CN117695307A - 砷剂蛋白质纳米制剂在肿瘤免疫协同治疗药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种砷剂蛋白质纳米制剂在砷剂蛋白质纳米制剂在肿瘤免疫协同治疗药物中的应用。本发明制备的砷剂蛋白质纳米制剂粒径适中、分散均匀，具有良好的肿瘤细胞毒性作用，并诱导其发生免疫原性细胞死亡，可与免疫检查点疗法协同增强抗肿瘤疗效。本发明提供的砷剂蛋白质纳米制剂包括亚砷酸锰、二氧化锰与蛋白质，其显著的优势在于增强砷剂诱导的肿瘤细胞免疫源性细胞死亡，有效产生肿瘤相关抗原和损伤相关模式分子，从而发挥免疫治疗作用，首次实现了砷剂化疗及其免疫治疗的有机融合，解决了砷剂在治疗实体肿瘤中面临的抗肿瘤转移及抑制肿瘤复发等治疗效果不理想的问题，将化疗药物砷剂拓展至免疫治疗协同，为提升砷剂的实体瘤治疗奠定了物质和科学基础。

Description

砷剂蛋白质纳米制剂在肿瘤免疫协同治疗药物中的应用
本发明为发明名称为一种砷剂蛋白质纳米制剂在肿瘤免疫协同治疗相关方面的应用、申请号为2022108926370、申请日为2022年7月27日的发明申请的分案申请，属于药物协同技术方案部分。
技术领域
本发明属于生物医药技术，具体涉及砷剂药物蛋白质纳米粒及其制备方法和应用，尤其是一种砷剂蛋白质纳米制剂在肿瘤免疫协同治疗相关方面的应用。
背景技术
三氧化二砷（arsenic trioxide，ATO）的水溶液，即亚砷酸注射液（砷剂），是用于急性早幼粒细胞白血病的一线抗癌药物。ATO参与胞内多种信号通路并影响细胞功能，诱导细胞凋亡、改变体内氧化还原状态、参与调控分子伴侣蛋白的作用、影响蛋白激酶和蛋白磷酸酶、抑制血管生成、促进细胞分化。随着ATO在治疗急性早幼粒细胞白血病中的成功，ATO治疗其它血液肿瘤和实体瘤的研究也逐渐受到关注。研究发现，砷剂对肝癌等实体瘤具有一定的疗效，但需要更高的剂量才能达到治疗效果，而高剂量砷剂易导致严重的毒副作用。因此，设计具有肿瘤靶向性的砷剂纳米载体，对降低三氧化二砷的毒副作用，提高其在实体瘤治疗中的疗效具有重要意义。纳米药物载体(如聚合物胶束、脂质体、介孔硅等)可对此改善，然而，目前临床上还未有砷剂纳米药物的应用。
以蛋白质为基础的纳米载体作为临床转化载体由于具有较好的生物相容性和增强的渗透和滞留效应而引起了广泛关注，诸多蛋白质载体的纳米药物进入临床试验或临床应用，白蛋白结合型紫杉醇纳米颗粒（AbraxaneTM，直径约130 nm）和其他一些蛋白质基纳米药物的临床应用成功证明了这一点。白蛋白作为一种能量物质，任何细胞在生长过程中都需要摄取，特别是生长较快的肿瘤细胞，其表面表达了白蛋白结合受体gp60，通过结合白蛋白，进一步结合另一蛋白caveolin-1，通过结合这一蛋白跨越内皮细胞，同时肿瘤细胞高表达的SPARC蛋白可以结合白蛋白，促进白蛋白在肿瘤部位的蓄积。白蛋白的这一特性使白蛋白作为一种药物载体在肿瘤诊断、治疗和递送方面的应用广泛且具有探索性。另外，免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）是细胞的一种死亡形式，通过释放肿瘤相关特异性抗原以诱导生命体免疫系统产生免疫应答，但是砷剂及砷剂纳米药物的ICD效应未见报道。
发明内容
针对现有技术，本发明的目的在于提供一种具有免疫协同治疗作用的砷剂药物蛋白质纳米制剂及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
砷剂蛋白质纳米制剂或者砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉在制备抑制原位瘤、转移瘤或肿瘤复发的药物中的应用。
砷剂蛋白质纳米制剂或者砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉在制备肿瘤免疫协同治疗药物中的应用。
砷剂蛋白质纳米制剂或者砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉在制备提高肿瘤免疫治疗效果的药物中的应用。
砷剂蛋白质纳米制剂或者砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉在制备诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡的药物中的应用。
一种肿瘤免疫协同治疗药物，其特征在于，其活性成分为砷剂蛋白质纳米制剂与免疫药物。所述肿瘤免疫协同治疗药物在制备抑制原位瘤、转移瘤或肿瘤复发的药物中的应用。优选的，免疫药物为PD-L1单抗。
本发明中，所述砷剂蛋白质纳米制剂的制备方法包括以下步骤：将金属离子水溶液与蛋白质水溶液混合得到混合液1，将砷剂药物水溶液与混合液1混合得到混合液2，然后调节混合液2的pH值，搅拌反应后纯化，得到砷剂蛋白质纳米制剂；进一步的，将砷剂蛋白质纳米制剂溶液与冻干保护剂溶液混合，冷冻干燥后得到砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉。
本发明中，调节混合液2的pH值为8～12，然后20～55 ℃搅拌反应2～8 h；纯化的方法为超滤或凝胶色谱分离。
本发明中，所述蛋白质为白蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、低密度脂蛋白中的一种或几种；所述砷剂药物为亚砷酸盐；所述砷剂蛋白质纳米制剂的载药量为1%～20%。载药量是指纯化后样品中，砷质量/砷剂蛋白质纳米制剂质量；本发明的矿化是蛋白质参与的砷剂药物的形成反应，砷剂蛋白质纳米制剂纳米粒具有良好的细胞毒作用和免疫原性死亡效应。
本发明中，亚砷酸根与蛋白质的摩尔比为(50～300) : 1；亚砷酸根与金属离子的摩尔比为(1～5) : 1；所述蛋白质水溶液的浓度为2～20 mg/mL。
本发明中，金属离子水溶液优选为锰离子水溶液，由水溶性锰盐与水混合得到。
本发明采用蛋白质作为载体，首先金属离子（比如锰离子）与蛋白质混合进入内部空腔，通过亚砷酸根与金属离子的沉淀反应，使砷剂药物在蛋白质内腔中可控生长，实现砷剂药物在蛋白质中的装载，从而制得砷剂药物蛋白质纳米粒。本发明与传统纳米载体包载药物不同，并有效解决了现有技术认为砷剂药物通常为水溶性的化合物，无法实现其在蛋白质疏水空腔中反应合成纳米粒的难题。本发明提供的砷剂药物蛋白质纳米粒具有体内长循环和肿瘤靶向性的特点，促进了砷剂药物和金属离子（比如锰离子）在肿瘤组织蓄积并进入肿瘤，可有效杀伤实体肿瘤并诱导肿瘤ICD效应产生免疫应答。
本发明的砷剂药物蛋白质纳米粒可制成注射剂，并进一步制成各类半固体制剂、固体制剂等。
本发明首次采用两步制备方法，成功制备了砷剂药物蛋白质纳米粒，制得的纳米粒分散均匀、粒径均一；纳米粒具有良好的肿瘤细胞毒作用和免疫原性细胞死亡效应，IC50低。本发明将锰离子稳定的进入白蛋白水空腔作为前体配合物，引入氯化锰离去基团发生配体交换反应，诱导砷剂药物在蛋白质内腔中形成，从而制得纳米粒，解决了砷剂药物难以有效包覆的问题。与其他载砷剂药物纳米粒相比，本发明提供的砷剂药物蛋白质纳米粒，其显著的优势在于制备工艺简单、尺寸均一、粒径可控、生物相容性良好、水溶性好、血液中循环时间长、肿瘤靶向性高等特点，可有效杀伤实体肿瘤并诱导肿瘤ICD效应产生免疫应答，为高效的肿瘤治疗奠定了基础。
附图说明
图1为实施例一中砷剂蛋白质纳米粒的电镜图；
图2为实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒的X-射线衍射图谱；
图3为本发明中实施例一制备的亚砷酸锰/二氧化锰蛋白质纳米粒和游离砷酸细胞毒性对4T1细胞株的细胞存活率图；
图4为实施例一中砷剂蛋白质纳米粒体外诱导肿瘤细胞CRT表达情况的免疫荧光图；
图5为实施例一中砷剂蛋白质纳米粒体外诱导肿瘤细胞核HMGB1释放情况的免疫荧光图；
图6为实施例一中砷剂蛋白质纳米粒诱导肿瘤细胞CRT表达情况的流式直方图（A）及其荧光统计图（B）；
图7为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒体外诱导肿瘤部位CRT表达阳性细胞占比的流式统计图；
图8为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒体外诱导肿瘤部位PD-L1表达阳性细胞占比的流式统计图；
图9为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒联合PD-L1单抗对原位乳腺癌模型荷瘤小鼠在18天内的抑瘤曲线图；
图10为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒联合PD-L1单抗对原位乳腺癌模型荷瘤小鼠在18天后肺部转移瘤荧光图；
图11为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒联合PD-L1单抗对原位乳腺癌模型荷瘤小鼠治疗后肿瘤引流淋巴结中成熟DC细胞占比的流式统计图
图12为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒联合PD-L1单抗对原位乳腺癌模型荷瘤小鼠治疗后肿瘤部位CD8阳性T细胞占比的流式统计图。
图13为本发明中实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒联合PD-L1单抗对原位乳腺癌模型荷瘤小鼠治疗后肿瘤部位CD4阳性T细胞占比的流式统计图。
实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明涉及的原料都为现有常规产品，具体实验操作为常规技术，动物实验符合苏州大学相关要求。Anti-mouse-PD-L1(catalog:BE0101, clone: 10F.9G2)来自Bioxcell Co., Ltd(Beijing, China)；Zombie AquaFixable Viability Kit (catalog: 423102), TruStain FcX (anti-mouse CD16/32,catalog: 101320), APC/Cyanine7 anti-mouse CD45 (catalog: 103116), PE/Cyanine7anti-mouse/human CD11b (catalog: 101216), APC anti-mouse CD8a (catalog:100712), PerCP anti-mouse CD4 (catalog: 100538), FITC anti-mouse CD3(catalog: 100204), PE anti-mouse CD80 (catalog: 104708), APC anti-mouse CD86(catalog: 105012) ，FITC anti-mouse CD11c (catalog: 117306) antibodies 都来自BioLegend, Inc. (San Diego, USA). Rabbit anti-calreticulin antibody (catalog:bs-2696R) 来自Bioss Co., Ltd (Beijing, China)。本发明实施例数据采用two-tailedStudent’s t-tests检验方法. ***P <0.001, **P <0.01 以及 *P <0.05为具有统计学显著性差异，而n.s.代表无显著性差异。
现有技术蛋白质结合砷剂药物的数量非常有限，亚砷酸钠具有很好的水溶性，临床给药会对正常组织产生很强的毒副作用，目前只能应用于血液肿瘤治疗，对实体瘤的靶向效果较差，且其抑制原位瘤和转移瘤或肿瘤复发的疗效不足；本发明中，白蛋白、转铁蛋白等蛋白质是一类生物相容性良好的载体材料，可以诱导无机金属及氧化物在其内部沉淀，形成无机纳米晶的单分子白蛋白纳米粒，亚砷酸钠具有很好的水溶性，首先通过蛋白纳米笼中的氨基酸残基与锰离子形成成核中心，随后引入亚砷酸根并用氢氧化钠将溶液调至偏碱性，锰离子与亚砷酸根发生沉淀反应生成亚砷酸锰/二氧化锰沉淀，在蛋白内腔产生沉淀复合物，制备出载亚砷酸锰/二氧化锰沉淀的白蛋白纳米粒。解决了水溶性药物亚砷酸钠难以形成沉淀，无法有效包覆于蛋白质中的问题。同时，本发明构建的砷剂蛋白质纳米制剂不仅具有良好的化疗作用，还具有诱导肿瘤细胞免疫原性细胞死亡的效果，可有效产生化疗免疫协同治疗效果。本发明抗肿瘤砷剂药物蛋白质纳米粒及其冻干粉的制备方法如下：
（1）将锰离子水溶液与蛋白质水溶液混合搅拌得到混合液1；
（2）将砷剂药物水溶液与上述混合液1混合得到混合液2，调节混合液pH值至10，搅拌反应4小时后纯化，得到砷剂药物蛋白质纳米粒；然后冻干得到砷剂药物蛋白质纳米粒冻干粉。
本发明中，步骤（1）中，搅拌下，锰离子水溶液滴加入蛋白质水溶液中；步骤（2）中，反应的温度为55 ℃，时间为4小时，纯化为在超滤管中离心处理。
本发明中，以水溶性锰盐与水配制锰离子水溶液，比如氯化锰；砷剂药物为亚砷酸钠；亚砷酸钠与蛋白质的摩尔比为240:1；亚砷酸钠与锰离子的摩尔比为2:1；所述蛋白质水溶液的浓度为5 mg/mL。
本发明中，冻干时保护剂包括甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖等的一种或几种。
本发明中，所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、低密度脂蛋白中的一种或几种；所述砷剂药物为亚砷酸钠。
本发明中，作为溶剂的水优选去离子水。
本发明中，用NaOH水溶液或HCl溶液调节混合液的pH值，优选NaOH水溶液或HCl溶液的浓度为2 M。
本发明的砷剂药物蛋白质纳米粒可制成注射剂，用于静脉注射，还可进一步冷冻干燥制成冻干粉针。
实施例一
砷剂药物蛋白质纳米粒制备，其具体步骤如下：
取30 µL氯化锰水溶液（锰离子浓度300 mM）与1.0 mL人血清白蛋白（蛋白质浓度5mg/mL）水溶液在常规搅拌下混合，然后加入45 µL亚砷酸钠水溶液（亚砷酸根离子浓度400mM），得到混合液，其中亚砷酸钠与蛋白质的摩尔比为240:1，亚砷酸根离子与锰离子的摩尔比为2∶1；然后用2 M NaOH水溶液调节混合的溶液pH至10，然后将混合液在55℃以200 rpm搅拌4小时，然后将所得混合液加入超滤管中，2000 rpm离心2分钟，制得砷剂蛋白纳米粒，为砷剂蛋白质纳米制剂。
将上述砷剂蛋白纳米粒采用甘露醇作为保护剂冻干，得到砷剂蛋白纳米粒冻干粉，冻干的条件为：将样品置于-80 ℃预冻10小时，并迅速转移至冷阱温度降至-20 ℃的冻干机，真空度10 Pa，干燥12小时，然后逐步升温至30 ℃，继续干燥2小时，得到砷剂蛋白纳米粒冻干粉。
对制备的砷剂蛋白纳米粒进行电镜拍摄，结果如图1所示，制得的纳米粒分散均匀、粒径均一，通过120 kV透射电镜对纳米粒的宏观形貌进行扫描，平均粒径（药物粒径）为4.6±0.7 nm，砷载药量为15%（质量百分数），用ICP测定样品中As的含量。
对实施例一制备的砷剂蛋白质纳米粒进行性能测试，方法如下：
1、对实施例一中制备的砷剂蛋白质纳米粒组成测试：具体步骤为：对制备的砷剂蛋白纳米粒进行X射线光电子能谱（XPS）分析。XPS结果（图2）表明，砷剂蛋白纳米粒纳米笼内形成了MnHAsO3/MnO2纳米杂化物，As(III)、Mn(II)和Mn(IV)是主要成分，证明了MnHAsO3/MnO2纳米杂化物在蛋白质空腔中生长。
2、对实施例一中制备的砷剂蛋白纳米粒细胞毒性的测试：具体步骤为：取对数生长期的4T1细胞铺入96孔板培养，接种密度为4×103/孔，每孔100 μL，放入细胞培养箱恒温培养12小时，细胞贴壁后去除培养基，用磷酸盐缓冲液洗1次，加入用培养基配好的砷剂蛋白纳米粒溶液，每孔100 μL；放入培养箱培养24小时后，去除培养基，加200 µL浓度为0.5mg/mL 噻唑蓝的培养基，4小时后弃去培养基，加入150 µL的DMSO，将板轻轻震荡15分钟，然后使用酶标仪在492 nm处测量吸光度。结果（图3）表明，本发明砷剂蛋白质纳米粒能有效杀伤4T1细胞。
3、对实施例一中制备的砷剂蛋白纳米粒体外诱导免疫原性细胞死亡（ICD）效应的能力测试：具体步骤为：
1）免疫荧光法测CRT表达：将4T1细胞以每皿5.0×104个细胞的密度接种到玻璃底培养皿中培养过夜，然后分别用PBS、浓度为15.0 µM亚砷酸钠水溶液、砷剂蛋白纳米粒水溶液（以砷计，浓度为15.0 µM）再孵育6小时。将细胞用PBS洗涤3次，随后将细胞与CRT一抗在室温下孵育45分钟，并与FITC标记的单克隆二抗在室温下孵育30分钟，然后与细胞核染料Hoechst 33342孵育5分钟进行细胞核染色，最后，在共聚焦显微镜（Zeiss LSM710）下对样本进行检测，观察CRT和细胞核的免疫荧光。结果如图4所示，纳米粒组较PBS组和游离药物组具有更多的CRT暴露在细胞膜表面。
2）免疫荧光法测HMGB1表达：将4T1细胞以每皿5.0×104个细胞的密度接种到玻璃底培养皿中培养过夜，然后分别用PBS、浓度为15.0 µM亚砷酸溶液和砷剂蛋白纳米粒溶液再孵育6小时。用PBS洗涤细胞并用4%多聚甲醛固定15分钟，然后用0.1% TritonX-100通透细胞膜15分钟。随后，将细胞与HMGB1一抗孵育45分钟，用Alexa Fluor 594偶联的二抗在室温下孵育30分钟，然后与细胞核染料Hoechst 33342孵育5分钟进行细胞核染色。最后，在共聚焦显微镜（Zeiss LSM710）下对样本进行检测，观察HMGB1和细胞核的免疫荧光。结果如图5所示，纳米粒组较PBS组和游离药物组导致肿瘤细胞核内更多的HMGB1释放出。
3）流式细胞术测CRT表达：将4T1细胞以每孔5.0×104个细胞的密度接种到12孔板中培养过夜，然后分别用PBS、浓度为15.0 µM亚砷酸溶液和砷剂蛋白纳米粒溶液再孵育6小时。用PBS洗涤细胞并用胰蛋白酶消化3分钟，然后将细胞洗涤并重悬于PBS中。随后，将细胞与CRT一抗在室温下孵育45分钟，并与FITC偶联的单克隆二抗孵育30分钟。最后，通过流式细胞仪（BD FACSCalibur）测量FITC绿色荧光阳性细胞，结果如图6所示，纳米粒组具有较PBS组和游离药物组更强的CRT表达，表明砷剂具有诱导肿瘤细胞ICD效应的能力，砷剂白蛋白纳米粒则进一步增强了这一效应。
4、对实施例一中制备的砷剂蛋白纳米粒体内诱导免疫原性细胞死亡（ICD）效应的能力测试：具体步骤为：流式细胞术测CRT表达：
（1）肿瘤模型的建立：4T1皮下乳腺癌模型：用剃毛器将6-8周Balb/c雌性小鼠右腿肌肉处的毛剃掉，涂脱毛膏，5 min后将脱毛膏擦洗干净。收集处于对数生长期的4T1细胞，1000 rpm离心3 min。弃上清，用PBS洗三遍，用预冷的PBS稀释成5×106个/mL，在小鼠右腿肌肉处皮下注射100 µL细胞悬液，量取肿瘤的长径和短径，待肿瘤长至70-100 mm3时使用。
（2）流式细胞术测肿瘤组织CRT和PD-L1表达：将小鼠随机分为3组，每组3只。包括PBS组，氯化锰/亚砷酸钠组，砷剂蛋白纳米粒组。以尾静脉给药的方式注射药物，以纳米粒中砷和锰的量来计算游离药物的给药量，给药标准是砷剂蛋白纳米粒组中砷为4 mg/kg，锰的给药剂量按纳米粒中砷和锰的比例推算，给药剂量大约为5.6 mg/kg。PBS组注射200 µLPBS作为对照；氯化锰/亚砷酸钠组是分开、连续注射。分别在第0、4、8天给4T1荷瘤小鼠静脉注射相应药物，第9天处死小鼠，收获肿瘤剪碎后并用0.2%胶原酶II和15 U mL-1 DNA酶I在1640培养基中于37 °C消化45分钟，10分钟吹打一次。通过70 µm细胞过滤器过滤细胞悬液。显微镜下计数细胞，取106个细胞悬浮于流式缓冲液中用于CRT和PD-L1染色，室温下孵育45分钟，将染色的细胞洗涤2次，后与FITC偶联的单克隆二抗孵育30分钟。最后，分别通过流式细胞仪（BD FACSCalibur）测量FITC绿色荧光阳性细胞，结果如图7和图8所示。
5、对实施例一制备的砷剂蛋白纳米粒进行Balb/c小鼠体内原位乳腺癌及肺转移抑制效果的考察：如上建立的肿瘤模型的方法构建4T1原位乳腺癌模型，待肿瘤体积至70-100 mm3时，将小鼠随机分为6组，每组5只。包括PBS组，PD-L1单抗组，氯化锰/亚砷酸钠组，氯化锰/亚砷酸钠+PD-L1单抗组，砷剂蛋白纳米粒组，砷剂蛋白纳米粒+PD-L1单抗组。以尾静脉给药的方式注射药物，以纳米粒中砷和锰的量来计算游离药物的给药量，给药标准是砷剂蛋白纳米粒组中砷为4 mg/kg，锰的给药剂量按纳米粒中砷和锰的比例推算，给药剂量大约为5.6 mg/kg。PBS组注射200 µL PBS作为对照，PD-L1单抗给药剂量为2.5 mg/kg。在第0、4、8天进行3次PBS、氯化锰/亚砷酸钠和砷剂蛋白纳米粒的注射，然后在第1、5、9天以2.5mg kg-1的剂量给予PD-L1单抗。由图9中4T1荷瘤小鼠肿瘤体积的变化可知，注射PBS组和PBS+PD-L1单抗组，氯化锰/亚砷酸钠组和氯化锰/亚砷酸钠+PD-L1单抗组相比，肿瘤生长没有差异，而砷剂蛋白纳米粒+PD-L1单抗组较砷剂蛋白纳米粒组有显著的肿瘤生长抑制效果，治疗18天后，对携带原位4T1肿瘤的小鼠腹腔注射200 µL D-荧光素钠盐，剂量为15 mg/kg，注射后处死。使用IVIS光谱收集并观察切除的肺，并通过IVIS活体图像软件量化肺转移灶的生物发光强度，如图10所示砷剂蛋白纳米粒+PD-L1单抗组的肺生物成像也显示了最少的肺部肿瘤转移，从左到右是平行作了5只老鼠。
6、对实施例一制备的砷剂蛋白纳米粒进行Balb/c小鼠体内原位乳腺癌相关免疫细胞检测：如上建立的肿瘤模型的方法构建4T1原位乳腺癌模型，待肿瘤体积至70-100 mm3时，将小鼠随机分为6组，每组5只。包括PBS组，PD-L1单抗组，氯化锰/亚砷酸钠组，氯化锰/亚砷酸钠+PD-L1单抗组，砷剂蛋白纳米粒组，砷剂蛋白纳米粒+PD-L1单抗组。如上述抑瘤实验给药方式，在第11天，收集来自肿瘤引流淋巴结的细胞用于评估DC细胞的成熟。取肿瘤引流淋巴结研磨后过70 µm细胞过滤器，显微镜下计数，取106个细胞用CD16/32抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）封闭15分钟，然后用CD11b-PEcy7抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）、CD11c-FITC抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）、CD80-PE抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）、CD86-APC抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）在4 °C下孵育30分钟。将细胞洗涤2次并重悬于500 μL缓冲液中用于流式检测。结果如图11所示，砷剂蛋白纳米粒由于引起肿瘤细胞显著的ICD效应释放肿瘤损伤相关模式分子促进DC细胞的成熟。收集肿瘤剪碎并用0.2%胶原酶II和15 U mL-1 DNA酶I在1640培养基中于37 °C消化45分钟，10分钟吹打一次。通过70 µm细胞过滤器过滤细胞悬液。显微镜下计数细胞，取悬浮在染色缓冲液中的106个细胞用于T细胞染色。首先将细胞用CD16/32抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）封闭15分钟，然后用CD45-APC-Cy7抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）、CD3-FITC抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释）、CD8-APC抗体（使用流式缓冲液1:200稀释），CD4-PerCP抗体（使用流式缓冲液1: 200稀释），4 °C孵育30分钟。将染色的细胞洗涤2次并重悬于500 μL缓冲液中用于流式检测。如图12和图13所示，砷剂蛋白纳米粒由于诱导较强的肿瘤细胞ICD效应，促进DC细胞成熟，呈递抗原并活化T细胞，联用PD-L1单抗后改善肿瘤部位由于砷剂蛋白纳米粒引起的肿瘤细胞PD-L1表达增加后的免疫抑制性环境，进一步激活T细胞。
实施例二
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将混合液置于37 ℃反应4小时，通过120 kV透射电镜对砷剂药物蛋白质纳米粒的宏观形貌进行扫描，制得的纳米粒平均粒径为3.6±0.4 nm。
实施例三
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将混合液置于55 ℃反应2小时，通过120 kV透射电镜对砷剂药物蛋白质纳米粒的宏观形貌进行扫描，制得的纳米粒平均粒径为2.6±0.3 nm。
实施例四
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将混合液置于55 ℃反应8小时，通过120 kV透射电镜对纳米粒的宏观形貌进行扫描，制得的砷剂药物蛋白质纳米粒平均粒径为15.6±3.1 nm。
实施例五
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将混合液pH调节至8，通过120 kV透射电镜对砷剂药物蛋白质纳米粒的宏观形貌进行扫描，制得的纳米粒平均粒径为3.2±2.3nm。
实施例六
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：亚砷酸根与锰离子的摩尔比为4∶1，通过120 kV透射电镜对砷剂药物蛋白质纳米粒的宏观形貌进行扫描，制得的纳米粒平均粒径为5.6±0.8 nm，载药量为7.6%。
实施例七
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：亚砷酸根与锰离子的摩尔比为8∶1，通过120 kV透射电镜对纳米粒的宏观形貌进行扫描，制得的砷剂药物蛋白质纳米粒平均粒径为6.7±0.6 nm，载药量为8.6%。
实施例八
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：砷剂与蛋白质的摩尔比为80∶1，制得的砷剂药物蛋白质纳米粒平均粒径为1.8±0.3 nm，载药量为3.6%。
实施例九
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：人血清白蛋白（HSA）溶液的浓度为2.5 mg/mL，对制备得到的纳米粒进行电镜拍摄，制得的砷剂药物蛋白质纳米粒平均粒径为16.8±3.5 nm，载药量为10.8%。
实施例十
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：人血清白蛋白（HSA）溶液的浓度为10mg/mL，对制备得到的纳米粒进行电镜拍摄，制得的砷剂药物蛋白质纳米粒平均粒径为4.8±0.6 nm，载药量为12%。
实施例十一
其区别在于：人血清白蛋白（HSA）溶液的浓度为20 mg/mL，对制备得到的砷剂药物蛋白质纳米粒进行电镜拍摄，制得的纳米粒平均粒径为4.8±0.6 nm，载药量为7.6%。
实施例十二
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以牛血清白蛋白（BSA）溶液为蛋白溶液，制得BSA包载的砷剂矿化蛋白质纳米粒，其平均粒径为5.1±1.2 nm。
实施例十三
本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以人转铁蛋白（Trf）溶液为蛋白溶液，制得砷剂药物蛋白质纳米粒，其平均粒径为4.5±0.9 nm。
蛋白质纳米载体的空间分布具有纳米级别的疏水空腔，作为纳米反应器可以允许单组分或多组分物质的可控成核和生长，以控制这些物质的生长大小。阳离子化合物或者带正电的金属离子通过引入另一个在溶液中呈负电荷的化合物，在无机沉淀反应、还原反应和氧化反应等作用下，以简单可控的方法诱导药物在蛋白质空腔中的反应和生长，诱导溶液中的离子可控地在蛋白质疏水空腔中沉淀，形成生物相容性良好的蛋白质基纳米药物。
基于以上分析，本发明采用临床已有批准应用的白蛋白等作为单分子蛋白质载体，通过锰离子形成成核中心，诱导亚砷酸根在蛋白质内腔中的生长，构建出具有肿瘤蓄积能力的砷剂蛋白质纳米粒，同时发现砷剂蛋白质纳米粒不仅具有很好的化疗作用、还可有效诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡，实现高效的肿瘤化疗与免疫治疗有机结合。

Claims (10)

1.砷剂蛋白质纳米制剂或者砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉在制备抑制原位瘤、转移瘤或肿瘤复发的药物中的应用。
2.砷剂蛋白质纳米制剂或者砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉在制备肿瘤免疫协同治疗药物中的应用。
3.根据权利要求1或者2所述的应用，其特征在于，所述砷剂蛋白质纳米制剂的制备方法包括以下步骤：将金属离子水溶液与蛋白质水溶液混合得到混合液1，将砷剂药物水溶液与混合液1混合得到混合液2，然后调节混合液2的pH值，搅拌反应后纯化，得到砷剂蛋白质纳米制剂；将砷剂蛋白质纳米制剂溶液与冻干保护剂溶液混合，冷冻干燥后得到砷剂蛋白质纳米制剂冻干粉。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，调节混合液2的pH值为8～12，然后20～55℃搅拌反应2～8 h；纯化的方法为超滤或凝胶色谱分离。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为白蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、低密度脂蛋白中的一种或几种；所述砷剂药物为亚砷酸盐；所述砷剂蛋白质纳米制剂的载药量为1%～20%。
6. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，亚砷酸根与蛋白质的摩尔比为(50～300):1；亚砷酸根与金属离子的摩尔比为(1～5):1；所述蛋白质水溶液的浓度为2～20mg/mL。
7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，肿瘤免疫协同治疗药物的活性成分为砷剂蛋白质纳米制剂与免疫药物。
8.一种肿瘤免疫协同治疗药物，其特征在于，其活性成分为权利要求1所述砷剂蛋白质纳米制剂与免疫药物。
9.权利要求8所述肿瘤免疫协同治疗药物在制备抑制原位瘤、转移瘤或肿瘤复发的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，药物诱导肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡。
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US20110020434A1 (en) * 2005-09-02 2011-01-27 O'halloran Thomas V Nanoparticle arsenic-platinum compositions
CN103142648B (zh) * 2011-12-07 2015-04-15 浙江中医药大学 一种砷化合物溶液及其制备的包载砷化合物的白蛋白纳米粒和冻干制剂
CN105288647B (zh) * 2015-10-10 2018-05-25 中国药科大学 功能化白蛋白及其纳米制剂的制备方法
CN113905722A (zh) * 2019-01-22 2022-01-07 锐创生物医药(香港)有限公司 白蛋白纳米颗粒、其制备方法和用途
CN112107556A (zh) * 2019-06-03 2020-12-22 北京大学 一种含砷纳米药物及其制备方法
CN110368374B (zh) * 2019-08-22 2021-11-09 苏州大学 一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用
WO2021035498A1 (zh) * 2019-08-26 2021-03-04 苏州大学 一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用
CN110859821A (zh) * 2019-11-12 2020-03-06 中山大学附属第五医院 一种含砷纳米颗粒的药物及其制备方法
CN111821279A (zh) * 2020-07-16 2020-10-27 复旦大学附属华山医院 白蛋白载二氧化锰及全氟溴辛烷纳米粒及制备方法与应用
CN112569258B (zh) * 2020-11-13 2022-04-12 扬州大学 一种肿瘤靶向性纳米砷剂及其制备方法和应用
CN112641852B (zh) * 2020-12-29 2022-01-07 中国科学院长春应用化学研究所 一种牛血清白蛋白-茶多酚-钼纳米复合物及其应用
CN114748457A (zh) * 2022-04-11 2022-07-15 中国医学科学院医学生物学研究所 一种用于治疗宫颈癌的药物组合物及其应用

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