WO2022250268A1 - 약물전달물질로서의 위암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

약물전달물질로서의 위암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a gastric cancer-specific target exosome composition comprising exosomes transformed from a recombinant expression vector and uses thereof.
  • Gastric cancer is one of the most frequent cancers and a leading cause of cancer death in Korea and Asia.
  • the causes of gastric cancer include genetic factors, dietary habits, smoking, alcohol consumption, and Helicobacter pylori infection, and over the past decades, 5-year survival rates for gastric cancer have significantly improved due to early diagnosis and improved treatment techniques.
  • the late survival rate is still known to be less than 10% due to the difficulty of late detection and the high recurrence rate.
  • Currently used anticancer drugs include 5-FU, cisplatin, doxorubicin, mitomycin, etc., but these substances show renal and hepatotoxicity when used in excess for a long period of time, and have various side effects, so they are not specifically delivered to cancer cells, so it is difficult to apply them to the living body. There are limits.
  • exosomes are only 30-100 nm in size, but contain various substances such as proteins, nucleic acids, and lipids contained in progenitor cells. is a particle As the function of exosomes as intercellular information carriers is known, they are attracting attention as next-generation anticancer substances.
  • the present inventors made diligent efforts to develop gastric cancer-specific target extracellular vesicles as a drug delivery material, and as a result, confirmed that exosomes extracted from adipose-derived stem cells have the function of gastric cancer-targeted anticancer drugs, thereby completing the present invention. .
  • An object of the present invention is for the prevention or treatment of gastric cancer, including extracellular vesicles transformed with a recombinant expression vector into which a gene expressing a ligand that binds to a receptor of gastric cancer cells is inserted into a gene expressed in extracellular endoplasmic reticulum of stem cells.
  • a pharmaceutical composition including extracellular vesicles transformed with a recombinant expression vector into which a gene expressing a ligand that binds to a receptor of gastric cancer cells is inserted into a gene expressed in extracellular endoplasmic reticulum of stem cells.
  • Another object of the present invention is to introduce a gene expressing a ligand that binds to a gastric cancer cell receptor into a gene expressed in the extracellular endoplasmic reticulum of adipose-derived stem cells; (b) culturing the cells into which the gene has been introduced in a medium to obtain extracellular vesicles; And (c) transducing an HSP90 inhibitor into the obtained extracellular vesicles; to provide a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating gastric cancer, including.
  • One aspect of the present invention is to prevent or treat gastric cancer, including extracellular vesicles transformed with a recombinant expression vector into which a gene expressing a ligand that binds to a gastric cancer cell receptor is inserted into a gene expressed in the extracellular endoplasmic reticulum of stem cells. It provides a pharmaceutical composition for use.
  • the "expression vector" in the present invention may be selected from the group consisting of a linear DNA vector, a plasmid DNA vector, and a recombinant viral vector, but is not limited thereto, and conventional vectors used for transformation in the art are all of the present invention. can be used in the method of In one embodiment of the present invention, the expression vector may be a pDisplay vector.
  • ligand refers to a substance that binds to a receptor of gastric cancer cells when inserted into a gene expressed as an extracellular endoplasmic reticulum of stem cells and expressed as an extracellular endoplasmic reticulum.
  • the ligand may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • extracellular vesicle refers to a small sphere surrounded by a membrane derived from a cell, and the extracellular vesicle is an extracellular vesicle derived from nature, such as plants, animals, and microorganisms, or artificially prepared extracellular It may be an endoplasmic reticulum.
  • the cells may be cells isolated from natural organisms.
  • extracellular vesicles may be exosomes, ectosomes or microvesicles, but in one embodiment of the present invention, the “extracellular vesicles” may be exosomes.
  • exosome is a small membrane-structured vesicle secreted from various cells, and refers to a vesicle released into the extracellular environment after fusion of the polycystic body and the plasma membrane.
  • the exosomes may be derived from or isolated from adipose-derived stem cells.
  • the exo-some may have a diameter of 50 to 150 nm.
  • the exosomes may be included at a concentration of 1 to 50 ⁇ L/ml.
  • “Stem cells” in the present invention refers to cells of various origins as pluripotent cells capable of differentiating into various tissue cells when appropriate conditions are met in an undifferentiated state.
  • the stem cells may be bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells or adipose-derived stem cells.
  • the stem cells may be adipose-derived stem cells.
  • the bone marrow-derived stem cells, cord blood-derived stem cells, or adipose-derived stem cells may be human or animal-derived stem cells.
  • Adipose-derived stem cells in the present invention are stem cells derived from adipose tissue, and refer to cells having pluripotency and self-renewal ability, and the adipose-derived stem cells of the present invention are obtained through liposuction and various surgical operations. It can, but is not limited to this.
  • the exosome is transformed to express a ligand that binds to a receptor of gastric cancer cells in a gene expressed by exosomes of host cells such as stem cells, so that it can act as a target for gastric cancer cells it means.
  • the exosome may be additionally equipped with an HSP90 inhibitor.
  • the heat-shock protein families (HSPs) in the present invention are molecular chaperones that control the folding of client proteins through ATP-dependent structural changes to activate nascent proteins and repair damaged proteins.
  • a protein that aids in refolding or disassembly is crucial to the folding of client proteins through ATP-dependent structural changes to activate nascent proteins and repair damaged proteins.
  • the client protein avoids aggregation through binding with molecular chaperones, and their binding refers to proteins that help intracellular deposition through membrane translocation of the client protein.
  • Hsp90 the molecular chaperone function of Hsp90, one of the heat shock protein groups, is required for the stability and activation of various client proteins involved in cell signal transduction pathways. Cancer-causing mutations in client proteins require higher levels of Hsp90 function and lead to overexpression of Hsp90, and overexpressed Hsp90 compared to normal tissues is a common feature in cancer cells.
  • HER2, RAF, KIT and MET promote self-growth
  • CDK4, CDK6 and CyclinD reduce responsiveness to growth inhibitory signals
  • IGF-1R and AKT avoid apoptosis
  • hTERT is known to be correlated with the acquisition of infinite proliferative ability, HIF, MET, Src and VEGF with continuous vascular proliferation, and MET, MMP2 and Urokinase by influencing the signal transduction pathway corresponding to metastasis of cancer cells.
  • HSP90 inhibitor in the present invention is a substance that inhibits the expression and activity of HSP90, which induces the activity of a tumor factor, and means a substance that inhibits HSP90 whose activity is increased in gastric cancer.
  • the "HSP90 inhibitor” in the present invention may be a radicicol derivative, a geldanamycin derivative, a novobiocin derivative, or an artificially synthesized substance based on purine, , Specifically, it may be selected from the group consisting of STA-9090 (Ganetespib), NVP-AUY922 (Luminespib), 17-AAG (Tanespimycin), 17-DMAG (Alvespimycin), STA-4783 (Elesclomol) and AT13387 (Onlaespib). , In one embodiment of the present invention, the "HSP90 inhibitor” may be 17-DMAG.
  • Another aspect of the present invention is (a) introducing a gene expressing a ligand that binds to a gastric cancer cell receptor into a gene expressed in the extracellular endoplasmic reticulum of adipose-derived stem cells; (b) culturing the cells into which the gene has been introduced in a medium to obtain extracellular vesicles; And (c) transducing an HSP90 inhibitor into the obtained extracellular vesicles; it provides a method for preparing an expression vector for preventing or treating gastric cancer.
  • Extracellular vesicles in the present invention may be exosomes, ectosomes or microvesicles, but in one embodiment of the present invention, the "extracellular vesicles” may be exosomes have.
  • the "medium” in the present invention may be an adipose-derived stem cell culture medium.
  • the adipose-derived stem cell culture medium is DMEM high-low glucose medium or FBS-Free to which FBS (inactivated fetal bovine serum) and P/S (penicillin-streptomycin) are added.
  • the medium can be DMEM low glucose.
  • Prevention in the present invention refers to all activities that suppress or delay the onset of gastric cancer by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Treatment in the present invention refers to all activities in which symptoms of gastric cancer are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • gastric cancer refers to malignant tumors occurring in the stomach, including gastric adenocarcinoma occurring in the gastric mucosal epithelium and malignant lymphoma, myosarcoma, and stromal tumors occurring in the submucosa, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutical composition comprising a recombinant expression vector into which a gene expressing a ligand that binds to a gastric cancer cell receptor is inserted into a gene expressed in the extracellular vesicle of stem cells of the present invention, and an extracellular vesicle transformed with the expression vector
  • exosomes can be used as a drug delivery material to selectively bind to gastric cancer cells, which are target cells, and act specifically on gastric cancer. Therefore, the target exosome can be applied to the field of gastric cancer treatment, in particular, as a clinical application technology.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing how exosomes bind to cancer cells, which are target cells, by expressing a targeting ligand in exosomes through an expression vector.
  • 17-DMAG can specifically attack gastric cancer cells compared to normal cells according to transduction.
  • Figure 2 shows the vector construction in pDisplay for the expression of the recombinant protein of the present invention.
  • Figure 3 shows the results of analysis using transmission electron microscopy (TEM) and flow cytometry (FACS) for structural analysis of exosomes.
  • TEM transmission electron microscopy
  • FACS flow cytometry
  • FIG. 5 shows the expression levels of Ho-1, a protein that responds to oxidative stress in AGS, a gastric cancer cell line, cleaved PARP and caspase3, which are pro-apoptotic factors, and the anti-apoptotic factor, This is the result of confirming the expression level of Bcl-xl.
  • Figure 6 shows the expression levels of Ho-1, a protein that responds to oxidative stress in AGS, a gastric cancer cell line, cleaved PARP and caspase3, which are pro-apoptotic factors, and the anti-apoptotic factor, This is the result of confirming the expression level of Bcl-xl.
  • FIG. 7 shows the results of confirming the expression levels of catalase, an enzyme, and superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GPx), which are active oxygen defense factors, in AGS, a gastric cancer cell line.
  • SOD superoxide dismutase
  • GPx glutathione peroxidase
  • FIG. 8 shows the results of external observation in a gastric cancer animal model constructed by transplanting AGS, a gastric cancer cell line, into a BALB/C Nude mouse.
  • exosomes were extracted using adipose-derived stem cells.
  • adipose-derived stem cells were used as donor cells for producing target exosomes, but immune cells such as NK cells are also possible, so it is not limited thereto.
  • Amino acid sequence (GTT GAA ACT TCA CAG TAT TTC AGA GGG ACA CTG TCA) encoding gastric cancer cell targeting ligand in pDisplay vector (invitrogen) using transfection reagent (lipofectamine, invitrogen) for adipose-derived stem cells according to the manufacturer's instructions It was transduced with. After cloning the vector, the cloned result of the vector was confirmed (FIG. 2), and target exosomes were prepared by inserting into adipose-derived stem cells.
  • adipose-derived stem cells were prepared in DMEM low glucose medium supplemented with 10% FBS (inactivated fetal bovine serum) and 1% P/S (penicillin-streptomycin) at 37°C and 5% CO 2 condition. cultured with.
  • FBS inactivated fetal bovine serum
  • P/S penicillin-streptomycin
  • the medium was exchanged with FBS-Free DMEM low glucose, and after 24 hours after the medium exchange, the culture medium of adipose-derived stem cells was removed and centrifuged at 1000 rpm by differential centrifugation. cells were removed.
  • Gastric cancer target exosomes were obtained from the culture medium from which the cells were removed using a thermo exosome extraction kit (Thermo Fisher scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • 17-DMAG as an HSP90 inhibitor was transformed into the target exosomes using electroporation using Neon (invitrogen) on the target exosomes obtained through the above process, and the exosomes equipped with the HSP90 inhibitor was additionally produced.
  • Example 2 Analysis of characteristics of target exosomes derived from adipose-derived stem cells
  • exosomes isolated from the adipose-derived stem cell culture medium had a nanometer-sized spherical structure.
  • expression of CD81, CD63, and CD9, which are exosome surface markers was confirmed using flow cytometry (FACS), it can be seen that the isolated exosomes have typical characteristics of exosomes (FIG. 3).
  • target exosome (t-Exo) in gastric cancer cell line AGS and the target exosome (t-Exo+17-DMAG) equipped with 17-DMAG as an HSP90 inhibitor were treated for 24 hours and 48 hours through the MTT assay method. Cytotoxicity was measured.
  • Target exosomes (t-Exo) at concentrations of 0 and 12.5ul, target exosomes equipped with 17-DMAG as an HSP90 inhibitor (t-Exo+17-DMAG) at concentrations of 0, 10, 25, 50, 100 and 200nM was treated at a concentration of
  • Adipose-derived stem cell exosomes and adipose-derived stem cell gastric cancer-targeted exosomes loaded with 17-DMAG were treated with AGS gastric cancer cell lines, and the expression patterns of apoptosis-related factors were confirmed.
  • exosomes (ct) as a control and neon electroporation were not performed on gastric cancer cell line AGS.
  • Untreated target exosomes (0), neon electroporated target exosomes (Ele), and neon electroporated target exosomes equipped with 17-DMAG as an HSP90 inhibitor (Ele+DMAG) were treated for 24 hours and 48 hours Results were observed.
  • Ho-1 Heme oxygenase-1
  • Bcl-xl an anti-apoptotic factor
  • Adipose-derived stem cell exosomes and adipose-derived stem cell gastric cancer-targeted exosomes loaded with 17-DMAG were treated with AGS gastric cancer cell lines, and expression of antioxidant-related factors was confirmed.
  • exosomes compared to adipose-derived stem cell-derived exosomes, exosomes (con) as a control and target exosomes ( t-EXO), neon electroporated target exosome (t-EXO-ele) and neon electroporated target exosome (t-EXO-ele+DMAG) equipped with 17-DMAG as an HSP90 inhibitor for 24 hours, 48 The treatment was performed for an hour and the result was observed.
  • Catalase an enzyme that converts hydrogen peroxide into water and oxygen, is involved in decomposing free radicals that attack and oxidize human tissues and cells to promote cell aging, and SOD (superoxide dismutase) and GPx (glutathione peroxidase), which are active oxygen defense factors. Changes were observed by comparing the expression levels of (FIG. 7).
  • Example 6 Efficacy evaluation of adipose-derived stem cell-derived target exosomes using gastric cancer animal models following gastric cancer cell line AGS transplantation

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Abstract

본 발명은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 약학적 조성물 및 위암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법에 대한 것으로, 본 발명은 세포외소포체로서 엑소좀을 약물전달물질로서 활용하여 표적 세포인 위암 세포에 선별적으로 결합하여 위암을 표적으로 특이적 작용이 가능한 이점이 있다.

Description

약물전달물질로서의 위암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도
본 발명은 재조합 발현벡터로부터 형질전환된 엑소좀을 포함하는 위암 특이적 표적 엑소좀 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
위암은 가장 빈번하게 발생하는 암 중 하나이며 한국과 아시아에서 암 사망의 주요 원인에 해당한다. 현재　보고된 바에 따르면 위암의 원인은 유전적 요인, 식이 습관, 흡연, 알코올 소비 및 헬리코박터 파일로리 감염을 들 수 있으며, 지난 수십 년 동안 조기 진단 및 개선된 치료 기술로 인해　위암의 5년 생존율이 유의하게 증가하였지만, 후기 발견의 어려움과 높은 재발률로 인해 후기 생존율은 여전히 10% 미만으로 알려져 있다. 최근 암 조기검진사업이 시행됨에 따라　위암이 조기에 진단되는 경우가 늘고 있고, 조기위암　중에서 림프절 전이가 없는 경우에는 내시경적 절제술로 완치가 가능하지만, 림프절 전이를 완벽하게 예측할 수 없기 때문에 내시경적 절제술의 대상 환자를 선별하는데 한계가 있다.
현재 사용중인 항암제로서 5-FU, 시스플라틴, 독소루비신, 마이토마이신 등이 있으나, 상기 물질은 장기간 과량을 사용하면 신장 및 간독성을 나타내며 여러 부작용이 있어 암세포에 특이적으로 전달되지 아니하여 생체에 적용하기에는 한계가 있다.
한편, 엑소좀은 그 크기가 30-100nm에 불과하지만, 원세포에 들어있는 단백질, 핵산, 지질 등 여러 물질을 포함하고 있는 물질로서, 면역세포나 줄기세포 등 우리 지방유래줄기세포가 분비하는 나노입자이다. 엑소좀의 세포간 정보 전달체 역할을 하는 기능이 알려지면서 차세대 항암물질로 주목받고 있다.
이에, 본 발명자들은 약물전달물질로서의 위암 특이적 표적 세포외소포체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 지방유래줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 위암 표적 항암제의 기능이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 지방유래줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자를 도입하는 단계; (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포외소포체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 세포외소포체에 HSP90 억제제를 형질도입시키는 단계;를 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제조방법을 제공하는 것이다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 발명의 일 측면은 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 "발현벡터"는 선형 DNA 벡터, 플라스미드 DNA 벡터 및 재조합 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에서 형질전환을 위해 사용되는 통상적인 벡터들은 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　발현벡터는 pDisplay 벡터일 수 있다.
본 발명에서의 "리간드"는 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 내에 삽입되어 세포외소포체로 발현 시 위암 세포의 수용체와 결합하는 물질을 의미한다. 바람직하게, 상기 리간드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명에서의 "세포외소포체"는 세포에서 유래되는 막으로 둘러싸인 작은 구체를 의미하는 것으로, 상기 세포외소포체는 자연계, 예컨대 식물, 동물, 미생물로부터 유래된 세포외 소포체 또는 인공적으로 제조된 세포외소포체일 수 있다. 또한, 상기 세포는 자연계 생물 개체로부터 분리된 세포인 것일 수 있다.
상기 "세포외소포체"는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome) 또는 미세소포(microvesicle)일 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "세포외소포체"는 엑소좀일 수 있다.
본 발명에서의 "엑소좀"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭으로서, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　엑소좀은 지방유래줄기세포로부터 유래 또는 분리한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　엑소좀은 50 내지 150 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 엑소좀은 1 내지 50 μL/ml의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에서의 "줄기세포(stem cells)"는 미분화 상태에서 적절한 조건을 맞춰주면 다양한 조직 세포로 분화될 수 있는 만능세포로서 다양한 유래의 세포를 의미한다.
상기 줄기세포는 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　줄기세포는 지방유래줄기세포일 수 있다. 또한, 상기 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포는 인체 또는 동물유래 줄기세포인 것일 수 있다.
본 발명에서의 "지방유래줄기세포"는 지방 조직으로부터 유래한 줄기세포로서, 다분화능 및 자기증식능을 가진 세포를 의미하며, 본 발명의 지방유래줄기세포는 지방흡입술 및 다양한 외과적 수술을 통해 수득할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기　엑소좀은 줄기세포 등 호스트세포의 엑소좀으로 발현하는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키도록 형질전환되어 위암 세포에 표적으로 작용할 수 있는 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 엑소좀은 HSP90 억제제를 추가로 장착한 것일 수 있다.
본 발명에서의 열충격 단백질군(heat-shock protein families; HSPs)은 분자샤페론으로 ATP 의존적인 구조 변화를 통해 클라이언트 단백질(client protein)의 접힘을 조절하여 초기 단백질(nascent proteins)의 활성화, 손상된 단백질의 재접힘이나 분해를 도와주는 단백질을 의미한다. 또한, 클라이언트 단백질은 분자샤페론과의 결합을 통해 집합 현상(aggregation)을 회피하며 이들의 결합은 클라이언트 단백질의 막 이동(membrane translocation)을 통해 세포내 퇴적(intracellular deposition)을 도와주는 단백질을 의미한다.
한편, 상기 열충격 단백질군의 하나인　Hsp90의 분자 샤페론 기능은 세포의 신호 전달 경로에 관계 있는 다양한 클라이언트 단백질의 안정성과 활성화에 필요하다고 알려져 있다. 클라이언트 단백질의 암유발 돌연변이는 더 높은 수준의　Hsp90　기능을 요구하고　Hsp90의 과발현으로 이어지게 되며, 정상 조직과 대비하여 과발현된　Hsp90은 암세포에서 나타나는 공통된 특징이다.
상기 HSP90 클라이언트 단백질과 연관된 암의 속성으로서, HER2, RAF, KIT 및 MET는 자가 성장 촉진, CDK4, CDK6 및 CyclinD는 성장 억제 신호에 대한 반응성 저하, IGF-1R 및 AKT는 세포 사멸과정으로부터의 회피, hTERT는 무한 증식능력의 획득, HIF, MET, Src 및 VEGF는 지속적인 혈관 증식, MET, MMP2 및 Urokinase은 암세포의 전이에 해당하는 신호 전달 경로에 영향을 주어 상관관계가 있다고 알려져 있다
본 발명에서의 "HSP90 억제제"는 종양인자의 활성을 유도하는 HSP90의 발현 및 활성을 억제하는 물질로서, 위암에서 활성도가 증가되어 있는 HSP90를 억제하는 물질을 의미한다.
본 발명에서의 "HSP90　억제제"는 라디시콜(Radicicol) 유도체, 겔다나마이신(Geldanamycin) 유도체, 노보비오신(Novobiocin) 유도체, 또는 퓨린(Purine)을 기본으로 한 인공적으로 합성된 물질 등일 수 있으며, 구체적으로 STA-9090(Ganetespib), NVP-AUY922(Luminespib), 17-AAG(Tanespimycin),　17-DMAG(Alvespimycin), STA-4783(Elesclomol) 및 AT13387(Onlaespib)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "HSP90 억제제"는 17-DMAG일 수 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 측면은 (a) 지방유래줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자를 도입하는 단계; (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포외소포체를 수득하는 단계; 및 (c) 상기 수득된 세포외소포체에 HSP90 억제제를 형질도입시키는 단계;를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법을 제공한다.
본 발명에서의 "세포외소포체"는 엑소좀(exosome), 엑토솜(ectosome) 또는 미세소포(microvesicle)일 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 "세포외소포체"는 엑소좀일 수 있다.
본 발명에서의 "배지"는 지방유래줄기세포 배양배지인 것일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 지방유래줄기세포 배양배지는 지방유래줄기세포를 FBS(inactivated fetal bovine serum) 및 P/S(penicillin-streptomycin)을 첨가한 DMEM high low glucose 배지 또는 FBS-Free DMEM low glucose로 배지일 수 있다.
본 발명에서의 “예방”은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 위암을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서의 “치료”는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 위암에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서의 "위암(gastric cancer)"은 위에 생기는 악성 종양으로, 위 점막상피에서 생기는 위선암과 점막하층에서 생기는 악성림프종, 근육육종, 간질성 종양 등을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 약학적 조성물은 세포외소포체로서 엑소좀을 약물전달물질로서 활용하여 표적 세포인 위암 세포에 선별적으로 결합하여 위암에 특이적으로 작용할 수 있다. 따라서, 상기 표적 엑소좀은 위암 치료 분야, 특히 임상적 적용 기술로 응용될 수 있다.
도 1은 발현벡터를 통하여 엑소좀에 타겟팅 리간드를 발현시켜 표적 세포인 암세포에 엑소좀이 결합하는 모습을 나타낸 모식도이다. 위암 표적 엑소좀을 처리 시 17-DMAG가 형질도입(transduction)에 따라 정상세포 대비 위암세포를 특이적으로 공격할 수 있다.
도 2는 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 위한 pDisplay에서의 벡터 구성을 나타낸 것이다.
도 3은 엑소좀에 대한 구조 분석을 위하여 투과전자현미경(TEM) 및 유세포분석기 (FACS)을 이용하여 분석한 결과이다.
도 4는 MTT assay 방법을 통하여 엑소좀의 세포 독성 평가한 결과이다.
도 5는 위암세포주인 AGS에서의 산화 스트레스에 반응하는 단백질인 Ho-1, 세포사멸 인자(pro-apoptotic factor)인 cleaved PARP 및 caspase3의 발현 수준 및 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic factor)인 Bcl-xl의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 6은 위암세포주인 AGS에서의 산화 스트레스에 반응하는 단백질인 Ho-1, 세포사멸 인자(pro-apoptotic factor)인 cleaved PARP 및 caspase3의 발현 수준 및 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic factor)인 Bcl-xl의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 7은 위암세포주인 AGS에서의 효소인 Catalase, 활성산소 방어인자인 SOD(superoxide dismutase)와 GPx(glutathione peroxidase)의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 8은 BALB/C Nude mouse에 위암세포주인 AGS을 이식하여 구축된 위암 동물 모델에서의 외형 관찰 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀　제작 및 확인
본 발명의 위암에 특이적으로 작용하는 표적 엑소좀을 제작하기 위하여 지방유래줄기세포를 사용하여 엑소좀을 추출하였다. 참고적으로, 본 발명에서는 표적 엑소좀을 생산하기 위한 donor cells로서 지방유래줄기세포를 사용하였지만, NK세포와 같은 면역세포도 가능하므로, 이에 한정하지 않는다.
지방유래줄기세포를 제조사의 지침에 따라 형질감염시약(lipofectamine, invitrogen)을 사용하여 pDisplay 벡터(invitrogen)에 위암세포 표적 리간드를 인코딩하는 아미노산 서열(GTT GAA ACT TCA CAG TAT TTC AGA GGG ACA CTG TCA)로 형질도입(transduction)시켰다. 상기 벡터를 클로닝한 후 해당 벡터가 클로닝된 결과를 확인하였으며(도 2), 지방유래줄기세포에 삽입하여 표적 엑소좀을 제작하였다.
제작된 표적 엑소좀을 추출하기 위하여 지방유래줄기세포를 10% FBS(inactivated fetal bovine serum) 및 1% P/S(penicillin-streptomycin)을 첨가한 DMEM low glucose 배지에서 37℃, 5% CO2조건으로 배양하였다.
24시간 경과 후 상기 배지를 FBS-Free DMEM low glucose로 배지를 교환하였으며, 배지 교환 후 24시간 경과 후 지방유래줄기세포의 배양 배지를 걷어 분별원심분리(differential centrifugation) 방법으로 1000rpm조건으로 원심분리하여 세포를 제거하였다.
상기 세포가 제거된 배양 배지를 thermo exosome 추출 kit(Thermo Fisher scientific)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 위암 표적 엑소좀을 확보하였다.
여기에, 상기 과정을 통하여 확보한 표적 엑소좀에 Neon(invitrogen)을 사용하여 HSP90 억제제로서 17-DMAG을 전기천공법(electroporation)을 사용하여 표적 엑소좀 내에 형질전환하여 HSP90 억제제를 장착한 엑소좀을 추가적으로 제작하였다.
실시예 2. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀의 특성 분석
본 발명의 위암에 특이적으로 작용하는 표적 엑소좀에 대한 구조 분석을 위하여 투과전자현미경(TEM) 및 유세포분석기 (FACS)을 이용하여 분석하였다. 이에 대한, 엑소좀의 FACs,　TEM　분석 결과를 도 3에 나타내었다.
지방유래줄기세포 배양액에서 분리된 엑소좀은 나노미터 단위의 미세한 구형 구조를 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 유세포분석기 (FACS)를 이용하여 엑소좀 표면 마커인　CD81, CD63, 및 CD9의 발현이 확인됨에 따라 분리된 엑소좀은 전형적인 엑소좀의 특성을 갖는 것을 알 수 있다(도 3).
실시예 3. 지방유래줄기세포 유래의　표적 엑소좀의 세포 독성 평가
위암 세포주인 AGS에 표적 엑소좀(t-Exo) 및 HSP90 억제제로서 17-DMAG을 장착한 표적 엑소좀(t-Exo+17-DMAG)에 MTT assay 방법을 통하여 24시간, 48시간 동안 처리 시의 세포독성을 측정하였다. 표적 엑소좀(t-Exo)은 0 및 12.5ul의 농도로, HSP90 억제제로서 17-DMAG을 장착한 표적 엑소좀(t-Exo+17-DMAG)은 0, 10, 25, 50, 100 및 200nM의 농도로 처리하였다.
이 후, cell viability를 측정한 결과, 17-DMAG의 농도 의존적으로 cell viability가 감소하는 경향을 확인할 수 있었다(도 4).
실시예 4. 위암세포주인 AGS에서의 지방유래줄기세포 유래 표적 엑소좀의 효능 평가(1)
지방유래줄기세포 엑소좀과 지방유래줄기세포 위암 표적 엑소좀에 17-DMAG를 장착한 엑소좀을 AGS 위암 세포주에 처리 후, apoptosis 관련인자의 발현 양상을 확인하였다.
지방유래줄기세포 유래 엑소좀 대비 본 발명에 따른 재조합 벡터가 클로닝된 지방유래줄기세포 유래 위암 표적 엑소좀의 항암 효능을 평가하기 위하여 위암세포주인 AGS에 대조군으로서의 엑소좀(ct), neon electroporation 진행하지 않은 표적 엑소좀(0), neon electroporation 진행한 표적 엑소좀(Ele) 및 neon electroporation을 진행하여 HSP90 억제제로서 17-DMAG을 장착한 표적 엑소좀(Ele+DMAG)을 24시간, 48시간 동안 처리하여 결과를 관찰하였다.
TNF-alpha가 유도하는 apoptosis를 억제할 수 있는 산화 스트레스에 반응하는 단백질인 Ho-1(Heme oxygenase-1), 세포사멸 기전에 관여하는 세포사멸 인자(pro-apoptotic factor)인 cleaved PARP 및 caspase3의 발현 수준 및 항-세포사멸 인자(anti-apoptotic factor)인 Bcl-xl의 발현 수준을 비교함으로써, 변화를 관찰하였다(도 5 및 도 6).
그 결과, 도 5 및 도 6에 나타낸 바와 같이, HSP90 억제제인 17-DMAG를 장착한 엑소좀을 AGS 위암 세포주에 처리한 군에서 위암 세포주의 사멸을 억제하는데 관여하는 HO-1의 발현이 감소되는 경향을 확인할 수 있었으며, pro-apoptosis에 관여하는 인자인 caspase3, cleaved PARP의 발현은 증가하고, anti-apoptosis에 관여하는 인자인 Bcl-xl의 발현은 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.
실시예 5. 위암세포주인 AGS에서의 지방유래줄기세포 유래 표적 엑소좀의 효능 평가(2)
지방유래줄기세포 엑소좀과 지방유래줄기세포 위암 표적 엑소좀에 17-DMAG를 장착한 엑소좀을 AGS 위암 세포주에 처리 후, 항산화 관련 인자의 발현을 확인하였다.
지방유래줄기세포 유래 엑소좀 대비 본 발명에 따른 재조합 벡터가 클로닝된 지방유래줄기세포 유래 위암 표적 엑소좀의 항암 효능을 평가하기 위하여 위암세포주인 AGS에 대조군으로서의 엑소좀(con), 표적 엑소좀(t-EXO), neon electroporation 진행한 표적 엑소좀(t-EXO-ele) 및 neon electroporation 진행하여 HSP90 억제제로서 17-DMAG을 장착한 표적 엑소좀(t-EXO-ele+DMAG)을 24시간, 48시간 동안 처리하여 결과를 관찰하였다.
인체의 조직과 세포를 공격하고 산화시켜 세포노화를 촉진시키는 활성산소를 분해하는데 관여하고 과산화 수소를 물과 산소로 바꾸는 효소인 Catalase, 활성산소 방어인자인 SOD(superoxide dismutase)와 GPx(glutathione peroxidase)의 발현 수준을 비교함으로써, 변화를 관찰하였다(도 7).
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, HSP90 억제제인 17-DMAG를 장착한 엑소좀을 AGS 위암 세포주에 처리한 군에서 catalase의 발현이 감소되는 경향을 확인할 수 있었으며, SOD 및 GPx과 같은 활성산소 방어인자들의 발현도 감소하는 경향을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 위암세포주 AGS 이식에 따른 위암 동물 모델을 이용한 지방유래줄기세포 유래 표적 엑소좀의 효능 평가
BALB/C Nude mouse(in vivo)의 둔부에 위암세포주인 AGS을 5x105으로 이식하여 위암을 유도한 뒤, 지방유래줄기세포 유래　엑소좀을 이용한 위암의 치료 효능을 확인하고자 하였다.
대조군으로서의 엑소좀(ct), 표적 엑소좀(tEXO), neon electroporation 진행한 표적 엑소좀(tEXO-ec) 및 neon electroporation 진행하여 HSP90 억제제로서 17-DMAG을 장착한 표적 엑소좀(tEXO-eDMAG) 각각을 상기 구축된 종양모델에 Tail vein injection 방식으로 2주간 주입한 후, 마우스를 희생하여 위암의 항 종양효과에 엑소좀이 미치는 영향을 확인하였다.
상기 BALB/C Nude mouse(in vivo)에 위암세포주인 AGS을 5x105으로 이식하여 구축된 위암 동물 모델에서의 외형 관찰 결과에 의하여 17-DMAG 장착 표적 엑소좀 처리한 군에서 종양의 크기가 억제되는 경향을 확인할 수 있었다(도 8).
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터로 형질전환된 세포외소포체를 포함하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀인 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 엑소좀은 HSP90 억제제를 추가로 장착한 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 HSP90 억제제는 17-DMAG 인 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 상기　엑소좀은 1 내지 50 μL/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포인 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 골수유래줄기세포, 제대혈유래줄기세포 또는 지방유래줄기세포는 인체 또는 동물유래 줄기세포인 것을 특징으로 하는 위암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. (a) 지방유래줄기세포의 세포외소포체로 발현되는 유전자 내에 위암 세포의 수용체와 결합하는 리간드를 발현시키는 유전자를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 유전자가 도입된 세포를 배지에서 배양하여 세포외소포체를 수득하는 단계; 및
    (c) 상기 수득된 세포외소포체에 HSP90 억제제를 형질도입시키는 단계;를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀인 것을 특징으로 하는 위암 예방 또는 치료용 발현벡터 제조방법.
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CN115025234A (zh) * 2021-06-22 2022-09-09 姜海涛 一种胃靶向载药外泌体及应用和治疗胃部疾病的药物

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