KR20190019872A - 표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀 - Google Patents

Abstract

본 발명은 표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 CD9 단백질의 170번째와 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드가 삽입된 벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하여 제조된 엑소좀은 표적 펩타이드가 엑소좀의 표면에서 발현되고, 이로인해 엑소좀에 포집된 약물이 표적 조직으로 잘 전달됨을 확인함으로써, 상기 엑소좀은 표적 특이적으로 물질을 전달하는 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀{METHOD FOR PRODUCING AN EXOSOME THAT TRANSFERS A SUBSTANCE SPECIFICALLY TO TARGET AND EXOSOME PRODUCED BY THE SAME METHOD}

본 발명은 표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀에 관한 것이다.

인체는 대략 200여 종류 100조 개의 세포로 이루어져 있고, 세포 내에서 다양한 단백질의 작용에 의해 생리 활성이 조절되어 생명을 유지한다.

세포는 인지질로 구성된 이중막 구조의 세포막으로 둘러 싸여져 있으며, 세포막은 이물질이 세포 내로 유입되는 것을 막는다. 지금까지 개발된 단백질 치료제들은 대부분 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어가지 못하고, 세포 외부에서 작용하거나 혹은 세포막에 있는 수용체에 작용하여 세포 내로 신호를 전달함으로써 그 활성을 나타낸다.

한편, 세포질에 존재하는 많은 단백질들은 서로 작용하여 생리활성을 조절한다. 따라서 단백질 치료제를 직접 세포질로 넣을 수 있다면 세포의 활성을 좀 더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다.

최근 목적 단백질을 세포 내로 직접 유입시키는 방법이 많이 연구되고 있다. 예를 들어, 세포막을 통과하는 펩타이드인 세포막 통과 도메인(Protein Transduction Domain, PTD)과 목적 단백질의 재조합 단백질을 만들어 상기 재조합 단백질이 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어간다. 세포막 통과 도메인에는 HIV-1 TAT(human immunodeficiency virus type-1 transacrivating regulatory protein), HSV VP22, Antp, dfTAT, Hph-1 등이 있다. 그러나 상기 방법은 세포막 통과 도메인과 목적 단백질이 결합된 융합 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하고 분리하는 과정에서 단백질의 재접힘(refolding)이 제대로 되지 않아, 생산된 단백질의 활성이 떨어지며, 비특이적으로 전달되고, 수율이 낮다는 문제점이 있다.

한편, Gold NP(nano particle), Liposome NP, Magnetic NP, Polymeric NP 등과 같은 다양한 나노 입자와 결합된 목적 단백질은 식작용(Endocytosis)에 의해 세포막을 통과하여 세포질로 들어갈 수 있다. 그러나, 나노입자와 목적 단백질의 결합체는 대부분 세포 내 리소좀에서 분해된다. 목적 단백질이 리소좀 내부에서 분해되면 단백질의 활성을 잃어버리게 된다. 또한, 세포질에서 목적 단백질과 나노 입자가 따로 분리되기 어려우며, 나노 입자의 독성이 문제가 될 수 있다.

엑소좀(exosome)은 세포 간 신호전달을 하기 위해, 단백질, DNA, RNA 등을 포집한채로 세포 밖으로 분비되는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 소낭을 가리킨다.

엑소좀은, 원래 적혈구가 성숙되는 마지막 단계에서 세포 내 단백질을 배출하여 제거함으로써 적혈구 내에 헤모글로빈만 남기는 과정에서 발견되었다. 이러한 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라, 다낭체(Multivesicular body, MVB)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출, 분비된다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라 부른다.

이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 대식세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 줄기세포 및 종양세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다.

엑소좀에는 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함된다. 이와 같이 엑소좀에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합 혹은 내포작용(endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다.

목적 단백질이 내부에 포함된 엑소좀은 생체 내에서 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 이를 위해서는 목적 단백질을 포함하는 엑소좀을 효율적으로 만들 수 있어야 한다. 대한민국 특허등록 제10-0519384호에는 특정 항원에 대한 유전자를 세포주 내에 도입하고, 도입된 유전자로부터 생산된 단백질이 세포주 내에서 안정하게 발현된 후, 엑소좀을 통하여 세포 밖으로 방출시키는 방법과 상기 방법으로 생산된 엑소좀을 백신으로 사용하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 엑소좀은 세포 내에서 자연적으로 형성되기 때문에, 엑소좀을 생성하는 세포에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한다해도 발현된 단백질을 내부에 포집한 엑소좀이 제조될 가능성이 매우 낮으며, 제조된 엑소좀이 표적 조직으로 전달되는 효율이 낮다는 문제점이 있다.

CD9는 테트라스파닌계(tetraspanin family)에 속하는 약 24 내지 27 kD의 세포표면 당단백질 수용체로서, 세포 발달, 활성, 성장 및 운동성을 조절하는데 중요한 신호전달 작용을 조절한다. 또한, 세포 부착 및 세포 이동을 조절할 수 있고, 혈소판-유발 내피세포 증식에 관여하는 혈소판 활성화를 유도한다. 아울러, 근육세포 융합을 촉진하고 근관 유지에 기여하는 등 세포 내의 다양한 현상에 관여한다.

테트라스파닌 계열은 4개의 막통과 부위를 가지고, 막의 세포내 부위에 N-말단과 C-말단이 모두 위치하며, 첫 번째와 두 번째, 및 세 번째와 네 번째 막통과 부위 사이에 두 개의 세포외 고리(extracellular loop)가 돌출되어 있다.

이에, 본 발명자들은 엑소좀을 표적 조직으로 보다 효과적으로 전달하기 위한 방법을 개발하던 중, 엑소좀에 주요하게 발현되는 CD9 단백질의 170 및 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드를 삽입하여 벡터를 제조하고, 이를 엑소좀 생산 세포에 도입하여 표적 펩타이드가 엑소좀 막단백질에 표지된 엑소좀을 제조하였다. 또한, 상기 엑소좀에 삽입된 펩타이드가 HEK293T 세포에서 잘 발현되며, 표적 조직으로 엑소좀에 포집된 약물을 잘 전달함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 엑소좀을 이용하여 표적 조직으로 활성물질을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법으로 제조된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 단백질 약물의 전달용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드가 삽입된 발현벡터를 포함하는 엑소좀 제조용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 엑소좀을 이용하여 표적 조직으로 활성물질을 전달하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 단백질 약물의 전달용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드가 삽입된 발현벡터를 포함하는 엑소좀 제조용 조성물을 제공한다.

본 발명의 CD9 단백질의 170번째와 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드가 삽입된 벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하여 제조된 엑소좀은 표적 펩타이드가 엑소좀의 표면에서 발현되고, 이로인해 엑소좀에 포집된 약물이 표적 조직으로 잘 전달됨을 확인함으로써, 상기 엑소좀은 표적 특이적으로 물질을 전달하는 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 CIBN 유전자, EGFP 유전자, 및 CD9 단백질의 170 및 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드 복합체가 삽입되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입된 벡터의 모식도(A), 및 CD9 단백질 구조에서 표적 펩타이드 복합체가 삽입되는 부위를 나타낸 도(B)이다.
도 2는 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀이 처리된 HEK293T 세포에서 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체의 발현을 확인한 사진이다.
도 3은 아포B 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀이 처리된 HEK293T 세포에서 아포B 펩타이드 복합체의 발현을 확인한 사진이다.
도 4는 아포E 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀이 처리된 HEK293T 세포에서 아포E 펩타이드 복합체의 발현을 확인한 사진이다.
도 5는 VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀이 처리된 HEK293T 세포에서 VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체의 발현을 확인한 사진이다.
도 6은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 Cre recombinase-CRY2 유전자, CIBN 유전자, EGFP 유전자, 및 CD9 단백질의 170 및 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드 복합체가 삽입되어 있는 단백질을 코딩하는 유전자가 삽입되어 있는 벡터의 모식도이다.
도 7은 막단백질에 표적 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀의 표적 특이적 전달 효과를 조직병리학적으로 확인한 도이다:
A: 대조군으로써, 막단백질에 표적 펩타이드가 표지되지 않은 엑소좀;
B: 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀;
C: 아포B 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀;
D: 아포E 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 1) 테트라스파닌(tetraspanin)의 세포외 부분(extracellular space)에 표적 펩타이드를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "테트라스파닌(tetraspanin)"은 세포막을 4번 통과하는 막단백질로서, 세포막 위에 존재하면서 세포사이의 정보를 주고 받고, 세포증식 등을 조절하는 단백질일 수 있다. 구체적으로, 상기 테트라스파닌은 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 테트라스파닌은 CD9 단백질일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "표적 펩타이드"는 생체 내에서 특정 부위로 물질을 전달할 수 있는 펩타이드로써 엑소좀의 표면에서 발현되어 엑소좀이 특정 조직으로 이동할 수 있게 한다. 즉, 본 발명에 따른 표적 펩타이드는 특정 조직으로 이동하는 것으로 공지된 펩타이드라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 표적 펩타이드는 엔지오펩틴-2, 아포B, 아포E, VCAM-1 내재화서열 또는 가로무늬근 표적일 수 있다. 상기 표적 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 CD9 단백질의 N-말단으로부터 170번째 및 171번째에 위치하는 아미노산 사이에 삽입될 수 있다.

상기 발현벡터는 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동가능한 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 선택마커를 더 포함할 수 있다. 선택마커는 형질전환된 미생물 또는 재조합된 벡터의 선별을 위한 마커로서 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같이 선택 가능한 표현형을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 선택마커를 포함하는 벡터를 사용하면 선택제가 처리된 환경에서 선택마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질 전환된 세포를 선별할 수 있다. 선택 마커로는 항생제 내성 유전자, 구체적으로는 카나마이신을 사용할 수 있지만, 통상의 기술분야에서 사용할 수 있는 선택마커라면 모두 사용할 수 있다.

상기 엑소좀 생산세포는 B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포, 대식세포, 줄기세포 및 종양세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 생산세포는 HEK293T 세포일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성물질"은 생체 기능을 증진시키거나 억제시키는 물질로서, 인체의 기능을 조절하는 물질이 결핍되거나 과도하게 분비되어 비정상적인 병태를 보일 때 이의 균형을 유지시켜줄 수 있는 물질을 의미한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 CIBN 유전자, EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 170번째 아미노산과 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드로서 앤지오펩틴-2, 아포B, 아포E, VCAM-1 내재화 서열 또는 가로무늬근 표적 펩타이드를 삽입하여 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 엑소좀 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하여 막단백질에 표적 펩타이드가 표지된 엑소좀을 수득하였다(도 1 참조), 상기 수득된 엑소좀의 막단백질에 표지된 표적 펩타이드가 잘 발현됨을 확인하였다(도 2 내지 5 참조).

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀을 제공한다.

상기 방법은 1) 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

상기 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 테트라스파닌은 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 테트라스파닌은 CD9 단백질일 수 있다.

상기 표적 펩타이드는 특정 조직을 표적으로 하는 펩타이드라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 표적 펩타이드는 엔지오펩틴-2, 아포B, 아포E, VCAM-1 내재화서열 또는 가로무늬근 표적일 수 있다.

상기 엑소좀 생산세포는 B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포, 대식세포, 줄기세포 및 종양세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 생산세포는 HEK293T 세포일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 CIBN 유전자, EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 170번째 아미노산과 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드 복합체를 삽입하여 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 엑소좀 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하여 막단백질에 표적 펩타이드가 표지된 엑소좀을 수득하였다(도 1 참조). 상기 수득된 엑소좀의 막단백질에 표지된 표적 펩타이드가 잘 발현됨을 확인하였다(도 2 내지 5 참조).

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 엑소좀을 이용하여 표적 조직으로 활성물질을 전달하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 1) 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

상기 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 테트라스파닌은 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 테트라스파닌은 CD9 단백질일 수 있다.

상기 표적 펩타이드는 특정 조직을 표적으로 하는 펩타이드라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 표적 펩타이드는 엔지오펩틴-2, 아포B, 아포E, VCAM-1 내재화서열 또는 가로무늬근 표적일 수 있다.

상기 엑소좀 생산세포는 B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포, 대식세포, 줄기세포 및 종양세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 생산세포는 HEK293T 세포일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 CIBN 유전자, EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 170번째 아미노산과 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드 복합체를 삽입하여 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 엑소좀 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하여 막단백질에 표적 펩타이드가 표지된 엑소좀을 수득하였다(도 1 참조). 상기 수득된 엑소좀의 막단백질에 표지된 표적 펩타이드가 잘 발현되며(도 2 내지 5 참조), 표적 조직으로 엑소좀에 포집된 약물이 잘 전달됨을 확인하였다(도 7 참조).

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 단백질 약물의 전달용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 방법은 1) 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

상기 방법은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 테트라스파닌은 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 테트라스파닌은 CD9 단백질일 수 있다.

상기 표적 펩타이드는 특정 조직을 표적으로 하는 펩타이드라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 표적 펩타이드는 엔지오펩틴-2, 아포B, 아포E, VCAM-1 내재화서열 또는 가로무늬근 표적일 수 있다.

상기 엑소좀 생산세포는 B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포, 대식세포, 줄기세포 및 종양세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀 생산세포는 HEK293T 세포일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 CIBN 유전자, EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 170번째 아미노산과 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드 복합체를 삽입하여 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 엑소좀 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하여 막단백질에 표적 펩타이드가 표지된 엑소좀을 수득하였다(도 1 참조). 상기 수득된 엑소좀의 막단백질에 표지된 표적 펩타이드가 잘 발현되며(도 2 내지 5 참조), 표적 조직으로 엑소좀에 포집된 약물이 잘 전달됨을 확인하였다(도 7 참조).

상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 엑소좀을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다.

본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다.

비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.

그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 내지 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 내지 5 g/kg일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.

아울러, 본 발명은 테트라스파닌의 세포외 부분에 표적 펩타이드가 삽입된 발현벡터를 포함하는 엑소좀 제조용 조성물을 제공한다.

상기 테트라스파닌은 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 단백질일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 테트라스파닌은 CD9 단백질일 수 있다.

상기 표적 펩타이드는 특정 조직을 표적으로 하는 펩타이드라면 모두 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 표적 펩타이드는 엔지오펩틴-2, 아포B, 아포E, VCAM-1 내재화서열 또는 가로무늬근 표적일 수 있다.

상기 발현벡터는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 발현벡터는 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 또한, 상기 발현벡터는 선택마커를 더 포함할 수 있다. 선택 마커로는 항생제 내성 유전자, 구체적으로는 카나마이신을 사용할 수 있지만, 통상의 기술분야에서 사용할 수 있는 선택마커라면 모두 사용할 수 있다.

상기 조성물은 발현벡터의 도입, 엑소좀 생산용 형질전환 세포의 배양, 상기 엑소좀 생산용 형질전환 세포로부터 생산된 엑소좀을 분리 및 정제하는데 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 발현벡터의 도입에 필요한 적절한 완충액, 상기 엑소좀 생산용 형질전환 세포의 배양에 필요한 배지 및 용기 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터에 CIBN 유전자, EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 170번째 아미노산과 171번째 아미노산 사이에 표적 펩타이드 복합체를 삽입하여 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 엑소좀 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하여 막단백질에 표적 펩타이드가 표지된 엑소좀을 수득하였다(도 1 참조). 상기 수득된 엑소좀의 막단백질에 표지된 표적 펩타이드가 잘 발현되며(도 2 내지 5 참조), 표적 조직으로 엑소좀에 포집된 약물이 잘 전달됨을 확인하였다(도 7 참조).

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

앤지오펩틴-2(angiopeptin-2) 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀의 제조

앤지오펩틴-2는 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 표적으로 하는 단백질로, 엔지오펩틴-2 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

먼저, pSF-CMV-CMV-SbfI(#OG411, Oxford Genetics, UK) 벡터의 멀티클로닝부위 중 NdeI 부분을 NdeI 제한 효소를 이용하여 절단함으로써, DNA를 선형화하였다. 이후, PCR을 통해 서열번호 9의 염기서열로 기재되는 CIBN 유전자, 서열번호 10의 염기서열로 기재되는 EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 N-말단으로부터 1번째 내지 170번째 아미노산을 코딩하는 유전자가 차례로 연결된 단편, CD9 단백질의 N-말단으로부터 171번째 내지 228번째 아미노산을 코딩하는 유전자 단편, 및 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체를 코딩하는 유전자 단편을 제작하였다. 다음으로, pSF-CMV-CMV-SbfI 벡터의 NdeI 부분에 상기 제작한 3개 단편의 양 끝 부분이 서로 20 내지 24 bp 겹치도록 깁슨 어셈블리(Gibson assembly) 방법으로 순서대로 연결하여, CIBN 유전자, EGFP 유전자 및 CD9 단백질의 170번째 아미노산과 171번째 아미노산 사이에 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재되는 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체를 코딩하는 유전자가 차례로 삽입된 CIBN-EGFP-CD9(1-170)-앤지오펩틴 2 복합체-CD9(171-228) 벡터를 제작하였다(도 1). 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체는 앤지오펩틴-2의 아미노산 서열이 세번 반복되어 있으며, 각각의 앤지오펩틴-2 아미노산 서열 사이에는 GGGGS의 아미노산 서열로 기재되는 링커가, 앤지오펩틴-2 아미노산 서열 양 끝에는 PPVAT의 아미노산 서열로 기재되는 링커가 삽입되어 있다. 이후, CIBN-EGFP-CD9(1-170)-앤지오펩틴 2 복합체-CD9(171-228) 벡터를 엑소좀 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 이를 24시간 동안 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하여 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양액을 1,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 수거한 후, 배양액을 공극 크기가 0.2 μm인 폴리에테르설폰(polyethersulfone) 막을 이용하여 여과하였다. 4℃에서 접선유동여과(tangential flow filtration)를 통해 여과액을 1차 농축하였다. 이후, 4℃에서 세파로즈 비드(sepharose bead)로 이루어진 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)를 이용하여 농축액을 정제하였다. 다음으로, 4℃의 포스페이트 버터드 세린 수용액(Phosphate Buffered Saline) 300 내지 500 ㎖를 정제용액에 첨가하여 희석한 후, 4℃에서 접선유동여과(tangential flow filtration)를 통해 2차 농축을 수행함으로써 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 수득하였다.

아포B(apoB) 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀의 제조

아포B는 혈액-뇌 장벽을 표적으로 하는 단백질로, 아포B 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

아포B의 아미노산 서열이 세번 반복되고, 각각의 아포B 아미노산 서열 사이에는 GGGGS의 아미노산 서열로 기재되는 링커가, 아포B 아미노산 서열 양 끝에는 PPVAT의 아미노산 서열로 기재되는 링커가 삽입된, 서열번호 2의 아미노산 서열로 기재되는 아포B 펩타이드 복합체를 사용한 것을 제외하고 <실시예 1>과 동일한 방법으로 아포B 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 수득하였다.

아포E(apoE) 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀의 제조

아포E는 혈액-뇌 장벽을 표적으로 하는 단백질로, 아포E 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

아포E의 아미노산 서열이 세번 반복되고, 각각의 아포E 아미노산 서열 사이에는 GGGGS의 아미노산 서열로 기재되는 링커가, 아포E 아미노산 서열 양 끝에는 PPVAT의 아미노산 서열로 기재되는 링커가 삽입된, 서열번호 3의 아미노산 서열로 기재되는 아포E 펩타이드 복합체를 사용한 것을 제외하고 <실시예 1>과 동일한 방법으로 아포E 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 수득하였다.

VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀의 제조

VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)은 혈관 염증 부위를 표적으로 하는 단백질로, VCAM-1 내재화서열 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

VCAM-1 내재화 서열이 세번 반복되고, 각각의 VCAM-1 내재화 서열 사이에는 GGGGS의 아미노산 서열로 기재되는 링커가, VCAM-1 내재화 서열 양 끝에는 PPVAT의 아미노산 서열로 기재되는 링커가 삽입된, 서열번호 4의 아미노산 서열로 기재되는 VCAM-1 내재화 서열 펩타이드 복합체를 사용한 것을 제외하고 <실시예 1>과 동일한 방법으로 VCAM-1 내재화 서열 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 수득하였다.

가로무늬근 표적 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀의 제조

가로무늬근(striated muscle) 표적 펩타이드는 가로무늬근 부위를 표적으로 하는 펩타이드로, 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 하기와 같은 방법으로 제조하였다.

가로무늬근 표적 펩타이드 복합체는 각각 ASSLNIA, TARGEHKEEELI 또는 SKTFNTHPQSTP 아미노산 서열이 세번 반복되고, 각각의 ASSLNIA, TARGEHKEEELI 또는 SKTFNTHPQSTP 아미노산 서열 사이에는 GGGGS의 아미노산 서열로 기재되는 링커가, ASSLNIA, TARGEHKEEELI 또는 SKTFNTHPQSTP 아미노산 서열 양 끝에는 PPVAT의 아미노산 서열로 기재되는 링커가 삽입된, 서열번호 5, 서열번호 6 또는 서열번호 7의 아미노산 서열로 기재되는 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체를 사용한 것을 제외하고 <실시예 1>과 동일한 방법으로 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 수득하였다.

<실험예 1> 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체의 발현 확인

상기 <실시예 1>의 엑소좀을 HEK293T 세포에 처리한 후, 24시간 뒤 형광현미경을 통해 엑소좀의 막단백질에 표지된 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 엑소좀의 표면에서 발현되는 것을 확인하였다(도 2).

<실험예 2> 아포B 펩타이드 복합체의 발현 확인

상기 <실시예 2>의 엑소좀을 HEK293T 세포에 처리한 후, 24시간 뒤 형광현미경을 통해 엑소좀의 막단백질에 표지된 아포B 펩타이드 복합체의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 아포B 펩타이드 복합체가 엑소좀의 표면에서 발현됨을 확인하였다(도 3).

<실험예 3> 아포E 펩타이드 복합체의 발현 확인

상기 <실시예 3>의 엑소좀을 HEK293T 세포에 처리한 후, 24시간 뒤 형광현미경을 통해 엑소좀 막단백질에 표지된 아포E 펩타이드 복합체의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 아포E 펩타이드 복합체가 엑소좀의 표면에서 발현됨을 확인하였다(도 4).

<실험예 4> VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체의 발현 확인

상기 <실시예 4>의 엑소좀을 HEK293T 세포에 처리한 후, 24시간 뒤 형광현미경을 통해 엑소좀 막단백질에 표지된 VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체의 발현을 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체가 엑소좀의 표면에서 발현됨을 확인하였다(도 5).

<실험예 5> 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체의 발현 확인

상기 <실시예 5>의 엑소좀을 HEK293T 세포에 처리한 후, 24시간 뒤 형광현미경을 통해 엑소좀 막단백질에 표지된 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체의 발현을 확인하였다.

그 결과, 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체가 엑소좀의 표면에서 발현됨을 확인하였다.

<실험예 6> 막단백질에 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀의 표적 특이적 전달 효과

100 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 내는 LED 등 아래에서, Cre recombinase-CRY2 유전자를 추가로 더 삽입한 것을 제외하고는 <실시예 1>과 동일한 방법으로 제작한 CIBN-EGFP-CD9(1-170)-앤지오펩틴 2 복합체-CD9(171-228) 벡터(도 6)를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하였다. Cre recombinase는 전달되는 활성물질로써 사용하였다. 24시간 동안 상기 세포를 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체한 후, 상기 LED 등 아래에서 48시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 배양액을 분리하고, 접선유동여과 및 사이즈 배제 크로마토그래피를 수행하여 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지된 엑소좀을 수득하였다. 이때, 대조군으로서 HEK293T 세포에서 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 막단백질에 표지되지 않은 엑소좀을 수득하여 사용하였다. 수득한 1×10⁹ particles/50 ㎕ 농도의 엑소좀을 Cre 리포터 마우스인 C57BL/6 loxP-eNphr3.0-loxP-eYFP TG 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, USA)의 혈관에 정맥 또는 복강주사하여 주입시키고 48 내지 72시간 후, 마우스의 장기를 적출하여 조직병리학적 검사를 하였으며, 마우스의 장기별 eYFP 분포를 분석하여, 특정 표적 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀의 생체 내 전달 분포 및 기능을 검증하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 막단백질에 앤지오펩틴-2 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀은 혈액-뇌 장벽에 특이적으로 잘 전달됨을 확인하였다(도 7의 B).

<실험예 7> 막단백질에 아포B 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀의 표적 특이적 전달 효과

100 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 내는 LED 등 아래에서, Cre recombinase-CRY2 유전자를 추가로 더 삽입한 것을 제외하고는 <실시예 2>와 동일한 방법으로 제작한 CIBN-EGFP-CD9(1-170)-아포B 펩타이드 복합체-CD9(171-228) 벡터(도 6)를 사용한 것을 제외하고는 <실험예 6>과 동일한 방법으로, 특정 표적 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀의 생체 내 전달 분포 및 기능을 검증하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 막단백질에 아포B 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀은 혈액-뇌 장벽에 특이적으로 잘 전달됨을 확인하였다(도 7의 C).

<실험예 8> 막단백질에 아포E 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀의 표적 특이적 전달 효과

100 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 내는 LED 등 아래에서, Cre recombinase-CRY2 유전자를 추가로 더 삽입한 것을 제외하고는 <실시예 3>과 동일한 방법으로 제작한 CIBN-EGFP-CD9(1-170)-아포E 펩타이드 복합체-CD9(171-228) 벡터(도 6)를 사용한 것을 제외하고는 <실험예 6>과 동일한 방법으로, 특정 표적 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀의 생체 내 전달 분포 및 기능을 검증하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 막단백질에 아포E 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀은 혈액-뇌 장벽에 특이적으로 잘 전달됨을 확인하였다(도 7의 D).

<실험예 9> 막단백질에 VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀의 표적 특이적 전달 효과

100 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 내는 LED 등 아래에서, Cre recombinase-CRY2 유전자를 추가로 더 삽입한 것을 제외하고는 <실시예 4>와 동일한 방법으로 제작한 CIBN-EGFP-CD9(1-170)-VCAM 1 내재화 서열 펩타이드 복합체-CD9(171-228) 벡터(도 6)를 사용한 것을 제외하고는 <실험예 6>과 동일한 방법으로, 특정 표적 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀의 생체 내 전달 분포 및 기능을 검증하였다.

그 결과, 막단백질에 VCAM-1 내재화서열 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀은 혈관 염증 부위에 특이적으로 잘 전달됨을 확인하였다.

<실험예 10> 막단백질에 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀의 표적 특이적 전달 효과

100 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 내는 LED 등 아래에서, Cre recombinase-CRY2 유전자를 추가로 더 삽입한 것을 제외하고는 <실시예 5>와 동일한 방법으로 제작한 CIBN-EGFP-CD9(1-170)-가로무늬근 표적 펩타이드 복합체-CD9(171-228) 벡터(도 6)를 사용한 것을 제외하고는 <실험예 6>과 동일한 방법으로, 특정 표적 펩타이드가 막단백질에 표지된 엑소좀의 생체 내 전달 분포 및 기능을 검증하였다.

그 결과, 막단백질에 가로무늬근 표적 펩타이드 복합체가 표지된 엑소좀은 가로무늬근 부위에 특이적으로 잘 전달됨을 확인하였다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Cellex Life Sciences, Incorporated <120> METHOD FOR PRODUCING AN EXOSOME THAT TRANSFERS A SUBSTANCE SPECIFICALLY TO TARGET AND EXOSOME PRODUCED BY THE SAME METHOD <130> 2018P-08-010 <150> KR 10-2017-0104171 <151> 2017-08-17 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> angiopeptin 2 peptide complex <400> 1 Pro Pro Val Ala Thr Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg 1 5 10 15 Asn Asn Phe Lys Thr Glu Glu Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Phe Phe 20 25 30 Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg Asn Asn Phe Lys Thr Glu Glu Tyr 35 40 45 Gly Gly Gly Gly Ser Thr Phe Phe Tyr Gly Gly Ser Arg Gly Lys Arg 50 55 60 Asn Asn Phe Lys Thr Glu Glu Tyr Pro Pro Val Ala Thr 65 70 75 <210> 2 <211> 137 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoB peptide complex <400> 2 Pro Pro Val Ala Thr Ser Ser Val Ile Asp Ala Leu Gln Tyr Lys Leu 1 5 10 15 Glu Gly Thr Thr Arg Leu Thr Arg Lys Arg Gly Leu Lys Leu Ala Thr 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VCAM 1 internalizing sequence peptide complex <400> 4 Pro Pro Val Ala Thr Val His Pro Lys Gln His Arg Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val His Pro Lys Gln His Arg Gly Gly Gly Gly Ser Val His Pro 20 25 30 Lys Gln His Arg Pro Pro Val Ala Thr 35 40 <210> 5 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> striated muscle targeting peptide complex <400> 5 Pro Pro Val Ala Thr Ala Ser Ser Leu Asn Ile Ala Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Ala Ser Ser Leu Asn Ile Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Ser 20 25 30 Leu Asn Ile Ala Pro Pro Val Ala Thr 35 40 <210> 6 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> striated muscle targeting peptide complex <400> 6 Pro Pro Val Ala Thr Thr Ala Arg Gly Glu His Lys Glu Glu Glu Leu 1 5 10 15 Ile Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ala Arg Gly Glu His Lys Glu Glu Glu 20 25 30 Leu Ile Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ala Arg Gly Glu His Lys Glu Glu 35 40 45 Glu Leu Ile Pro Pro Val Ala Thr 50 55 <210> 7 <211> 56 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> striated muscle targeting peptide complex <400> 7 Pro Pro Val Ala Thr Ser Lys Thr Phe Asn Thr His Pro Gln Ser Thr 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Phe Asn Thr His Pro Gln Ser 20 25 30 Thr Pro Gly Gly Gly Gly Ser Ser Lys Thr Phe Asn Thr His Pro Gln 35 40 45 Ser Thr Pro Pro Pro Val Ala Thr 50 55 <210> 8 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly 1 5 10 15 Phe Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly 20 25 30 Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu 35 40 45 Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile 50 55 60 Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly 65 70 75 80 Ala Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu 85 90 95 Leu Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser 100 105 110 His Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr 115 120 125 Tyr Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu 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aagatgaaac acaaagccaa gaaagaagag aacaatttct ctaatgattc atctaaagtg 480 acgaaggaat tggagaaaac ggattatatt catgtaccgg tcgccacc 528 <210> 10 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP gene <400> 10 atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60 ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120 ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180 ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240 cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300 ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360 gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420 aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480 ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540 gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600 tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660 ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagggc 720 agtggttccg gactcagatc tcgagctcaa gcttcgaatt ctgcagtcga cggtaccgcg 780 ggcccgggat ccaccggatc tagatca 807

Claims (10)

1) 테트라스파닌(tetraspanin)의 세포외 부분(extracellular space)에 표적 펩타이드를 삽입하여 발현벡터를 제작하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 발현벡터를 엑소좀 생산 세포에 도입하는 단계를 포함하는 표적 특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 테트라스파닌이 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법.

제 2항에 있어서, 상기 CD9 단백질의 N-말단으로부터 170번째 및 171번째에 위치하는 아미노산 사이에 표적 펩타이드가 삽입된, 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법.

제 2항에 있어서, 상기 CD9 단백질이 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는, 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법.

제 1항에 있어서, 상기 엑소좀 생산 세포가 B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 대식세포, 줄기세포 및 종양세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포인, 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법.

제 1항의 방법으로 제조된 표적 특이적으로 활성물질을 전달하는 엑소좀.

제 1항의 방법으로 제조된 엑소좀을 이용하여 표적 조직으로 활성물질을 전달하는 방법.

제 1항의 방법으로 제조된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 단백질 약물의 전달용 약학적 조성물.

테트라스파닌(tetraspanin)의 세포외 부분(extracellular space)에 표적 펩타이드가 삽입된 발현벡터를 포함하는 엑소좀 제조용 조성물.

제 9항에 있어서 상기 테트라스파닌이 CD9, CD37, CD53, CD63, CD81, CD82 및 CD151로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 엑소좀 제조용 조성물.

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