CN115192546B - 一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒及其制备方法 - Google Patents

一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒及其制备方法，所述制备方法包括如下步骤：向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加EDC溶液和NHS溶液并搅拌一段时间，得到混合液；向混合液中添加CD133抗体溶液和穿膜肽溶液进行反应；待反应结束，离心收集沉淀物、洗涤、冷冻干燥，即得所述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒；本发明制备得到的多功能纳米粒能够对肝癌细胞具有被动和主动靶向，对肝癌细胞具有更加优异毒性，最大限度的提高了肝脏肝癌干细胞的选择性和治疗效果；此外，本发明制备方法工艺简单、易于操作，便于生产。

Description

一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明涉及靶向治疗技术领域，具体涉及一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒及其制备方法。
背景技术
肝脏是人体重要器官之一，参与体内消化、排泄、解毒和免疫调节等过程，因此肝脏也是人体最易受损的器官之一。然而，肝癌等疾病导致了大量的死亡，严重威胁人类的健康。
目前，肝癌治疗的方法主要包括化学治疗、放射疗法、外科手术、光动力学治疗等。发展比较早且使用广泛的治疗方法是化学治疗和放射疗法，其主要缺点在于：治疗手段对癌细胞的靶向性不高，不能有效区分癌细胞和正常细胞，特别是化疗及一些蛋白质药物具有很高的细胞毒性，在治疗的同时也对正常机体器官造成很大损伤。按照传统的给药方式，小分子药物在体内随机分布，真正蓄积到病患部位进而发挥药效的只是少部分药物，多数都被代谢排出体外，生物利用度很低。
靶向性药纳米物传递是一种既可以提高治疗靶向性又比较容易实现的治疗途径，主要依靠药物分子通过靶向特异性到达病变部位，杀灭致病病毒、修复受损组织或消除疾病症状。概括而言，靶向性药物输送体系具有如下主要优点：高度靶向性，减少毒副作用；增加非水溶性药物在体内的分散量，稳定药物在体内的存在；浓集药物并能够调节药物的释放速度；改变药物给药途径，如将需要静脉注射的药物制成方便的口服药物等。然而，目前关于体内靶向功能的药物载体成功用于临床报道极其少见，导致靶向药物的临床应用进展缓慢。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒及其制备方法，该多功能纳米粒能够对肝癌细胞具有被动和主动靶向，对肝癌细胞具有更加优异毒性，最大限度的提高了肝脏肝癌干细胞的选择性和治疗效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加EDC溶液和NHS溶液并搅拌一段时间，得到混合液；
(b)向混合液中添加CD133抗体溶液和穿膜肽溶液进行反应；
(c)待反应结束，离心收集沉淀物、洗涤、冷冻干燥，即得所述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒。
在本发明中对紫杉醇PLGA纳米粒的制备方法不作严格限制，可以通过本领域的常规方法制备得到；优选地，可以采用如下方法制得：
将紫杉醇1～3mg和聚乙酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA，L/G＝50/50，分子量＝25000)0.1～0.3g溶于二氯甲烷5ml，加入1％聚乙烯醇(PVA，分子量＝30000-70000)水溶液20～40ml，磁力搅拌并超声乳化3～10min；持续搅拌所生成的悬浊液4～8h挥发二氯甲烷，蒸馏水洗涤2～3遍除去PVA，离心弃上清，沉淀冷冻干燥，纳米粒干粉4℃保存备用。
优选地，所述步骤(a)中，紫杉醇PLGA纳米粒悬液浓度为4～6mg/ml；EDC溶液和NHS溶液浓度分别为40～60mg/ml。
优选地，所述步骤(a)中，紫杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1000∶(5～20)∶(5～20)。
优选地，所述步骤(a)中，搅拌时间为15～30min，搅拌温度为室温。
优选地，所述步骤(b)中，CD133抗体溶液浓度为0.8～1.2mg/ml，穿膜肽溶液浓度为1.5～2.5mg/ml。
优选地，所述步骤(b)中，CD133抗体溶液和穿膜肽溶液的添加量分别为混合液体积的0.8～1.2倍。
优选地，所述步骤(b)中，反应温度2～6℃，时间为10～14h。
优选地，所述步骤(c)中，离心转速为25000～35000r/min，时间为4～6min。
优选地，所述步骤(b)中，穿膜肽为穿膜肽R9。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制得的靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明制备得到的多功能纳米粒能够对肝癌细胞具有被动和主动靶向，对肝癌细胞具有更加优异毒性，最大限度的提高了肝脏肝癌干细胞的选择性和治疗效果；此外，本发明制备方法工艺简单、易于操作，便于生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实验例中不同纳米粒的紫杉醇替我释放曲线；
图2为本发明实验例中不同纳米粒与肝癌细胞共培养后的显微照片；
图3为本发明实验例中不同纳米粒对肝癌细胞HepG2存活能力的影响；
图4为本发明实验例中不同纳米粒对肝癌细胞Huh7存活能力的影响。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
以下各实施例中采用的原料如下：
紫杉醇PLGA纳米粒通过如下方法制得：
将紫杉醇2mg和聚乙酸-聚羟基乙酸共聚物(PLGA，L/G＝50/50，分子量＝25000)0.1g溶于二氯甲烷5ml，加入1％聚乙烯醇(PVA，分子量＝30000-70000)水溶液30ml，磁力搅拌并超声乳化5min；持续搅拌所生成的悬浊液6h挥发二氯甲烷，蒸馏水洗涤3遍除去PVA，离心弃上清，沉淀冷冻干燥，纳米粒干粉4℃保存备用(记为P-NPs)。
未载药的纳米粒为空白纳米粒。
实施例1
本实施例为一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将紫杉醇PLGA纳米粒分散在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3)中，得到浓度为4mg/ml的紫杉醇PLGA纳米粒悬液；然后，向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加浓度为60mg/ml的EDC溶液和浓度为40mg/mlNHS溶液并搅拌30min，得到混合液，其中，杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1000∶5∶20；
(b)向混合液中添加浓度为0.8mg/ml的CD133抗体溶液和浓度为2.5mg/ml的穿膜肽R9溶液，并在6℃下进行反应10h，其中，CD133抗体溶液和穿膜肽R9溶液的添加量分别为混合液体积的0.8倍；
(c)待反应结束，以25000r/min离心6min收集沉淀物、再采用蒸馏水洗涤2次、冷冻干燥，即得上述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒。
实施例2
本实施例为一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将紫杉醇PLGA纳米粒分散在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3)中，得到浓度为6mg/ml的紫杉醇PLGA纳米粒悬液；然后，向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加浓度为40mg/ml的EDC溶液和浓度为60mg/mlNHS溶液并搅拌15min，得到混合液，其中，杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1000∶20∶5；
(b)向混合液中添加浓度为1.2mg/ml的CD133抗体溶液和浓度为1.5mg/ml的穿膜肽R9溶液，并在2℃下进行反应14h，其中，CD133抗体溶液和穿膜肽R9溶液的添加量分别为混合液体积的1.2倍；
(c)待反应结束，以35000r/min离心4min收集沉淀物、再采用蒸馏水洗涤4次、冷冻干燥，即得上述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒。
实施例3
本实施例为一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将紫杉醇PLGA纳米粒分散在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3)中，得到浓度为5mg/ml的紫杉醇PLGA纳米粒悬液；然后，向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加浓度为50mg/ml的EDC溶液和浓度为50mg/mlNHS溶液并搅拌20min，得到混合液，其中，杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为100∶1∶1；
(b)向混合液中添加浓度为1mg/ml的CD133抗体溶液和浓度为2mg/ml的穿膜肽R9溶液，并在4℃下进行反应12h，其中，CD133抗体溶液和穿膜肽R9溶液的添加量分别为混合液体积的1倍；
(c)待反应结束，以30000r/min离心5min收集沉淀物、再采用蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥，即得上述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒(记为CD133+R9-NPs)。
对比例1
本对比例为一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将紫杉醇PLGA纳米粒分散在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3)中，得到浓度为5mg/ml的紫杉醇PLGA纳米粒悬液；然后，向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加浓度为50mg/ml的EDC溶液和浓度为50mg/mlNHS溶液并搅拌20min，得到混合液，其中，杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为100∶1∶1；
(b)向混合液中添加浓度为1mg/ml的CD133抗体溶液，并在4℃下进行反应12h，其中，CD133抗体溶液的添加量分别为混合液体积的1倍；
(c)待反应结束，以30000r/min离心5min收集沉淀物、再采用蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥，即得上述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒(记为CD133-NPs)。
对比例2
本实施例为一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(a)将紫杉醇PLGA纳米粒分散在磷酸盐缓冲液(PBS，pH 6.3)中，得到浓度为5mg/ml的紫杉醇PLGA纳米粒悬液；然后，向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加浓度为50mg/ml的EDC溶液和浓度为50mg/mlNHS溶液并搅拌20min，得到混合液，其中，杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为100∶1∶1；
(b)向混合液中添加浓度为2mg/ml的穿膜肽R9溶液，并在4℃下进行反应12h，其中，穿膜肽R9溶液的添加量分别为混合液体积的1倍；
(c)待反应结束，以30000r/min离心5min收集沉淀物、再采用蒸馏水洗涤3次、冷冻干燥，即得上述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒(记为R9-NPs)。
实验例
1、分别按照实施例3以及对比例1～2的制备方法制备多功能纳米粒，不同实施例制备步骤(c)中对离心得到的上清液中抗体的含量用考马斯亮蓝法测定。用荧光分光光度法测定上清液中R9的含量；计算不同实施例中CD133抗体以及穿膜肽R9的负荷率，负荷率＝(CD133抗体或R9在P-NPs中的量/P-NPs的量)×100％。
采用动态光散射方法，使用粒度分析仪对P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs的大小、多分散指数进行检测；
计算结果如下：
CD133-NPs和CD133+R9-NPs的抗体负荷率分别为1.36和1.19％；
R9-NPs和CD133+R9-NPs的穿膜肽R9负荷率分别为2.57和2.33％；
P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs的大小分别为111.45±42.33、132.86±51.78、129.81±53.64和145.54±58.27nm；多分散指数0.127、0.143、0.139和0.149。
包封率和载药率计算如下：
用1ml二氯甲烷溶解5mg纳米粒，加入到乙腈︰水＝50︰50混合溶液3ml中萃取，用氮气蒸发二氯甲烷至溶液清亮。采用高效液相色谱仪分析药物含量，其中，流动相为乙腈︰水＝50︰50，流速1ml/min，紫外探测波长为227nm。实验重复3次。计算包封率和载药率。
包封率(％)＝纳米粒中药物的质量/所用药物的总质量×100％；
载药率(％)＝纳米粒中药物的质量/纳米粒的总质量×100％；
按照上述方法对P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs的载药率和包封率进行检测，检测结果如下：
P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs的载药率分别为4.62±0.49％、4.48±0.53％、4.52±0.44％、4.39±0.47％；包封率分别为90.16±12.4％、85.27±9.8％、86.79±10.1％和82.93±8.7％。
2、对P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs分别进行体外紫杉醇释放实验，具体实验过程如下：
将5mg纳米粒分散于10ml磷酸盐缓冲液(PBS)，在定轨摇床上振荡混悬液，频率为120转/min，温度为37℃；于不同时间点取出混悬液，离心，保存上清，用10ml新鲜PBS重悬沉淀并继续振荡。高效液相色谱仪分析上清中药物含量；实验重复3次。
体外实验结果如图1所示，由图1可知，不同的纳米粒中紫杉醇在最初的24小时内迅速释放，随后缓慢和持续释放数月，14天内累积药物释放约为40％。
3、暴露于载药NPs的HepG2和Huh7细胞的形态学研究：
具体实验过程如下：
将HepG2和Huh7细胞以1×106/孔接种于六孔培养板，培养24h贴壁，分别加入2mg/ml不同NPs，培养24h。TE2000-S显微镜(日本Nikon公司)拍摄细胞形态。
实验结果如图2所示；由图2可知，由于释放的紫杉醇的细胞毒性，导致HepG2和Huh7细胞细胞的损伤和分解.
4、细胞存活实验
采用平板克隆形成实验检测纳米粒作用后细胞存活情况。37℃，将HepG2和Huh7细胞以每孔500个细胞接种在6孔组织培养板中培养24h，然后将细胞与1mg/ml空白纳米粒、紫杉醇纳米粒(分别释放7.46、11.72、16.41、23.55、37.86和57.29ng/ml紫杉醇)、CD133-NPs(分别释放7.19、10.96、15.33、22.16、35.03和54.48ng/ml紫杉醇)、R9-NPs(分别释放7.01、10.13、14.43、21.75、34.52和53.36ng/ml紫杉醇)和CD133+R9-NPs(分别释放6.85、9.43、13.29、20.05、33.26和51.63ng/ml)共培养1、2、3、6、12、24h。给药后，细胞继续培养10～14d；宏观菌落用吉姆萨染色，显微镜下计数菌落，细胞数超过50个的菌落为阳性。计算细胞接种率和细胞存活率，绘制细胞存活曲线。实验重复3次。
实验结果如图3、图4所示，图3为P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs对肝癌细胞HepG2存活能力的影响；图4为P-NPs、CD133-NPs、R9-NPs和CD133+R9-NPs对肝癌细胞Huh7存活能力的影响；
由图3、图4可知：
在HepG2和Huh7细胞中，P-NPs导致细胞克隆形成能力丧失；通过选择性的细胞和细胞内转运，CD133抗体和/或R9修饰的P-NPs的作用比P-NPs更明显；并且CD133+R9-NPs对肿瘤细胞有最显著的抑制作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (9)

1.一种靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)向紫杉醇PLGA纳米粒悬液中添加EDC溶液和NHS溶液并搅拌一段时间，得到混合液；
(b)向混合液中添加CD133抗体溶液和穿膜肽溶液进行反应；
(c)待反应结束，离心收集沉淀物、洗涤、冷冻干燥，即得所述靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒；
所述穿膜肽为穿膜肽R9。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，紫杉醇PLGA纳米粒悬液浓度为4～6mg/ml；EDC溶液和NHS溶液浓度分别为40～60mg/ml。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，紫杉醇PLGA纳米粒悬液、EDC溶液和NHS溶液的体积比为1000∶(5～20)∶(5～20)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，搅拌时间为15～30min，搅拌温度为室温。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，CD133抗体溶液浓度为0.8～1.2mg/ml，穿膜肽溶液浓度为1.5～2.5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，CD133抗体溶液和穿膜肽溶液的添加量分别为混合液体积的0.8～1.2倍。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)中，反应温度2～6℃，时间为10～14h。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(c)中，离心转速为25000～35000r/min，时间为4～6min。
9.权利要求1～8任一所述的制备方法制得的靶向肝癌干细胞的多功能纳米粒。
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