것을 특징으로 하는 트랜스펙션 제재.
인간 및 동물의 유전자 치료 요법을 위한 약물을 제조하기 위한 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 하나의 항에 따른 트랜스펙션 제재의 이용.
제 13 항 내지 제 21 항 중 어느 하나의 항에 따른 트랜스펙션 제재를 포함하는 약제학적 조제.
핵단백질 필라멘트를 형성할 수 있는 적어도 하나의 단백질과, 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 하나의 항에 따른 적어도 하나의 기능적 성분 뿐만 아니라 다음 성분들중 적어도 하나를 포함하는, 핵산으로 세포를 트랜스펙션하는데 적합한 킷트:

a) 뉴클레오시드 트리포스페이트 및/또는 뉴클레오시드 트리포스페이트 유사체들

(b) 트랜스펙션되는 적어도 하나의 핵산

(c) 보조약 및 첨가제들
세포가 상기 트랜스펙션 제재로 트랜스펙션되고 잠재 억제제 또는 활성제에 노출되는 것을 특징으로 하는 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 하나의 트랜스펙션 제재의 발현 산물의 활성제 또는 억제제의 확인 방법.
세포가 제 13 항 내지 제 20 항 중 어느 하나에 따른 트랜스펙션 제재로 트랜스펙션되고 생리학적 변형이 트랜스펙션되지 않은 조절 세포들과 비교하여 결정되는 것을 특징으로 하는 생리학적으로 활성인 핵산의 확인 방법.