ES2357622T3 - Péptido etiqueta que contiene cisteína para la conjugación específica de sitio de proteínas. - Google Patents
Péptido etiqueta que contiene cisteína para la conjugación específica de sitio de proteínas. Download PDFInfo
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Abstract
Conjugado biológico, que comprende: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión, presentando dicho conjugado biológico un enlace covalente entre el grupo tiol de SEC ID nº 2 y un grupo funcional en dicho grupo de unión.
Description
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención se refiere a un conjugado biológico que comprende proteínas que presentan las secuencias de proteína que codifican una etiqueta que contiene cisteína y un grupo de unión unido covalentemente a la etiqueta que contiene cisteína en la proteína. Asimismo, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen los conjugados biológicos en combinación con entidades terapéuticas, diagnósticas, o de investigación seleccionadas.
[0002] La conjugación de proteínas recombinantes con diversas entidades se utiliza en varias áreas. Un área es la administración dirigida de agentes terapéuticos, diagnósticos y de investigación en células diana en el paciente con el fin de mejorar su eficacia y de minimizar los efectos secundarios potencialmente adversos. En este área, los agentes terapéuticos, diagnósticos y de investigación o sus portadores se conjugan químicamente con proteínas recombinantes de direccionamiento que pueden unirse selectivamente a células diana (revisión por Dubowchik y Walker, 1999). Los conjugados resultantes son estructural y funcionalmente heterogéneos debido a que se forman aleatoriamente mediante reacciones químicas con unos cuantos de entre varios grupos químicos disponibles, habitualmente grupos ε-amino de residuos lisina en la proteína de direccionamiento. Debido a que la conjugación aleatoria no discrimina entre residuos aminoácidos funcionalmente importantes y los dispensables en la proteína de direccionamiento, el procedimiento debería desarrollarse ajustado a medida y optimizarse caso por caso con el fin de incrementar la proporción de proteínas funcionalmente activas.
[0003] Otro área es la derivatización de superficies artificiales y/o composiciones en masa de dispositivos biomédicos o andamiajes de tejidos con proteínas con diana en determinados componentes del ambiente interno del organismo con el fin de mejorar la compatibilidad superficial con el ambiente y de modular las características deseadas, tales como la afinidad o rechazo de determinados componentes internos del organismo. En este área, las proteínas recombinantes se injertan covalentemente en el material mediante conjugación química aleatoria, habitualmente mediante grupos ε-amino de residuos lisina, que implica residuos aminoácidos tanto funcionalmente importantes como dispensables en las proteínas, resultando en productos heterogéneos con una fracción desconocida de proteínas funcionalmente activas.
[0004] Todavía otro área con problemas similares es la construcción de diversos biosensores u otros dispositivos funcionales con superficies derivatizadas con proteínas, que convierten los resultados de las interacciones entre la proteína "activa" y los componentes diana del ambiente en un resultado detectable, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, una señal detectable o los productos de actividad enzimática de proteínas inmovilizadas. En este área, también se conjugan químicamente proteínas recombinantes con superficies artificiales de estos dispositivos, habitualmente mediante grupos ε-amino de residuos lisina, rindiendo superficies heterogéneas con una fracción desconocida de proteínas funcionalmente activas.
[0005] Se han desarrollado varios métodos para la conjugación química de proteínas con superficies artificiales (ver, por ejemplo, la patentes US nº 5.492.840 de Malmqvuist, nº 5.853.744 de Mooradian et al., nº
6.033.719 de Keogh, Mann et al., 2001; Kuhl y Griffith-Cima, 1996; Bentz et al., 1998. Estos métodos se desarrollaron caso por caso con el fin de minimizar los daños a la proteína e incrementar la homogeneidad de la superficie.
[0006] Estos problemas han sido perfectamente reconocidos, y a lo largo de los años se han desarrollado varios enfoques para introducir en proteínas recombinantes residuos cisteína únicos para la conjugación específica de sitio de diversas entidades. Esta estrategia se basa en la observación de que residuos cisteína intrínsecos en las proteínas habitualmente se encuentran implicados en enlaces disulfuro intramoleculares o entre subunidades y no se encuentran fácilmente disponibles para la conjugación química. En teoría, la introducción de un único residuo cisteína que no afecte a la formación de enlaces disulfuro intrínsecos y que no afecte a la actividad funcional de la proteína recombinante puede proporcionar un grupo tiol disponible para la conjugación específica de sitio mediante enlaces conocidos de la técnica. Por ejemplo, varios grupos han informado de la introducción de cisteínas en fragmentos de anticuerpo Fv de una sola cadena (scFv) recombinantes, habitualmente en los extremos C-terminales o próximamente a ellos, con el fin de utilizar dichos residuos cisteína para la formación de diacuerpos y/o para la conjugación específica de sitio con diversas entidades (Adams et al., 1993; Kipriyanov et al., 1994; Wang et al., 1997; Marti et al., 2001; Gupta et al., 2001; Xu et al., 2002; Li et al., 2002; Renard et al., 2002; Albrecht et al., 2004). Sin embargo, incluso para scFv, la presencia de una cisteína no apareada en el extremo C-terminal o próximamente a ella afecta significativamente al rendimiento, solubilidad y actividad funcional de la proteína (Schmiedl et al., 2000). Futami et al., 2000, introdujeron residuos cisteína en una posición próxima a los extremos N-terminal y C-terminal de la ARNasa I humana, resultando en una ARNasa I estabilidad. Sin embargo, el rendimiento y actividad enzimática del producto se redujeron significativamente. Además, esta ARNasa I mutante o sus fragmentos no fueron utilizados en otros productos.
[0007] Otro método para la modificación dirigida a sitio de las proteínas es la ligación mediada por inteína de diversas entidades con el extremo C-terminal de la proteína (ver, por ejemplo, Evans et al., 1999; Tolbert y Wong, 2000; Macmillan et al., 2000; Mukhopadhyay et al., 2001; Hofmann y Muir, 2002; Lovrinovic et al., 2003; Wood et al., 2004). Sin embargo, la aplicación de este método requiere el plegamiento correcto de la proteína fusionada con un domino grande de inteína y la capacidad de resistir condiciones reductoras bastante fuertes durante la ligación mediada por inteína. Además, en ambos enfoques comentados anteriormente, la conjugación con un residuo cisteína disponible se encuentra limitada a entidades que no interfieren con actividades de la proteína a pesar de su estrecha proximidad al cuerpo de la proteína.
[0008] De esta manera, en el área de la administración dirigida basada en proteínas de compuestos terapéuticos, diagnósticos y de investigación, así como en el área de la construcción de diversos dispositivos y andamiajes con superficies derivatizadas con proteínas, en la técnica se requieren composiciones y métodos generales que: (1) permitan la conjugación específica de sitio de proteínas recombinantes con diversas entidades con el fin de producir productos más homogéneos de maneras que minimicen la interferencia con actividades funcionales de dichas proteínas, (2) conviertan fácilmente diversas proteínas recombinantes de interés en un formato adecuado para la conjugación específica de sitio, (3) puedan utilizarse con una amplia diversidad de entidades con las que resulta necesario conjugar la proteína recombinante de interés, y (4) no resulten en problemas inmunogénicos o de toxicidad al introducirlos en seres humanos. Se cree que la presente invención es una respuesta a dichos objetivos.
DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN
[0009] En un aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado biológico, comprendiendo: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión, presentando el conjugado biológico un enlace covalente entre el grupo tiol de SEC ID nº 2 y un grupo funcional en el grupo de unión.
[0010] En otro aspecto, la presente invención se refiere a un conjugado biológico, que comprende: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión que comprende una proteína adaptadora unida covalentemente al grupo de direccionamiento, presentando la proteína adaptadora un grupo tiol; presentando el conjugado biológico un enlace disulfuro entre el grupo tiol de secuencia SEC ID nº 2 y el grupo tiol de la proteína adaptadora.
[0011] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para administrar selectivamente entidades seleccionadas en una diana de un paciente, comprendiendo un portador farmacéuticamente aceptable, y uno u otro de los conjugados biológicos anteriormente indicados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0012] La invención se entenderá más completamente a partir de la descripción detallada siguiente considerada conjuntamente con los dibujos adjuntos, en los que:
la Fig. 1 es una representación de las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de la etiqueta C4 fusionada genéticamente con la región de sitio de clonación múltiple mediante una molécula conectora G4S (panel A), y representación esquemática de un plásmido para la expresión bacteria
na de proteínas recombinantes de fusión fusionados con la etiqueta C4 mediante una molécula conectora G4S (panel B).
La Fig. 2 es una representación esquemática de la conjugación específica de sitio entre una proteína recombinante de fusión etiquetada con C4 y una proteína adaptadora complementaria denominada HuS(C118) (panel A), una representación esquemática de una familia de proteínas adaptadoras basada
en la ARNasa I humana capaz de conjugación específica de sitio con un residuo cisteína en la etiqueta C4 fusionada genéticamente con la proteína recombinante (panel B), lo que demuestra la conjugación espontánea a través de un enlace disulfuro entre C4-VEGF y HuS(C118), conduciendo a la
aparición de nuevas bandas de proteínas sensibles a DTT en las muestras denominadas HuS-C4-VEGF en el gel SDS-PAGE (panel C), y una demos- tración de que la actividad ribonucleasa se reconstituye tras la formación del conjugado químico, pero no tras la mezcla física de proteína adaptadora y la proteína recombinante de fusión etiquetada con C4 (panel D).
La Fig. 3 ilustra que las actividades funcionales de varias proteínas recom- binantes de fusión etiquetadas con C4 y de varias proteínas recombinantes de fusión etiquetadas con C4 y conjugadas con proteínas adaptadoras complementarias son comparables a las de las proteínas parentales. El panel A ilustra que en el ensayo de fosforilación de tirosinas de VEGFR-2 en células 293/KDR, las actividades funcionales del factor de crecimiento endotelial vascular etiquetado con C4 (C4-VEGF), del factor de crecimiento endotelial vascular de una sola cadena etiquetado con C4 (C4-scVEGF) y del conjugado HuS(C118)-C4-VEGF (HuS-C4-VEGF), son comparables a las del VEGF que no contiene etiqueta C4. El panel B ilustra que las actividades funcionales de la anexina V etiquetada con C4 (C4-anexina) y de los conjugados HuS(C118)-C4-anexina V (HuS-C4-anexina) son comparables a la de la anexina V en un ensayo de unión de eritrocitos. El panel C ilustra que la capacidad de un fragmento catalíticamente inactivo etiquetado con C4 del factor letal del ántrax, C4LFn, y del conjugado correspondiente HuS(C118)-C4-LFn (HuS-C4-LFn), son comparables a la de LFn en la protección de las células RAW frente a la actividad citotóxica de la toxina del ántrax LF/PA.
La Fig. 4 ilustra que la conjugación específica de sitio de HYNIC-maleimida (hidrocloruro de 5maleimido-2-hidraziniopiridina), un quelante de 99mTc, con las proteínas de fusión y de actividad funcional C4-VEGF y C4-scVEGF como los conjugados. El panel A ilustra que las actividades funcionales de los conjugados HYNIC-C4-VEGF y HYNIC-C4-scVEGF es comparable a la del C4VEGF parental en el ensayo de autofosforilación de tirosinas del VEGFR-2 en células 293/KDR. El panel B ilustra que los conjugados HYNIC-C4-VEGF e HYNIC-C4-scVEGF son comparables al C4VEG parental en sus capacidades de proteger a las células 293/KDR frente a la citotoxicidad de la proteína de fusión toxina-VEGF.
La Fig. 5 ilustra la conjugación específica de sitio de maleimida-polietilenglicol de 20 ó 40 kDa (PEG20 y PEG40, respectivamente) con C4-VEGF y la actividad funcional del conjugado PEG-C4VEGF. El panel A ilustra el análisis de SDS-PAGE del conjugado PEGF-C4-VEGF. El panel B ilustra que la actividad funcional del conjugado PEG-C4-VEGF es comparable a la de C4-VEGF parental en el ensayo de autofosforilación de tirosinas del VEGFR-2 en células 293/KDR.
La Fig. 6 ilustra la utilización de la etiqueta C4 y una proteína adaptadora complementaria HuS(C88, C118) para la construcción de los conjugados regulados por VEGF (Cy5.5-Hus-C4-VEGF) que contienen pigmento cianina Cy5.5 para la formación dirigida in vivo de imágenes fluorescentes de infrarrojo cercano. El panel A es un diagrama de flujo para la construcción y caracterización del conjugado Cy5.5-Hus-C4-VEGF. El panel B ilustra que la actividad funcional del conjugado Cy5.5Hus-C4-VEGF es comparable a la del C4-VEGF parental en el ensayo de autofosforilación de tirosinas del VEGFR-2, mientras que la conjugación específica de sitio (Cy5.5-C4-VEGF) o aleatoria (Cy5.5-VEGF) de una cantidad similar de Cy5.5 por cada VEGF etiquetado con C4 reduce la actividad del VEGF. El panel C ilustra que el conjugado Cy5.5-Hus-C4-VEGF es comparable al C4VEGF parental en su capacidad de proteger a las células 293/KDR frente a la citotoxicidad de la proteína de fusión toxina-VEGF, mientras que la conjugación específica de sitio (Cy5.5-C4-VEGF) o aleatoria (Cy5.5-VEGF) de una cantidad similar de Cy5.5 por cada VEGF etiquetado con C4 reduce la actividad del VEGF. El panel D ilustra la utilización del conjugado Cy5.5-Hus-C4-VEGF para la formación de imágenes in vivo de la vasculatura tumoral.
La Fig. 7 ilustra la utilización de la etiqueta C4 y de una proteína adaptadora complementaria HuS(C118) para la construcción de conjugados regulados por VEGF (Lip/Hus-C4-VEGF) que contienen liposomas cargados de doxorubicina ("DOXIL") para la administración dirigida de fármacos. El panel A es un diagrama de flujo para la construcción y caracterización del conjugado Lip/Hus-C4-VEGF. El panel B ilustra que la actividad funcional del conjugado Lip/Hus-C4-VEGF es comparable a la del C4-VEGF parental en el ensayo de autofosforilación de tirosinas del VEGFR-2. El panel C ilustra que los liposomas cargados de doxorubicina con diana en VEGF (Lip/HuS-C4VEGF) resultan tóxicos para las células que expresan VEGFR-2 en un intervalo de concentraciones en el que los liposomas cargados de doxorubicina no dirigidos resultan ineficaces, encontrándose en la base del mecanismo mediado por receptor de toxicidad del conjugado Lip/Hus-C4-VEGF. El panel D ilustra que VEGF protege a las células 293/KDR frente a la actividad citotóxica del conjugado Lip/Hus-C4-VEGF.
La Fig. 8 ilustra la utilización de C4-scVEGF para la construcción de conjugados regulados por VEGF (Lip/C4-scVEGF) que contienen liposomas cargados de doxorubicina ("DOXIL") para la administración dirigida de fármacos. El panel A es un diagrama de flujo para la construcción y caracterización del conjugado Lip/C4-scVEGF. El panel B ilustra que en el ensayo de autofosforilación de toxinas del VEGFR-2, la actividad funcional del conjugado Lip/C4-scVEGF es comparable a la del C4-VEGF parental. El panel C ilustra que Lip/C4-scVEGF resulta tóxico para las células que expresan VEGFR-2 en un intervalo de concentraciones en el que los liposomas cargados de doxorubicina no dirigidos resultan ineficaces, encontrándose en la base del mecanismo mediado por receptores de la toxicidad del conjugado Lip/C4-scVEGF. El panel D ilustra que VEGF protege a las células 293/KDR frente a la actividad citotóxica del conjugado Lip/C4-scVEGF.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
[0013] Tal como se ha indicado anteriormente, la presente invención comprende composiciones y métodos que resultan útiles para la conjugación específica de sitio de las proteínas de fusión recombinantes con diversas entidades mediante un único residuo cisteína presente en un péptido de etiqueta introducido en la proteína. Los métodos de conjugación actuales conocidos de la técnicas se basan principalmente en el entrecruzamiento aleatorio de diversas entidades con residuos aminoácidos, tales como, por ejemplo, lisina o tirosina, que son abundantes en la proteína. Los residuos cisteína menos abundantes habitualmente se encuentran implicados en enlaces disulfuro intramoleculares que resultan esenciales para la actividad funcional de la proteína y que por lo tanto no se encuentran disponibles para la conjugación. En consecuencia, incluso en el caso de que la conjugación implique únicamente un residuo aminoácido por cada proteína, el producto final contiene una mezcla de proteínas modificadas en diferentes posiciones y por lo tanto de características heterogéneas de actividad, farmacocinética, farmacodinámica y distribución en tejidos. Además, la conjugación con residuos aminoácidos en la proteína en todo caso se encuentra limitada por el perjuicio que puede implicar para la actividad funcional de las proteínas. En consecuencia, los procedimientos de conjugación deben desarrollarse a medida caso por caso. Sin embargo, la conjugación a medida no permite un enfoque estandarizado para la adaptación rápida de diferentes proteínas para fines similares, por ejemplo para una administración dirigida del mismo reactivo de formación de imágenes, o la derivatización superficial del mismo dispositivo.
[0014] Para superar dichos obstáculos y otros, la presente invención da a conocer composiciones y métodos que resultan útiles para la conjugación específica de sitio de proteínas recombinantes con diversas entidades. El método se basa en la conversión de una proteína de interés en una proteína de fusión que comprende un péptido de etiqueta que contiene cisteína, denominado C4, fusionado mediante un péptido conector a un extremo N-terminal o C-terminal de la proteína de interés. Por definición, con el fin de que resulte útil, dichas proteínas de fusión deberían conservar sus actividades funcionales, y un residuo cisteína en el péptido de etiqueta debería encontrarse disponible para la conjugación específica de sitio con diversas entidades, incluyendo proteínas adaptadoras complementarias, capaces de formar un enlace disulfuro covalente con la cisteína de la etiqueta. Diversos enlaces para la conjugación de un grupo tiol de cisteína son bien conocidos de la técnica. Por ejemplo, las entidades derivatizadas con grupos maleimida, o grupos vinilsulfona, o con grupos tiol químicamente activados, pueden conjugarse con un grupo tiol en la etiqueta C4. Por otra parte, el grupo tiol en la etiqueta C4 puede modificarse con la formación de un enlace disulfuro activado que pueda reaccionar con grupos tiol disponibles en diversas entidades, o puede modificarse con reactivos bifuncionales para la conjugación con entidades que puedan reaccionar con el segundo grupo funcional.
[0015] De esta manera, ahora se ha descubierto que una etiqueta C4 de péptido de fusión que contiene cisteína puede proporcionar a una proteína fusionada a la etiqueta la capacidad de conjugarse químicamente con diversos componentes químicos. El residuo cisteína de la etiqueta C4 se utiliza para formar un enlace covalente con los componentes químicos, proporcionando de esta manera un enlace estable fuerte. Mediante el residuo cisteína de C4, pueden formarse enlaces estables entre la proteína etiquetada con C4 y una amplia diversidad de entidades, incluyendo fármacos, portadores de fármacos, agentes de contraste, portadores para agentes de contraste, radionucleidos, portadores para radionucleidos, diversas nanopartículas y micropartículas, incluyendo liposomas, puntos quantum, partículas paramagnéticas pequeñas y ultrapequeñas, otras proteínas o fragmentos de proteína, ácidos nucleicos, diversas moléculas modificadoras de proteínas, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, así como superficies de diversos dispositivos, tales como dispositivos biomédicos, biosensores, o andamiajes de tejidos artificiales. En una realización, se une covalentemente una proteína adaptadora complementaria a la proteína etiquetada con C4 mediante un enlace disulfuro. La proteína adaptadora puede utilizarse como plataforma para la conjugación con diversas entidades indicadas anteriormente. La presente invención da a conocer que las proteínas etiquetadas con C4 conservan la actividad funcional de la proteína y que pueden conjugarse de modo específico de sitio con diversas entidades sin pérdida de actividad funcional in vitro o in vivo.
[0016] La formación de un enlace covalente ofrece varias ventajas para la presente invención. En primer lugar, la entidad unida covalentemente a la etiqueta C4 se encuentra alejada de las partes funcionales de la proteína. Además, una proteína adaptadora complementaria permite distanciar adicionalmente las entidades unidas de las partes funcionales de la proteína. En segundo lugar, el enlace covalente es fuerte, de manera que los materiales unidos a la proteína etiquetada con C4 no se disocian fácilmente en líquidos biológicos o en soluciones. En tercer lugar, el enlace y las condiciones para formar el enlace covalente son conocidos y pueden reproducirse fácilmente. En cuarto lugar, bajo determinadas condiciones conocidos por el experto en la materia resulta posible destruir el enlace covalente y permitir que los componentes se disocien. Por ejemplo, en el caso de que se forme un enlace disulfuro, pueden seleccionarse condiciones apropiadas para reducir este enlace y permitir que se disocie la proteína etiquetada con C4. Esta característica de la invención ofrece ventajas en el aspecto de que, por ejemplo, las superficies derivatizadas pueden regenerarse tras un periodo de tiempo predeterminado.
[0017] A menos que se indique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria presentan el mismo significado entendido comúnmente por el experto en la materia a la que se refiere el objeto de la presente invención.
[0018] Tal como se utiliza en la presente memoria, "C4" se refiere a un fragmento mutante N-terminal de 15 aminoácidos de longitud de la ARNasa I humana con las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos siguientes:
AAAGAATCTTGCGCTAAAAAA.TTTCAACGTCAACACATGGACTCT (SEC ID nº 1) Lys-Glu-Ser-Cys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gln-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser (SEC ID nº 2)
[0019] Aunque no debe esperarse que péptidos humanos alterados mínimamente resulten inmunogénicos en el ser humano y por lo tanto son realizaciones preferentes de etiquetas que contienen cisteína, se entiende que en algunas aplicaciones la inmunogenicidad no es un problema y por lo tanto estos péptidos pueden utilizarse tras la modificación mediante sustitución de aminoácidos, deleción de aminoácidos, inserción de aminoácidos y adición de aminoácidos, incluyendo la introducción de un residuo cisteína en diferentes posiciones en estos péptidos o la utilización de fragmentos correspondientes de ribonucleasas no humanas.
[0020] Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "proteína de direccionamiento" se refiere a una proteína que puede interactuar selectivamente con receptores celulares u otras proteínas de superficie celular, o que puede interactuar selectivamente con determinados componentes del ambiente, libres o unidos a una superficie.
[0021] Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "secuencia de molécula conectora" se refiere a una longitud inocua de ácido nucleico o proteína que une dos otras secciones de ácido nucleico o proteína.
[0022] Los términos "mutante" y "mutado" se refieren a secuencias de ácido nucleico o proteína que no se encuentran naturalmente. El término "truncado" se refiere a secuencias de ácido nucleico o proteína que son más cortas que las observadas en la naturaleza.
[0023] Tal como se define en la presente memoria, "conjugado biológico" se refiere a un complejo entre un grupo de direccionamiento y un grupo de unión y estabilizado mediante un enlace covalente. El termino “grupo de direccionamiento” ser refiere a una proteína que presenta un polipéptido que comprende C4 y una proteína de direccionamiento. La expresión "grupo de unión" se refiere a cualquier sustancia o superficie que puede unirse covalentemente al grupo de direccionamiento. La expresión "grupo funcional" se refiere a grupos químicos naturales o no naturales que interactúan químicamente con un grupo tiol. Un grupo funcional natural se refiere a un grupo químico que se observa naturalmente en el grupo de unión que puede interactuar químicamente con un grupo tiol. Un grupo funcional no natural se refiere a un grupo que se añade artificialmente al grupo de unión (por ejemplo la adición de un grupo maleimida o grupo vinilsulfona a polietilenglicol) de manera que el grupo artificial es químicamente reactivo con el grupo tiol del grupo de unión.
[0024] La expresión "proteína adaptadora" se refiere a una proteína que es complementaria (por ejemplo parte de una pareja de unión) y que puede interactuar con el grupo de direccionamiento para formar un enlace disulfuro específico entre dicha proteína y el grupo de direccionamiento. La expresión "proteína de fusión" se refiere a una proteína recombinante que contiene dos o más fragmentos de polipéptido que se encuentran codificados por secuencias de ADN que han sido combinadas con los métodos de tecnología de ADN recombinante de una forma que permite la expresión de la proteína de fusión en huéspedes adecuados.
[0025] Tal como se utiliza en la presente memoria, "portador" se refiere a moléculas naturales o sintéticas o agregados de las mismas que pueden asociarse covalente o no covalentemente con compuestos terapéuticos, diagnósticos o de investigación. Entre dichos portadores se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, quelantes, polímeros naturales o sintéticos, incluyendo dendrímeros, copolímeros, polímeros derivatizados, liposomas, diversas partículas víricas y bacteriofágicas, diversas nanopartículas y micropartículas naturales y fabricadas, y perlas.
[0026] Tal como se utiliza en la presente memoria, "scVEGF" se refiere a un factor de crecimiento endotelial vascular de una sola cadena que comprende dos fragmentos de 3 a 112 aminoácidos de la isoforma VEGF121 conectados cabeza con cola en una proteína de una cadena mediante un residuo de alanina y que presenta las secuencias de proteína y de ácido nucleico siguientes:
[0027] Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique SEC ID nº 4 se encuentra comprendida en los ácidos nucleicos de la presente invención.
[0028] En todavía otra realización, el grupo de direccionamiento presenta la secuencia polipeptídica mostrada en SEC ID nº 14. Esta secuencia polipeptídica, que es una fusión genética de C4 y un VEGF de una sola cadena (scVEGF) que presenta la secuencia polipeptídica mostrada en SEC ID nº 4, se encuentra codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEC ID nº 13. Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique SEC ID nº 14 se encuentra comprendida en los ácidos nucleicos de la presente invención. Aunque scVEGF contiene 16 residuos de cisteína en cada molécula monocatenaria, las moléculas etiquetadas con C4 se repliegan en una conformación funcionalmente activa, de manera que el residuo cisteína en la etiqueta C4 puede conjugarse con diversas entidades, rindiendo conjugados con actividades funcionales comparables a las del VEGF no modificado.
[0029] Tal como se ha indicado anteriormente, en una realización, la presente invención se refiere a un conjugado biológico, que comprende: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión, en el que el conjugado biológico presenta un enlace covalente entre el grupo tiol de secuencia SEC ID nº 2 y un grupo funcional en el grupo de unión. La presente invención también se refiere a un conjugado biológico, que comprende: (a) un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y (b) un grupo de unión que comprende una proteína adaptadora unida covalentemente al grupo de direccionamiento, presentando la proteína adaptadora un grupo tiol, en el que el conjugado biológico presenta un enlace disulfuro entre el grupo tiol de secuencia SEC ID nº 2 y el grupo tiol de la proteína adaptadora. Cada uno de estos componentes se comenta en más detalle posteriormente. El grupo de direccionamiento preferentemente es una proteína que presenta un polipéptido que comprende el péptido C4 y una proteína de direccionamiento. Tal como se ha indicado anteriormente, la parte de péptido C4 del grupo de direccionamiento es un fragmento N-terminal mutante de 15 aminoácidos de longitud de la ARNasa I humana en la que la arginina en la posición 4 ha sido sustituido por cisteína. Este péptido particular ofrece varias ventajas en la presente invención. El origen humano reduce la probabilidad de inducir una respuesta inmunológica fuerte en un huésped humano. Además, un fragmento N-terminal de la ARNasa I humana es capaz de formar una hélice α que puede protegerlo frente a la formación de enlaces disulfuro con otros residuos cisteína en la proteína de fusión durante el replegamiento y la purificación de la proteína. Finalmente, los fragmentos N-terminal y C-terminal de tipo salvaje enzimáticamente inactivos de la ARNasa I humana forman espontáneamente complejos no covalentes enzimáticamente activos, un fenómeno que se aprovecha en la presente invención para desarrollar proteínas adaptadoras complementarias capaces de formar un enlace disulfuro con un residuo de C4 en la etiqueta C4. El fragmento N-terminal mutante de 15 aminoácidos de longitud de la ARNasa I humana presenta las secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos siguientes:
AAAGAATCTTGCGCTAAAAAATTTCAACGTCAACACATGGACTCT (SEC ID nº 1)
Lys-Glu-Ser-Cys-Ala-Lys-Lys-Phe-Gln-Arg-Gln-His-Met-Asp-Ser (SEC ID nº 2)
[0030] La parte de proteína de direccionamiento del grupo de direccionamiento es cualquier proteína que pueda unirse selectivamente a receptores celulares o a otras proteínas de superficie celular o de interactuar selectivamente con determinados componentes del ambiente, y que se encuentra genéticamente fusionada con el péptido C4. En realizaciones preferentes, la proteína de direccionamiento puede ser un factor de crecimiento endotelial vascular humano (VEGF), o una forma mutada o truncada del mismo, tal como VEGF110, la anexina V humana, o una forma mutada o truncada de la misma, un fragmento catalíticamente inactivo del vector letal del ántrax, o una forma mutada o truncada del mismo, o un derivado del VEGF de una sola cadena, o una forma mutada o truncada del mismo.
[0031] En una realización, el grupo de direccionamiento presenta las secuencias polipeptídicas mostradas en las secuencias SEC ID nº 6 ó 8. Estas secuencias polipeptídicas, que son fusiones genéticas de C4 y VEGF121 o VEGF110, respectivamente, se encuentran codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos mostradas en SEC ID nº 5 y 7, respectivamente. Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique SEC ID nº 6 ó 8 se encuentra comprendido en los ácidos nucleicos de la presente invención. Además, aunque las isoformas seleccionadas del VEGF (VEGF121) contienen 18 residuos cisteína en cada molécula dimérica, las moléculas etiquetadas se repliegan en una conformación funcionalmente activa, en la que el residuo cisteína en la etiqueta C4 puede conjugarse con diversas entidades, rindiendo conjugados con actividades funcionales comparables a las del VEGF no modificado.
[0032] El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) controla el crecimiento de las células endoteliales mediante la interacción con varios receptores, entre los que la expresión del receptor KDR/flk-1 (VEGFR-2) se encuentra limitada mayoritariamente a las células endoteliales. En los organismos adultos, el crecimiento de las células endoteliales (angiogénesis) se produce, con la excepción del desarrollo del cuerpo lúteo, únicamente en diversas condiciones patológicas. De esta manera, la administración mediada por receptor de KDR/flk-1 (VEGFR-2) de entidades terapéuticas, diagnósticas, de contraste y de investigación de manera específica de sitio ligada a VEGF o a scVEGF, o ligada a VEGF o scVEGF mediante una proteína adaptadora complementaria, puede resultar útil en terapias para diversas patologías. Por otra parte, VEGF o scVEGF, PEGilado específicamente en un sitio, de circulación prolongada o liberable lentamente a partir de una matriz adecuada, así como VEGF o scVEGF conjugado con las superficies de dispositivos biomédicos, tales como stents, o andamiajes de tejidos, podría resultar útil para estimular la angiogénesis en situaciones isquémicas.
[0033] En otra realización, el grupo de direccionamiento presenta la secuencia polipeptídica mostrada en SEC ID nº 10. Esta secuencia polipeptídica, que es una fusión genética de C4 y anexina V, se encuentra codificada por la secuencia de ácido nucleico mostrada en SEC ID nº 9. Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique SEC ID nº 10 se encuentra comprendida en los ácidos nucleicos de la presente invención. Aunque la anexina V contiene un único residuo cisteína, las moléculas etiquetadas se repliegan en una conformación funcionalmente activa, en la que el residuo cisteína en la etiqueta C4 puede conjugarse con diversas entidades, rindiendo conjugados con actividades funcionales comparables a las de la anexina V no modificada. La anexina V interactúa con fosfatidilserina expuesta sobre la superficie de las células apoptóticas, y se utiliza como un marcador precoz del proceso apoptótico. De esta manera, la administración mediada por fosfatidilserina de entidades terapéuticas, diagnósticas o de investigación ligadas de manera específica de sitio a la anexina V podría resultar útil para inhibir o estimular la apoptosis.
[0034] En otra realización, el grupo de direccionamiento presenta la secuencia polipeptídica mostrada en SEC ID nº 12. Esta secuencia polipeptídica, que es una fusión genética de C4 y un fragmento catalíticamente inactivo del factor letal del ántrax, conocido como LFn, se encuentra codificado por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEC ID nº 11. Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique SEC ID nº 12 se encuentra comprendido en los ácidos nucleicos de la presente invención. Aunque LFn no contiene residuos cisteína, las moléculas etiquetadas se repliegan en una conformación funcionalmente activa, de manera que el residuo cisteína en la etiqueta C4 pueda conjugarse con diversas entidades, rindiendo conjugados con actividades funcionales comparables a las del LFn no modificado. El fragmento catalíticamente inactivo del factor letal del ántrax, LFn, se empareja con otra proteína del ántrax, denominada antígeno protector (AP), que interactúa con los mismos receptores celulares que la combinación de factor letal catalíticamente activo/antígeno protector (LF/AP). De esta manera, la administración mediada por AP de entidades terapéuticas, diagnósticas o de investigación ligadas específicamente en un sitio a LFn podría resultar útil para mapear sitios con receptores para AP, o para la administración en células de compuestos que podrían interferir con la actividad citotóxica del factor letal.
[0035] En todavía otra realización, el grupo de direccionamiento presenta la secuencia polipeptídica mostrada en SEC ID nº 14. Esta secuencia polipeptídica, que es una fusión genética de C4 y un VEGF de una sola cadena (scVEGF) que presenta la secuencia polipeptídica mostrada en SEC ID nº 4, se encuentra codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEC ID nº 13. Sin embargo, debido a la redundancia del código genético, cualquier ácido nucleico que codifique SEC ID nº 14 se encuentra comprendido en los ácidos nucleicos de la presente invención. Tal como se ha indicado anteriormente, scVEGF comprende dos fragmentos de 3 a 112 residuos aminoácidos de la isoforma VEGF121 conectados cabeza con cola en una proteína monocatenaria mediante un residuo alanina. Aunque scVEGF contiene 16 residuos cisteína en cada molécula monocatenaria, las moléculas etiquetadas se repliegan en una conformación funcionalmente activa, en la que el residuo cisteína en la etiqueta C4 puede conjugarse con diversas entidades, rindiendo conjugados con actividades funcionales comparables a las del VEGF dimérico no modificado.
[0036] Con referencia al grupo de direccionamiento anteriormente indicado, puede situarse una secuencia conectora entre el péptido C4 y la secuencia de la proteína de direccionamiento. Las secuencias conectoras, tales como los conectores Gly4Ser o (Gly4Ser)3, se introducen en los vectores disponibles comercialmente para la expresión bacteriana de proteínas recombinantes y pueden introducirse fácilmente en vectores para la expresión de proteínas recombinantes en otros huéspedes, incluyendo, aunque sin limitación, células de mamífero, células de insecto, células de levadura y organismos transgénicos. Los conectores sirven para proporcionar una cierta distancia útil entre el péptido C4 y la proteína de direccionamiento. Aunque en las realizaciones presentadas la etiqueta C4 se sitúa en el extremo N-terminal de la proteína de direccionamiento, el experto en la materia apreciará que la etiqueta puede situarse en el extremo C-terminal de la proteína de direccionamiento, o en el interior del área funcionalmente prescindible de la proteína de direccionamiento, por ejemplo entre dos dominios funcionales de anticuerpo de una sola cadena, utilizando métodos comúnmente conocidos de manipulación genética.
[0037] La Fig. 1, panel A, muestra las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de la etiqueta C4 fusionada genéticamente a una región de sitio de clonación múltiple en el plásmido de expresión típico mediante un conector G4S. Tal como se muestra en el panel A de la Fig. 1, la secuencia de ácidos nucleicos completa incluye elementos de control y transcripción (promotor de T7, operador lac, sitio de unión ribosómica, y similares), así como la secuencia de ácidos nucleicos de la etiqueta C4. Una secuencia conectora separa la secuencia de C4 de un sitio de clonación múltiple, que puede utilizarse para introducir ácidos nucleicos de interés que funcionarán como la proteína de direccionamiento. Un sitio de terminación de T7 completa el ácido nucleico de longitud completa. La Fig. 1, panel B, muestra una representación esquemática de un plásmido para la expresión bacteriana de proteínas recombinantes de fusión fusionadas con la etiqueta C4 mediante un conector G4S.
[0038] El grupo de direccionamiento del conjugado biológico puede ser una citoquina, quimoquina, factor de crecimiento, anticuerpo y fragmentos del mismo, enzima, y combinaciones de los mismos que puedan resultar útiles en diversas aplicaciones biomédicas o industriales. La parte de grupo de unión del conjugado biológico puede ser cualquier sustancia o superficie que pueda unirse covalentemente al grupo tiol de C4 del grupo de direccionamiento o al grupo funcional de la proteína adaptadora en el conjugado de adaptador/grupo de direccionamiento. Entre los ejemplos de grupos de unión útiles se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, fármacos, radionucleidos quelantes, polietilenglicol, pigmentos, lípidos, liposomas y superficies seleccionadas.
[0039] Entre los radionucleidos quelantes se incluyen compuestos tales como hidrocloruro de 5-maleimido-2hidraziniopiridina (HYNIC) para la carga con radionucleido de formación de imágenes o terapéutico. El polietilenglicol resulta útil para enlentecer la eliminación sanguínea de la proteína, y puede utilizarse en una forma derivatizada (por ejemplo modificado con maleimida o vinilsulfona) o no derivatizada. Entre los pigmentos útiles se incluyen, por ejemplo, el pigmento cianina Cy5.5, para la formación de imágenes fluorescentes en el infrarrojo cercano. Las superficies que pueden unirse al grupo tiol de C4 del grupo de direccionamiento o a un grupo funcional de la proteína adaptadora en el conjugado de adaptador/grupo de direccionamiento incluyen las superficies de una nanopartícula o micropartícula, la superficie de un dendrímero, las superficies de andamiajes de cultivo de tejidos, dispositivos biomédicos, y biosensores. Se entiende que, en el caso de que una entidad de unión incluya una superficie, puede utilizarse sin modificación,
o pueden depositarse otros grupos químicos sobre la superficie mediante métodos conocidos de la técnica. Estos grupos químicos pueden utilizarse además para la modificación con reactivos bifuncionales que permitan la conjugación con la etiqueta C4 o con una proteína adaptadora mediante métodos conocidos de la técnica.
[0040] En una realización de la presente invención, el conjugado biológico presenta un enlace covalente entre el grupo tiol del péptido C4 (SEC ID nº 2) y un grupo funcional natural en el grupo de unión. De esta manera, se contempla que el grupo tiol del péptido C4 reaccione químicamente de manera directa con un grupo reactivo en el grupo de unión, de manera que se forme un enlace covalente estable. En realizaciones alternativas, el grupo reactivo que reacciona con el grupo tiol del péptido C4 puede introducirse artificialmente, por ejemplo mediante la utilización de agentes de entrecruzamiento bifuncionales conocidos de la técnica. Por ejemplo, puede introducirse un grupo maleimida en polietilenglicol o un lípido, y utilizarse para la reacción con el grupo tiol del péptido C4.
[0041] En una realización alternativa, el conjugado biológico de la presente invención incluye un grupo de unión que comprende una proteína adaptadora unida covalentemente al grupo de direccionamiento. En general, la proteína adaptadora es una ARNasa I mutante humana o un fragmento de la misma que incluye cisteína en la posición 118 (Cys118). Entre los ejemplos de proteínas adaptadoras que resultan útiles en la presente invención se incluyen proteínas que presentan las secuencias polipeptídicas mostradas en SEC ID nº 16, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20 y SEC ID nº 22, que se describen en mayor detalle posteriormente.
[0042] Cuatro realizaciones particularmente preferentes de proteína adaptadora capaz de formar un enlace disulfuro con un residuo de C4 en la etiqueta de C4 se muestran en la Fig. 2, en la que el panel A proporciona una representación esquemática de la conjugación específica de sitio entre la proteína recombinante de fusión etiquetada con C4 y una proteína adaptadora complementaria. La Fig. 2, panel B, muestra una representación esquemática de una familia de proteínas adaptadoras basada en la ARNasa I humana mutante V118C T24N. La primera realización es un fragmento de la ARNasa I humana mutante V118C T24N denominado HuS(C118) (SEC ID nº 15 y 16). Pueden utilizarse grupos aminos de HuS(C118) para la conjugación con diversas entidades utilizando métodos conocidos de la técnica antes de la conjugación específica de sitio de HuS(C118) con proteínas etiquetadas con C4. La segunda realización es un fragmento de la ARNasa I humana mutante V118C T24N que contiene la sustitución N88C denominada HuS(C88,C118) (SEC ID nº 17 y 18). El grupo tiol de C88 en HuS(C88,C118) puede utilizarse para la conjugación con diversas entidades utilizando métodos conocidos de la técnica tras la conjugación específica de sitio de HuS(C88,C118) con proteínas etiquetadas con C4. La tercera y cuarta realizaciones se basan en una ARNasa-BH quimérica que contiene un fragmento de 1 a 29 aminoácidos de la ARNasa A bovina que difere del fragmento correspondiente de la ARNasa humana en cada posición y un fragmento de 30 a 127 aminoácidos de la ARNasa I humana (Gaynutdinov et al., 2003). La tercera realización es el mutante V118C de la BH-ARNasa que contiene las sustituciones F8A y Q11P denominado BHR(A8,P11,C118) (SEC ID nº 19 y 20), que no requiere la eliminación de 20 residuos aminoácidos N-terminales antes de la conjugación específica de sitio con proteínas etiquetadas con C4. Pueden derivatizarse grupos amino de BHR(A8,P11,C118) con diversas entidades utilizando métodos conocidos de la técnica antes de la conjugación específica de sitio de HuR(A8,P11,C118) con proteínas etiquetadas con C4. La cuarta realización es la BH-ARNasa mutante V118C, que contiene A8, P11 y C88, denominada BHR(A8,P11,C88,C118) (SEC ID nº 21 y nº 22), que no requiere la eliminación de 20 residuos aminoácidos N-terminales antes de la conjugación específica de sitio con proteínas etiquetadas con C4. El grupo tiol C88 en BHR(A8,P11,C88,C118) puede utilizarse para la conjugación con diversas entidades utilizando métodos conocidos de la técnica tras la conjugación específica de sitio de BHR(A8,P11,C88,C118) con proteínas etiquetadas con C4. Utilizando métodos conocidos de la técnica resulta fácil construir otras proteínas adaptadoras basadas en la ARNasa I humana capaces de conjugación específica de sitio con proteínas etiquetadas con C4 y que proporcionan plataformas convenientes para la derivatización con diversas entidades. El experto en la materia apreciará que pueden utilizarse otras proteínas adaptadoras basadas en la ARNasa I humana además de las explícitamente indicadas en la presente memoria. Por ejemplo, el experto en la materia apreciará que pueden construirse proteínas adaptadoras basándose en otras ribonucleasas, por ejemplo la ARNasa A bovina, con la condición de que dichas proteínas adaptadoras conserven la capacidad de formar conjugados con la etiqueta C4, o con etiquetas similares basadas en fragmentos N-terminales de otras ribonucleasas.
[0043] El panel C en la Fig. 2 proporciona evidencia de que la conjugación de C4-VEGF y HuS(C118) mediante un enlace disulfuro conduce a la aparición de nuevas bandas de proteínas sensibles a DTT en las muestras denominadas HuS-C4-VEGF en el gel de SDS-PAGE correspondientes a la conjugación de uno o dos adaptadores HuS(C118) con etiquetas C4 en una molécula dimérica de C4-VEGF. El panel D proporciona evidencia de que la actividad ribonucleasa se reconstituye tras la formación del conjugado químico, pero no tras la mezcla física de la proteína adaptadora HuS(C118) con la proteína de fusión recombinante etiquetada con C4 (panel D).
[0044] La proteína adaptadora puede derivatizarse con una diversidad de materiales funcionales para conseguir un resultado deseado. Por ejemplo, en una realización, la proteína adaptadora puede derivatizarse con un pigmento, tal como el pigmento Cy5.5 para la formación de imágenes ópticas, o con un lípido para asociar la proteína adaptadora con un liposoma que actúa como un portador para compuestos terapéuticos, diagnósticos o de investigación. En una realización, los liposomas pueden transportar o cargar doxorubicina ("DOXIL").
[0045] Los conjugados biológicos pueden combinarse con portadores farmacéuticamente aceptables para producir composiciones farmacéuticas para administrar selectivamente compuestos terapéuticos, de investigación o diagnósticos en una diana de un paciente. Dicha composición farmacéutica puede administrarse en un paciente, y permitirse que el conjugado biológico entre en contacto con la diana con el fin de administrar el compuesto en la diana en el paciente. En estas realizaciones, entre los portadores farmacéuticamente aceptables útiles se incluyen materiales tales como agua, gelatina, lactosa, almidón, estearato de magnesio, talco, aceites vegetales, gomas, alcohol, vaselina o similares. La preparación farmacéutica de la invención debería incluir una cantidad del conjugado biológico que resulte efectiva para la actividad deseada. La dosis efectiva dependerá de la actividad del conjugado biológico particular utilizado y de esta manera se encuentra comprendida dentro de los conocimientos del experto ordinario en la materia la determinación para cualquier huésped mamífero particular u otro organismo huésped.
[0046] En general, se combina una cantidad farmacéuticamente efectiva del conjugado biológico de un modo convencional con el portador farmacéuticamente aceptable para producir la composición farmacéutica. La composición farmacéutica de la invención preferentemente se administrar internamente, por ejemplo intravenosamente, en forma de preparaciones farmacéuticas convencionales, por ejemplo en excipientes farmacéuticamente aceptables entéricos o parenterales convencionales que contiene portadores inertes orgánicos y/o inorgánicos tal como se ha indicado anteriormente. Las preparaciones farmacéuticas pueden encontrarse en formas sólidas convencionales, por ejemplo tabletas, grageas, supositorios, cápsulas o similares, o formas líquidas convencionales, tales como suspensiones, emulsiones o similares. Si se desea, pueden esterilizarse y/o contener adyuvantes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes, agentes estabilizadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes, tampones, o sales utilizadas para el ajuste de la presión osmótica. Las preparaciones farmacéuticas también pueden contener otros materiales terapéuticamente activos.
EJEMPLOS
[0047] Los Ejemplos siguientes pretenden ilustrar, aunque en modo alguno limitar, el alcance de la presente invención. Todas las partes y porcentajes se proporcionan en peso y todas las temperaturas se proporcionan en grados centígrados, a menos que se indique explícitamente lo contrario.
Ejemplo 1. Construcción y utilización de vectores de expresión que contienen C4 y un péptido conector.
- 1.
- Cepas bacterianas y plásmidos
[0048] E. coli cepa DH5α-T se encuentra disponible comercialmente de Invitrogen (USA). Las cepas de E. coli BI21(DE3) y NovaBlue se encuentran disponibles comercialmente de Novagen (USA). El vector de expresión bacteriana pET29a(+) se obtuvo de Novagen (USA). El plásmido pLen-121 que contiene la secuencia de ADN codificante de la isoforma de 121 residuos aminoácidos del VEGF humano ha sido descrito en la patente US nº 5.219.739, incorporada como referencia en su totalidad en la presente memoria, y se obtuvo del Dr. J. Abraham (Scios Nova, Inc., USA). El plásmido pPAP1-1.6, que contiene la secuencia de ADN codificante de la anexina V humana, se obtuvo del Dr. J. Tait (University of Washington School of Medicine, Seattle, WA). El plásmido pGEX-KG LF254, que contiene la secuencia de ADN codificante del fragmento N-terminal no tóxico del factor letal del ántrax (LFn), se obtuvo del Dr. S. Leppla (National Institute of Allergy and Infectious Diseases, NIH, Bethesda, MD).
- 2.
- Manipulaciones del ADN
[0049] Los enzimas de restricción y modificación utilizados en la presente invención se encuentran disponibles comercialmente en los Estados Unidos y se utilizaron siguiendo las instrucciones del fabricante. La preparación de células competentes, la transformación y el medio bacteriano siguieron Sambrook et al. (J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, 1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) o las instrucciones del fabricante. La purificación de los plásmidos se realizó utilizando minipreparaciones Wizard Plus SV o sistemas de purificación de ADN Maxipreps (Promega, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La purificación de los fragmentos de ADN a partir de los geles de agarosa se realizó utilizando el kit Geneclean Spin (Bio 101, USA) siguiendo las instrucciones del fabricante.
- 3.
- Construcción de vectores para la expresión de proteínas fusionadas con la etiqueta C4
[0050] El vector pET/Hu(G4S)3 para la expresión de las proteínas recombinantes con una etiqueta Hu N-terminal fusionada con el ORF de la proteína mediante una molécula conectora (G4S)3 se construyó tal como se encuentra descrito (Backer et al., 2004). La sustitución de aminoácidos R4C se introdujo en la etiqueta Hu del vector pET/Hu(G4S)3 mediante mutagénesis sitio-dirigida utilizando el kit de mutagénesis sitio-dirigida Gene-Tailor (Invitrogen). Se utilizaron los cebadores SEC ID nº 23 y SEC ID nº 24 para introducir la mutación R4C. El vector resultante se confirmó mediante secuenciación y se denominó pET/Hu-C4(G4S)3.
SEC ID nº 23: 5'-ATATACATATGAAAGAATCTTGCGCTAAAAAATTTC
SEC ID nº 24: 5'-AGATTCTTTCATATGTATATCTCCTTCTTAAAGTT
[0051] Se amplificó el ADN codificante de C4-G4S mediante PCR utilizando el vector de ADN pET/HuC4(G4S)3 como molde, un cebador de sentido SEC ID nº 25 introduciendo el sitio XbaI, y un cebador antisentido SEC ID nº 26 introduciendo el sitio NcoI. La inserción se clonó en el vector pET29a(+) cortado con XbaI y NcoI. El vector resultante se confirmó mediante secuenciación y se denominó pET/Hu-C4-G4S.
SEC ID nº 25: 5'-GGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC
SEC ID nº 26: 5'-ACTACCCATGGAACCGCCGCCACCAGAGTCCATG
4. Subclonación de fragmentos de ADNc codificantes de proteínas de interés en los vectores pET/HuC4(G4S)3 y pET/Hu-C4-G4S
[0052] Los ADNs de los vectores pET/Hu-C4(G4S)3 y pET/Hu-C4-G4S se cortaron separadamente con NcoI y se desfosforilaron. Todos los fragmentos de ADN que debían clonarse en los vectores anteriormente indicados se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores, introduciendo sitios NcoI en ambos extremos de los fragmentos de ADN amplificados. El ADN codificante de la isoforma de 121 aminoácidos del VEGF humano se amplificó a partir del plásmido pLen-121 de ADN utilizando los cebadores SEC ID nº 27 y SEC ID nº 28. El ADN codificante de un fragmento N-terminal de 1 a 254 aminoácidos de longitud del factor letal del ántrax (LFn) se amplificó a partir del plásmido de ADN pGEX-KG LF254 utilizando los cebadores SEC ID nº 29 y SEC ID nº 30. El ADN codificante de la anexina V humana se amplificó a partir del plásmido pPAP1-1.6 utilizando los cebadores SEC ID nº 31 y SEC ID nº 32. Cada fragmento de ADN amplificado se cortó con NcoI, se purificó y se clonó en los sitios NcoI de los vectores pET/Hu-C4(G4S)3 y pET/Hu-C4-G4S. Los clones con orientaciones correctas del ORF clonado se seleccionaron mediante PCR utilizando un cebador de sentido basado en un promotor de T7, y se confirmaron mediante secuenciación:
SEC ID nº 27: 5'-CACAAGCCATGGCACCCATGGCAGAAGGAGGA
SEC ID nº 28: 5'-ACTACCCATGGTCACCGCCTCGGCTTGTCAC
SEC ID nº 29: 5'-CTGCTCCATGGGAGCGGGCGGTCATGGTGATG
SEC ID nº 30: 5'-ACTACCCATGGCTATAGATT
TATTTCTTGTTCGTTAAATTTATC
SEC ID nº 31: 5'-CACAAGCCATGGCACAGGTTCTCAGAG
SEC ID nº 32: 5'-ACTACCCATGGTTAGTCATCTTCTCCACAGAGC
5. Expresión y purificación de proteínas de fusión recombinante con etiqueta C4.
[0053] Todas las proteínas se expresaron en E. coli BL21(DE3) cultivado en medio LB (Q-Biogen, Carlsbad, CA). Se indujo la expresión con IPTG 1 mM a una densidad óptica de entre 0,5 y 0,7 a 600 nm. Tras la inducción, los cultivos se cultivaron durante 2,5 a 3 horas a 37ºC bajo agitación a 300 rpm; a continuación se recolectaron mediante centrifugación y se lisaron utilizando EmulsiFlex-C5 (Avestin, Ottawa, Canada).
[0054] Se expresó C4-VEGF en forma insoluble y se purificó de la manera siguiente: se solubilizaron los cuerpos de inclusión en urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Na2SO3 80 mM, Na2S4O6 10 mM, DTT 10 mM, se incubaron durante 6 a 8 horas a 4ºC bajo agitación; después se suplementaron con Tris[2carboxietil]fosfina 2,5 mM (Pierce) y se incubaron durante 16 a 18 horas a 4ºC. La proteína solubilizada se replegó mediante una diálisis en tres etapas: en primer lugar, 10 a 12 horas a 4ºC en 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, urea 2 M, arginina 0,5 M, glutatión reducido 1 mM, glutatión oxidado 0,4 mM; en segundo lugar, 24 horas a 4ºC en 50 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0; en tercer lugar, 24 horas a 4ºC en 50 volúmenes de NaOAc 20 mM (pH 5,5). Tras la diálisis, la solución se clarificó mediante centrifugación (15.000xg durante 20 minutos) y se purificó el C4-VEGF mediante cromatografía en heparina HP sefarosa (columnas pre-empaquetadas de 1 ml, Amersham). Para la conjugación, el grupo tiol de C4 en C4-VEGF se desprotegió mediante tratamiento suave con DTT utilizando un exceso de DTT de 1,2 molar a 34ºC durante 45 minutos.
[0055] Para minimizar la implicación potencial del residuo cisteína presente en la posición 116 en el VEGF121 nativo, los inventores prepararon una versión de C4-VEGF truncado en la posición 112 utilizando métodos conocidos de la técnica. La proteína truncada contenía 110 aminoácidos (un fragmento de 3 a 112 aminoácidos de VEGF121) y por lo tanto se denominó C4-VEGF110. El C4-VEGF110 se expresó y se purificó tal como se ha indicado anteriormente y mostró actividades similares a las de C4-VEGF en ensayos de cultivo de tejidos.
[0056] Para optimizar adicionalmente el VEGF etiquetado con C4, los inventores construyeron un VEGF de una sola cadena fusionado con un único péptido etiqueta C4 mediante un péptido conector G4S (C4-scVEGF). En general, la manipulación, expresión, replegamiento y purificación de las proteínas monoméricas resulta más simple que las de las proteínas oligoméricas, o incluso diméricas, tales como las isoformas nativas del VEGF. Además, se diseñó el scVEGF para evitar la formación de monómeros inactivos del VEGF que habitualmente se encuentran presentes en las preparaciones de VEGF dimérico, para simplificar cualquier re-manipulación proteica del VEGF, para simplificar la expresión, replegamiento y purificación, y para simplificar la conjugación de los grupos de unión a una única etiqueta C4. En primer lugar, se cortó el vector de ADN pET/Hu-C4-G4S con BamHI y se desfosforiló. El ADN codificante de un fragmento de 3 a 112 aminoácidos de longitud del VEGF humano se amplificó a partir del plásmido pLen-121 utilizando un cebador de sentido (SEC ID nº 33) introduciendo el sitio BamHI inmediatamente cadena arriba del codón 3 del VEGF, e introduciendo un cebador antisentido (SEC ID nº 34) un codón de parada inmediatamente cadena abajo del codón 112 del VEGF y un sitio BamHI inmediatamente después del codón de parada. El fragmento de ADN amplificado se purificó, se cortó con BamHI, y se clonó en el sitio BamHI del vector pET/Hu-C4-G4S. Se seleccionó la orientación correcta del ORF clonado mediante PCR utilizando un cebador de sentido basado en el promotor de T7. El plásmido de ADN purificado a partir de los clones seleccionados se confirmó mediante secuenciación y se denominó pET/C4(G4S)VEGF110.
SEC ID nº 33: 5'-CACGGATCCGGTGGCGGCGGTAGTGGT SEC ID nº 34: 5'-CACGGATCCTCATCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC
[0057] El vector de ADN pET/C4(G4S)VEGF110 se cortó con NcoI y se desfosforiló. Se amplificó el ADN codificante del fragmento de 3 a 112 aminoácidos del VEGF humano a partir del plásmido pLen-121 mediante PCR utilizando un cebador de sentido (SEC ID nº 35) introduciendo el sitio NcoI inmediatamente cadena arriba del codón 3 del VEGF, e introduciendo el cebador antisentido (SEC ID nº 36) una citosina inmediatamente cadena abajo del codón 112 del VEGF (para compensar el desplazamiento del ORF), y un sitio NcoI inmediatamente después de la citosina introducida. El fragmento de ADN amplificado se purificó, se cortó con NcoI y se clonó en el sitio NcoI del vector pET/C4(G4S)VEGF110. Se seleccionaron los clones con dos copias de VEGF110 mediante PCR utilizando un cebador de sentido basado en el promotor de T7 y un cebador antisentido basado en el terminador de T7. El ADN aislado a partir de cuatro clones seleccionados aleatoriamente se secuenció y para la propagación se seleccionó un clon que contenía un tándem de VEGF110 con una orientación de VEGF110 de cabeza con cola. El plásmido seleccionado, denominado pET/C4(G4S)scVEGF se transformó en células E. coli cepa BL21(DE3) competentes para la expresión de las proteínas.
SEC ID nº 35: 5'-CACAAGCCATGGCACCCATGGCAGAAGGAGGA
SEC ID nº 36: 5'-ACTACCCATGGCTCTTGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC
[0058] El C4-scVEGF se expresó y se purificó tal como se ha indicado anteriormente, y mostraba actividades similares a las del C4-VEGF en ensayos de cultivo de tejidos. Se recuperó C4-scVEGF con ~50% de los grupos tiol de C4 disponibles para la conjugación. Para la conjugación, se desprotegió el grupo tiol de C4 en C4-VEGF mediante tratamiento suave con DTT utilizando 0,5 equivalentes molares de DTT.
[0059] Se expresó C4-LFn en una forma citoplasmática soluble y se purificó de la manera siguiente: se dializó la parte soluble del lisado bacteriano frente a 200 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, durante 20 horas a 4ºC, se clarificó mediante centrifugación (15.000g durante 20 minutos), y se pasó a través de una columna de sefarosa-Q FF. Las fracciones que contenían C4-LFn se agruparon, se dializaron frente a 100 volúmenes de NaOAc 20 mM, pH 6,5, durante 20 horas a 4ºC, y se purificaron en heparina-sefarosa-HP, seguido de cromatografía de interacción hidrofóbica en butil-sefarosa FF (columnas pre-empaquetadas de 1 ml, Amersham). El rendimiento de C4-LFn fue de entre 8 y 10 mg/l, pureza >98% mediante SDS-PAGE, seguido de tinción segura SimplyBlue (Invitrogen).
[0060] Se purificó la C4-anexina tal como se ha descrito para Hu-anexina (Backer et al., 2004). Dependiendo de la naturaleza de la molécula conectora, y la proteína, se encuentra implicado un residuo cisteína en la etiqueta C4 en grado variable en componentes mixtos de disulfuro y redox del tampón de replegamiento. En caso necesario, los residuos cisteína pueden desprotegerse con DTT bajo condiciones que se optimizan para cada proteína C4.
6. Construcción y expresión de proteínas adaptadoras.
[0061] 6.1. Se construyó una ARNasa-127H-1-29B/30 quimérica (BH-ARNasa) que comprendía un fragmento de 1 a 29 aminoácidos de la ARNasa A bovina y un fragmento de 30 a 127 aminoácidos de la ARNasa I humana, y se expresó y se purificó tal como se ha descrito (Gaynutdinov et al., 2003). Se introdujo la mutación V118C en el plásmido de ADN pET29/1-29B-127H-ARNasa mediante mutagénesis sitio-dirigida utilizando el kit de mutagénesis dirigida Gene-Tailor (Invitrogen) y los cebadores SEC ID nº 37 y SEC ID nº 38. Se confirmó la sustitución de VC118 mediante secuenciación; la proteína se denominó BH-ARNasa(C118). Se expresó la BH-ARNasa(C118) y se purificó tal como se ha descrito para la BH-ARNasa de tipo salvaje (Gaynutdinov et al., 2003). La presencia de un grupo tiol reactivo se sometió a ensayo mediante reacción con el reactivo tiol N-(1-pireno)-maleimida (Molecular Probes, Eugene, OR) seguido de análisis de RP-HPLC tal como se ha descrito (Backer et al., 2000). La proteína adaptadora HuS(C118) se obtuvo mediante digestión limitada de la BH-ARNasa(C118) con subtilisina (Sigma) tal como se ha descrito para la BH-ARNasa (Gaynutdinov et al., 2003).
SEC ID nº 37: 5'-AAGGCTCTCCGTACGTTCCGTGTCATTTCGACGCG
SEC ID nº 38: 5'-CGGAACGTACGGAGAGCCTTCGCATGCAAC
6.2. HuS(C88,C118)
[0062] Se introdujo la mutación N88C en el plásmido de ADN pET29/1-29B/30-127H-ARNasa(V118C) mediante mutagénesis sitio-dirigida utilizando los cebadores SEC ID nº 39 y SEC ID nº 40). La sustitución N88C se confirmó mediante secuenciación y la proteína se denominó BH-ARNasa(C88,C118). La BHARNasa(C88,C118) se expresó, se purificó y se digirió con subtilisina, rindiendo proteína adaptadora HuS(C88,C118) tal como se ha indicado anteriormente para la BH-ARNasa(C118).
SEC ID nº 39: 5'-TCACTGACTGCCGTCTTACTTGCGGATCCCGTT
SEC ID nº 40: 5'-AGTAAGACGGCAGTCAGTGATATGCATAGAA 6.3. HuR(A8,P11,C118)
[0063] Las mutaciones Q11P y F8A se introdujeron en consecuencia en el plásmido de ADN pET29/129B/30-127H-ARNasa(V118C) mediante mutagénesis sitio-dirigida utilizando los cebadores SEC ID nº 41 a 44, respectivamente. Ambas sustituciones se confirmaron mediante secuenciación y la proteína se denominó BH-ARNasa(A8,P11,C118). Se expresó la BH-ARNasa(A8,P11,C118) y se purificó tal como se ha indicado anteriormente para la BH-ARNasa(C118).
SEC ID nº 41: 5’- GCAGCCAAGTTTGAGCGGCCGCACATGGACTC
SEC ID nº 42: 5’- GCCGCTCAAACTTGGCTGCTGCAGTTTCCTT
SEC ID nº 43: 5’- GGAAACTGCAGCAGCCAAGGCTGAGCGGCCGC
SEC ID nº 44: 5’- CTTGGCTGCTGCAGTTTCCTTCATATGTATAT
7. Construcción y expresión de proteínas utilizadas en los ensayos.
7.1. SLT-VEGF.
[0064] El plásmido pET/VEGF121-SLT/L codificante de la proteína de fusión SLT-VEGF que portaba la etiqueta S N-terminal y la etiqueta His ha sido descrita anteriormente (Backer y Backer, 2001). Se amplificó la secuencia codificante de ADN de SLT-VEGF mediante PCR a partir del plásmido de ADN pET/VEGF121SLT/L utilizando cebadores (SEC ID nº 45) que introducían el sitio NdeI (SEC ID nº 46) y el sitio XhoI. El producto purificado mediante PCR se cortó con restrictasas NdeI y XhoI, se purificó y se clonó en los sitios NdeI-XhoI del vector pET29a(+) (Novagen). El plásmido resultante se confirmó mediante secuenciación y se denominó pET29/SLT-VEGF. Se expresó SLT-VEGF en BL21(DE3) tal como se ha indicado anteriormente para las proteínas portadoras de C4, y se purificó de la manera siguiente: los cuerpos de inclusión se solubilizaron en urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Na2SO3 80 mM, Na2S4O6 10 mM, DTT 10 mM y se incubaron durante 6 a 8 horas a 4ºC bajo agitación; después se suplementaron con Tris[2carboxietil]fosfina 5 mM (Pierce) y se incubaron durante 16 a 18 horas a 4ºC. Las proteínas solubilizadas se replegaron mediante una diálisis en tres etapas: en primer lugar, durante 8 a 10 horas a 4ºC en 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, urea 2 M, arginina 0,5 M, glutatión reducido 1 mM, glutatión oxidado 0,4 mM; en segundo lugar, 24 horas a 4ºC en 100 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, NP-40 al 0,01%, y en tercer lugar, 24 horas a 4ºC en 100 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 20 mM. Tras la diálisis, la solución se clarificó mediante centrifugación (15.000xg durante 20 minutos) y se purificó el SLT-VEGF mediante cromatografía en sefarosa Q HiTrap (columnas pre-empaquetadas de 1 ml, Amersham).
SEC ID nº 45: 5'-AAAAACATATGAAGGAATTTACCTTAGACTTCTCG
SEC ID nº 46: 5'-TACTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCAC
- 7.2.
- Hu-VEGF.
[0065] Se construyó la proteína de fusión Hu-VEGF121 que portaba una etiqueta Hu de tipo salvaje N-terminal tal como se ha descrito en Backer et al., 2003. Se expresó Hu-VEGF121 y se replegó a partir de cuerpos de inclusión tal como se ha indicado anteriormente para C4-VEGF, con las modificaciones siguientes: el replegamiento a partir de cuerpos de inclusión se realizó mediante una diálisis en dos etapas: durante 8 a 10 horas a 4ºC en 10 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, urea 2 M, arginina 0,5 M, glutatión reducido 1 mM y glutatión oxidado 0,4 mM; en segundo lugar, 24 horas a 4ºC en 50 volúmenes de Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Además, para la purificación final de Hu-VEGF121, se llevó a cabo una cromatografía en SP-sefarosa FF HiTrap seguido de heparina-HP-sefarosa (columnas pre-empaquetadas de 1 ml, Amersham).
- 8.
- Actividades funcionales de proteínas de fusión recombinantes con etiqueta C4.
[0066]
A. Actividad de VEGF. Se sometieron a ensayo las actividades funcionales del VEGF y los conjugados basados en VEGF en dos ensayos. En el primer ensayo, se llevó a cabo la estimulación de la autofosforilación de VEGFR-2 de la manera siguiente: se trasladaron células 293/KDR prácticamente confluyentes tras ayuno durante la noche (DMEM/FBS al 0,5%) a DMEM sin suero con vanadato sódico 0,5 mM, durante 20 minutos a 37ºC; después se estimularon con VEGF durante 10 minutos a 37ºC, se lisaron y se analizaron mediante transferencia western utilizando conjugado antifosfotirosina RC20:HRPO (BD Transduction Labs, USA). En el segundo ensayo, se llevó a cabo la protección de las células 293/KDR frente al efecto citotóxico de SLTVEGF de la manera siguiente. Se sembraron células 293/KDR en placa de 96 pocillos 20 horas antes del experimento, 1.000 células/pocillo. Se mezclaron con SLT-VEGF cantidades variables de VEGF o conjugados basados en medio VEGF de cultivo completo y se añadieron a las células en pocillos por triplicado a una concentración final de SLT-VEGF de 1 nM. Las células viables se cuantificaron 96 horas después utilizando el kit de proliferación celular acuoso de una solución CellTiter 96® (Promega, USA).
B. Actividad de la anexina V. Se sometieron a ensayo las actividades funcionales de la C4-anexina y la HuSC4-anexina a partir de su capacidad de competir con FITC-anexina (Sigma) para la unión a eritrocitos que expresaban fosfatidilserina procedentes de sangre humana estabilizada (4C Plus Cell Control, Beckman Coulter, USA) tal como se ha descrito (Tait et al., 1995). Brevemente, se incubaron diez millones de eritrocitos (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 136 mM, CaCl2 2,5 mM) durante 15 minutos a TA. Las células se peletizaron, se resuspendieron en un tampón de unión suplementado con EDTA 5 mM, y se peletizaron nuevamente. Se midió la fluorescencia de FITC-anexina en los sobrenadantes a λex 485 nm/λem 520 nm.
C. Actividad del LFn. Se sometieron a ensayo C4-LFn y Hus-C4-LFn para su capacidad de proteger las células RAW frente a los efectos citotóxicos del LF de longitud completa en presencia de AP. Se sembraron células RAW264.7 en placas de 96 pocillos, 15x103 células/pocillo, 20 horas antes del experimento. Se mezclaron cantidades variables de LFn, C4-LFn o Hus-C4-LFn con LF y AP (List Biological, USA) en medio de cultivo DMEM completo, y se añadieron a células en pocillos por triplicado a concentraciones finales de 2 nM de AP y 0,2 nM de LF. Tras 2,5 horas de incubación a 37ºC en 5% de CO2, se determinaron los números de células viables mediante el kit de ensayo de proliferación celular acuoso de una solución CellTiter 96® (Promega).
9. Líneas celulares.
[0067] Las células renales embrionarias transformadas humanas HEK293 (CRL-1573) y los monocitos de ratón RAW 264.7 (TIB-71) se obtuvieron de la American type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Las células 293/KDR que expresaban 2,5x106 VEGFR-2/célula fueron desarrollados por SibTech, Inc. (Newington, CT; Backer y Backer, 2001a). Todas las células se mantuvieron en DMEM (Life Technologies, USA) suplementado con suero de feto bovino al 10% (Gemini, USA), glutamina 2 mM (Life Technologies, USA) y penicilina-estreptomicina (Life Technologies, USA) a 37ºC, 5% de CO2.
Ejemplo 2: conjugación específica de sitio de proteínas etiquetadas con C4 con proteína adaptadora HuS(C118).
[0068] El protocolo incluía la conjugación específica de sitio de proteínas etiquetadas con C4 con la proteína adaptadora HuS(C118) y el ensayo de las actividades funcionales de los conjugados en cultivo de tejido.
[0069] Se mezclaron HuS(C118) preparado tal como se ha indicado anteriormente y proteínas etiquetadas con C4, tal como C4-VEGF, o C4-anexina, o C4-LFn, en un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, se incubó a 4ºC durante 16 horas, y después se analizó mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras y no reductoras. El análisis SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras reveló nuevos productos proteicos formados en las mezclas durante la incubación (fig. 2C, carriles sin DTT). Los pesos moleculares de las proteínas en estas bandas correspondían al peso molecular de conjugados que portaban una o dos moléculas de HuS por cada proteína parental, respectivamente. Bajo condiciones reductoras, estas bandas desaparecieron, y únicamente eran detectables las bandas correspondientes a las proteínas parentales y HuS(C118) de 12 kDa (fig. 2C, carriles con adición de DTT). Los conjugados se purificaron en primer lugar en una columna de péptido Hu para eliminar el HuS(C118) libre y, en caso necesario, mediante cromatografía de intercambio iónico para eliminar las proteínas parentales libres.
[0070] Se sometieron a ensayo las actividades funcionales de los conjugados en ensayos de cultivo de tejidos indicados anteriormente. La actividad del conjugado HuS-C4-VEGF era similar a la del C4-VEGF en la inducción de la autofosforilación de tirosinas del VEGFR-2 en células 293/KDR (Fig. 3, panel A). El conjugado HuS-C4-anexina era activa en competencia con FITC-anexina para la unión a los eritrocitos que expresaban fosfatidilserina procedentes de sangre humana estabilizada con una IC50 de 11+3 nM por conjugado frente a una IC50 de 9+4 nM para la anexina V recombinante según informa Tait et al., 1995 (Fig. 3, panel B). HuS-C4LFn era tan activo como C4-LFn en la protección de las células RAW 264.7 proporcionada por LF en presencia de AP (Fig. 3, panel C). Conjuntamente, estos datos indican que la conjugación de proteína adaptadora a diferentes proteínas etiquetadas con C4 no destruye su actividad.
Ejemplo 3: conjugación específica de sitio de C4-VEGF y C4-scVEGF al radionucleido quelante, hidrocloruro de 5-maleimido-2-hidraziniopiridina.
[0071] El protocolo incluía la conjugación específica de sitio de C4-VEGF y C4-scVEGF al radionucleido quelante químicamente activo hidrocloruro de 5-maleimido-2-hidraziniopiridina (Solulink, San Diego, CA) y someter a ensayo el conjugado en clutivo de tejidos.
[0072] Se mezcló C4-VEGF, preparado tal como se ha indicado anteriormente, con dimetilformamida disuelta en hidrocloruro de 5-maleimido-2-hidraziniopiridina, en lo sucesivo denominado HYNIC, en la proporción molar HYNIC/proteína de 3:1 en un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. El producto, denominado HYNIC-C4-VEGF, se purificó en una columna PD-10 (Amersham, USA) equilibrada con tricina 0,114 M, pH 6,9. Se utilizó una RP-HPLC analítica (Fig. 4, panel A) para determinar la concentración de proteína mediante detección de la densidad óptica a 216 nm y la concentración de HYNIC mediante la detección de la densidad óptica a 310 nm. Bajo las condiciones seleccionadas, la proporción de HYNIC a C4-VEGF en HYNIC-C4-VEGF purificado era de ~1.
[0073] Se conjugó C4-scVEGF, preparado tal como se ha indicado anteriormente, con HYNIC, y se purificó tal como se ha indicado anteriormente, y la proporción de HYNIC a C4-scVEGF en el producto purificado denominado HYNIC-C4-VEGF era de ~1.
[0074] Se sometió a ensayo la actividad funcional del grupo VEGF en HYNIC-C4-VEGF y HYNIC-C4-scVEGF en dos ensayos de cultivo de tejidos tal como se ha indicado anteriormente: inducción de la autofosforilación de las tirosinas del VEGFR-2 en células 293/KDR (Fig. 4, panel B) y protección de las células 293/KDR frente a la actividad citotóxica de SLT-VEGF (Fig. 4, panel C). En ambos ensayos las actividades de HYNIC-C4VEGF y HYNIC-C4-scVEGF eran comparables a las del C4-VEGF no modificado, indicando que la conjugación de C4-VEGF o de C4-scVEGF con HYNIC no destruía la actividad de la proteína.
Ejemplo 4. Conjugación específica de sitio de C4-VEGF con polietilenglicol.
[0075] El protocolo incluía la conjugación específica de sitio de C4-VEGF110 con polietilenglicol funcionalizado con grupo maleimida químicamente activo (Nektar Therapeutics) y el ensayo del conjugado en cultivo de tejidos.
[0076] Se mezcló C4-VEGF110, preparado tal como se ha indicado anteriormente, con maleimidapolietilenglicol (PEG) de 20 kDa ó 40 kDa a una proporción de PEG a proteína de 3:1 y se incubó durante una hora a temperatura ambiente en un tampón que contenía Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Los productos, denominados PEG20-C4-VEGF y PEG40-C4-VEGF, se purificaron a partir de C4-VEGF no reaccionado y PEG mediante filtración en gel HPLC en una columna equilibrada con Tris-HCl 20 mM, pH 8,0. Se utilizó una RP-HPLC analítica para determinar la concentración de proteína mediante detección de la densidad óptica a 216 nm. El análisis de transferencia western de los productos VEGF PEGilados reducidos con anticuerpo contra VEGF reveló una banda correspondiente a una masa molecular aparente de 55 kDa y una banda de intensidad aproximadamente igual correspondiente a monómero VEGF no modificado (Fig. 5, panel A), indicando en que la mayor parte de los dímeros de VEGF, únicamente se había conjugado una etiqueta C4 con PEG.
[0077] Se sometió a ensayo la actividad funcional de PEG-C4-VEGF en ensayo de cultivo de tejidos de la inducción de la autofosforilación de las tirosinas de VEGFR-2 en células 293/KDR (Fig. 5, panel B para PEG40-C4-VEGF). En este ensayo las actividades de PEG-C4-VEGF eran comparables a las del C4-VEGF no modificado, indicando que la conjugación específica de sitio de C4-VEGF con polietilenglicol no destruía la actividad de la proteína.
Ejemplo 5. Conjugación específica de sitio del pigmento cianina Cy5.5 con el conjugado HuS-C4-VEGF.
[0078] El protocolo incluía la preparación de HuS(C88,C118), su conjugación con C4-VEGF, la purificación del conjugado Hus-C4-VEGF resultante, y la conjugación de dicho conjugado con un pigmento cianina Cy5.5, rindiendo el conjugado denominado Cy5.5-Hus-C4-VEGF (Fig. 6, panel A). Con fines comparativos, C4-VEGF se modificó aleatoriamente con NHS-Cy5.5 en grupos amino hasta la proporción 1:1, o se modificó con maleimida-Cy5.5 en el residuo C4 en la etiqueta C4. Se sometieron a ensayo las actividades funcionales del grupo VEGF en todos los conjugados que contenían Cy5.5 en dos ensayos de cultivo de tejidos, tal como se ha indicado anteriormente: inducción de la autosfosforilación de las tirosinas de VEGFR-2 (Fig. 6, panel B), y protección de las células 293/KDR frente a la actividad citotóxica del SLT-VEGF (Fig. 6, panel C). En ambos ensayos sólo las actividades del conjugado Cy5.5-Hus-C4-VEGF eran comparables a las del C4-VEGF no modificado, subrayando la eficacia de utilizar una proteína adaptadora capaz de unirse a la etiqueta C4 para la derivatización de las proteínas.
[0079] Se sometió a ensayo la utilidad de Cy5.5-Hus-C4-VEGF para la obtención de imágenes en ratones Balb/c hembra que portaban tumores de adenocarcinoma mamario de ratón 4T1 subcutáneo. Las imágenes, obtenidas con un aparato KODAK Image Station 2000MM dotado de un filtro de paso de banda a 630 nm y un filtro de pase largo a 700 nm, indicaban que el conjugado Cy5.5-HuS-C4-VEGF se localizaba preferentemente en la periferia del tumor primario (Fig. 6, panel D). Esta localización preferente resultó inhibida en ratones pretratados con proteína SLT-VEGF, que destruye las células positivas para VEGFR-2 en los tumores (Backer et al., presentado para su publicación), indicando que la acumulación de conjugado Cy5.5-HuS-C4-VEGF en el tumor se encuentra mediado por receptor de VEGF y que puede utilizarse para la obtención de imágenes específicas de la vasculatura tumoral.
Ejemplo 6. Utilización de la etiqueta C4 y una proteína adaptadora unida covalentemente a esta etiqueta para la construcción de conjugados regulados por VEGF que contienen liposomas cargados de fármaco para la administración dirigida de fármacos.
[0080] El protocolo incluía la preparación de HuS(C118), su conjugación con PEG-lípido-maleimida, la inserción de HuS(C118) lipidado en liposomas cargados de doxorubicina, que conduce a un constructo estandarizado denominado Lip/HuS(C118) y la conjugación de este constructo con C4-VEGF, rindiendo Lip/HuS-C4-VEGF (Fig. 7, panel A). Se sometió a ensayo la actividad funcional del grupo VEGF en el conjugado Lip/Hus-C4-VEGF en un ensayo de cultivo de tejidos indicado anteriormente: la inducción de la fosforilación de tirosinas de VEGFR-2 en células 293/KDR (Fig. 7, panel B). En este ensayo, la actividad del VGF de los liposomas con Lip/Hus-C4-VEGF era comparable a la del C4-VEGF no modificado, subrayando la eficacia de utilizar una proteína adaptadora capaz de unirse a la etiqueta C4 para la derivatización de proteínas.
[0081] Una exposición de 15 minutos de células 293/KDR a Lip/HuS-C4-VEGF resultó en una inhibición dependiente de dosis del crecimiento celular (Fig. 7, panel C), mientras que cantidades equivalentes de liposomas cargadas con doxorubicina no dirigidos (disponibles comercialmente bajo el nombre comercial "DOXIL") derivatizados con HuS(C118) por sí solas no resultaron tóxicas para estas células, indicando la existencia de un mecanismo mediado por receptor de VEGF de citotoxicidad de los liposomas dirigidos con Lip/Hus-C4-VEGF. Este mecanismo se confirmó adicionalmente a partir de la capacidad del VEGF de inhibir la citotoxicidad de Lip/Hus-C4-VEGF de un modo dependiente de dosis (Fig. 7D).
Ejemplo 7. Utilización de la etiqueta C4 para la construcción de conjugados regulados por scVEGF que contienen liposomas cargados de fármaco para la administración dirigida de fármacos.
[0082] El protocolo incluía la preparación de C4-scVEGF, su conjugación con PEG-lípido-maleimida, y la inserción de C4-scVEGF lipidado en liposomas cargados de doxorubicina ("DOXIL") (Fig. 8, panel A). Se sometió a ensayo la actividad del grupo VEGF en el conjugado Lip/C4-scVEGF en un ensayo de cultivo de tejidos indicado anteriormente: la inducción de la fosforilación de tirosinas de VEGFR-2 en células 293/KDR (Fig. 8, panel B). En este ensayo, la actividad del VEGF de liposomas con Lip/C4-scVEGF era comparable a la del C4-VEGF no modificado, subrayando la eficacia de utilizar C4-scVEGF.
[0083] Una exposición de 15 minutos de las células 293/KDR a Lip/C4-scVEGF resultó en una inhibición dependiente de dosis del crecimiento celular (Fig. 8, panel C), mientras que cantidades equivalentes de liposomas no dirigidos cargados de doxorubicina ("DOXIL") no resultaron tóxicas para estas células, indicando la existencia de un mecanismo de citotoxicidad mediado por el receptor de VEGF de los liposomas dirigidos con Lip/C4-scVEGF. Este mecanismo se confirmó adicionalmente a partir de la capacidad del VEGF de inhibir la citotoxicidad de Lip/Hus-C4-VEGF de un modo dependiente de dosis (Fig. 8D).
REFERENCIAS
LISTADO DE SECUENCIAS
[0085]
<110> Backer, Marina V.
Backer Joseph M.
<120> PÉPTIDO ETIQUETA QUE CONTIENE CISTEÍNA PARA LA CONJUGACIÓN ESPECÍFICADE SITIO DE PROTEÍNAS
<130> 102131-300
<150> 09/872,712
<151> 2001-06-01
<150> 60/209,660
<151> 2000-06-06
<160> 46
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
<210> 1
<211> 45
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento de ADN mutante de la ARNasa I humana
<400> 1
aaagaatctt gcgctaaaaa atttcaacgt caacacatgg actct 45
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Fragmento mutante N-terminal de 15 aminoácidos de longitud de la ARNasa I humana
<400> 2
5 <210> 3
<211> 666
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> ADN de factor de crecimiento vascular endotelial de una sola cadena (SCVEGF)
<221> CDS
- <222>
- (1)...(666) 15
<400> 3
<210> 4
<211> 221
- <212>
- PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Proteína factor de crecimiento vascular endotelial de una sola cadena (scVEGF)
<210> 5
<211> 423
- <212>
- ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> CDS
- <222>
- (1)...(423) 10
10 <400> 4 <223> constructo C4-VEGF121
<400> 5 <210> 6
<211> 140
<212> PRT
5 <213> Humano
<220>
<223> constructo C4-VEGF121
10 <400> 6
<210> 7
<211> 396
<212> ADN 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<221> CDS
<222> (1)...(396)
<223> constructo C4-VEGF110
<400> 7
<210> 8
<211> 131
<212> PRT
<213> Humano
<220>
<223> constructo C4-VEGF110
<400> 8
<210> 9
<211> 1056
<212> ADN
5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> constructo C4(G4S)3-Anexina V
10 <221> CDS
<222> (1)...(1056)
<400> 9
<210> 10
<211> 351
- <212>
- PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> constructo C4(G4S)3-Anexina V
<210> 11
<211> 864
- <212>
- ADN 5 <213> Secuencia artificial
10 <400> 10 <220>
<223> constructo C4(G4S)3-LFn
10 <221> CDS
<222> (1)...(864)
<400> 11 <210> 12
<211> 287
- <212>
- PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> constructo C4(G4S)3-LFn
<210> 13
<211> 729
- <212>
- ADN 5 <213> Secuencia artificial
10 <400> 12 <220>
<223> constructo C4(G4S)SCVEGF
10 <221> CDS
<222> (1)...(729)
<400> 13 <210> 14
<211> 242
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
31
<220>
<223> constructo C4(G4S)scVEGF
<400> 14
<210> 15
<211> 324
<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Hus(C118)
15 <221> CDS
<222> (1)...(324)
<400> 15 <210> 16
<211> 107
5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HuS(CC118) 10
<400> 16
<210> 17
<211> 324 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> HuS(C88, C118)
<221> CDS
<222> (1)...(324)
<400> 17
<210> 18 10 <211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> HuS(C88, C118)
<400> 18 <210> 19
<211> 387
<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> BHR(A8, P11, C118)
10 <221> CDS
<222> (1)...(387)
<400> 19 <210> 20
<211> 128
<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> BHR(A8, P11, C118)
10 <400> 20 <210> 21
<211> 387
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> BHR(A8, P11, C88, C118)
<221> CDS 10 <222> (1)...(387)
<400> 21
<210> 22 15 <211> 128
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> BHR(A8, P11, C88, C118)
<400> 22
- <210> 23 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 23 tatacatat gaaagaatct tgcgctaaaa aatttc
- 36
- <210> 24 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 24 agattctttc atatgtatat ctccttctta aagtt
- 35
- <210> 25 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 25 ggataacaat tcccctctag aaataatttt gtttaac 37
<210> 26
<211> 34
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 26 actacccatg gaaccgccgc caccagagtc catg
<210> 27
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 27 cacaagccat ggcacccatg gcagaaggag ga 32
<210> 28
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 28 actacccatg gtcaccgcct cggcttgtca c 31
<210> 29
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 29 ctgctccatg ggagcgggcg gtcatggtga tg 32
<210> 30
<211> 44
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 30 actacccatg gctatagatt tatttcttgt tcgttaaatt tatc 44
<210> 31
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 31 cacaagccat ggcacaggtt ctcagag 27
<210> 32
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 32 actacccatg gttagtcatc ttctccacag agc 33
<210> 33
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 33 cacggatccg gtggcggcgg tagtggt 27
<210> 34
<211> 38
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 34 cacggatcct catcttgctc tatctttctt tggtctgc
<210> 35
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
- <223> Secuencia de cebador
- <400> 35 cacaagccat ggcacccatg gcagaaggag ga
- 32
- <210> 36 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 36 actacccatg gctcttgctc tatctttctt tggtctgc
- 38
- <210> 37 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 37 aaggctctcc gtacgttccg tgtcatttcg acgcg
- 35
- <210> 38 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 38 cggaacgtac ggagagcctt cgcatgcaac
- 30
<210> 39
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 39 tcactgactg ccgtcttact tgcggatccc gtt 33
<210> 40
<211> 31
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 40 agtaagacgg cagtcagtga tatgcataga a
<210> 41
<211> 32
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Secuencia de cebador
<400> 41 gcagccaagt ttgagcggcc gcacatggac tc 32
<210> 42
<211> 31
<212> ADN
- <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 42 gccgctcaaa cttggctgct gcagtttcct t
- 31
- <210> 43 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 43 ggaaactgca gcagccaagg ctgagcggcc gc
- 32
- <210> 44 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 44 cttggctgct gcagtttcct tcatatgtat at
- 32
- <210> 45 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Secuencia de cebador
- <400> 45 aaaaacatat gaaggaattt accttagact tctcg
- 35
- 5
- <210> 46 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 10
- <220> <223> Secuencia de cebador
- 15
- <400> 46 tactcgagtc accgcctcgg cttgtcac 28
Claims (16)
- REIVINDICACIONES1. Conjugado biológico, que comprende:
- (a)
- un grupo de direccionamiento que comprende un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácido que comprende la secuencia polipeptídica SEC ID nº 2 y la secuencia polipeptídica de una proteína de direccionamiento seleccionada, y
- (b)
- un grupo de unión,
presentando dicho conjugado biológico un enlace covalente entre el grupo tiol de SEC ID nº 2 y un grupo funcional en dicho grupo de unión. -
- 2.
- Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende VEGF humano, o una forma mutada o truncada del mismo.
-
- 3.
- Conjugado biológico según la reivindicación 2, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 6 ó SEC ID nº 8.
-
- 4.
- Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende anexina V humana, o una forma mutada o truncada de la misma.
-
- 5.
- Conjugado biológico según la reivindicación 4, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 10.
-
- 6.
- Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende un fragmento catalíticamente inactivo del factor letal del ántrax, o una forma mutada o truncada del mismo.
-
- 7.
- Conjugado biológico según la reivindicación 6, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 12.
-
- 8.
- Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende scVEGF que presenta la secuencia proteica SEC ID nº 4.
-
- 9.
- Conjugado biológico según la reivindicación 8, en el que dicha proteína de direccionamiento comprende la secuencia SEC ID nº 14.
-
- 10.
- Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicho grupo de unión se selecciona de entre fármacos, radionucleidos quelantes, polietilenglicol, pigmentos, lípidos, liposomas y superficies seleccionadas.
-
- 11.
- Conjugado biológico según la reivindicación 10, en el que dichas superficies seleccionadas se seleccionan de entre la superficie de una nanopartícula o micropartícula, la superficie de un dendrímero, la superficie de un andamiaje de tejidos, la superficie de un dispositivo biomédico y la superficie de un biosensor.
-
- 12.
- Conjugado biológico según la reivindicación 1, en el que dicho grupo de unión comprende una proteína adaptadora complementaria.
-
- 13.
- Conjugado biológico según la reivindicación 12, en el que dicha proteína adaptadora es la ARNasa I humana mutante que comprende Cys18, o un fragmento de la misma.
-
- 14.
- Conjugado biológico según la reivindicación 13, en el que dicha proteína adaptadora presenta una secuencia polipeptídica seleccionada de entre SEC ID nº 16, SEC ID nº 18, SEC ID nº 20 y SEC ID nº
- 22.
-
- 15.
- Composición farmacéutica para administrar selectivamente una entidad seleccionada en una diana en un paciente, que comprende:
- (a)
- un portador farmacéuticamente aceptable, y
- (b)
- el conjugado biológico según la reivindicación 1.
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|---|---|---|---|
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Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9701754B1 (en) * | 2002-10-23 | 2017-07-11 | City Of Hope | Covalent disulfide-linked diabodies and uses thereof |
| WO2005115477A2 (en) | 2004-04-13 | 2005-12-08 | Quintessence Biosciences, Inc. | Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents |
| WO2006005058A2 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymer-factor ix moiety conjugates |
| JP2009541333A (ja) * | 2006-06-23 | 2009-11-26 | クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド | 修飾リボヌクレアーゼ |
| EP2049151A4 (en) * | 2006-07-17 | 2010-03-24 | Quintessence Biosciences Inc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT OF CANCER |
| US20080031815A1 (en) * | 2006-07-27 | 2008-02-07 | Xiaoyuan Chen | Pet imaging of vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), compositions for VEGF cancer imaging, and methods of VEGF cancer imaging |
| CA2702043A1 (en) | 2007-10-08 | 2009-04-16 | Quintessence Biosciences, Inc. | Compositions and methods for ribonuclease-based therapies |
| US20100068151A1 (en) * | 2008-03-11 | 2010-03-18 | Rosenblum Michael G | Multimodality molecular imaging with therapeutic conjugates |
| WO2010039985A1 (en) | 2008-10-01 | 2010-04-08 | Quintessence Biosciences, Inc. | Therapeutic Ribonucleases |
| US9440849B2 (en) * | 2009-01-15 | 2016-09-13 | Cornell University | Nanoparticle organic hybrid materials (NOHMS) |
| GB201121571D0 (en) | 2011-12-15 | 2012-01-25 | Astrimmune Ltd | Compounds and uses thereof |
| US20180125988A1 (en) * | 2014-11-11 | 2018-05-10 | Amunix Operating Inc. | Targeted xten conjugate compositions and methods of making same |
| US20160298187A1 (en) * | 2015-04-08 | 2016-10-13 | Verily Life Sciences Llc | Methods of tagging particles for multiplexed functional screening |
| AU2017378427A1 (en) | 2016-12-14 | 2019-06-20 | Ligandal, Inc. | Methods and compositions for nucleic acid and protein payload delivery |
| CN113512089B (zh) * | 2021-06-30 | 2023-06-13 | 兰州大学 | 一种水溶性量子点的多肽稳定剂及应用 |
Family Cites Families (38)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5492A (en) * | 1848-03-28 | Fastening eor books | ||
| US6075010A (en) | 1992-06-09 | 2000-06-13 | Neorx Corporation | Small molecular weight ligand-hexose containing clearing agents |
| US4885172A (en) | 1985-06-26 | 1989-12-05 | The Liposome Company, Inc. | Composition for targeting, storing and loading of liposomes |
| US5166320A (en) | 1987-04-22 | 1992-11-24 | University Of Connecticut | Carrier system and method for the introduction of genes into mammalian cells |
| SE8804074D0 (sv) | 1988-11-10 | 1988-11-10 | Pharmacia Ab | Sensorenhet och dess anvaendning i biosensorsystem |
| US5354844A (en) | 1989-03-16 | 1994-10-11 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Protein-polycation conjugates |
| US5194596A (en) | 1989-07-27 | 1993-03-16 | California Biotechnology Inc. | Production of vascular endothelial cell growth factor |
| US6113946A (en) | 1992-04-03 | 2000-09-05 | The Regents Of The University Of California | Self-assembling polynucleotide delivery system comprising dendrimer polycations |
| DE4237113B4 (de) | 1992-11-03 | 2006-10-12 | "Iba Gmbh" | Peptide und deren Fusionsproteine, Expressionsvektor und Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins |
| US6015897A (en) | 1993-12-07 | 2000-01-18 | Neorx Corporation | Biotinamido-n-methylglycyl-seryl-o-succinamido-benzyl dota |
| US6037329A (en) | 1994-03-15 | 2000-03-14 | Selective Genetics, Inc. | Compositions containing nucleic acids and ligands for therapeutic treatment |
| US5972901A (en) | 1994-03-23 | 1999-10-26 | Case Western Reserve University | Serpin enzyme complex receptor--mediated gene transfer |
| US6312699B1 (en) | 1994-03-28 | 2001-11-06 | Uab Research Foundation | Ligands added to adenovirus fiber |
| GB9412844D0 (en) | 1994-06-27 | 1994-08-17 | Medical Res Council | Improvements in or relating to therapeutic methods |
| US5972707A (en) | 1994-06-27 | 1999-10-26 | The Johns Hopkins University | Gene delivery system |
| US5559099A (en) | 1994-09-08 | 1996-09-24 | Genvec, Inc. | Penton base protein and methods of using same |
| US5837533A (en) | 1994-09-28 | 1998-11-17 | American Home Products Corporation | Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent |
| US5766899A (en) | 1995-02-27 | 1998-06-16 | Board Of Regents , The University Of Texas System | Targeted nucleic acid delivery into liver cells |
| US5859228A (en) | 1995-05-04 | 1999-01-12 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes |
| AU727531B2 (en) | 1995-07-25 | 2000-12-14 | Crucell Holland B.V. | Methods and means for targeted gene delivery |
| US6020473A (en) | 1995-08-25 | 2000-02-01 | Genentech, Inc. | Nucleic acids encoding variants of vascular endothelial cell growth factor |
| US6033719A (en) | 1996-04-25 | 2000-03-07 | Medtronic, Inc. | Method for covalent attachment of biomolecules to surfaces of medical devices |
| JP3184459B2 (ja) * | 1996-08-01 | 2001-07-09 | 株式会社日立製作所 | 受電保護装置 |
| US5853744A (en) | 1996-08-20 | 1998-12-29 | Regents Of The University Of Minnesota | Solid-phase method for attaching a biomolecule to a substrate surface with a photoreactive crosslinking agent |
| US6056973A (en) | 1996-10-11 | 2000-05-02 | Sequus Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic liposome composition and method of preparation |
| US6750044B1 (en) | 1996-10-17 | 2004-06-15 | Genentech, Inc. | Variants of vascular endothelial cell growth factor having antagonistic properties, nucleic acids encoding the same and host cells comprising those nucleic acids |
| US6485942B1 (en) | 1997-02-14 | 2002-11-26 | Genentech, Inc. | Variants of vascular endothelial cell growth factor having altered pharmacological properties, and recombinant methods of production |
| US6395707B1 (en) | 1997-02-14 | 2002-05-28 | Genentech, Inc. | Methods of treatment utilizing variants of vascular endothelial cell growth factor |
| US6385707B1 (en) * | 1998-02-24 | 2002-05-07 | Adaptec, Inc. | Method and apparatus for backing up a disk drive upon a system failure |
| US6284742B1 (en) | 1998-09-29 | 2001-09-04 | Uab Research Foundation | Immunomodulation by genetic modification of dendritic cells and B cells |
| US6660843B1 (en) | 1998-10-23 | 2003-12-09 | Amgen Inc. | Modified peptides as therapeutic agents |
| NZ511119A (en) | 1998-11-02 | 2004-04-30 | Ludwig Inst Cancer Res | Vascular endothelial growth factor-like protein from ORF virus NZ2 binds and activates mammalian VEGF receptor-2 |
| US6251599B1 (en) | 1998-11-06 | 2001-06-26 | Selective Genetics, Inc. | Stabilized nucleic acid compositions and methods of preparation and use thereof |
| US6703020B1 (en) | 1999-04-28 | 2004-03-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF |
| BR0010017A (pt) | 1999-04-28 | 2002-06-11 | Univ Texas | Composições e processos para o tratamento de câncer por inibição seletiva de vegf |
| JP2003528632A (ja) | 2000-03-31 | 2003-09-30 | インスティティ・パスツール | 血管内皮成長因子（ｖｅｇｆ）−媒介性脈管形成を阻害するペプチド、該ペプチドをエンコードするポリヌクレオチド及びその使用方法 |
| US20030059461A1 (en) * | 2000-06-06 | 2003-03-27 | Sibtech, Inc. | Molecular delivery vehicle for delivery of selected compounds to targets |
| WO2005115477A2 (en) * | 2004-04-13 | 2005-12-08 | Quintessence Biosciences, Inc. | Non-natural ribonuclease conjugates as cytotoxic agents |
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