CN116603069B - 一种微生物靶向定植系统及方法 - Google Patents

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Abstract

一种微生物靶向定植系统及方法，用于微生物靶向定植的组合物包含1)叠氮修饰的糖代谢物或叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药，以及2)修饰有配体的微生物；修饰有配体的微生物用于靶向结合至叠氮修饰的糖代谢物或糖代谢前药的产物。本发明的实验数据证实，肿瘤特异性表达的N3与配体修饰的细菌等微生物通过体内生物正交技术实现微生物的靶向定植，在细菌等微生物靶向肿瘤及其在肿瘤内定植方面具体显著效果，这显示了其在肿瘤生物治疗方面的巨大潜力和重要的临床应用价值。

Description

一种微生物靶向定植系统及方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种微生物靶向定植系统及方法。
背景技术
癌症免疫治疗通过外源干预机体免疫系统，重新启动并维持“肿瘤-免疫”循环，恢复、提高机体的抗肿瘤免疫反应来达到对肿瘤细胞的识别和杀伤。相比手术、放疗和化疗等传统治疗手段，癌症免疫治疗具有特异性强、疗效高、副作用小的优势，具有巨大的临床应用前景。自从ipilimumab成为美国FDA批准的第一款免疫检查点疗法用药后，肿瘤免疫疗法的一大重要分支免疫检查点疗法便进入了发展黄金期。其在治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等方面得到了长足的进步，也为癌症患者们带来了新的希望。尽管这类新型抗癌策略在治疗多种实体瘤方面取得很大的进展，但是其在如胰腺癌、脑胶质瘤等治疗的疗效都不理想，其应答率较低。
科学家们发现肠道微生物菌群在塑造机体免疫系统功能上扮演着关键角色，肠道微生物菌群能提供特殊的免疫刺激信号来激发外周先天性免疫系统。口服双歧杆菌联合PD-L1免疫检查点治疗几乎完全抑制肿瘤的生长。双歧杆菌产生的信号能够稳定地调节树突细胞的活化，从而改善细胞毒性T细胞的效应功能，并可促进T细胞浸润到肿瘤微环境中。一些细菌的代谢产物如短链脂肪酸丁酸盐，尤其是戊酸盐能够增加T细胞的细胞毒性活性。同时，研究发现戊酸盐治疗能够增强CAR-T细胞疗法对胰腺癌的治疗效果。
益生菌作为一类安全有效的微生态制剂，在肿瘤免疫治疗方面具有较大的发展潜力。已有多项益生菌和免疫检查点联合治疗肿瘤的研究进入临床试验阶段。可见，随着肿瘤内特定细菌在肿瘤发病学中作用的明确，以肿瘤菌群调控为核心的微生物疗法有望成为未来肿瘤治疗极具潜力的前沿方向。但是，益生菌介导的肿瘤治疗总是受到其给药后的肿瘤特异性和其在肿瘤部位的定植能力所困扰。因此，如何提高细菌的肿瘤靶向性和定植能力从而提高细菌疗法的安全性和抗肿瘤功效，仍是本领域至今未能解决或取得显著改善的技术难题。
发明内容
第一方面，在一实施例中，提供一种用于微生物靶向定植的组合物，所述组合物包含1)叠氮修饰的糖代谢物或叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药，以及2)修饰有配体的微生物；所述修饰有配体的微生物用于靶向结合至所述叠氮修饰的糖代谢物或所述糖代谢前药的产物。
第二方面，在一实施例中，提供一种定植系统，包括叠氮修饰的靶细胞、修饰有配体的微生物，所述修饰有配体的微生物定植于所述靶细胞。
第三方面，在一实施例中，提供一种靶向定植微生物的方法，包括：
提供叠氮修饰的靶细胞、修饰有配体的微生物，使所述修饰有配体的微生物与叠氮修饰的靶细胞接触，所述配体靶向结合至叠氮修饰的细胞，获得靶细胞，所述靶细胞定植有所述修饰有配体的微生物。
第四方面，在一实施例中，提供一种微生物，所述微生物修饰有配体。
第五方面，在一实施例中，提供一种药物组合物，包含第四方面任意一项所述的微生物。
在一实施例中，本发明的实验数据证实，肿瘤特异性表达的N3与配体修饰的细菌等微生物通过体内生物正交技术实现微生物的靶向定植，在细菌等微生物靶向肿瘤及其在肿瘤内定植方面具体显著效果，这显示了其在肿瘤生物治疗方面的巨大潜力和重要的临床应用价值。
附图说明
图1为P/L(Ac)脂质体的表征和其体内外靶向性的研究结果；其中：
图1a：P/L(Ac)脂质体的水合粒径表征：粒径为99.63±1.57nm；L(Ac)脂质体的水合粒径表征：粒径为98.55±1.43nm；
图1b：P/L(Ac)脂质体的透射电镜表征结果，比例尺：100nm；
图1c：P/L(Ac)和L(Ac)脂质体在37℃条件下水合粒径和单分散性随时间变化的结果；
图2a为Panc02胰腺癌细胞摄取Dil标记的P/L(Dil)脂质体和L(Dil)脂质体2h后的激光共聚焦图像，比例尺：100nm；其中，Hoechst 33342标记细胞核，Dil标记脂质体。P/L(Dil)组的红色荧光强于L(Dil)组；
图2b为流式细胞术分析Panc02胰腺癌细胞摄取Dil标记的P/L(Dil)脂质体和L(Dil)脂质体2h后的情况；
图2c为流式细胞术分析Panc02胰腺癌细胞摄取Dil标记的P/L(Dil)脂质体和L(Dil)脂质体2h后的平均荧光强度值；
图3a为小鼠活体成像分析P/L(Dil)脂质体静脉给药24h后在胰腺肿瘤部位的聚集情况。原位胰腺癌模型构建所用细胞为Panc02-Luciferase(表达荧光素酶)；
图3b为PBS、L(Dil)和P/L(Dil)组胰腺肿瘤中Dil的平均荧光强度；
图3c为PBS、L(Dil)和P/L(Dil)组胰腺中心、肝、脾、肺和肾的平均荧光强度；
图4示出了P/L(Ac)脂质体的体内外Click验证结果；
图4a为将Panc02胰腺癌细胞分别用PBS、P/L(含胰腺癌靶分子的空白脂质体)、Ac(游离的N3)和P/L(Ac)孵育24h后，用DBCO修饰的Cy5荧光分子孵育2h后的激光共聚焦图像；其中，Hoechst 33342(蓝色)标记细胞核，Cy5(红色荧光)；
图4b为流式细胞术分析Panc02胰腺癌细胞摄取P/L(Ac)脂质体并与DBCO-Cy5发生Cli ck反应的情况；
图4c为流式细胞术分析Panc02胰腺癌细胞表面Cy5的平均荧光强度值；
图5a为小鼠活体成像分析P/L(Ac)脂质体连续静脉给药3天(1次/天)后，静脉给药DBCO-Cy5(5mg/kg)48h后在胰腺肿瘤部位的聚集情况。原位胰腺癌模型构建所用细胞为Panc02-Luciferase(表达荧光素酶)；
图5b为胰腺肿瘤处冰冻切片，DAPI染细胞核，呈蓝色；Cy5呈红色；
(d)图5c为图5a中Cy5荧光强度的定量分析；
(e)图5d为图5b中Cy5荧光强度的定量分析；
图6为DBCO修饰的益生菌与表达N3的胰腺癌细胞发生Click反应；
图6a为DBCO修饰的EcN与表达N3的Panc-02细胞结合的激光共聚焦图像(EcN为红色)；
图6b为DBCO修饰的EcN与表达N3的Panc-02细胞结合的扫描电镜图像(红色虚线为EcN)；
图6c为DBCO修饰的EcN与表达N3的Panc-02细胞结合的流式分析图；
图7为益生菌在胰腺肿瘤部位的定植结果图，其中，图7a为小鼠活体成像分析静脉给药后DBCO修饰的EcN在胰腺肿瘤部位的定植情况；图7b为各组荷瘤小鼠胰腺肿瘤区域的mCherry平均荧光强度统计图；图7c为各组荷瘤小鼠胰腺肿瘤区域的益生菌EcN的DNA含量。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
生物正交化学反应是一类可以在生理条件下发生的化学反应，具有简单、高效、高特异性的特点，在生物医学的研究中被广泛应用。通过生物代谢途径可有效地将各种化学报告基团、放化疗药物引入靶标物的生物分子中，有利于携带配对基团的标记物与其发生生物正交反应，从而在活体系统中实现对生物分子的标记示踪和药物递送。上述研究结果表明，“生物正交-糖代谢靶向”策略可以特异性的提高配体修饰物质(如放化疗药物、细胞、抗体等)靶向蓄积。
受上述现象的启发，本发明通过“生物正交-糖代谢靶向”策略使携带有配对基团的益生菌与标记有N3基团的肿瘤细胞发生生物正交反应，从而提高肿瘤处益生菌的定植率。
第一方面，在一实施例中，提供一种用于微生物靶向定植的组合物，组合物包含1)叠氮修饰的糖代谢物或叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药，以及2)修饰有配体的微生物；修饰有配体的微生物用于靶向结合至叠氮修饰的糖代谢物或糖代谢前药的产物。
在一实施例中，微生物可以为细胞型生物或非细胞型生物。
在一实施例中，组合物还含有靶分子，用于特异性靶向目标细胞。靶分子可以与叠氮修饰的糖代谢物或叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药混合制成复合物，用于靶向目标细胞(例如肿瘤细胞)。
在一实施例中，靶分子包括肽。
在一实施例中，修饰有配体的益生菌等微生物用于通过生物正交反应靶向结合至叠氮修饰的细胞。
在一实施例中，组合物包括载体复合物、叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药中的至少一种，载体复合物包含叠氮修饰的糖代谢物。
在一实施例中，叠氮化修饰的糖代谢前药用于在肿瘤特异性酶的作用下，特异性地在肿瘤细胞中参与反应，得到细胞膜上修饰有叠氮基团的肿瘤细胞，实现肿瘤细胞的叠氮化修饰，使得修饰有配体的微生物(例如微生物细胞)靶向定植至肿瘤细胞。
在一实施例中，组合物包括载体复合物、叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药中的至少一种，载体复合物包含所述叠氮修饰的糖代谢物。
在一实施例中，载体复合物包含载体、靶分子、叠氮修饰的糖代谢物，载体用于负载靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物，靶分子用于特异性靶向靶细胞。
在一实施例中，靶分子包括但不限于肽。肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物。
在一实施例中，载体包括但不限于纳米载体。具体可以是针对不同肿瘤特异性高表达的靶向配体的纳米载体，如特异性靶向胰腺癌的plectin-1或胶质瘤的angiopeptide-2等的纳米载体。
在一实施例中，制备的纳米载体或前药通过尾静脉或腹腔给药的方式给移植有肿瘤的小鼠，通过糖代谢途径，检测N3肿瘤细胞标记的能力。
在一实施例中，将修饰有DBCO或BCN配体的细菌(如益生菌等)通过口服或尾静脉方式注射给标记有N3的抑制肿瘤的小鼠，观察细菌在肿瘤处的定植能力。
在一实施例中，载体包括但不限于脂质体。
在一实施例中，脂质体的制备方法不受限制，例如，可以通过微流控法、薄膜水化法、反相挥发法或乙醇注入法制备胰腺癌靶分子修饰的N3糖脂质体。具体地，用于制备N3糖脂质体的原料包括：原料1：卵磷脂、氢化大豆卵磷脂(HSPC，生产商包括艾伟拓)或磷脂酰胆碱，原料2：胆固醇(Chol，生产商包括百灵威科技)，原料3：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG，生产商包括艾伟拓)，原料4：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG-Mal，生产商包括阿拉丁)或二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺酯(DSPE-PEG-NHS，生产商包括阿拉丁)，原料5：靶向肽，原料6：N3糖。
在一实施例中，靶向肽包括但不限于胰腺癌靶向肽。
在一实施例中，N3糖可以市购得到，生产商包括但不限于北京翰隆达科技发展有限公司。
在一实施例中，按质量计，原料1：原料2：原料3：原料4：原料5：原料6＝(1～5):(0.5～2.7):(0.8～3.5):(0.01～1.5):(0.01～0.38):(0.5～5)。
在一实施例中，糖代谢物包括但不限于葡萄糖、甘露糖、半乳糖等等中的至少一种。
在一实施例中，靶细胞包括但不限于肿瘤细胞。
在一实施例中，肿瘤包括但不限于实体瘤。
在一实施例中，肿瘤包括但不限于胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、子宫癌、直肠癌、咽喉癌、乳腺癌。优选为肺癌、胰腺癌。
在一实施例中，肿瘤也可以是非实体瘤。包括但不限于胶质瘤、白血病等血液性疾病。
在一实施例中，配体包括但不限于炔烃。
在一实施例中，炔烃包括但不限于二苯基环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)中的至少一种。
在一些实施例中，表面修饰有氨基的微生物均适用于本发明，氨基可与炔基配体发生反应，实现将炔烃类配体修饰至细胞表面。
在一实施例中，微生物包括但不限于在乏氧环境(例如肿瘤细胞)中生存和/或繁殖的微生物。
在一实施例中，微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌中的至少一种。
在一实施例中，细菌包括但不限于益生菌、减毒细菌中的至少一种。益生菌是通过定殖在宿主(例如人体)内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。减毒细菌即为经过减毒处理后的细菌，也适用于本发明。
在一实施例中，细菌包括革兰氏阴性细菌。
在一实施例中，细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌、酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、放线菌等等中的至少一种。
在一实施例中，DBCO或BCN配体修饰的不同种类细菌，如双歧杆菌、Nissle 1917等，可用于制备治疗肿瘤的免疫治疗方面的药物。
在一实施例中，负载有靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物的载体、修饰有配体的益生菌可以独立分装于不同的容器中，在使用时，先将负载有靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物的载体通过口服、注射或其他可能的方式递送至受试者或患者的目标细胞(例如肿瘤细胞)，载体基于靶分子靶向结合至目标细胞，然后将修饰有配体的益生菌通过口服、注射或其他可能的方式递送至受试者或患者体内，修饰有配体的益生菌通过生物正交反应靶向结合至叠氮修饰的细胞，实现益生菌对目标细胞的高效定植。
第二方面，在一实施例中，提供一种定植系统，包括叠氮修饰的靶细胞、修饰有配体的微生物，修饰有配体的微生物定植于靶细胞。
在一实施例中，叠氮修饰的靶细胞包括1)靶细胞，以及2)载体复合物、叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药中的至少一种；载体复合物包含叠氮修饰的糖代谢物。
在一实施例中，载体复合物包含载体、靶分子、叠氮修饰的糖代谢物，载体用于负载靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物，靶分子用于特异性靶向靶细胞。
在一实施例中，靶分子包括但不限于肽。
在一实施例中，载体包括但不限于纳米载体。具体可以是针对不同肿瘤特异性高表达的靶向配体的纳米载体，如特异性靶向胰腺癌的plectin-1或胶质瘤的angiopeptide-2等的纳米载体。
在一实施例中，载体包括但不限于脂质体。
在一实施例中，糖代谢物包括但不限于葡萄糖、甘露糖、半乳糖等等中的至少一种。
在一实施例中，靶细胞包括但不限于肿瘤细胞。
在一实施例中，肿瘤包括但不限于实体瘤。
在一实施例中，肿瘤包括但不限于胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、子宫癌、直肠癌、咽喉癌、乳腺癌。优选为肺癌、胰腺癌。
在一实施例中，肿瘤也可以是非实体瘤。包括但不限于胶质瘤、白血病等血液性疾病。
在一实施例中，配体包括但不限于炔烃。
在一实施例中，炔烃包括但不限于二苯基环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)中的至少一种。
在一些实施例中，表面修饰有氨基的微生物均适用于本发明，氨基可与炔基配体发生反应，实现将炔烃类配体修饰至细胞表面。
在一实施例中，微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌。
在一实施例中，细菌包括但不限于益生菌、减毒细菌中的至少一种。益生菌是通过定殖在宿主(例如人体)内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性微生物。
在一实施例中，细菌包括革兰氏阴性细菌。
在一实施例中，细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌、酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、放线菌等等中的至少一种。
第三方面，在一实施例中，提供一种微生物靶向定植的方法，包括：
提供叠氮修饰的靶细胞、修饰有配体的微生物，使修饰有配体的微生物与叠氮修饰的靶细胞接触，配体靶向结合至叠氮修饰的细胞，获得靶细胞，靶细胞定植有修饰有配体的微生物。
在一实施例中，叠氮修饰的靶细胞包括1)靶细胞，以及2)载体复合物；载体复合物包含载体、靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物，靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物负载于载体，靶分子用于特异性靶向靶细胞。
在一实施例中，叠氮修饰的靶细胞可以不含有载体复合物，而是由叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药在靶细胞(例如肿瘤细胞)中，在肿瘤特异性酶的作用下，通过一系列反应得到。叠氮修饰的肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药在肿瘤细胞内经过一些列的生化反应，最终会成为细胞膜上糖蛋白的一部分，此时细胞膜被标记上叠氮基团。
在一实施例中，载体包括但不限于纳米载体。
在一实施例中，载体包括但不限于脂质体。
在一实施例中，糖代谢物包括但不限于葡萄糖、甘露糖、半乳糖中的至少一种。
在一实施例中，靶细胞包括但不限于肿瘤细胞。
在一实施例中，肿瘤包括但不限于实体瘤、非实体瘤。
在一实施例中，肿瘤包括但不限于胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、子宫癌、直肠癌、咽喉癌、乳腺癌。优选为肺癌、胰腺癌。
在一实施例中，靶分子包括但不限于肽。
在一实施例中，配体包括但不限于炔烃。
在一实施例中，炔烃包括但不限于二苯基环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)中的至少一种。
在一实施例中，微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌中的至少一种。
在一实施例中，细菌包括但不限于益生菌、减毒细菌中的至少一种中的至少一种。
在一实施例中，细菌包括革兰氏阴性细菌。
在一实施例中，细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌、酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、放线菌等等中的至少一种。
第四方面，在一实施例中，提供一种微生物，微生物修饰有配体。
在一实施例中，配体包括但不限于炔烃。
在一实施例中，炔烃包括但不限于二苯基环辛炔(DBCO)、双环[6.1.0]壬炔(BCN)中的至少一种。
在一实施例中，微生物包括但不限于细菌、病毒、真菌中的至少一种。
在一实施例中，细菌包括但不限于益生菌、减毒细菌中的至少一种。
在一实施例中，细菌包括革兰氏阴性细菌。
在一实施例中，细菌包括但不限于大肠杆菌、沙门氏菌、双歧杆菌、酵母菌、益生芽孢菌、丁酸梭菌、乳杆菌、放线菌等等中的至少一种。
第五方面，在一实施例中，提供一种药物组合物，包含第四方面任意一项的微生物。
在一实施例中，药物组合物用于治疗肿瘤。该肿瘤可以是常见的实体瘤或非实体瘤，具体包括但不限于肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、子宫癌、直肠癌、咽喉癌、乳腺癌等，优选为肺癌、胰腺癌。
在一实施例中，药物组合物还可以包含其他助剂，如缓释载体等等。
在一实施例中，本发明提供一种用于提高肠道菌肿瘤定植的生物正交方法，具体地，是通过对肿瘤细胞进行特异性的叠氮基团修饰使其特异性地结合修饰有靶向配体的微生物(例如细菌)，提高微生物在肿瘤处的定植能力，包括靶向肿瘤特异性糖代谢药物的纳米载体或肿瘤特异性酶响应糖代谢前药的制备、配体修饰的微生物及其应用。其中，微生物可以为细菌，具体可选自革兰氏阴性菌中的任意一种或多种；该靶向配体是和N3基团进行生物正交反应的二苯基环辛炔(DBCO)或双环[6.1.0]壬炔(BCN)。其中，对肿瘤进行特异性N3标记的糖代谢药物为纳米载体或肿瘤特异性酶响应的糖代谢前药。利用生物体内生物正交反应，使修饰有DBCO或BCN配体的细菌定植到肿瘤组织内，从而使其治疗效果最大化。
针对益生菌肿瘤靶向性和定植能力不佳的不足，在一实施例中，本发明提出采用“生物正交-糖代谢靶向”策略使携带有配对基团的益生菌与标记有N3基团的肿瘤细胞发生生物正交反应，从而提高肿瘤处益生菌的定植率，本发明可用于制备肿瘤治疗药物。
在一实施例中，本发明提供了靶向肿瘤的递送N3糖纳米载体和肿瘤特异性酶响应的N3糖前药的制备方法，通过尾静脉和腹腔给药使肿瘤细胞特异性的表达N3基团。
在一实施例中，制备靶向胰腺癌的脂质体递送N3修饰的糖，通过尾静脉给药，观察肿瘤细胞表达N3的情况。
在一实施例中，本发明提供了一种制备表面修饰有DBCO或BCN配体的细菌的方法，该细菌是通过酰胺化过程将DBCO或BCN配体结合到细菌表面。
在一实施例中，该细菌选自革兰氏阴性细菌中的任意一种或多种。任选地是大肠杆菌、沙门氏菌；优选地是双歧杆菌。
在一实施例中，该N3配体优选为DBCO或BCN配体。
在一实施例中，将DBCO或BCN修饰的细菌通过口服或尾静脉的方式给药，检测其与N3修饰肿瘤细胞的结合率和定植率。
在一实施例中，可将上述表面结合配体的细菌制备成治疗肿瘤的药物。
在一实施例中，根据制备地递送N3糖的纳米载体和特异性酶响应的N3糖前药的不同，用于治疗不同类型的肿瘤。该肿瘤可以是常见的实体瘤，包括但不限于肺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、子宫癌、直肠癌、咽喉癌、乳腺癌等，优选为肺癌、胰腺癌。
有益效果：
在一实施例中，本发明公开了一种用于提高肠道菌肿瘤定植的生物正交方法，修饰有配体的细菌及其制备方法，及包含该细菌的药物组合物，以及该细菌在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
基于实验研究，肿瘤特异性表达的N3与DBCO修饰的细菌通过体内生物正交技术，可以增强细菌给药后在肿瘤处的靶向性，及其在肿瘤处的定植能力。本发明的实验数据证实，肿瘤特异性表达的N3与DBCO修饰的细菌通过体内生物正交技术在细菌靶向肿瘤及其在肿瘤内定植方面具体显著效果，这显示了其在肿瘤生物治疗方面的巨大潜力和重要的临床应用价值。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：制备胰腺癌靶分子修饰的N3糖脂质体P/L(Ac)
通过薄膜法制备胰腺癌靶分子修饰的N3糖脂质体。具体地，将氢化卵磷脂(HSPC，艾伟拓)、胆固醇(Chol，艾伟拓)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2k)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(DSPE-PEG2k-Malimide，阿拉丁)、胰腺癌靶向肽(上海吉尔生化)和N3糖(葡萄糖-叠氮，即叠氮修饰的葡萄糖，北京翰隆达科技发展有限公司)按照质量比1:0.5:0.8:0.01:0.01:0.5称取各原料，进行脂质体的制备，得到的P/L(Ac)脂质体的粒径为99.63±1.57nm。
P/L(Ac)中，“P”是指靶向肽(petide)，“L”是指脂质体，Ac是指N3糖，P/L(Ac)是指由靶向肽、N3糖、脂质体制备得到的复合物。
实施例2：P/L(Dil)脂质体对Panc02胰腺癌细胞的体外靶向性研究
通过细胞流式分析术(型号：BD FACSCanto SORP，厂家：BD)和共聚焦成像系统(型号：LSM980，厂家：Zeiss)研究Panc02胰腺癌细胞对P/L(Dil)和L(Dil)的摄取情况，用于验证P/L(Dil)脂质体具有对Panc02胰腺癌细胞的体外靶向的特点。
P/L(Dil)中，“P”是指靶向肽(petide)，“L”是指脂质体，“Dil”是一种染色剂，全称：1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基氨基氰高氯酸盐，品牌：英潍捷基。
P/L(Dil)是指标记有染色剂Dil的靶向肽与脂质体复合物。
L(Dil)是指标记有染色剂Dil的脂质体复合物(即不含有靶向肽)。
实验2.1：细胞流式分析术
六孔板细胞铺板4×105个细胞/孔，分别设置PBS组、P/L(Dil)组和L(Dil)组。37℃孵育24h后，各组分别加入PBS、P/L(Dil)(1μM Dil)和L(Dil)(1μM Dil)，孵育0、2、4h后，收集细胞并进行细胞流式分析，比较各组细胞的Dil的平均荧光强度。
实验2.2：激光共聚焦成像
将细胞以4×105个细胞/孔的密度铺于35mm的激光共聚焦玻璃小皿中，分别设置PBS组、P/L(Dil)组和L(Dil)组。37℃孵育24h后，各组分别加入PBS、P/L(Dil)(1μM Dil)和L(Dil)(1μM Dil)，孵育0、2、4h后，用Hoechst33342标记细胞核。最后将各组细胞放置于激光共聚焦显微镜下拍照。
实施例3：P/L(Dil)脂质体对Panc02胰腺癌细胞的体内靶向性研究
实验3.1：原位胰腺模型的构建
C57BL/6J雌性小鼠(6～8周，18～20g)由广东维通利华实验动物技术有限公司提供。所有小鼠饲养于12/12h的暗/光循环和SPF(环境温度(25℃)和湿度(55％)条件下。动物研究方案由南方科技大学动物护理和使用委员会审核批准。
原位胰腺癌模型所用细胞为表达荧光素酶的Panc02细胞系，每只小鼠种植于胰腺的细胞数量为1.5×105个，细胞分散在25μL PBS和基质胶的混合溶液(按体积计，PBS：基质胶＝1:1)中。给造模后的小鼠腹腔注射200μL荧光素钾，之后通过小动物活体成像监测胰腺癌的大小，当肿瘤的荧光强度值到达e5时，即可进行脂质体的体内靶向研究。
实验3.2：脂质体体内靶向研究
将原位胰腺癌模型分为PBS组、P/L(Dil)组和L(Dil)组，每组3只小鼠，分别尾静脉注射200μL PBS、P/L(Dil)(10μM Dil)或L(Dil)(10μM Dil)。给药24h后，通过小鼠活体成像观察肿瘤区域的Dil荧光信号分布情况，并且取出心肝脾肺肾胰腺组织，进行荧光信号分析。
实施例4：P/L(Ac)脂质体与DBCO-Cy5的体外Click反应验证
通过细胞流式分析术(型号：BD FACSCanto SORP，厂家：BD)和共聚焦成像系统(型号：LSM980，厂家：Zeiss)研究Panc02胰腺癌细胞通过摄取N3糖或者脂质体，使得肿瘤细胞膜表达N3基团，DBCO-Cy5与N3基团发生Click反应，从而观察到细胞膜上有Cy5荧光，证明Click反应的成功发生。为通过Click反应实现益生菌的定植提供证据。
叠氮糖在肿瘤细胞内经过一些列的生化反应，最终会成为细胞膜上糖蛋白的一部分，此时细胞膜被标记上叠氮基团。
实验4.1：细胞流式分析术
六孔板细胞铺板4×105个细胞/孔，分别设置Blank组、PBS+DBCO-Cy5组、P/L+DBCO-Cy5组、Ac+DBCO-Cy5和P/L(Ac)+DBCO-Cy5组。37℃孵育24h后，各组分别加入培养基、PBS、P/L、Ac和P/L(Ac)(50μM Ac)。孵育24h后，Blank组更换空白培养基，其余各组分别更换含DBCO-Cy5(5μg/mL)培养基。37℃孵育1h，去掉培养基，PBS洗涤3次后收集细胞并进行细胞流式分析，比较各组细胞的Cy5的平均荧光强度。
实验4.2：激光共聚焦成像
将细胞以2×104个细胞/孔的密度铺于35mm的激光共聚焦玻璃小皿中，分别设置PBS、P/L(含胰腺癌靶分子的空白脂质体)、Ac(游离的N3)和P/L(Ac)。37℃孵育24h后，各组分别加入PBS、P/L、Ac和P/L(Ac)(基于50μM Ac)，孵育24h后，用PBS洗涤细胞3次，换用含DBCO-Cy5 5μg/mL的新鲜培养基。随后用Hoechst33342标记细胞核。最后将各组细胞放置于激光共聚焦显微镜下拍照，验证胰腺癌细胞可摄取脂质体，并在细胞膜上表达N3基团，该基团可以与DBCO-Cy5中的DBCO基团发生click反应，从而使得Cy5荧光呈现在胰腺癌细胞膜上。
实施例5：P/L(Ac)脂质体与DBCO-Cy5的体内Click反应验证
实验5.1：原位胰腺癌模型的构建
C57BL/6J雌性小鼠(6～8周，18～20g)由广东维通利华实验动物技术有限公司提供。所有小鼠饲养于12/12h的暗/光循环和SPF(环境温度(25℃)和湿度(55％)条件下。动物研究方案由南方科技大学动物护理和使用委员会审核批准。
原位胰腺癌模型所用细胞为表达荧光素酶的Panc02细胞系，每只小鼠种植于胰腺的细胞数量为1.5×105个，细胞分散在25μL PBS和基质胶的混合溶液(VPBS：V基质胶＝1:1)中。给造模后的小鼠腹腔注射200μL荧光素钾，之后通过小动物活体成像监测胰腺癌的大小，当肿瘤的荧光强度值到达e5时，即可进行P/L(Ac)脂质体与DBCO-Cy5的体内Click反应验证研究。
实验5.2：脂质体与DBCO-Cy5的体内Click反应验证
将原位胰腺癌模型分为Ac4GalNAz(游离的N3)和P/L(Ac)，每组3只小鼠，分别尾静脉注射200μL Ac4GalNAz(游离的N3，40mg/kg)和P/L(Ac)(40mg/kg)，每天给药一次，连续给药3天，第4天给小鼠尾静脉注射DBCO-Cy5(5mg/kg)。给药48h后，并且取出心肝脾肺肾胰腺组织，进行荧光信号分析。并将胰腺癌部位进行冰冻切片，观察肿瘤部位Cy5荧光的强度。
实施例6：体外实验验证DBCO(二苯并环辛炔基)修饰的益生菌与N3-Panc-02细胞的结合
实验6.1：DBCO修饰益生菌的步骤
取OD600＝0.4～0.6的mCherry-EcN(mCherry为红色荧光蛋白，EcN为大肠杆菌Escheric hia coli strain Nissle 1917)，以6000rpm离心5分钟获得益生菌沉淀。用PBS重悬、离心三次，得到干净的益生菌，以备待用。将含有50～200μM DBCO-PEG-NHS的PBS溶液加入到备用的益生菌中，并在37℃下孵育0.5～1h后，即可得到DBCO修饰的益生菌——DBCO-mCherry EcN。(下述用到的DBCO-mCherry EcN均经过实验6.1获得)
实验6.2：激光共聚焦成像
将细胞以2×104个细胞/孔的密度铺于35mm的激光共聚焦玻璃小皿中，分别设置Blank+DBCO-mCherry EcN组、Liposomes+DBCO-mCherry EcN组、Ac4GalNAz+DBCO-mCherryEcN组、P/L(Ac)+mCherry EcN和P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组。37℃孵育24h后，各组分别加入等量的新鲜培养基、含Liposomes的培养基、含Ac的培养基和含P/L(Ac)的培养基(50μMAc)。孵育72h后，其中P/L(Ac)+mCherry EcN组更换含mCherry EcN的培养基，其余各组分别更换含DBCO-mCherry EcN的培养基。37℃孵育1h，去掉培养基，PBS洗涤3次后即可观察。最后将各组细胞放置于激光共聚焦显微镜下拍照，验证表达N3的胰腺癌细胞可与DBCO-mCherry EcN高效结合。
实验6.3：扫描电镜
将细胞以2×104个细胞/孔的密度铺于爬片上，分别设置Blank+DBCO-mCherryEcN组、Liposomes+DBCO-mCherry EcN组、Ac4GalNAz+DBCO-mCherry EcN组、P/L(Ac)+mCherry EcN和P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组。37℃孵育24h后，各组分别加入等量的新鲜培养基、含Liposomes的培养基、含Ac的培养基和含P/L(Ac)的培养基(50μM Ac)。孵育72h后，其中P/L(Ac)+mCherry EcN组更换含mCherry EcN的培养基，其余各组分别更换含DBCO-mCherry EcN的培养基。37℃孵育1h，去掉培养基，PBS洗涤3次后加入甲醛固定2h，固定后离心去除甲醛，并用PBS洗涤三次。后续对各组进行梯度脱水，依次加入50％、70％、80％、90％、100％的乙醇溶液。待100％乙醇溶液的上清液去除后，吹干并喷金60s，利用扫描电镜进行观察。
实验6.4：细胞流式分析术
六孔板细胞铺板4×105个细胞/孔，分别设置Blank+DBCO-mCherry EcN组、Liposome s+DBCO-mCherry EcN组、Ac4GalNAz+DBCO-mCherry EcN组、P/L(Ac)+mCherryEcN和P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组。37℃孵育24h后，各组分别加入等量的新鲜培养基、含Liposomes的培养基、含Ac的培养基和含P/L(Ac)的培养基(50μM Ac)。孵育72h后，其中P/L(Ac)+mCherry EcN组更换含mCherry EcN的培养基，其余各组分别更换含DBCO-mCherryEcN的培养基。37℃孵育1h，去掉培养基，PBS洗涤3次后收集细胞并进行细胞流式分析，比较各组中mCherry荧光强度的占比。
实施例7：益生菌在胰腺部位的定植研究
实验7.1：原位胰腺癌模型的构建
C57BL/6J雌性小鼠(6～8周，18～20g)由广东维通利华实验动物技术有限公司提供。所有小鼠饲养于12/12h的暗/光循环和SPF(环境温度(25℃)和湿度(55％)条件下。动物研究方案由南方科技大学动物护理和使用委员会审核批准。
原位胰腺癌模型所用细胞为表达荧光素酶的Panc02细胞系，每只小鼠种植于胰腺的细胞数量为1.5×105个，细胞分散在25μL PBS和基质胶的混合溶液(按体积计，PBS：基质胶＝1:1)中。给造模后的小鼠腹腔注射200μL荧光素钾，之后通过小动物活体成像监测胰腺癌的大小，当肿瘤的荧光强度值到达e5时，即可进行益生菌在胰腺肿瘤部位的定植研究。
实验7.2：益生菌在胰腺部位的定植研究
对原位胰腺癌模型鼠分组，将其分为三个组：PBS组，Ac4GalNAz+DBCO-mCherryEcN组以及P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组。分别对其连续两天尾静脉注射PBS，Ac4Gal NAz以及P/L(Ac)。并在第一天尾静脉注射后，对Ac4GalNAz+DBCO-mCherry EcN组以及P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组腹腔注射DBCO修饰的mCherry EcN。待第三天，使用小动物活体成像仪(IVIS Spectrum,PerkinElmer)观察模型鼠胰腺肿瘤处mCherry的荧光情况。并解剖取材，通过qPCR定量分析胰腺肿瘤处益生菌mCherry EcN的DNA含量。
实验结果与分析
1.脂质体的表征
L(Ac)和P/L(Ac)脂质体的水合粒径是通过马尔文粒度仪(型号：nano series，厂家：Mal vern)测得，如图1a所示，粒径大小分别为98.55±1.43nm和99.63±1.57nm。将脂质体水溶液滴加到含方华膜的铜网上，并用磷钨酸负染，然后通过透射电镜(型号：HT7700，厂家：日立)对脂质体的形态进行了表征，得到的脂质体形态如图1b所示，脂质体呈均一的球形。
2.脂质体的稳定性分析
为了研究L(Ac)和P/L(Ac)脂质体的稳定性，将脂质体分散于纯化水和含10％血清中，于室温和37℃条件下检测粒径和PDI的变化情况。检测结果如图1c所示，室温条件下纯化水中的脂质体的粒径在72h内基本保持不变，说明脂质体具有良好的稳定性。
3.体外分析脂质体的靶向性
为了研究L(Ac)和P/L(Ac)脂质体的体外靶向性，通过激光共聚焦成像和流式细胞分析来研究了Panc02细胞对两种脂质体的摄取情况。如图2a所示，Panc02细胞对Dil染料标记的脂质体摄取2h后，P/L(Dil)组的荧光强度明显高于L(Dil)组，说明Panc02细胞对具有胰腺癌靶分子修饰的脂质体的摄取效率更高，也证明了P/L(Ac)脂质体具有胰腺癌靶向性。同时，流式细胞分析结果(图2b和图2c)也展现了Panc02细胞对具有胰腺癌靶分子修饰的脂质体更高的摄取率，进一步证明了P/L(Ac)脂质体具有胰腺癌靶向性。
4.体内分析脂质体的靶向性
如图3a所示，选用胰腺癌大小相近的小鼠进行脂质体体内靶向性研究，尾静脉注射Dil标记脂质体，给药后24h取出小鼠心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织进行荧光成像分析。从组织的荧光图像结果可以先出，相对于对照组PBS和L(Dil)，P/L(Dil)组肿瘤部位的荧光信号更强。通过Living Image 3D软件分析统计，P/L(Dil)在肿瘤部位的聚集量与对照组具有显著性差异(图3b)，说明胰腺癌靶分子修饰的脂质体P/L(Ac)脂质体具有胰腺癌靶向性。如图3c所示，我们对实验鼠的心、肝、脾、肺、肾组织进行荧光定量分析，发现无论是L(Dil)还是P/L(Dil)组，其富集在肝和脾这两个代谢器官中，这与多数脂质体的代谢途径相同。
5.体外验证Click反应
我们对DBCO-Cy5能否与Panc02细胞膜上的N3基团(通过摄取P/L(Ac)表达的)反应进行了研究。如图4a所示，P/L(Ac)和Ac组Panc02细胞膜上呈现强烈的Cy5荧光，说明Cy5通过DBCO与细胞膜上的N3基团的Click反应实现了细胞膜的标记。而PBS组合P/L组的细胞膜上基本无Cy5荧光，是因为细胞膜上无N3基团，无法与DBCO基团发生反应，从而无法实现Cy5标记细胞膜。流式分析结果(图4b和图4c)与共聚焦成像结果一致。这些实验结果验证了P/L(Ac)脂质体可成功地让Panc02细胞膜表达N3基团，而且，细胞膜上表达的N3基团可与DBCO-Cy5发生Click反应。
6.体内验证Click反应
我们对DBCO-Cy5能否与体内胰腺癌细胞膜上的N3基团(通过摄取P/L(Ac)表达的)反应进行了研究。如图5a所示，P/L(Ac)组的肿瘤组织上呈现较强的Cy5荧光，说明Cy5通过DBCO与肿瘤组织的细胞膜上的N3基团的Click反应实现了细胞膜的标记。Ac组的肿瘤组织上虽然也有Cy5荧光，但是荧光强度弱于P/L(Ac)组，说明P/L(Ac)在肿瘤处的积累多于Ac。将肿瘤冰冻切片的数据显示P/L(Ac)组的Cy5荧光强度显著强于Ac组(图5b)。图5c和图5d分别是对图5a和图5b的定量分析。这些结果证明了P/L(Ac)脂质体可主动靶向胰腺癌部位，并成功地让细胞膜表达N3基团，细胞膜表达的N3基团可与Cy5标记的DBCO基团发生Click反应。
7.体外实验验证益生菌与Panc-02细胞的结合
为了检验DBCO-EcN与表达N3癌细胞的结合效率，将DBCO修饰的mCherry-EcN与表达N3的Panc-02细胞共孵育2小时。CLSM成像显示，DBCO-mCherry EcN可与Ac4GalNAz和P/L(Ac)处理的Panc-02细胞强烈结合(图6a)。流式细胞分析结果与CLSM的发现一致，DBCO-mCherry EcN与Ac4GalNAz和P/L(Ac)处理的Panc-02细胞有效结合(图6c)。最后，我们使用扫描电镜直观展示了DBCO-mCherry EcN与表达N3的Panc-02细胞的结合。如图6b所示，更多的DBCO-mCherry EcN与N3-Panc-02细胞结合。这些结果表明，DBCO修饰的益生菌可通过Click化学更多地与表达N3的癌细胞相互结合。
8.益生菌在胰腺肿瘤部位的定植研究
大肠杆菌已被证明能够在乏氧的肿瘤部位定植，这种缺氧肿瘤靶向能力促进了肿瘤靶向治疗的发展。
为了探究工程化益生菌能否通过生物正交反应来增加其在胰腺肿瘤部位的定植，我们通过尾静脉注射P/L(Ac)，并通过腹腔注射的方式对原位胰腺癌模型鼠给予工程化益生菌(DB CO-mCherry EcN)。如图7a所示，活体成像图像显示P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组其胰腺肿瘤部位有强烈的mCherry荧光。并且，如图7b所示，对a图荧光进行定量分析发现，P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组的荧光强度与Ac4GalNAz+DBCO-mCherry EcN组相比有差异。除此之外，我们通过qPCR对肿瘤内益生菌的DNA含量进行定量分析，如图7c所示，P/L(Ac)+DBCO-mCherry EcN组的益生菌DNA含量最多，是Ac4GalNAz+DBCO-mCherry EcN组的5倍，并且两组间有明显的差异。这与活体成像结果趋势一致。综上，生物正交反应这一策略能有效地增加工程化益生菌在肿瘤区域的定植。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

Claims (15)

1.一种用于益生菌靶向肿瘤细胞的组合物，其特征在于，所述组合物包含1）载体复合物，所述载体复合物包含载体、靶分子、叠氮修饰的糖代谢物，所述载体用于负载所述靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物，所述靶分子用于特异性靶向肿瘤细胞，以及2）修饰有配体的益生菌；所述修饰有配体的益生菌用于靶向结合至所述叠氮修饰的糖代谢物，使益生菌靶向定植于所述肿瘤细胞。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述载体为纳米载体。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述载体为脂质体。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述糖代谢物包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖中的至少一种。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述配体包括炔烃。
6.如权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述炔烃包括二苯基环辛炔、双环[6.1.0]壬炔中的至少一种。
7.一种定植系统，其特征在于，包括叠氮修饰的肿瘤细胞、修饰有配体的益生菌，所述修饰有配体的益生菌定植于所述肿瘤细胞；
所述叠氮修饰的肿瘤细胞包括1）肿瘤细胞，以及2）载体复合物；所述载体复合物包含载体、靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物，所述靶分子以及叠氮修饰的糖代谢物负载于所述载体，所述靶分子用于特异性靶向肿瘤细胞。
8.如权利要求7所述的定植系统，其特征在于，所述载体包括纳米载体。
9.如权利要求7所述的定植系统，其特征在于，所述载体包括脂质体。
10.如权利要求7所述的定植系统，其特征在于，所述糖代谢物包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖中的至少一种。
11.如权利要求7所述的定植系统，其特征在于，所述肿瘤包括实体瘤、非实体瘤中的至少一种。
12.如权利要求11所述的定植系统，其特征在于，所述肿瘤包括胰腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、子宫癌、直肠癌、咽喉癌、乳腺癌中的至少一种。
13.如权利要求12所述的定植系统，其特征在于，所述肿瘤为胰腺癌。
14.如权利要求7所述的定植系统，其特征在于，所述配体包括炔烃。
15.如权利要求14所述的定植系统，其特征在于，所述炔烃包括二苯基环辛炔、双环[6.1.0]壬炔中的至少一种。
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"益生菌在肿瘤免疫治疗中的研究进展";姜帅铭等;《肿瘤代谢与营养电子杂志》;第8卷(第2期);第128-133页 *
Wen-Fang Song等."In Situ Bioorthogonal Conjugation of Delivered Bacteria with Gut Inhabitants for Enhancing Probiotics Colonization".《ACS CENTRAL SCIENCE》.2022,第8卷(第9期),第1306-1317页. *

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