WO2022231114A1 - 약물전달물질로서의 대장암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

약물전달물질로서의 대장암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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김옥희
김민기
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가톨릭대학교 산학협력단
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a colorectal cancer-specific target exosome composition comprising exosomes transformed from a recombinant expression vector and uses thereof.
  • the large intestine is divided into colon and rectum, and cancer occurring in the colon is referred to as colon cancer, cancer occurring in the rectum is referred to as rectal cancer, and colorectal cancer or colorectal cancer.
  • Colorectal cancer is an adenocarcinoma that occurs in the lining of the large intestine (colon) and rectum. Almost all cancers of the large intestine and rectum (colorectal) are adenocarcinomas. There is a characteristic that the incidence of colorectal cancer rapidly increases around the age of 40 to 50.
  • Exosomes are only 30-100 nm in size, but contain various substances such as proteins, nucleic acids, and lipids in original cells. They are nanoparticles secreted by our adipose-derived stem cells, such as immune cells or stem cells. . As the function of exosomes as an intercellular information carrier is known, it is attracting attention as a next-generation anticancer substance.
  • An object of the present invention is to prevent colon cancer comprising an extracellular vesicle transformed with a recombinant expression vector in which a gene for expressing a ligand binding to a receptor of a colorectal cancer cell is inserted in a gene expressed in the extracellular vesicle of a stem cell or To provide a pharmaceutical composition for treatment.
  • Another object of the present invention is to (a) introducing a gene expressing a ligand that binds to a receptor of colorectal cancer cells into the gene expressed in the extracellular vesicles of adipose-derived stem cells; (b) culturing the cell into which the gene is introduced in a medium to obtain an extracellular vesicle; And (c) transfecting the obtained extracellular vesicles with a nucleic acid capable of suppressing the expression of a colorectal cancer-inducing gene;
  • One aspect of the present invention is to prevent colorectal cancer comprising an extracellular vesicle transformed with a recombinant expression vector into which a gene for expressing a ligand binding to a receptor of a colorectal cancer cell is inserted in a gene expressed in the extracellular vesicles of stem cells. Or it provides a pharmaceutical composition for treatment.
  • the "expression vector" in the present invention may be selected from the group consisting of a linear DNA vector, a plasmid DNA vector, and a recombinant viral vector, but is not limited thereto, and all conventional vectors used for transformation in the art are the present invention. can be used in the method of In one embodiment of the present invention, the expression vector may be a pDisplay vector.
  • extracellular vesicle refers to a small sphere surrounded by a membrane derived from a cell
  • the extracellular vesicle is an extracellular vesicle derived from a natural system, such as a plant, animal, microorganism, or an artificially produced extracellular vesicle. It may be an endoplasmic reticulum.
  • the cell may be a cell isolated from a living organism in nature.
  • the "extracellular vesicle” may be an exosome, an ectosome, or a microvesicle, but in one embodiment of the present invention, the "extracellular vesicle” may be an exosome.
  • exosome refers to a small vesicle with a membrane structure secreted from various cells, and refers to a vesicle that is released into the extracellular environment due to fusion of the polycystic body and the plasma membrane.
  • the exosome may be derived or isolated from adipose-derived stem cells.
  • the exosome may have a diameter of 50 to 150 nm.
  • the exosome may be included at a concentration of 1 to 50 ⁇ L/ml.
  • stem cells refers to cells of various origins as pluripotent cells that can be differentiated into various tissue cells when appropriate conditions are met in an undifferentiated state.
  • the stem cells may be bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells or adipose-derived stem cells.
  • the stem cells may be adipose-derived stem cells.
  • the bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells or adipose-derived stem cells may be human or animal-derived stem cells.
  • Adipose-derived stem cells in the present invention are stem cells derived from adipose tissue, and refer to cells with pluripotency and self-renewal capacity, and the adipose-derived stem cells of the present invention are obtained through liposuction and various surgical procedures. can, but is not limited thereto.
  • the exosome is transformed to express a ligand that binds to a receptor of a colorectal cancer cell within a gene expressed as an exosome of a host cell, such as a stem cell, to act as a target for colorectal cancer cells.
  • the exosome may be transfected with a nucleic acid capable of suppressing the expression of a colorectal cancer-inducing gene.
  • transfection refers to a method of mutating the genetic trait of a cell by directly introducing DNA or RNA into an animal cell, which is a method known in the art, for example, calcium phosphate transfection (calcium phosphate transfection), lipofection, electroporation, microinjection, microprojectile, but is not limited thereto.
  • calcium phosphate transfection calcium phosphate transfection
  • lipofection lipofection
  • electroporation electroporation
  • microinjection microprojectile
  • a method of treating cells by mixing DNA with a commercially available reagent such as DNA calcium phosphate precipitation or lipofection or PEI may be used.
  • Nucleic acid in the present invention means including a gene that is inserted into a gene expressed in the extracellular vesicles of stem cells and can encode a peptide that binds to a receptor of colorectal cancer cells when expressed in the extracellular vesicles.
  • Nucleic acid in the present invention is a nucleic acid capable of inhibiting the expression of a colorectal cancer-inducing gene, and inhibits the expression of a colorectal cancer-inducing gene by binding to a nucleic acid expressing an oncogene or directly binding to an oncogene to inhibit expression. can be suppressed.
  • Nucleic acid in the present invention may be one or more nucleic acids selected from the group consisting of miRNA, siRNA, shRNA, antisense RNA and ribozyme, but in one embodiment of the present invention, the "nucleic acid” is miRNA and one or more nucleic acids selected from the group consisting of siRNA.
  • another aspect of the present invention comprises the steps of (a) introducing a gene expressing a ligand that binds to a receptor of colorectal cancer cells into the gene expressed in the extracellular vesicles of adipose-derived stem cells; (b) culturing the cell into which the gene is introduced in a medium to obtain an extracellular vesicle; And (c) transfecting the obtained extracellular vesicles with a nucleic acid capable of inhibiting the expression of a colorectal cancer-inducing gene; provides a method for producing an expression vector for preventing or treating colon cancer, including.
  • extracellular vesicle in the present invention may be an exosome, an ectosome or a microvesicle, but in one embodiment of the present invention, the "extracellular vesicle” may be an exosome have.
  • “Medium” in the present invention may be an adipose-derived stem cell culture medium.
  • the adipose-derived stem cell culture medium is DMEM high low glucose medium or FBS-free in which the adipose-derived stem cells are added with inactivated fetal bovine serum (FBS) and penicillin-streptomycin (P/S).
  • FBS fetal bovine serum
  • P/S penicillin-streptomycin
  • the medium may be DMEM low glucose.
  • prevention refers to any action that suppresses or delays the onset of colon cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Treatment in the present invention means any action in which symptoms for colorectal cancer are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • colonal cancer refers to a malignant tumor composed of cancer cells generated in the colon.
  • Colon cancer is an adenocarcinoma that has mostly developed in the form of a polyp pathologically. By site, it is broadly divided into colon cancer and rectal cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising an extracellular vesicle transformed with a recombinant expression vector into which a gene for expressing a ligand binding to a receptor of a colorectal cancer cell is inserted in a gene expressed in the extracellular vesicle of the stem cell of the present invention is an extracellular vesicle
  • exosomes can be used as a drug delivery material to selectively bind to colorectal cancer cells, which are target cells, and thus act specifically for colorectal cancer. Therefore, the target exosome can be applied in the field of colorectal cancer treatment, in particular, as a clinical application technology.
  • FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the binding of exosomes to cancer cells, which are target cells, by expressing a targeting ligand in exosomes through an expression vector.
  • cancer target exosomes by inserting RNAs that suppress oncogenes into the exosomes, they can be efficiently delivered to colon cancer cells compared to normal cells to suppress colon cancer cells.
  • 2A is a vector configuration in pDisplay for expression of the recombinant protein of the present invention
  • B is a diagram showing aspects according to the expression of the vector.
  • TEM transmission electron microscope
  • Western blot Western blot
  • FIG. 4 is a real-time PCR analysis result in HCT29, a colorectal cancer cell line.
  • the vertical axis of the graph means relative density.
  • 5 is a result showing the cell migration according to the wound healing assay of the exosomes.
  • E-cad, snail, and PIN1 which are factors involved in the EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) mechanism in HCT116, a colon cancer cell line.
  • Figure 7 shows the expression of E-cad, N-cad, vimentin, snail and PIN1 factors involved in the EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) mechanism in a colorectal cancer animal model transplanted with HCT116, a colorectal cancer cell line, in BALB/C Nude mouse; It is the result of checking the level.
  • EMT Epihelial to Mesenchymal Transition
  • Figure 8 shows the results of observation of the appearance in the colorectal cancer animal model constructed by transplanting the colon cancer cell line HCT116 to BALB / C Nude mouse.
  • Figure 9 shows the tumor size (Tumor volume) and body weight (body weight) in the colon cancer animal model constructed by transplanting the colon cancer cell line HCT116 to BALB / C Nude mouse.
  • the exosomes were extracted using adipose-derived stem cells.
  • adipose-derived stem cells were used as donor cells for producing target exosomes, immune cells such as NK cells are also possible, so the present invention is not limited thereto.
  • Adipose-derived stem cells were transfected with a transfection reagent (lipofectamine, invitrogen) in the pDisplay vector (invitrogen) according to the manufacturer's instructions (ACG TGG TAT AAA ATC GCG TTT CAG CGC AAC CGA AAA) was transduced with After cloning the vector, the result of cloning the vector was confirmed (FIG. 2), and a target exosome was prepared by inserting it into adipose-derived stem cells.
  • a transfection reagent lipofectamine, invitrogen
  • pDisplay vector invitrogen
  • adipose-derived stem cells were treated in DMEM low glucose medium supplemented with 10% FBS (inactivated fetal bovine serum) and 1% P/S (penicillin-streptomycin) at 37°C, 5% CO 2 condition. incubated with 10% FBS (inactivated fetal bovine serum) and 1% P/S (penicillin-streptomycin) at 37°C, 5% CO 2 condition. incubated with
  • the medium was exchanged with FBS-Free DMEM low glucose, and after 24 hours after the medium exchange, the culture medium of adipose-derived stem cells was removed and centrifuged at 1000 rpm by differential centrifugation method. Cells were removed.
  • Colorectal cancer target exosomes were obtained from the culture medium from which the cells were removed according to the manufacturer's instructions using a thermo exosome extraction kit (Thermo Fisher scientific).
  • PIN-siRNA was transfected into the target exosome using the Exo-Fect kit (SBI System biosciences) into the target exosome obtained through the above process, and through this, an exosome capable of targeting the colorectal cancer receptor was additionally manufactured. did.
  • Example 2 Characterization of target exosomes derived from adipose-derived stem cells
  • TEM transmission electron microscope
  • exosomes isolated from the adipose-derived stem cell culture had a microscopic spherical structure in the nanometer unit.
  • expression of the exosome surface markers CD81 and CD9 was confirmed using Western blot, it can be seen that the isolated exosome has typical exosome characteristics (FIG. 3).
  • Example 3 Real-time PCR analysis of target exosomes derived from adipose-derived stem cells
  • HCT116 and HCT29 were selected as colorectal cancer cell lines
  • PIN1 which is known to promote EMT in colorectal cancer
  • cancer cells undergo migration and invasion by transforming the properties of epithelial cells into mesenchymal cells through the EMT (Epithelial to Mesenchymal Transition) process.
  • RNA was converted into the first cDNA strand using a specific primer using a cDNA kit (TOYOBO), and then using SYBR green (TOYOBO) with a thermo PCR machine. ) was performed under the conditions of 95 ° C. 20 sec, 95 ° C. 10 min (1 cycle), 95 ° C. 10 sec, 60 ° C. 1 min (40 cycle), 95 ° C. 15 sec, 60 ° C. 1 min, 95 ° C. 15 sec (1 cycle), and the results were observed ( Fig. 4).
  • Example 4 Evaluation of tumorigenesis inhibitory ability of target exosomes derived from adipose-derived stem cells
  • Example 5 Efficacy evaluation of adipose-derived stem cell-derived target exosomes in HCT116, a colon cancer cell line
  • an exosome was added to the colon cancer cell line HCT116 as a control.
  • target exosome TK
  • PIN-siRNA-equipped (si-pin) exosome si-pin TK-CT
  • PIN-siRNA-equipped si-pin target exosome
  • Example 6 Efficacy evaluation of adipose-derived stem cell-derived target exosomes using an animal model of colorectal cancer following transplantation of colon cancer cell line HCT116
  • exosomes tk-ct
  • target exosomes tk
  • PIN-siRNA-equipped si-PIN1
  • si-PIN1 tk-ct PIN-siRNA-equipped exosomes
  • si-PIN1 tk-ct PIN-siRNA-equipped mice
  • mice were sacrificed to confirm the effect of the exosomes on the anti-tumor effect of colorectal cancer .

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 약학적 조성물 및 대장암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법에 대한 것으로, 본 발명은 세포외소포체로서 엑소좀을 약물전달물질로서 활용하여 표적 세포인 대장암 세포에 선별적으로 결합하여 대장암을 표적으로 특이적 작용이 가능한 이점이 있다.

Description

약물전달물질로서의 대장암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도
본 발명은 재조합 발현벡터로부터 형질전환된 엑소좀을 포함하는 대장암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
대장은 크게 결장과 직장으로 구분되며 결장에 생기는 암은 결장암, 직장에 생기는 암은 직장암으로, 대장암 또는 결장직장암으로 통칭하기도 한다. 결장직장암은 대장 및 직장(결장직장)의 거의 모든 암은 대장(결장) 및 직장의 내벽에서 발생하는 샘암종으로, 장 또는 직장 내벽 표면에서 암이 성장에 의하여 발생하며 인접 림프절에도 침입할 수 있으며, 결장직장암 발생률은 40 ~ 50세경에 급격히 증가하기는 특성이 존재한다.
엑소좀은 그 크기가 30-100nm에 불과하지만, 원세포에 들어있는 단백질, 핵산, 지질 등 여러 물질을 포함하고 있는 물질로서, 면역세포나 줄기세포 등 우리 지방유래줄기세포가 분비하는 나노입자이다. 엑소좀의 세포간 정보 전달체 역할을 하는 기능이 알려지면서 차세대 항암물질로 주목받고 있다.
이에, 본 발명자들은 약물전달물질로서의 대장암 특이적 표적 세포외소포체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 지방유래줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 대장암 표적 항암제의 기능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 지방유래줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자를 도입하는 단계; (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포외소포체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 세포외소포체에 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 형질주입시키는 단계;를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 일 측면은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 "발현벡터"는 선형 DNA 벡터, 플라스미드 DNA 벡터 및 재조합 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에서 형질전환을 위해 사용되는 통상적인 벡터들은 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　발현벡터는 pDisplay 벡터일 수 있다.
본 발명에서의 "세포외소포체"는 세포에서 유래되는 막으로 둘러싸인 작은 구체를 의미하는 것으로, 상기 세포외소포체는 자연계, 예컨대 식물, 동물, 미생물로부터 유래된 세포외 소포체 또는 인공적으로 제조된 세포외소포체일 수 있다. 또한, 상기 세포는 자연계 생물 개체로부터 분리된 세포인 것일 수 있다.
상기 "세포외소포체"는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome) 또는 미세소포(microvesicle)일 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "세포외소포체"는 엑소좀일 수 있다.
본 발명에서의 "엑소좀"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭으로서, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　엑소좀은 지방유래줄기세포로부터 유래 또는 분리한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　엑소좀은 50 내지 150 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀은 1 내지 50 μL/ml의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서의 "줄기세포(stem cells)"는 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직 세포로 분화될 수 있는 만능세포로서 다양한 유래의 세포를 의미한다.
상기 줄기세포는 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　줄기세포는 지방유래줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포는 인체 또는 동물유래 줄기세포인 것일 수 있다.
본 발명에서의 "지방유래줄기세포"는 지방 조직으로부터 유래한 줄기세포로서, 다분화능 및 자기증식능을 가진 세포를 의미하며, 본 발명의 지방유래줄기세포는 지방흡입술 및 다양한 외과적 수술을 통해 수득할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　엑소좀은 줄기세포 등 호스트세포의 엑소좀으로 발현하는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키도록 형질전환되어 대장암 세포에 표적으로 작용할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 엑소좀은 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산이 형질주입된 것일 수 있다.
본 발명에서의 "형질주입"은 동물세포에 DNA 또는 RNA를 직접 도입하여 세포의 유전형질을 변이시키는 방법을 의미하며, 이는 당해 기술분야에 공지된 방법, 예를 들어, 칼슘 인산염　형질주입법(calcium phosphate transfection), 리포펙션법(lipofection), 전기천공법(electroporation), 미량주사법(microinjection), 마이크로프로젝틸법(microprojectile)을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 진핵생물의 경우 DNA인산칼슘침전법 또는 리포펙션, PEI 등의 상품화된 시약과 DNA를 혼합하여 세포를 처리하는 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서의 "핵산"은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 삽입되어 세포외소포체로 발현 시 대장암 세포의 수용체와 결합하는 펩타이드를 코딩할 수 있는 유전자를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서의 "핵산"은 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산으로서, 발암 유전자를 발현하는 핵산과 결합 또는 발암 유전자와 직접 결합하여 발현을 억제시키는 방식으로 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있다.
본 발명에서의 "핵산"은 miRNA, siRNA, shRNA,　안티센스 RNA 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산일 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "핵산"은 miRNA 및 siRNA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산을 포함한다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 (a) 지방유래줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자를 도입하는 단계; (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포외소포체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 세포외소포체에 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 형질주입시키는 단계;를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법을 제공한다.
본 발명에서의 "세포외소포체"는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome) 또는 미세소포(microvesicle)일 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "세포외소포체"는 엑소좀일 수 있다.
본 발명에서의 "배지"는 지방유래줄기세포 배양배지인 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 지방유래줄기세포 배양배지는 지방유래줄기세포를 FBS(inactivated fetal bovine serum) 및 P/S(penicillin-streptomycin)을 첨가한 DMEM high low glucose 배지 또는 FBS-Free DMEM low glucose로 배지일 수 있다.
본 발명에서의 “예방”은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서의 “치료”는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 대장암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서의 "대장암(colorectal cancer)"은 대장에 생긴 암세포로 이루어진 악성 종양을 의미한다. 대장암은 병리학적으로 대부분 융종(polyp)의 형태에서 발전된 선암(adenocarcinoma)이며 드물게 유암종(carcinoid), 림프종(lymphoma) 등에 의한 암이 발생하기도 한다. 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 나뉜다.
본 발명의 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 약학적 조성물은 세포외소포체로서 엑소좀을 약물전달물질로서 활용하여 표적 세포인 대장암 세포에 선별적으로 결합하여 대장암에 특이적으로 작용할 수 있다. 따라서, 상기 표적 엑소좀은 대장암 치료 분야, 특히 임상적 적용 기술로 응용될 수 있다.
도 1은 발현벡터를 통하여 엑소좀에 타겟팅 리간드를 발현시켜 표적 세포인 암세포에 엑소좀이 결합하는 모습을 나타낸 모식도이다. 대장암 표적 엑소좀을 처리 시 종양 유전자를 억제하는 RNAs를 엑소좀 내에 삽입함에 따라 정상세포 대비 대장암 세포에 효율적으로 전달하여 대장암 세포를 억제할 수 있다.
도 2의 A는 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 위한 pDisplay에서의 벡터 구성이고, B는 벡터의 발현에 따른 양상을 나타낸 것이다.
도 3은 엑소좀에 대한 구조 분석을 위하여 투과전자현미경(TEM) 및 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4는 대장암세포주인 HCT29에서의 실시간 PCR 분석 결과이다. 그래프의 세로축은 Relative density을 의미한다.
도 5는 엑소좀의 wound　healing　assay에 따른 cell migration을 나타낸 결과이다.
도 6은 대장암세포주인 HCT116에서의 EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition) 기전에 관여하는 인자인 E-cad, snail 및 PIN1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7는 BALB/C Nude mouse에 대장암세포주인 HCT116을 이식한 대장암 동물 모델에서의 EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition) 기전에 관여하는 인자인 E-cad, N-cad, vimentin, snail 및 PIN1의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 BALB/C Nude mouse에 대장암세포주인 HCT116을 이식하여 구축된 대장암 동물 모델에서의 외형 관찰 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 BALB/C Nude mouse에 대장암세포주인 HCT116을 이식하여 구축된 대장암 동물 모델에서의 종양의 크기(Tumor volume) 및 체중(body weight)을 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀　제작 및 확인
본 발명의 대장암에 특이적으로 작용하는 표적 엑소좀을 제작하기 위하여 지방유래줄기세포를 사용하여 엑소좀을 추출하였다. 참고적으로, 본 발명에서는 표적 엑소좀을 생산하기 위한 donor cells로서 지방유래줄기세포를 사용하였지만, NK세포와 같은 면역세포도 가능하므로, 이에 한정하지 않는다.
지방유래줄기세포를 제조사의 지침에 따라 형질감염시약(lipofectamine, invitrogen)을 사용하여 pDisplay 벡터(invitrogen)에 대장암세포 표적 리간드를 인코딩하는 염기서열(ACG TGG TAT AAA ATC GCG TTT CAG CGC AAC CGA AAA)로 형질도입(transduction)시켰다. 상기 벡터를 클로닝한 후 해당 벡터가 클로닝된 결과를 확인하였으며(도 2), 지방유래줄기세포에 삽입하여 표적 엑소좀을 제작하였다.
제작된 표적 엑소좀을 추출하기 위하여 지방유래줄기세포를 10% FBS(inactivated fetal bovine serum) 및 1% P/S(penicillin-streptomycin)을 첨가한 DMEM low glucose 배지에서 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다.
24시간 경과 후 상기 배지를 FBS-Free DMEM low glucose로 배지를 교환하였으며, 배지 교환 후 24시간 경과 후 지방유래줄기세포의 배양 배지를 걷어 분별원심분리(differential centrifugation) 방법으로 1000rpm조건으로 원심분리하여 세포를 제거하였다.
상기 세포가 제거된 배양 배지를 thermo exosome 추출 kit(Thermo Fisher scientific)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 대장암 표적 엑소좀을 확보하였다.
여기에, 상기 과정을 통하여 확보한 표적 엑소좀에 Exo-Fect kit(SBI System biosciences)을 사용하여 PIN-siRNA를 표적 엑소좀 내에 형질주입하였으며 이를 통해 대장암 수용체에 표적이 가능한 엑소좀을 추가적으로 제작하였다.
실시예 2. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀의 특성 분석
본 발명의 대장암에 특이적으로 작용하는 표적 엑소좀에 대한 구조 분석을 위하여 투과전자현미경(TEM) 및 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 분석하였다. 이에 대한, 엑소좀의 TEM　분석, 웨스턴 블롯(Western blot) 결과를 도 3에 나타내었다.
지방유래줄기세포 배양액에서 분리된 엑소좀은 나노미터 단위의 미세한 구형 구조를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 웨스턴 블롯(Western blot)을 이용하여 엑소좀 표면 마커인　CD81 및 CD9의 발현이 확인됨에 따라 분리된 엑소좀은 전형적인 엑소좀의 특성을 갖는 것을 알 수 있다(도 3).
실시예 3. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀의 실시간 PCR 분석
대장암 세포주 별 발현에 차이를 확인하기 위하여, 대장암 세포주 및 대장암 표적 엑소좀에 장착할 유전자를 선별하였다. 대장암 세포주로서 HCT116 및 HCT29를 선별하고, 표적 엑소좀에 장착할 유전자는 대장암에서 EMT를 촉진한다고 알려져 있는 PIN1을 선정하였다. 한편, 암세포는 EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition)과정을 통하여 상피세포(Epithelial)가 간엽성세포(Mesenchymal)로 세포의 성질을 변형하여 이동 및 침윤을 진행하는 것으로 알려져 있다.
실시간　PCR(RealtimePCR)분석을 위하여, cDNA kit(TOYOBO)를 사용하여 10ng의 RNA를 특이적 프라이머를 사용하여 첫번째 cDNA가닥으로 전환시킨 후 SYBR green(TOYOBO)를 사용하여　thermo PCR machine으로 실시간　PCR(RealtimePCR)을 95℃ 20sec, 95℃ 10min(1cycle), 95℃ 10sec, 60℃ 1min (40cycle), 95℃ 15sec, 60℃ 1min, 95℃ 15sec (1cycle)의 조건으로 수행한 후, 결과를 관찰하였다(도 4).
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대장암 세포주로서 HCT29에서 유의하게 EMT 및 PIN1의 Relative density값이 감소되는 경향을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀의 종양생성 억제능 평가
세포의 전이능을 관찰하기 위하여　HCT116 대장암 세포주에 처리하여 wound　healing　assay를 진행하였다. 먼저, 대조군(Control)으로서 엑소좀(TK-CT), 표적 엑소좀(TK), PIN-siRNA를 장착한(siPIN) 엑소좀(siPIN TK-CT) 및 PIN-siRNA를 장착한(siPIN) 표적 엑소좀(siPIN TK)을 준비하였다.
실험결과, wound healing assay(24H 및 48H)를 수행했을 때, PIN-siRNA를 장착한(siPIN) 엑소좀(siPIN TK-CT) 및 PIN-siRNA를 장착한(siPIN) 표적 엑소좀(siPIN TK)에서 유의하게 cell migration이 억제됨을 확인할 수 있었다(도 5).
실시예 5. 대장암세포주인 HCT116에서의 지방유래줄기세포 유래 표적 엑소좀의 효능 평가
지방유래줄기세포 유래 엑소좀 대비 본 발명에 따른 재조합 벡터가 클로닝된 지방유래줄기세포 유래 대장암 표적 엑소좀의 항암 효능을 평가하기 위하여 대장암세포주인 HCT116에 대조군(Control)으로서 엑소좀(TK-CT), 표적 엑소좀(TK), PIN-siRNA를 장착한(si-pin) 엑소좀(si-pin TK-CT) 및 PIN-siRNA를 장착한(si-pin) 표적 엑소좀(si-pin TK)을 처리하였다. EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition) 기전에 관여하는 인자인 E-cad, snail 및 PIN1의 발현 수준을 비교함으로써, 변화를 관찰하였다(도 6).
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, PIN-siRNA를 장착한(si-pin) 엑소좀(si-pin TK-CT) 및 PIN-siRNA를 장착한(si-pin) 표적 엑소좀(si-pin TK)에서 E-cad의 발현 수준이 증가하고 Snail 및 PIN1의 발현 수준이 감소되어 EMT가 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 대장암세포주 HCT116 이식에 따른 대장암 동물 모델을 이용한 지방유래줄기세포 유래 표적 엑소좀의 효능 평가
BALB/C Nude mouse(in vivo)에 대장암세포주인 HCT116을 5x105으로 이식하여 대장암을 유도한 뒤, 지방유래줄기세포 유래　엑소좀을 이용한 대장암의 치료 효능을 확인하고자 하였다.
대조군(Control)으로서 엑소좀(tk-ct), 표적 엑소좀(tk), PIN-siRNA를 장착한(si-PIN1) 엑소좀(si-PIN1 tk-ct) 및 PIN-siRNA를 장착한(si-PIN1) 표적 엑소좀(si-PIN1 tk) 각각을 상기 구축된 종양모델에 Tail vein injection 방식으로 2주간 주입한 후, 마우스를 희생하여 대장암의 항 종양효과에 엑소좀이 미치는 영향을 확인하였다.
EMT(Epithelial to Mesenchymal Transition) 기전에 관여하는 인자인 E-cad, N-cad, vimentin, snail 및 PIN1의 발현 수준을 비교함으로써, 변화를 관찰하였다(도 7). 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, PIN-siRNA를 장착한(si-PIN1) 엑소좀(si-PIN1 tk-ct) 및 PIN-siRNA를 장착한(si-PIN1) 엑소좀(si-PIN1 tk)에서 E-cad의 발현 수준이 증가하고 N-cad, vimentin, snail 및 PIN1의 발현 수준이 감소되어 EMT가 억제됨을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 BALB/C Nude mouse(in vivo)에 대장암세포주인 HCT116을 5x105으로 이식하여 구축된 대장암 동물 모델에서의 외형 관찰 결과에 의하여도 도 8 및 도 9에 나타낸 바와 같이, PIN-siRNA를 장착한(siPIN) 엑소좀(TK-CT-Pin) 및 PIN-siRNA를 장착한(siPIN) 표적 엑소좀(TK-Pin)을 처리한 군에서 종양의 크기가 억제되는 경향을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드는 서열번호 1의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀인 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 엑소좀은 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산이 형질주입된 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 핵산은 miRNA, siRNA, shRNA,　안티센스 RNA 및 리보자임(ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 핵산인 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 엑소좀은 1 내지 50 μL/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포인 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포는 인체 또는 동물유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. (a) 지방유래줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 대장암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자를 도입하는 단계;
    (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포외소포체를 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 수득된 세포외소포체에 대장암 유발 유전자의 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 형질주입시키는 단계;를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀인 것을 특징으로 하는 대장암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법.
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