KR20230013009A - 세포외 소포체 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표면 개질된 세포외 소포체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 표면개질된 세포외 소포체는 체내 안정성 증가에 따라 효과적인 담체로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포외 소포체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV)는 세포외 환경으로 세포외 소포체 생산 세포에 의해 방출된 나노 크기의 소포이다. 세포외 소포체 중 엑소좀은 세포 내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 소포체이다. 엑소좀은 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포 밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여, 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병 진행 등에 관여하는 것으로 알려져있다. 또한, 엑소좀은 합성을 통해 제작되는 리포좀과 다르게 자연에서 유래되어 생성되는 소포체로서 독성이 낮고 면역원성이 낮아 약물 전달체로 폭넓게 활용되고 있다. 그 외에도, 엑소좀 표면은 개질이 용이하여 다양한 리간드 (펩티드, 항체, 엡타머등)를 결합시키거나, 엑소좀 내부에 다양한 형태의 약물을 탑재할 수 있으며 동결건조가 가능하다는 특징을 가지므로 생산성 및 안정성이 우수하다.
하지만 이와 같은 엑소좀 또는 엑소좀 유사체를 생체에 주입할 경우, 빠른 시간 안에 거의 대부분 간이나 비장의 면역세포에 섭취된 후 오랫동안 머물러 표적 병변 부위, 즉 암 조직 또는 염증부위에 도달하는 효율이 매우 낮을 뿐 아니라, 정상적인 조직에서 부적절하게 축적되는 문제점이 존재한다. 이러한 문제점은 인지질, 다당류, 단백질 등으로 구성된 엑소좀 표면의 성질로 인한 것이다. 따라서, 생체분포 거동을 제어하기 위해서는 표면을 효과적으로 개질하여 간조직의 비특이적 섭취를 줄이고 혈액에서 순환시간을 늘려 타겟 병변 부위에 도달하는 효율을 증대시킬 수 있는 기술이 요구된다.
본 발명은 세포외 소포체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질이 삽입된 인지질 이중층을 포함하고, 상기 폴리에틸렌글리콜은 적어도 일부가 인지질 이중층 외부 표면에 노출된 것인 세포외 소포체.
2. 위 1에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디펙사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디나노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민(DSPE), 1,2-디노나데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도일-sn- 글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헤나라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2- 디베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디트리코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), L-α-포스파티딜콜린 (HSPC), 1-미리스토일-2-스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC) 및 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (MPPC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 인지질에 폴리에틸렌이 결합된 것인 세포외 소포체.
3. 위 1에 있어서, 상기 세포외 소포체는 입경이 50 내지 300nm인, 세포외 소포체.
4. 위 1에 있어서, 인지질 이중층에 삽입된 형광염료를 더 포함하는, 세포외 소포체.
5. 위 1 내지 4 중 어느 한 항의 세포외 소포체를 포함하는 조영제 조성물.
6. 용매 중에서 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 혼합하고 교반하는 단계를 포함하는 세포외 소포체의 제조방법.
본 발명의 세포외 소포체는 생체적합성이 뛰어나다.
본 발명의 세포외 소포체는 혈액 내 안정성이 우수하고, 체내 장기간 순환할 수 있다.
도 1은 표면개질 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV) 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 인지질 분자를 표시하고, 유기용매를 활용한 세포외 소포체 표면에 폴리에틸렌글리콜을 표지하는 기술을 개략적으로 나타내었다.
도 2는 표면개질을 한 EV-DSPE-PEG2k를 얻기 위한 주요 단계를 나타낸다.
도 3은 표면개질하지 않은 EV와 표면개질을 한 EV-DSPE-PEG2k의 크기, 다분산 지수(Polydispersity Index) 및 제타 전위(zeta potential)을 비교한 결과이다.
도 4는 형광 표지한 EV와 표면개질한 EV의 크기 및 다분산 지수(Polydispersity Index)를 비교한 결과이다
도 5는 형광 염료로 염색한 EV의 폴리에틸렌글리콜 양 최적화를 위한 크기 및 안정도를 비교한 결과이다.
도 6은 형광 염료로 염색한 EV에 대한 최적화된 DSPE-PEG2k의 농도로 재현성 실험을 진행한 결과이다.
도 7은 나노입자 추적분석 및 투과 전자 현미경을 통해 최종적으로 형성한 나노입자의 물리적 특성을 재확인한 결과이다.
도 8은 표면개질을 하지 않은 EV와 DSPE-PEG로 표면개질을 한 EV의 체내 순환을 형광 이미징으로 확인한 결과이다.
도 2는 표면개질을 한 EV-DSPE-PEG2k를 얻기 위한 주요 단계를 나타낸다.
도 3은 표면개질하지 않은 EV와 표면개질을 한 EV-DSPE-PEG2k의 크기, 다분산 지수(Polydispersity Index) 및 제타 전위(zeta potential)을 비교한 결과이다.
도 4는 형광 표지한 EV와 표면개질한 EV의 크기 및 다분산 지수(Polydispersity Index)를 비교한 결과이다
도 5는 형광 염료로 염색한 EV의 폴리에틸렌글리콜 양 최적화를 위한 크기 및 안정도를 비교한 결과이다.
도 6은 형광 염료로 염색한 EV에 대한 최적화된 DSPE-PEG2k의 농도로 재현성 실험을 진행한 결과이다.
도 7은 나노입자 추적분석 및 투과 전자 현미경을 통해 최종적으로 형성한 나노입자의 물리적 특성을 재확인한 결과이다.
도 8은 표면개질을 하지 않은 EV와 DSPE-PEG로 표면개질을 한 EV의 체내 순환을 형광 이미징으로 확인한 결과이다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합된 인지질이 삽입된 인지질 이중층을 포함하고, 상기 폴리에틸렌글리콜은 적어도 일부가 인지질 이중층 외부 표면에 노출된 것인 세포외 소포체에 관한 것이다.
세포외 소포체는 세포간 물질인 단백질, 지질, 유전물질의 교환을 가능하게 하며 생리적, 병리적으로 신호를 전달하는 매개체로 기능하며, 크게는 엑소좀과 마이크로베시클로 분류할 수 있으며, 다양한 세포로부터 유래된 엑토좀, 마이크로파티클, 막 소포체, 나노베시클, 외막 소포체를 포함하는 개념일 수 있다. 또한, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 것이라면 세포외 소포체의 유래는 제한되지 않는 것으로, 그 유래는 예를 들면 적혈구, 단핵구, 대식세포 또는 혈액 줄기세포로부터 유래한 세포외 소포체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"표면 개질"이란 폴리에틸렌글리콜의 적어도 일부가 인지질 이중층 외부 표면에 노출된 것을 말한다. 폴리에틸렌글리콜의 적어도 일부 또는 전체가 외부 표면에 노출된 것일 수 있다. 세포외소포체의 표면 개질은 예를 들면 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 인지질 이중층에 삽입시켜 수행될 수 있다.
상기 세포외 소포체는 공지된 방법을 통해 얻어지는 모든 세포외 소포체를 의미한다. 예를 들어, 세포를 압출시켜 얻거나, 구체적으로는 적혈구, 단핵구, 대식세포 또는 혈액 줄기세포를 투과막의 구멍 크기가 큰 것부터 작은 순서로 차례대로 투과시키는 방식으로 수득되는 것일 수 있으나, 이러한 방식에 제한되는 것은 아니다.
폴리에틸렌글리콜은 인지질 분자로 이루어진 인지질 이중층 사이에 위치한 단백질에 결합하거나 폴리에틸렌글리콜이 인지질 분자 사이에 삽입될 수 있는 것으로, 보다 구체적으로는 폴리에틸렌글리콜과 결합한 인지질이 세포막 융합(cell membrane fusion) 또는 세포내 이입(endocytosis) 에 의해 인지질 이중층을 이루는 인지질 분자 사이에 삽입될 수 있는 것으로, 이는 유기용매에 분산되어 있는 폴리에틸렌글리콜과 결합된 인지질이 세포외 소포체와 직접적으로 반응하여 삽입되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 세포외 소포체는 상기 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질 분자를 특정 비율로 반응시켜 얻는 것일 수 있으며, 그 비율은 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질 분자가 인지질 이중층을 이루고 있는 인지질 분자들에 적절히 삽입될 수 있는 비율이라면 특정 비율에 제한되지 않는 것으로, 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체 1 중량부에 대해 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질 분자의 비율은 예를 들면 1 내지 100 중량부, 1 내지 75 중량부, 1 내지 50 중량부, 1 내지 25 중량부, 또는 1 내지 15 중량부일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌글리콜은 인지질 이중층의 외부에 노출되도록 인지질 분자와 결합하여 세포외 소포체의 체내 안정성을 증대시킬 수 있는 것이라면 그 분자량은 제한되지 않는 것으로, 분자량은 예를 들면 1 내지 10 kDa, 2 내지 8 kDa 또는 2 내지 5 kDa일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질에서 상기 인지질은 폴리에틸렌글리콜이 결합될 수 있는 경우 그 종류에 제한이 없다. 예를 들면, 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디펙사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디나노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민(DSPE), 1,2-디노나데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헤나라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디트리코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), L-α-포스파티딜콜린(HSPC), 1-미리스토일-2-스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC) 또는 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MPPC)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인지질 이중층을 구성하는 인지질은 그 종류에 제한이 없다. 예를 들면, 동물 세포, 식물 세포를 포함하는 진핵세포의 인지질을 구성하는 인지질이면 모두 포함될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질이 삽입된 인지질 이중층은 공지의 방법으로 얻어진 것일 수 있다. 예를 들어, 세포외 소포체를 구성하는 인지질과 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 혼합할 수 있고, 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 혼합할 수도 있다. 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질은 개별 인지질 상태일 수도 있고, 이들이 복수개 결합된 마이셀 형태일 수도 있다.
상기 인지질 이중층에는 단백질, 콜레스테롤, 형광염료 등을 더 포함시킬 수 있다. 예를들어, 상기 콜레스테롤 분자는 폴리에틸렌글리콜이 더 결합될 수 있으며, 상기 폴리에틸렌글리콜은 상기 이중층의 외부로 노출되어, 표면 개질 세포외 소포체를 제공할 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외 소포체에는 활성물질 등을 더 포함시킬 수 있다. 예를들어, 상기 활성물질은 인지질 이중층에 삽입된 것일 수 있고, 세포외 소포체 내부에 담지된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 활성물질은 예를들어 저분자화합물, 지용성화합물, 단백질, mRNA, siRNA 또는 miRNA 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외 소포체의 입경은 50 내지 300 nm, 60 내지 275 nm, 70 내지 250 nm, 80 내지 225 nm가 될 수 있고, 바람직하게는 80 내지 225 nm가 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포외 소포체는 조영제로 사용 될 수 있다.
상기 조영제로 사용되는 경우, 세포외 소포체는 조영물질을 포함 할 수 있다. 예를 들어, 조영 물질은 형광 물질 또는 방사성 동위원소를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 용매 중에서 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 혼합하고 교반하는 단계를 포함하는 세포외 소포체의 제조방법을 제공한다.
상기 세포외 소포체, 인지질 이중층 및 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질은 상기 설명한 것과 같다.
상기 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 혼합하는 방법에는 예를 들어, 동일 용매에 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 담아 혼합하는 방법, 다른 종류의 용매에 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 담아 각 용매를 혼합하는 방법이 있을 수 있으며, 상기 용매의 종류는 수용성 용매 또는 유기용매가 될 수 있고, 바람직하게 상기 수용성 용매는 PBS, 상기 유기용매는 메탄올이 될 수 있으나, 이에 제한 되지않는다.
상기 교반하는 방법은 당업자에 공지된 방법이라면 제한 없이 사용 할 수 있다. 예를 들어, 초음파 교반, 가열 교반, vortexing 등의 방법이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반시 반응시키는 온도는 세포외 소포체의 인지질 이중층 사이에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질 분자가 균일하게 삽입될 수 있는 온도면, 특정 온도에 제한되지 않으나, 반응 온도는 예를 들면, 4 내지 70 ℃, 10 내지 50 ℃, 15 내지 45 ℃, 20 내지 40 ℃, 또는 30 내지 40 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 교반시 반응시키는 pH는 세포외 소포체의 인지질 이중층 사이에 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질 분자가 균일하게 삽입될 수 있는 pH라면, 특정 pH 조건에 제한되지 않으나, pH 조건은 예를 들면 4 내지 10, 5 내지 9, 5.5 내지 8, 또는 6 내지 10일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용매의 교반시 혼합 비율은 세포외 소포체 대비 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질의 중량비가 200 내지 50 대 1, 175 내지 60 대 1, 150 내지 70 대 1, 125 내지 80 대 1이 될 수 있으나, 바람직하게는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 125 내지 80 대 1이 될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리에틸렌글리콜은 외부에로 노출되어 표면개질 세포외 소포체의 체내 안정성을 증대시킬 수 있는 것이라면 그 분자량은 제한되지 않는 것으로, 분자량은 전술한 바와 같다.
본 발명의 표면개질 세포외 소포체 제조방법에 이용되는 표면개질 대상이 되는 세포외 소포체의 종류, 유래, 내부에 탑재되는 물질의 종류 및 인지질 분자의 종류는 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
제조예.
(1) 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EV) 합성을 위한 세포 준비
실험을 위해서 배양하는 세포는 Raw264.7로 쥐에서 유래된 단핵구이다. 세포를 5 x 107 개만큼 준비하여 DPBS (Dulbecco's phosphate buffered saline) 15 mL에 모아 준비한다. Raw264.7 세포를 M1 유형 대식세포로 분화시키기 위해 LPS (Lipopolysaccharides) 100 μg/mL, IFN-γ (Interferon gamma) 20 μg/mL만큼 처리한다. 물질 처리 후 24시간이 경과하면 세포 긁개(SPL)를 이용하여 세포를 다 떼어내고 원심분리를 이용하여 세포를 모은 뒤, 한번 용출 시 109 세포/mL 로 PBS (phosphate buffer saline) 10 mL에 준비한다.
(2) 나노입자 준비
소형 용출기 (mini-extruder, AVANTI, CAT# 610000)를 이용하여 세포를 용출한다. 아래 그림과 같이 용출 주사기 및 투과막을 위치하며, 10, 5, 1, 0.4 μm의 4가지 종류의 구멍 크기가 존재하는 투과막 (Polycarbonate membrane)을 사용한다. 한 번 용출할 때의 부피는 1 mL로 좌우로 8회 용출하며, Polycarbonate membrane (Whatman, cyclopore, pore size: 10, 5, 1, 0.4 μm)로 투과막의 구멍 크기가 큰 것부터 작은 순서로 차례대로 용출한다.
용출을 마친 용액은 100,000 × g, 90분 동안 초고속 원심분리기(Optima MAX-TL)를 이용하여 원심분리를 진행한다. 원심분리를 마친 후 상층액은 버리고 침전물을 1 mL의 PBS로 재부유한 뒤, 0.22 μm 구멍 크기의 주사기 필터에 여과하여 얻어진 용액을 BCA assay를 통해 단백질양을 기준으로 정량한다.
(3) 나노입자 페길화 (PEGylation)
시료의 단백질 양 기준 EV 100 μg을 400 μL의 PBS에 준비한다. 이 후, 18:0 PEG2000 PE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) 1mg을 4μL 메탄올에 녹이고 이를 EV가 포함된 용액에 넣는다. 32 ℃에서 1시간 동안 200 rpm으로 섞는다. 반응을 보낸 후 EV 용액은 PD-10 칼럼 (Disposable PD 10 desalting column, Sigma, GE17-0851-01)에 통과시켜 EV로부터 반응이 되지 않은 18:0 PEG2000 PE를 분리하여 준비한다. 과정에서 샘플 일루젼 및 모든 상충용액은 PBS를 이용하며, 실험적 분석을 위해서도 PBS를 사용한다.
(4) 형광 염색 (fluorescence labeling)
페길화되지 않은 시료의 형광 염색을 위해 DiR (DilC18(7) (1,1’-Dioctadecyl-3,3,3,3’-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide)를 사용한다. 2 mg/mL의 농도로 에탄올에 녹여져 있는 형광 염료를 220 μg 넣는다. 32 ℃에서 1시간 동안 200 rpm으로 섞는다.
페길화된 시료의 형광 염색을 위해서는 동일한 DiR 을 사용하되 폴리에틸렌글리콜을 시료에 섞는 시점에 형광 염료를 넣고, 32℃에서 1시간 동안 200 rpm으로 섞는다.
(5) 동물 실험
체내 순환 이미지를 얻기 위해 형광염색된 시료를 준비한다. 시료는 단백질양 기준 20 ug으로 쥐의 꼬리정맥을 통해 주입한다. 0, 3, 12, 24 시간대 별로 IVIS (in vivo fluorescence system) 영상을 얻는다. 24 시간대 체내 순환 영상을 얻은 뒤에는 장기를 적출하여 형광 신호를 확인한다.
실험예.
(1) Bare EV 및 표면개질을 한 EV-DSPE-PEG
2k
의 물리적 특성 비교
표면개질을 하지 않은 EV와 EV-DSPE-PEG2k의 크기가 매우 유사함을 확인하였다(도 3). 둘 사이의 다분산 지수(polydispersity index)도 거의 유사하여, 두 입자는 비슷한 크기 분포를 띄고 있음을 확인할 수 있었지만 표면개질 후에 나노입자의 제타전위가 중성에 가까워지는 것을 확인하였다. 이는 혈장 내 환경에서도 전기적으로 양성인 단백질이 달라붙어 응고체를 형성한 뒤 간, 폐에 분포한 대식세포에 쉽게 탐식되지 않을 것으로 예상할 수 있다.
(2) 형광 표지한 나노입자의 물리적 특성 비교
인터칼레이션 형광염료를 이용하여 나노입자를 표지한 결과를 비교하였을 때, DSPE-PEG2k를 이용하여 표면개질한 경우 그 크기의 차이가 크지 않지만, 보통의 EV는 그 크기가 현저히 커지는 것을 확인하였다. 추가적으로 분산도는 DSPE-PEG2k를 이용해 표면개질을 진행한 경우가 더 크게 확인되었다 (도 4).
(3) 인터칼레이션 형광 염료로 염색한 EV의 PEG양 최적화를 위한 크기 및 안정도 비교
표면개질을 진행하였을 때 가장 안정적인 폴리에틸렌글리콜의 양을 확인하고자 하였다. 안정도 확인을 위해 합성 직후 Dynamic light scattering (DLS)을 통해 분산도를 측정함과 동시에 7일차까지 0, 1, 3, 7일에 해당하는 시점에 크기를 확인했다. 그 결과 DSPE-PEG2k를 사용한 경우 3일차까지는 크기가 유사했으며, 0.5 μmol의 폴리에틸렌글리콜을 넣어준 경우, 7일차에 크기가 불안정하게 증가함을 확인하였다. 분산도는 DSPE-PEG2k를 이용하여 표면개질을 한 두 경우 모두 증가하였지만, 나노입자 샘플이 단일분산을 띄고 있다고 야기할 정도로 분산도가 높지 않았다 (도 5).
또한, 최적화된 DSPE-PEG2k의 양으로 재현성 실험을 진행한 결과, 도5와 마찬가지로 그 크기가 유사하게 유지됨을 확인하였으며, 다분산 수치도 역시 합성 후 7일차까지 낮은 것을 확인할 수 있었다 (도 6).
(4) DiR labeled EV - DSPE-PEG
2k
나노입자의 물리적 특성 확인
나노입자 추적분석 및 투과 전자 현미경을 통해 최종적으로 형성한 나노입자의 물리적 특성을 재확인하였다(도 7). 크기는 100 내지 200 nm에 해당하는 분포가 가장 많았으며, 통계적 평균치는 182.4 ± 77.8로, 앞선 DLS 실험의 결과치의 범위에 들어오는 수치였다.
(5) Bare EV 및 표면개질을 한 EV-DSPE-PEG
2k
의 시간별 형광 이미지 비교 및 장기 적출 후 조직별 형광 이미지 비교
표면개질을 하지 않은 EV와 DSPE-PEG로 표면개질을 한 EV의 체내 순환을 형광 이미지로 얻었다. 안락사 후 장기를 적출하여 획득한 형광 이미지를 보면, 표면개질을 한 경우 생체 내 신호가 종양에서 더 강하게 확인이 되었다. 이는 일반적으로 나노입자가 가장 많이 섭취되는 간 대비 종양에서 나오는 형광 신호의 비율을 확인해 보았을 때 표면개질을 한 경우, 하지 않은 것 대비 약 7배 이상으로 향상되는 것을 확인하였다(도 8).
Claims (6)
- 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질이 삽입된 인지질 이중층을 포함하고, 상기 폴리에틸렌글리콜은 적어도 일부가 인지질 이중층 외부 표면에 노출된 것인 세포외 소포체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DMPC), 1,2-디펙사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헵타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디옥타노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디나노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디운데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DLPC), 1,2-디트리데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디펜타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DPPC), 1,2-디헵타데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에타놀아민(DSPE), 1,2-디노나데카노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디아라키도일-sn- 글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디헤나라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2- 디베헤노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디트리코사노일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디리그노세로일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 하이드로제네이티드 포스파티딜콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC), L-α-포스파티딜콜린 (HSPC), 1-미리스토일-2-스테로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(MSPC) 및 1-미리스토일-2-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (MPPC)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 인지질에 폴리에틸렌이 결합된 것인 세포외 소포체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 세포외 소포체는 입경이 50 내지 300nm인, 세포외 소포체.
- 청구항 1에 있어서, 인지질 이중층에 삽입된 형광염료를 더 포함하는, 세포외 소포체.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 세포외 소포체를 포함하는 조영제 조성물.
- 용매 중에서 인지질 이중층을 포함하는 세포외 소포체와 폴리에틸렌글리콜이 결합된 인지질을 혼합하고 교반하는 단계를 포함하는 세포외 소포체의 제조방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20210093770 | 2021-07-16 | ||
| KR1020210093770 | 2021-07-16 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230013009A true KR20230013009A (ko) | 2023-01-26 |
Family
ID=85110259
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220088364A KR20230013009A (ko) | 2021-07-16 | 2022-07-18 | 세포외 소포체 및 그 제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
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| KR (1) | KR20230013009A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102100420B1 (ko) | 2017-08-17 | 2020-04-13 | 주식회사 일리아스바이오로직스 | 표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀 |
-
2022
- 2022-07-18 KR KR1020220088364A patent/KR20230013009A/ko unknown
Patent Citations (1)
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| KR102100420B1 (ko) | 2017-08-17 | 2020-04-13 | 주식회사 일리아스바이오로직스 | 표적특이적으로 물질을 전달하는 엑소좀의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 엑소좀 |
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