KR101841211B1

KR101841211B1 - 세포 투과성 펩티드 및 이를 이용한 생물학적 활성 물질의 전달방법

Info

Publication number: KR101841211B1
Application number: KR1020140027918A
Authority: KR
Inventors: 최제민; 조현정; 김원주; 김도현; 구자현; 이정아; 이홍균; 임상호
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-10
Filing date: 2014-03-10
Publication date: 2018-03-22
Also published as: US20170057997A1; CN106255699A; US9969774B2; KR20150105852A; EP3118212A1; EP3118212B1; CN106255699B; EP3118212A4; WO2015137705A1

Abstract

본 발명은 새로운 세포 투과성 펩티드 및 그를 이용한 생물학적 활성 물질 전달용 조성물, 유전자 치료용 조성물, 생물학적 활성 물질의 전달 방법 및 유전자 치료 방법을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 세포 투과성 펩티드는 인간 세포주 및 조직 내로 효과적으로 단백질을 전달할 수 있으며, 세포 투과성 펩티드로써 상용되고 있는 TAT 펩티드와 비교했을 때 더욱 높은 효율로 단백질을 전달할 수 있고, 세포 내에 치료 목적으로 사용할 수 있는 단백질, 유전물질, 화학화합물 등의 생물학적 활성 물질의 전달에도 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포 투과성 펩티드 및 이를 이용한 생물학적 활성 물질의 전달방법 {Cell penetrating peptide and method for delivery of biologically active materials using it}

본 발명은 세포 내에서 기능을 담당하는 생물학적 활성 물질을 세포 내로 전달하는 시스템에 관한 것이다.

일반적으로 단백질, DNA와 같은 고분자로 된 생물학적 활성 물질은 친수성 및 소수성의 인지질 이중층을 통과할 수 없기 때문에 세포막을 투과해 세포 내로 들어갈 수 없다. 하지만 수용체와 같은 다른 분자의 도움 없이 세포막을 가로지를 수 있는 세포 투과성 펩티드(Cell penetrating peptide)가 알려져 있다.

세포 투과성 펩티드는 PTD(protein-transduction domains), MTS(membrane-translocating sequences)라고도 불리는 데, 수송대상체에 결합된 형태 또는 혼합된 형태로 세포막을 통과해 단백질, DNA, RNA 등의 운반 대상을 세포 내로 뿐만 아니라 세포질, 세포내 소기관, 핵 안에까지 운반할 수 있다(Endoh와 Ohtsuki, 2010; Joliot와 Prochiantz, 2004; Mogi와 Kondo, 2010).

HIV-1(Human immunodeficiency virus-1)의 감염 기작 중 하나로 Tat라는 물질의 세포막을 투과하는 현상이 확인된 첫 번째 단백질로써, 이로부터 유래한 'YGRKKRRQRRR'에 해당하는 TAT 펩티드는 가장 많이 적용되고 활발한 연구가 진행되고 있다(Mann, D. A. et al., Embo J 10 : 1733-1739, 1991).

TAT 펩티드를 이용하여 β-galactosidase, horseradish peroxidase, RNase A, domain of Pseudomonas exotoxin A (PE)등을 세포내로 전달해서 그 기능과 세포 내의 localization에 대한 연구가 진행된 바 있고(Fawell, S. et al., PNAS 91 : 664-668, 1994), TAT 펩티드는 세포막에 존재하는 Heparan sulfate와의 상호작용 후 발생하는 Lipid Raft가 관여하는 엔도시토시스(Endocytosis)에 의한 것임을 밝혀졌다(Jehangir S. W. et al., Nature Med 10 : 310 - 315, 2004).

이 외에도, 초파리의 발생과정에 필수적인 전사인자인 Antennapedia homeoprotein으로부터 유래한 16개의 아미노산 서열로 구성된 Penetratin (Antp)이라는 세포 투과성 펩티드, HSV-1 (Herpes simplex virus type 1)이 발현하는 단백질인 VP22로부터 유래한 동명의 세포 투과성 펩티드 VP22, 인공적으로 합성해낸 27개의 아미노산 서열로 이루어진 Transportan, 세포 투과성 펩티드에서 가장 중요한 기능을 담당할 것이라고 예상되는 아르기닌을 인공적으로 반복시킨 폴리아르기닌 (Poly-Arginine) 등이 세포 투과성 펩티드로 잘 알려져 있다.

이러한 종래 세포 투과성 펩티드들은 HIV-1과 같은 바이러스 단백질로부터 유래한 서열이거나, 초파리와 같은 다른 종이 발현하는 단백질로부터 유래한 것들이거나, 종래 세포 투과성 펩티드를 구성하는 아미노산 서열 분석을 통해 특징적인 아미노산 서열을 선정, 인공적으로 합성해 낸 아미노산 서열이라는 점에서, 인체에 적용해서 사용할 때에 면역 반응 등의 부작용을 일으킬 소지가 있었다.

또한 이들은 비교적 긴 아미노산 사슬로 이루어져 있어서 원치 않는 면역반응을 일으킬 가능성이 더 크고, 전달하고자 하는 단백질의 구조 및 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 세포 내로 전달하고자 하는 생물학적 활성 물질과 연결할 때에 효율이 저하되는 문제가 있었다.

본 발명은 종래 세포 투과성 펩티드에 비하여 면역 반응을 일으킬 가능성이 낮고, 생물학적 활성 물질의 전달 효율이 뛰어난 세포 투과성 펩티드 및 그를 이용한 생물학적 활성 물질 전달용 조성물, 유전자 치료용 조성물, 생물학적 활성 물질의 전달 방법 및 유전자 치료 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 (X1)_n-X2-(시스테인)-(X3)_m의 서열을 가지는 세포 투과성 펩티드를 제공한다. 상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이며, 상기 X1 및 X3은 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이며, 상기 X2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 발린, 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공한다.

본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 함유하는 세포 또는 조직 내 생물학적 활성 물질 전달용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드와 유전물질의 융합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 단백질이 융합된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드를 코딩하는 DNA와 생물학적 활성 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

본 발명은 세포 투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 생물학적 활성 물질의 전달방법을 제공한다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 유전자 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 세포 투과성 펩티드는 인간 세포주 및 조직 내로 효과적으로 단백질을 전달할 수 있으며, 세포 투과성 펩티드로써 상용되고 있는 TAT 펩티드와 비교했을 때 더욱 높은 효율로 단백질을 전달할 수 있고, 세포 내에 치료 목적으로 사용할 수 있는 단백질, 유전물질, 화학화합물 등의 생물학적 활성 물질의 전달에도 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 제조예 2의 AP와 이것이 연결된 EGFP (AP-EGFP)를 코딩하는 PCR 산물인 789 bp의 이중사슬 DNA 절편을 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 2는 제조예 3의 AP-EGFP DNA 절편을 삽입하기 위하여 AP-EGFP DNA 절편 (789 bp)과 pRSET-b 벡터 (2.9 Kb)를 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 각각 효소반응 한 뒤, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 DNA의 양을 확인한 사진이다.
도 3은 제조예 3의 AP-EGFP를 코딩하는 DNA 절편이 삽입된 pRSET-b 벡터를 DH5α 대장균주에 형질 전환시킨 후 평판 LB 배지에서 배양해 선택한 콜로니를 액체 LB 배지에 접종하여 배양한 후 플라스미드 Mini preparation 과정을 통해 분리해 낸 DNA를 1% 아가로스 젤 전기영동 사진이다.
도 4는 제조예 3의 분리한 플라스미드 DNA가 AP-EGFP를 코딩하는 DNA 절편 (789 bp)과 pRSET-b 벡터 (2.9 Kb)로 구성되었음을 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 한 뒤 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 5는 제조예 3의 AP-EGFP가 삽입된 pRSET-b 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 6은 제조예 4의 정제한 AP-EGFP 단백질과 음성 대조군에 해당하는 세포 투과 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질, 양성대조군에 해당하는 기존에 가장 널리 알려진 세포 투과 펩티드인 TAT-EGFP 단백질을 12% SDS 젤 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 7은 실험예 1에서 Jurkat 세포 내로 AP-EGFP 단백질이 농도 의존적, 시간 의존적으로 전달되었음을 유세포분석기(flow cytometry)를 이용한 세포 내 형광 강도 분석을 통해 나타낸 그래프이다.
도 8은 실험예 2에서 AP가 Jurkat 세포 내로 단백질을 전달하는 효율을 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 9는 실험예 3에서 AP의 가장 많은 부분을 차지하고 있는 아미노산 서열인 아르기닌이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 미치는 영향을 아르기닌을 하나씩 없애는 대조군을 설정하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 10은 실험예 3에서 AP를 구성하는 아미노산 서열인 트립토판(X2), 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 주는 영향을 확인하기 위하여 각각 알라닌으로 치환하여 유세포분석기 (flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 11은 실험예 3에서 AP를 구성하는 아미노산 서열인 트립토판(X2), 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)이 AP의 세포 내로 단백질을 전달하는 데에 주는 영향을 확인하기 위하여 각각 아르기닌으로 치환하여 유세포분석기(flow cytometry)를 통해 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 12는 실험예 4에서 온도 및 배지 내 혈청 (serum)농도의 변화에 따른 AP의 세포 내 전달 효율의 변화를 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 세포 내 형광 강도 분석 그래프이다.
도 13은 실험예 5에서 Heparin과 MβCD (Methyl-beta-cyclodextrin)의 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율의 변화를 종래의 세포 투과 펩티드들을 양성 대조군으로 이용하여 비교 분석한 그래프이다.
도 14는 실험예 6에서 HeLa 세포 내부로 AP-EGFP가 전달되었음을 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 15는 실험예 7에서 쥐의 각 장기 세포 내부로 AP-EGFP가 전달되었음을 보여주는 형광 현미경 사진이다.

본 발명은 (X1)_n-X2-(시스테인)-(X3)_m의 서열을 가지는 세포 투과성 펩티드를 제공한다.

상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 3 내지 6 중의 어느 하나의 정수이며, 상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고, 바람직하게는 4 내지 7 중의 어느 하나의 정수이다.

상기 세포 투과성 펩티드는 바람직하게는 9 내지 14개, 더욱 바람직하게는 9 내지 12개, 가장 바람직하게는 9 내지 10개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 하한치 미만에서는 세포 투과 효율이 급격히 감소하고, 상기 상한치를 초과할 경우에는 면역 반응을 일으킬 가능성이 높아진다.

상기 세포 투과성 펩티드에서 X1 및 X3은 각각 독립적으로 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 아르기닌 또는 라이신이다. 상기 (X1)_n은 X1에 해당하는 n개의 양전하 아미노산이 결합된 것으로, n개의 아미노산은 동일 아미노산이 n개 존재하는 것 뿐만 아니라 각기 다른 양전하 아미노산이 n개 존재하는 것도 포함한다. 마찬가지로 상기 (X3)_m은 각기 다른 양전하 아미노산이 m개 존재하는 것도 포함한다.

상기 세포 투과성 펩티드에서 X2는 무극성 또는 양전하 아미노산 중의 어느 하나로서, 알라닌(Ala, A), 글리신(Gly, G), 프롤린(Pro, P), 트립토판(Trp, W), 페닐알라닌(Phe, F), 로이신(Leu, L), 이소로이신(Ile, I), 메티오닌(Met, M), 발린(Val, V), 아르기닌(Arg, R), 라이신(Lys, K) 또는 히스티딘(His, H)이며, 바람직하게는 알라닌, 트립토판 또는 아르기닌이다.

상기 세포 투과성 펩티드는 바람직하게는 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진다.

본 발명은 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체를 제공한다.

상기 생물학적 활성은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타낸다. 또한 상기 생물학적 활성을 갖는 물질은단백질, 유전물질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물일 수 있다. 상기 유전물질은 DNA, RNA일 수 있고, 상기 화학화합물은 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 항생제 및 생물의 성장, 발달 또는 분화의 인자일 수 있다.

상기 세포 투과성 펩티드는 매우 작은 펩티드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성 물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다. 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 융합체는 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다.

상기 융합체를 특정 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 생물학적 활성 물질은 특정 세포, 조직 또는 장기에서 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포 외 부분 단백질, 또는 이들 수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체(mAb) 및 변형된 형태와 결합하여 융합체를 형성할 수 있다. 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다.

본 발명은 상기 융합체를 유효성분으로 포함하는 생물학적 활성 물질의 세포내 전달용 조성물 및 유전자 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 종래 생물학적 활성 물질이 쉽게 통과할 수 없었던 세포막을 통과하여 세포 내에 직접 작용할 수 있게 한다. 따라서 상기 조성물은 약물전달체계(drug delivery system)의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다.

상기 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 융합체를 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

상기 조성물은 상기 융합체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

상기 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 조성물은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 생체 내 전달될 수 있다. 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 화합물의 경우 약 0.01 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 단백질이 융합된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 및 세포 투과성 펩티드를 코딩하는 DNA와 생물학적 활성 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

상기 생물학적 활성 단백질은 세포 내 또는 생체 내로 전달되어 생리적 현상과 관련된 활성 또는 치료 목적과 관련된 활성을 나타내는 것일 수 있다.

상기 재조합 발현 벡터는 상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 단백질의 서열 및 상기 융합 단백질의 정제를 용이하게 하는 태그(tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 및 Myc 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합체의 가용성(solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너(partner) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 상기 재조합 단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 스페이서(spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서의 예로는 AAY(P. M. Daftarian et al., J Trans Med 2007, 5:26), AAA, NKRK(R. P. M. Sutmuller et al., J Immunol. 2000, 165: 7308-7315) 또는, 하나에서 다수의 리신(lysine) 잔기들(S. Ota et al., Can Res. 62, 1471-1476, K. S. Kawamura et al., J Immunol. 2002, 168: 5709-5715)을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 또한 상기 재조합 단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현 조절 서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마커(marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인(regulatory domain)으로 구성될 수 있다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 생물학적 활성 물질의 전달 방법을 제공한다.

상기 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 물질의 결합은 뉴클레오티드 수준에서 발현 벡터를 이용한 클로닝 기법에 의한 간접적인 연결에 의하거나 펩티드와 생물학적 활성 물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 펩티드와 생물학적 활성 물질의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내 주입은 정맥내(intravein), 복막내(intraperitoneal), 근육내(intramuscular), 피하내(subcutaneous), 피내(intradermal), 비내(nasal), 점막내(mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구(oral) 등의 경로로 주입함으로써 수행될 수 있다. 상기 전달 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.

본 발명은 상기 세포 투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및 상기 전달 복합체를 세포 내로 주입하는 단계로 구성되는 유전자 치료 방법을 제공한다.

상기 세포 투과성 펩티드와 유전물질의 화학적 또는 물리적 공유 결합 또는 비공유 결합에 의한 직접적인 연결에 의할 수 있다. 상기 유전물질의 전달 복합체를 생체 또는 세포 내 주입은 앞서 기재된 것과 동일한 경로로 투여 가능하다. 상기 치료 방법은 배양 세포뿐만 아니라 일반적인 생체 내 전달, 즉 동물 세포, 동물 조직 및 동물체로의 전달시에도 충분히 확대 적용될 수 있다.

상기 유전물질의 전달 복합체는 비면역원성, 비감염성이며, 레트로바이러스 또는 아데노 바이러스와 같은 벡터 유기체에 DNA가 패키징되어 있지 않기 때문에 플라스미드 크기에 제한을 받지 않는다. 따라서 어떤 실용적인크기의 재조합 유전자 발현 구조물에도 사용될 수 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

제조예 1: 펩티드 합성 및 분리정제

서열번호 1 내지 12의 아미노산 서열을 가지는 펩티드를 합성하였다.

상기 아미노산 서열에 합당한 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고테옥시뉴클레오타이드(oligodeoxy nucleotide)를 각각 합성한 후 95℃에서 3분 방치하여 형성된 2차 또는 3차 구조를 제거하고(denaturation) 50℃ 그리고 72℃로 온도를 바꾸어 DNA 2중가닥을 만들었다. pRSET-b 벡터에 끼워 넣기 위하여 센스(sense)와 안티센스(antisense) 올리고데옥시뉴클레오타이드 이외의 제한효소 특이 서열을 5'과 3'에 넣었다. 이후 대장균(E. coli)에 넣어(형질변화(transformaiton)) 대량 증폭하였다. 이후 서열의 온전성을 확인하고 대장균에 넣어 발현 유도하였다.

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 펩티드(이하, 'AP'라고도 함)를 녹색 형광 단백질(EGFP)과 융합하기 위하여 AP의 N-말단에 EGFP가 연결될 수 있도록 하는 프라이머를 제작하여 AP-EGFP 유전자를 PCR 반응을 통해 생산하고 이를 벡터 (pRSET-b)에 삽입하여 대장균 균주에서 단백질을 발현, 정제한 후 세포 내에 전달효율을 확인하는 실험을 진행하였다.

제조예 2: AP가 N-말단에 연결된 EGFP을 코딩하는 이중사슬 DNA의 제조

녹색 형광 단백질(이하, 'EGFP'라고도 함)의 N-말단의 일부를 코딩하는 DNA 염기서열에 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩티드를 코딩하는 DNA 염기서열을 추가하여 포워드 프라이머를 제작하였다.

서열번호 13의 포워드 프라이머는 5′ 말단에 DNA 클로닝을 위한 NheI 제한효소 인식부위를 포함하고 있으며 AP와 EGFP의 염기서열 사이에는 BamHI 제한효소 인식부위를 포함하고 있다. 한편 AP-EGFP를 PCR반응으로 증폭시키기 위해 서열번호 14의 리버스 프라이머를 제작하였다. 상기 리버스 프라이머는 EGFP의 C-말단 일부를 코딩하는 DNA 염기서열을 포함하며 프라이머의 5′ 가장 말단 부분에는 DNA 클로닝을 위하여 HindIII 제한효소 인식 부위를 삽입하였다.

PCR 반응은 EGFP유전자가 포함된 pRSETb 벡터를 주형으로 하여 상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머들을 이용하였다. 95℃에서 3분 동안 초기 열 변성 반응을 한 뒤, 95℃에서 주형의 열 변성반응 20초, 50℃에서 프라이머와 주형이 결합하는 중합반응 20초, 72℃에서 연장반응으로 30초를 수행하는 것으로 1주기를 설정하여 30주기를 PCR 반응기 (Biorad)를 이용하여 수행하였다.

상기 반응으로부터 증폭된 AP-EGFP의 증폭산물은 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 789 bp의 DNA 절편이 증폭되었음을 확인하였다(도 1).

제조예 3: AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터의 제조

AP-EGFP 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 발현 벡터인 pRSETb에 상기 제조예 2에서 제조된 789 bp의 DNA 절편을 제한효소로 자른 후 연결효소(ligase)를 이용하여 벡터에 삽입하였다.

제조예 2에서 증폭된 DNA 절편을 NheI과 HindIII (NEB)를 이용하여 DNA의 5′/ 3′ 말단을 접착성 말단 (sticky end)이 되도록 효소 반응 시켰다. 한편, 같은 두 개의 제한효소를 이용하여 pRSETb를 효소 반응시켜 NheI, HindIII 삽입 부위를 갖는 선형의 pRSETb 벡터를 만들었다. 각각의 효소 반응 이후에는 PCR 정제 키트(코스모진텍)를 이용하여 분리하였다.

분리된 AP-EGFP 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 25℃에서 두 시간 동안 T4 Ligase (NEB)를 이용하여 연결되도록 효소 반응 시켰다. AP-EGFP 이중사슬 DNA 절편과 pRSET-b 벡터는 1% 아가로스 겔 전기영동을 통해 각각의 농도가 확인되었다(도 2).

이렇게 연결시킨 AP-EGFP가 삽입된 원형의 pRSETb 벡터를 DH5α 대장균 균주에 형질전환 시켜 항생제인 암피실린 50 μg/㎖이 포함된 LB 평판 배지에 배양하여 콜로니를 형성하는 형질전환 대장균을 선별하였다. 선별된 대장균 콜로니는 다시 암피실린 50 μg/㎖을 포함하는 액체 LB 배지에 접종하여 배양했으며 이후 플라스미드 Mini Preparation 키트(코스모진텍)를 이용하여 플라스미드 벡터를 분리하였다(도 3).

상기 과정을 통해 분리된 플라스미드 벡터가 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터임을 확인하기 위하여 일차적으로 NheI과 HindIII 제한효소를 이용해 효소 반응 시킨 후, 1% 아가로스 젤 전기영동을 통해 확인하였다. 그 결과 789 bp에 해당하는 AP-EGFP DNA 절편이 2.9 kbp에 해당하는 pRSET-b 벡터에 삽입되어 있는 것을 확인하였다(도 4). 그리고 이것은 DNA 염기서열 분석(바이오닉스)을 통하여 최종적으로 확인할 수 있었다. 이렇게 제작된 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터의 구조는 도 5에 나타내었다.

제조예 4: 대장균에서 AP-EGFP 단백질의 발현 및 정제

상기 제조예 3의 AP-EGFP가 삽입된 pRSETb 벡터를 대장균 BL21 (DE3)star pLysS 균주에 형질전환 시킨 후 항생제인 클로람페니콜 34 μg/㎖와 암피실린 50 μg/㎖가 포함된 LB 평판 배지에서 형성된 콜로니를 액체 LB 배지 50㎖에 접종하여 37℃에서 10시간 배양하여 이를 새로운 액체 LB 배지 500㎖에 접종하였다. 동일한 온도에서 대장균의 양이 분광광도계로 배양액을 측정하였을 때, O.D 값이 0.5가 될 때까지 배양한 후, IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)의 농도가 1mM이 되도록 첨가하여 온도는 20℃, 회전 속도는 150rpm로 맞춰진 진탕 배양기에서 14시간을 더 배양하였다. 이렇게 대장균주가 발현한 단백질은 AP-EGFP의 앞쪽에 pRSET-b 벡터에 코딩되어 있는 6X-His tag을 포함하고 있다. 이를 이용해 하기의 실험 방법으로 단백질을 정제하였다.

배양액을 원심분리로 모은 후 native condition의 용해용액(0.5M NaCl, 5mM imidazole, 20mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 재 부유시켰다. 대장균의 세포벽과 세포막을 깨뜨리기 위해 용해용액에 부유해 있는 상태로 10분간 놓아두었다. 그리고 초음파 세포 파쇄기인 VCX-130(Sonics & Materials)을 사용해 세포를 분쇄하고 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액은 0.45㎛ 필터(Advantec)를 이용해 한번 거른 뒤 Ni-NTA agarose(Qiagen)와 상온에서 1시간 동안 결합하도록 하였다. 이후에는 히스티딘 칼럼(His-column, Biorad)을 이용해 Ni-NTA agarose와 결합된 단백질 산물만을 column에 결합할 수 있도록 하였다. 20mM의 imidazole 용액으로 세척한 뒤, 250mM의 imidazole 용액을 이용해 최종적으로 용출해냈다. 이렇게 용출된 단백질 산물은 PD-10 탈염 칼럼(Amersham Bioscience)에 적용하여 AP-EGFP를 최종적으로 순수 분리 정제하였다(도 6).

실험예 1: 암화 된 인간의 T 세포인 Jurkat 세포주 안으로 AP-EGFP 단백질의 전달 효율 비교

상기 제조예 4의 과정에서 정제된 AP-EGFP 단백질을 암화 된 인간 T 세포 세포주인 Jurkat 세포주 내로 전달하고 이의 효율을 확인하였다. Jurkat 세포를 RPMI 배지(HyClone)를 사용하여 배양하고, 350㎕의 RPMI 배지를 분주해 놓은 24-well 플레이트(SPL lifescience)의 각 well에 세포수가 1ㅧ10⁶ 만큼 들어있는 100㎕의 RPMI 배지를 첨가하는 방식으로 세포를 분주했다. 그리고 50㎕안에 D-PBS(Welgene)와 적정 농도가 되도록 맞춘 단백질을 섞어 총 부피가 500㎕가 되도록 단백질을 한 후에 명시한 바와 같이 다양한 조건에 맞게 단백질을 처리하였다. 이하 실험예에서 단백질의 처리 조건을 따로 명시하지 않은 경우, 배양액에 각각의 단백질을 5μM씩 처리하고 5% CO₂세포 배양기에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다.

첫 번째로는 AP-EGFP 단백질의 농도가 각각 1μM과 5μM이 되도록 처리한 후 5% CO₂세포 배양기에서 37℃로 1시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 AP가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질과 종래의 세포 투과성 펩티드 중 하나인 TAT-EGFP 단백질을 이용하였다. 1시간이 지난 후에는 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거해 주었다. 또한 세포 표면에 묻어있거나, 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다. 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 D-PBS 500㎕로 최종적으로 재 부유 시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACScantoII)를 이용해 세포 내 형광을 측정하는 방식으로 단백질의 세포 내 전달 효율을 측정하였다. 그 결과, 단백질의 처리 농도에 의존적으로 AP-EGFP가 Jurkat 세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다.

이어서 AP-EGFP 단백질의 농도는 5μM로 유지하고 5% CO₂세포 배양기에서 37℃로 30분 ~ 4시간 동안 배양하였다. 해당 처리 시간이 지난 후에는 상기에 명시한 바와 같은 방법으로 세포를 세척한 후 유세포분석기로 세포 내 형광을 측정하였다. 그 결과 단백질의 처리 시간에 의존적으로 AP-EGFP가 Jurkat 세포주 안으로 전달되었음을 확인하였다(도 7).

실험예 2: 종래 세포 투과성 펩티드들과의 단백질의 전달 효율 비교

또한 종래의 세포 투과성 펩티드들과 그 효율을 비교하기 위하여 실험예 1과 같은 농도, 같은 시간 동안 위와 같은 방법으로 Jurkat 세포주 안으로 각각의 단백질을 전달하는 실험을 진행하였다.

음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP 단백질을 사용하고, 양성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드에 EGFP (Enhanced Green Fluorescence Protein, 형광단백질)를 각각 연결한 TAT-EGFP, R9-EGFP, Hph-1 EGFP를 사용하여 비교해 보았다. 그 결과, 본 발명을 통해 발견/개발된 AP 서열이 TAT 보다 높은 효율로 단백질을 Jurkat 세포 안으로 전달하고 있음을 확인하였다(도 8).

실험예 3: AP 구성 아미노산의 치환, 제거, 추가에 따른 단백질의 전달 효율 비교

AP를 구성하는 각 아미노산의 역할에 대해 알아보기 위하여 다양한 변이체 들을 만들어 비교 분석해보았다.

(1) 말단 아미노산 제거에 따른 단백질 전달 효율 비교

먼저 AP의 양 끝을 구성하고 있는 아르기닌을 N-말단에서 하나(AP_D1, 서열번호 2), C-말단에서 하나(AP_D2, 서열번호 3), N, C-말단에서 각각 하나씩 제외(AP_D3, 서열번호 4)한 변이체를 만든 뒤, EGFP와 AP-EGFP, TAT-EGFP, R9-EGFP를 대조군으로 하여 비교해 보았다.

그 결과, 아르기닌이 하나라도 없는 경우, 즉 X1이 3 미만이거나, X2가 4 미만인 경우 기존의 AP 보다 효율이 크게 감소하는 것으로 보아 AP의 세포 내 단백질 전달의 역할에 있어 X1 및 X2의 아미노산 개수 하한치의 임계적 의의를 확인하였다(도 9).

(2) X2, 시스테인, X3 아미노산의 치환에 따른 단백질 전달 효율 비교

트립토판(X2)과 시스테인, 라이신(X3 중 첫 번째 아미노산)의 역할에 대해 알아보기 위하여 각각의 아미노산을 알라닌 또는 아르기닌으로 치환한 변이체를 제작하여 비교해보았다. 알라닌은 전하를 띠지 않고 가장 간단하면서도 작은 구조이기 때문에 대조군으로 적합하다.

양전하를 띠고 있는 아르기닌으로의 치환체는 아르기닌이 9개 붙어있는 R9과의 효율을 비교하는 대조군으로 사용하였다. 결과적으로 알라닌 치환체와 아르기닌 치환체는 서로 유사한 패턴을 보였다. 트립토판은 다른 아미노산으로 바꾸어도 기존의 AP 서열과 큰 효율의 차이를 보이지 않는 것으로 보아 AP의 기능적 역할에 큰 기여를 하지는 않는 것으로 확인되었다. 아르기닌은 다른 아미노산으로 치환하게 되면 효율이 크게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 아르기닌의 양전하를 띠는 특성이 긍정적인 영향을 미친 것으로 판단된다. 시스테인을 다른 아미노산으로 치환한 경우 가장 급격한 효율의 감소를 보였는데, 이는 시스테인이 AP에 있어 매우 중요한 기능 및 역할을 하고 있음을 시사한다(도 10 및 도 11).

실험예 4: AP의 세포 투과 기작 확인

한편 AP가 기존에 가장 잘 알려진 세포 투과성 펩티드인 TAT처럼 세포내 섭취(endocytosis)과정으로 세포 내로 전달되는지 확인하기 위하여 온도에 의존한 세포 내 전달변화를 측정하였고, 배지 내의 혈청 (serum) 농도에 따라 다른 단백질의 영향을 받는지 여부를 확인해 보았다. 음성 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되어 있지 않은 EGFP를, 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하였다.

각각의 단백질을 상기와 같은 방법으로 5μM이 되도록 Jurkat 세포에 처리하여 각각 4℃, 25℃, 37℃ 온도에서 독립적으로 1시간. 그 결과, 기존의 TAT과 달리 온도에 영향을 받지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이것은 AP가 에너지에 의존하는 세포내 섭취(endocytosis)를 통해 전달되는 TAT과 다른 방식으로 전달된다는 것의 간접적인 증거가 되는 것으로써, AP가 기존에 알려진 방식과 다른 방식으로 단백질을 세포내로 전달하는 세포 투과성 펩티드임을 확인하였다. 뿐만 아니라 각각의 온도에서 모두 TAT보다 높은 전달효율을 보이는 것을 확인하였다(도 12의 위).

또한 RPMI 배지에 첨가한 혈청의 농도를 각각 0%, 10%로 달리 했을 때 5μM이 되도록 처리한 각 단백질의 전달 효율을 분석하였다. 세포에 단백질 처리 후 1시간 동안 37℃에서 배양하였으며, 음성 대조군은 세포 투과성 펩티드가 연결되지 않은 EGFP, 양성대조군은 TAT-EGFP를 이용하였다.

그 결과, 배지의 혈청 농도가 증가할수록 AP-EGFP 단백질이 세포막을 통과하여 세포 안으로 전달되는 효율이 낮아지는 것을 확인하였다. 이것 역시 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포 투과성 펩티드가 영향을 받는 것을 간접적으로 보여주는 결과로써 본 발명에서 개발된 AP가 갖는 세포 투과성 펩티드로써의 기능을 다시 확인해 주는 결과이다. 한편 각각의 혈청 농도에서 AP는 다른 양성 대조군에 비해 여전히 높은 전달 효율을 나타내고 있음을 확인하였다(도 12의 아래).

실험예 5: Heparin과 MβCD의 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 단백질 전달 효율

(1) Heparin 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 단백질 전달 효율

상기 실험예 4를 통해 AP-EGFP의 전달 효율의 기작을 확인하였던 것처럼 세포 투과성 펩티드가 세포 표면에 있는 헤파란 황산염 (heparan sulfate)과 결합하는 것을 방해할 수 있는 비슷한 구조의 heparin을 미리 처리하여 상호작용에 의해 직접적이거나 간접적인 영향을 받을 것이라는 예상을 하여 Heparin (Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa, Sigma)을 0 μm/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml 4 가지 농도로 Jurkat 세포주에 30분 먼저 처리해주고 10μM의 AP-EGFP 단백질을 D-PBS로 최종 부피가 100㎕이 되도록 만들어 처리하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하여 비교하였다. 그리고 1시간 동안 37℃의 5% CO₂세포 배양기에서 배양했다. 1시간이 지난 후에는 세포를 모두 거두어 튜브에 옮겨 담고 원심분리를 이용해 상층액을 제거해 주었다. 또한 세포 표면에 묻어있거나, 배지가 남아 효율을 측정하는데 영향을 받지 않도록 D-PBS 1㎖를 이용해 세척하며 재 부유시키고 원심분리 하는 과정을 2회 반복했다. 2회의 세척 과정 후 얻어진 세포를 D-PBS 500㎕로 최종적으로 재 부유 시켜 유세포분석기(flow cytometry, FACS machine, BD science FACS Canto )를 이용해 세포 내 형광을 측정하는 방식으로 단백질의 세포내 전달 효율을 측정하였다.

그 결과, Heparin 처리 농도가 높아짐에 따라 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율이 현저하게 낮아지는 것을 확인하였다(도 13의 위).

(2) MβCD 농도의 변화에 따른 AP-EGFP의 세포 내 단백질 전달 효율

또한 AP-EGFP가 세포 내로 전달되는 과정에서, 인지질 이중층 세포막을 구성하는 지질 뗏목 (lipid raft)과 연관된 엔도시토시스(endocytosis)에 영향을 받을 것이라고 예측하여, 세포막의 콜레스테롤 (cholesterol)을 제거하는 것으로 알려져 있는 MβCD(Methyl-beta-cyclodextrin)를 처리하여 지질로 인한 엔도시토시스 (endocytosis)를 미리 저해한 뒤, MβCD를 0 mM, 3 mM, 5 mM 세 가지 농도로 Jurkat 세포주에 얼음에서 20분 먼저 처리해주고, 10μM의 AP-EGFP 단백질을 한 시간 동안 처리하였다. 양성 대조군으로는 TAT-EGFP를 사용하여 비교하였다. 그 결과, MβCD 처리 농도가 높아짐에 따라 AP-EGFP의 세포 내 전달 효율이 확연하게 떨어지는 것을 확인하였다(도 13의 아래).

이것 역시 다른 단백질들과의 경쟁이나 상호작용에 의해 세포 투과성 펩티드가 영향을 받는 것을 직, 간접적으로 보여주는 결과로써 본 발명에서 개발된 AP가 갖는 세포 투과성 펩티드로써의 기능을 다시 확인해 주는 결과이다.

실험예 6: 암세포주인 HeLa 세포 안으로의 AP-EGFP의 전달

상기 실험예 1과 같이 유세포분석기를 통해 AP 단백질을 세포내로 효과적으로 전달하고 있음을 확인하였다. AP가 단백질과 함께 실제로 세포 내로 전달되는 것인지, 세포 내 어느 위치에 존재하는지 직접 확인하기 위하여 자궁경부암 세포주인 HeLa 세포 안으로 AP-EGFP를 전달하여 공초점현미경을 이용해 분석하였다.

12-well 플레이트 (SPL lifescience)의 각 well에 미리 현미경용 원형 커버글라스 (Marin field)를 깔아두고 HeLa 세포의 세포수를 1ㅧ10⁵ 으로 분주한 후, 18시간 동안 DMEM 배지 (HyClone)에서 배양하여 세포가 커버글라스에 부착될 수 있도록 하였다. 이후 배지를 모두 흡입 (suction)하여 버린 후 새로운 DMEM 450㎕를 넣어주고, 실시예 3을 통해 정제된 AP-EGFP 단백질을 농도가 5μM이 되도록 하여 D-PBS와 섞어 부피가 50㎕이 되게 해서 처리하였다. 그리고 30분 동안 37℃의 5% CO₂세포 배양기에서 배양했다. 30분의 처리시간이 지난 뒤에 세포외부의 단백질을 제거하기 위해 배지를 모두 흡입하여 버린 후 1㎖의 D-PBS로 세척하는 과정을 5회 반복했다. 그리고 포름알데히드 (formaldehyde 37% solution, formalin, SIGMA) 1㎖로 세포를 고정하였다. 고정 후에도 D-PBS 1㎖를 이용해 5회 세척하였다. 이후에는 세포를 확인하고 핵의 위치를 확인하기 위하여 1:4000으로 희석한 Hoechst (Hoechst AG)를 500㎕이용해 핵이 형광을 띄도록 염색했으며 10분의 반응시간 후에 D-PBS 1ml를 이용해 5회 세척하였다. 이렇게 준비된 커버 글라스는 Mounting medium (SIGMA)을 이용해 슬라이드 글라스위에 마운팅하여 형광현미경 AX-10 (Fluorescence microscope, Carl zeiss) 으로 녹색 형광 단백질의 위치와 세포 안으로 전달되는 것을 확인하였다. 그 결과, AP가 연결된 녹색 형광 단백질은 세포막을 투과해 세포 내로 전달되어 들어가며, 세포내 위치는 세포질 (cytoplasm)에 머물러 있는 것을 확인하였다(도 14).

실험예 7 : 쥐의 각 장기 내부로의 AP - EGFP 의 전달

상기 실험예 1와 같이 유세포분석기를 통해 AP 단백질을 세포내로 효과적으로 전달하고 있음을 확인하였고, 실험예 6과 같이 공초점현미경을 통하여 HeLa 암세포주 내로 AP-EGFP가 전달되었음을 확인하였다. AP가 실제 체내 조건에서도 전달되는 것인지, 전달이 된다면 어느 장기까지 얼마나 전달이 될 수 있는지 직접 확인하기 위하여 C57BL/6 종의 6주 된 암컷 쥐에 5 mg의 AP-EGFP 단백질을 복강 주사하여 2시간 후 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 장 등의 장기를 얻어 4% 파라포름알데히드로 고정한 뒤, D-PBS로 2~3회 세척하여 O.C.T. compound를 이용해 얼린 블록을 제작하였다. 이후 크라이오스탯 (cryostat)을 이용하여 6μm의 두께로 절편을 만들어 슬라이드 샘플을 제작, 형광 현미경을 통하여 여러 장기 세포 내 AP-EGFP의 전달 여부를 확인하였다. 슬라이드 제작 후 Hoechst로 10분간 염색한 뒤 형광 단백질과 겹쳐서 비교하는 과정을 통하여 세포 내부로 들어갔는지의 여부를 확인하였다. 대조군으로는 세포 투과성 펩티드가 연결되지 않은 EGFP를 사용하였다. 그 결과 EGFP에 비교하여 AP가 연결된 녹색 형광 단백질은 뇌, 심장, 신장, 간, 폐, 비장, 장 등의 장기를 구성하는 세포 안으로 확연하게 잘 들어가는 것을 확인하였다(도 15).

<110> IUCF-HYU (Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University) <120> Cell penetrating peptide and method for delivery of biologically active materials using it <130> HPC4440 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 1 Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 2 Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 3 Arg Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 4 Arg Arg Trp Cys Lys Arg Arg 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 5 Arg Arg Arg Ala Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 6 Arg Arg Arg Trp Ala Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 7 Arg Arg Arg Trp Cys Ala Arg Arg Arg 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 8 Arg Arg Arg Arg Cys Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 9 Arg Arg Arg Trp Arg Lys Arg Arg Arg 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 10 Arg Arg Arg Trp Cys Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 11 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Cell penetrating peptide <400> 12 Arg Arg Arg Arg Cys Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 13 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP forward primer <400> 13 ctagctagcc gccggcgctg gtgcaaacgc cgccggggat ccgtgagcaa gggcgaggag 60 ctgttcac 68 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP reverse primer <400> 14 caagctttta cttgtatagc tcgtc 25

Claims

(X1)_n-X2-(시스테인)-(X3)_m의 서열을 가지는 세포 투과성 펩티드:
상기 n은 3 내지 14 중의 어느 하나의 정수이고,
상기 m은 4 내지 14 중의 어느 하나의 정수이며,
상기 X1 및 X3은 각각 독립적으로 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이며,
상기 X2는 알라닌, 글리신, 프롤린, 트립토판, 페닐알라닌, 로이신, 이소로이신, 메티오닌, 발린, 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다.
제1항에 있어서, 상기 세포 투과성 펩티드는 9 내지 14개의 아미노산으로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩티드.
제2항에 있어서, 상기 X1 및 X3은 각각 독립적으로 아르기닌 또는 라이신 인 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩티드.
제2항에 있어서, 상기 X2는 알라닌, 트립토판 또는 아르기닌 인 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩티드.
제3항에 있어서, 서열번호 1, 서열번호 5, 서열번호 8 또는 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 투과성 펩티드.
청구항 제1항 내지 제5항 중에서 선택되는 어느 한 항의 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성을 갖는 물질이 융합된 융합체.
제6항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 단백질, 유전물질, 지방, 탄수화물 및 화학화합물 중에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합체.
제7항에 있어서, 상기 단백질은 녹색 형광 단백질(Green Flurorescent protein)인 것을 특징으로 하는 융합체.
제6항에 있어서, 상기 생물학적 활성 물질은 세포, 조직 또는 장기의 수용체와 선택적으로 결합하는 리간드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 융합체.
청구항 제6항의 융합체를 유효성분으로 함유하는 세포 또는 조직 내 생물학적 활성 물질 전달용 조성물.
청구항 제1항 내지 제5항 중에서 선택되는 어느 한 항의 세포 투과성 펩티드와 유전물질의 융합체를 유효성분으로 함유하는 유전자 치료용 조성물.
청구항 제1항 내지 제5항 중에서 선택되는 어느 한 항의 세포 투과성 펩티드와 생물학적 활성 단백질이 융합된 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터.
청구항 제1항 내지 제5항 중에서 선택되는 어느 한 항의 세포 투과성 펩티드를 코딩하는 DNA와 생물학적 활성 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터.
청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩티드를 생물학적 활성 물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 생물학적 활성 물질의 전달방법.
청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 세포 투과성 펩티드를 유전물질과 결합시켜 전달 복합체를 제조하는 단계; 및
상기 제조된 전달 복합체를 인간을 제외한 포유동물의 생체 또는 세포 내로 주입하는 단계;를 포함하여 이루어지는 유전자 치료 방법.