CN112402632A - 一种放疗增敏用纳米级配位聚合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种放疗增敏用纳米级配位聚合物的制备方法，Hemin、Gd³⁺和5'‑GMP利用超分子自组装技术制备而成。包括以下步骤：将Hemin以及5'‑GMP溶入缓冲液中，混合均匀后，再向其中加入含钆离子的溶液，搅拌后，经离心、洗涤、再离心以及超声分散即得到纳米级配位聚合物Hemin@Gd‑NCPs。本发明原料廉价易得，制备工艺过程简单易操作且可控性好，形成的纳米级放疗增敏药物能够利用能在相对低的放疗剂量下利用高序数离子Gd³⁺有效地沉积、散射以及发射X‑射线，增加局部放疗剂量；改善肿瘤微环境，放大细胞内的氧化应激水平，产生更多的羟基自由基，协同放疗增强对肿瘤的杀伤性，达到放疗增效的效果。

Description

一种放疗增敏用纳米级配位聚合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地涉及一种放疗增敏用纳米级配位聚合物及其制备方法和用途。

背景技术

放疗(RT)一直是临床癌症治疗的主流手段，它利用外源的高能电离辐射(例如X射线)产生自由基来破坏肿瘤细胞的DNA。由于其较低的全身副作用和广谱的疗效，目前临床有超过50％的临床癌症患者的治疗方案中包含放疗。

大量的体外研究证实，放疗可通过诱导免疫原性死亡从而实现免疫调节。具体来说，X射线能除了能够直接引起肿瘤细胞死亡以外还伴随着肿瘤相关抗原(TAAs)的释放。其产生的活性氧(ROS)会有效的破坏细胞核的完整性，提高高迁移率族蛋白(HMGB1)的释放；同时也会进一步增加内质网的ROS水平，导致钙网蛋白(CRT)的转位增加，并且还能够诱导肿瘤细胞自噬，从而增加ATP释放，潜在地能够促进树突状细胞(DCs)的活化并向肿瘤引流淋巴结的迁移，进而激活T细胞并恢复全身性的抗肿瘤免疫反应，增强放射治疗的远端效应。

然而，放疗在临床上的应用受限于高剂量放疗下对肿瘤相邻正常组织的毒副作用。以及单独放疗诱导的抗肿瘤免疫很难引起全身性的抗肿瘤免疫反应，从1964到2014年的临床案例中，仅仅只观察到46例放疗引起的“远端效应”，如此低的远端效应出现率远远不能满足临床肿瘤治疗的需要。即使放疗与免疫检查点抑制剂等免疫治疗手段结合，全身性免疫反应的发生率虽有所提高，但仍有巨大提升地空间。

大量研究文献表明，一方面由于肿瘤组织对X射线的吸收能力较差以及对辐射存在内源性抵抗，导致RT产生的羟基自由基不足。另一方面，由于氧气的供需不均，在实体肿瘤部位存在着大量乏氧区域，并且在肿瘤细胞中，过氧化氢(H₂O₂)、超氧自由基(O₂ ^-)等一系列ROS以高于正常组织浓度生成，导致其代谢失调。癌细胞通常会进一步形成一系列复杂的自适应抗氧化剂，如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和谷胱甘肽(GSH)，以维持细胞内活性氧(ROS)的平衡，使癌细胞存活，最终导致肿瘤细胞处于高氧化还原环境中(高H₂O₂高GSH)。这就使得RT产生的羟基自由基被GSH消耗，进一步削弱了RT产生ROS的能力，最终导致放射治疗的失败。

因此，我们希望通过安全有效的手段在全肿瘤细胞范围内增强放疗(RT)介导的ROS的生成，除了提高DNA损伤之外，还能够在多层次诱导损伤相关的分子模式(DAMPs)释放，增加放疗的氧化应激水平，诱导更加强大的免疫原性死亡，从而增加放射治疗过程中的原位疗效以及远端效应。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，提供了一种原料廉价易得、制备工艺过程简单易操作且可控性好的放疗增敏用纳米级配位聚合物。

本发明采用的技术方案为：一种放疗增敏用纳米级配位聚合物，所述配位聚合物包括含有过氧化物酶活性的氯化血红素(Hemin)、钆离子(Gd³⁺)和5'-鸟苷酸(5'-GMP)。

优选的，所述Hemin、Gd³⁺和5'-GMP按化学物质的量比为(1～5)：(15～30)：(20～45)。

优选的，所述Hemin、Gd³⁺和5'-GMP按化学物质的量比为2：20：30。

优选的，所述纳米级配位聚合物的粒径为50～150nm。

一种放疗增敏用纳米级配位聚合物的制备方法，Hemin、Gd³⁺和5'-GMP利用超分子自组装技术制备而成，其超分子自组装结构式如下：

优选的，所述超分子自组装技术包括以下步骤：将Hemin以及5'-GMP溶入缓冲液中，混合均匀后，再向其中加入含钆离子的溶液，搅拌后，经离心、洗涤、再离心以及超声分散即得到纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs。

优选的，所述步骤的详细制备过程包括：将Hemin以及5'-GMP溶入HEPES缓冲液中，搅拌5～30分钟，混合均匀后，再向其中加入含钆离子的溶液，搅拌10～50分钟后，经8000～12000rpm×10min条件下离心得到纳米级粗产物，再经去离子水洗涤1～5次、每次去离子水用量为1～7mL，去除游离分子单体；再次离心得到纳米级纯净固体；最后将纳米级纯净固体溶入生理盐水中进行超声分散即得到纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs。

放疗增敏用纳米级配位聚合物的用途所述纳米级配位聚合物用于放射治疗恶性肿瘤。

本发明获得的有益效果为：本发明提出了一种全新的纳米级配位聚合物，具体包括含有过氧化物酶样活性的氯化血红素(Hemin)，沉积、散射以及发射X-射线的钆离子(Gd^{3 +})以及生物体中广泛存在的5'-鸟苷酸(5'-GMP)。本配位聚合物可应用于恶性肿瘤的放射治疗。本发明原料廉价易得，制备工艺过程简单易操作且可控性好，形成的纳米级放疗增敏药物能够利用能在相对低的放疗剂量下利用高序数离子Gd³⁺有效地沉积、散射以及发射X-射线，增加局部放疗剂量；同时，它还能通过具有过氧化物酶样活性的氯化血红素(Hemin)利用肿瘤微环境中过表达的过氧化氢(H₂O₂)和谷胱甘肽(GSH)，改善肿瘤微环境，放大细胞内的氧化应激水平，产生更多的羟基自由基(·OH)，协同放疗增强对肿瘤的杀伤性，达到一个放疗增效的效果；同时纳米药物水溶性好，药物状态稳定，有利于肿瘤或者其他疾病的放射治疗。

本发明还在于构建了一种纳米药物的载体平台Gd³⁺/5'-GMP(Gd-NCPs)。高序数离子Gd³⁺能够有效地沉积、散射以及发射X-射线，增加局部放疗剂量；生物体内广泛存在的5'-GMP作为Gd³⁺的配体，具有高度地生物安全性。其具体制备方法为将一定量的钆离子(Gd³⁺)滴入一定量搅拌均匀的Hemin与5'-GMP混合HEPES缓冲液中，震荡混合30分钟，再经离心分离、水洗、超声分散即得到功能化的纳米放疗增敏药物。其中Hemin的摩尔浓度为2mM,Gd³⁺与5'-GMP的摩尔浓度分别为20mM与30mM。

氯化血红素(Hemin)是一种广泛存在于肉食类产品的口服补铁药物，其具有过氧化物酶样活性，能够有效地催化过氧化氢(H₂O₂)和谷胱甘肽(GSH)产生对肿瘤具有杀伤作用的羟基自由基(·OH)，但其水溶性较差，且单独使用催化活性较差。本发明将其溶解在pH＝7.4的HEPES缓冲液中，使得其能够均匀地分散在Gd³⁺/5'-GMP(Gd-NCPs)纳米网络状框架中，避免了自身的π-π堆叠而使活性降低。经均匀分散的Hemin@Gd-NCPs能够利用肿瘤微环境中过表达的过氧化氢(H₂O₂)和谷胱甘肽(GSH)，打破肿瘤细胞内异常调节的氧化还原平衡，放大细胞内的氧化应激水平，产生更多的羟基自由基(·OH)，协同放疗增强对肿瘤的杀伤性。

附图说明

图1为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs(所有的图中缩写为H@Gd-NCPs)的高分辨率场发射扫描电镜照片；

图2A为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs的粒径分布图；

图2B为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs的Zeta电位图；

图3A为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs的紫外可见吸收光谱；

图3B为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs的红外光谱；

图3C为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs的荧光光谱；

图3D为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs的X-ray电子能谱；

图4为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs在经不同剂量的X-ray照射后，通过沉积X-ray产生羟基自由基与放疗剂量的关系曲线；

图5为本发明纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs在体外催化H₂O₂消除GSH的活性与时间以及Hemin浓度的关系曲线；

图6A为本发明小鼠结直肠癌细胞(CT26)经过未放射治疗后毒性的统计数据图；

图6B为本发明小鼠结直肠癌细胞(CT26)经过放射治疗后毒性的统计数据图；

图7经过不同的治疗方式后小鼠的肿瘤体积与时间的关系曲线；

图8经过不同的治疗方式后小鼠心肝脾肺肾以及肿瘤部位的H&E染色组织切片图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

一种放疗增敏用纳米级配位聚合物，所述配位聚合物包括含有过氧化物酶活性的氯化血红素(Hemin)、钆离子(Gd³⁺)和5'-鸟苷酸(5'-GMP)。Hemin、Gd³⁺和5'-GMP按化学物质的量比为(1～5)：(15～30)：(20～45)。

一种放疗增敏用纳米级配位聚合物的制备方法，Hemin、Gd³⁺和5'-GMP利用超分子自组装技术制备而成，其超分子自组装结构式如下：

步骤的详细制备过程包括：将Hemin以及5'-GMP溶入HEPES缓冲液中，搅拌5～30分钟，混合均匀后，再向其中加入含钆离子的溶液，搅拌10～50分钟后，经8000～12000rpm×10min条件下离心得到纳米级粗产物，再经去离子水洗涤1～5次、每次去离子水用量为1～7mL，去除游离分子单体；再次离心得到纳米级纯净固体；最后将纳米级纯净固体溶入生理盐水中进行超声分散即得到粒径为50～150nm。纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs。

实施例1纳米级放射增敏药物的制备与表征

先配制好GdCl₃·6H₂O(10.0mM，pH＝7.4)溶液100mL，5'-GMP(10.0mM，pH＝7.4)溶液100mL以及Hemin(1.0mM，pH＝7.4)HEPES缓冲液100mL备用。取20mL 5'-GMP(10.0mM，pH＝7.4)于100mL烧杯中，加入20mL Hemin(1.0mM，pH＝7.4)HEPES缓冲液，磁力搅拌10分钟以后，向该体系中加入30mL GdCl₃·6H₂O(10.0mM，pH＝7.4)，继续磁力搅拌30分钟形成黑褐色纳米颗粒聚集物。经离心(12000rpm×10min)分离得到纳米级粗产物，再经去离子水洗涤(10mL×3次)去除游离分子单体，经离心(12000rpm×10min)分离得到纳米级纯净固体产物，最后加入10mL的生理盐水超声重悬，得到纳米级放疗增敏药物Hemin@Gd-NCPs，其浓度为2mM Hemin@20mM Gd-NCPs，以Hemin与Gd³⁺定量。

将制备好的Hemin@Gd-NCPs纳米粒稀释100倍后，滴加于镀碳支持膜(铜网)上，自然晾干后用高分辨率场发射扫描电镜(FE-SEM)观察其形态。溶液的粒径由动态光散射(DLS，Brookhaven 90plus Zeta)粒径仪测定。结果如图1所示，Hemin@Gd-NCPs呈不规则圆形颗粒，形状规则轮廓清晰，粒径大小在110nm左右。如图2A-B所示，用动态光散射粒径测定仪测定的平均粒径结果为112.5nm，Zeta电位为-5.81mV，其结果与高分辨率场发射扫描电镜拍摄结果相符。

实施例2纳米级放射增敏药物的光学研究及元素表征

Hemin@Gd-NCPs的紫外可见吸收光谱由岛津UV-VIS-2450分光光度计来测定；荧光图谱是通过Varioskan LUX全波长多功能酶标仪测定，制备相同浓度的Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs溶液后，用Varioskan LUX全波长多功能酶标仪扫描溶液，记录荧光值。红外光谱由FTIR-650傅里叶变换红外光谱仪，使用冻干的Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs纳米颗粒测定。元素表征由K-Alpha X射线光电子能谱仪测定，使用冻干的Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs纳米颗粒测定。

如图3A-D所示，空白的Gd-NCPs载体没有特征的吸收峰，而游离的Hemin与Hemin@Gd-NCPs有着相似的紫外-可见吸收光谱，在390nm处有最大吸收特征峰，说明Hemin被成功装载在纳米配位聚合物中(图3A)。傅里叶变换红外光谱(FT-IR)进一步确认了Hemin在纳米颗粒中的配位关系，Hemin@Gd-NCPs具有GdCl3·6H₂O，5'-GMP和Hemin的特征吸收峰。在1000，1051以及3266cm^-1处观察到属于5′-GMP的N-H面内振动和N-H拉伸振动的特征吸收峰。这些吸收峰在Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs形成后仍然存在，说明Gd³⁺无法取代氢质子。在1691cm^-1的C＝O伸缩振动表明配位键的形成，1620和2922cm^-1处的C＝C伸缩振动和碳氢键反对称伸缩振动表明了Hemin大共轭基团的存在(图3B)。随后我们检测了Hemin@Gd-NCPs在不同梯度浓度下的荧光光谱，结果表示Hemin@Gd-NCPs在330nm激发波长下，在660nm出现较强的荧光(图3C)。X射线光电子能谱(XPS)也证实了金属元素钆的存在，其特征结合能为148.00eV(Gd4d_3/2)，与Gd³⁺的标准XPS一致。此外，Hemin@Gd-NCPs中其他非金属元素如C，N，O，Cl也进一步得到确证(图3D)。

实施例3纳米级配位聚合物体外沉积X-ray产生羟基自由基能力的研究

为了检测不同辐射剂量下羟基自由基(·OH)的产生，使用基于亚甲基蓝(MB)在生理环境下衰变的经典比色法测定。具体步骤为，将含有15μg/mLMB的H₂O溶液，GdCl₃溶液，Gd-NCP溶液以及Hemin@Gd-NCP溶液(除H₂O组外，其他组Gd³⁺浓度均为20μM)，分别照射0、5Gy，10Gy，20Gy剂量，30min后在664nm处测量MB紫外吸收，检测MB的降解速率，MB降解得越多就说明产生的羟基自由基越多。

羟基自由基(·OH)是电离辐射产生主要细胞毒性的自由基种类，可以通过亚甲基蓝(MB)降解法检测。我们比较了在各种辐射剂量下H₂O，GdCl₃，Gd-NCP和Hemin@Gd-NCP的羟基自由基生成速率(图4)，验证Gd³⁺在各剂量下均能沉积X-ray的能力。辐射分解产生的·OH本身会导致亚甲基蓝的缓慢衰变。掺入高原子序数(High-Z)元素(GdCl₃，Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs)可以加速MB衰变过程，表明游离态的Gd或纳米颗粒都可以增强X射线的吸收和能量沉积促进·OH的生成。

实施例4纳米级配位聚合物体外催化H₂O₂消除GSH的能力研究

Hemin和Hemin@Gd-NCPs体外催化H₂O₂消除GSH的能力评估GSH消耗。具体实验方案为：取400μL 0.5、1.0以及2.0μM Hemin或Hemin@Gd-NCPs于24孔板中，再向其中加入4mMGSH(400μL)和400mM H₂O₂(20μL)的水溶液混合并震荡1小时以及24小时。然后，通过GSH和GSSG测定试剂盒(S0053，Beyotime，China)测定GSH的浓度。

通过GSH/GSSG分析试剂盒进一步研究了游离Hemin和Hemin@Gd-NCPs体外催化H₂O₂消除GSH的实验。Hemin可以利用GSH作为电子供体，模拟过氧化物酶分解H₂O₂，然后将其定量氧化为GSSG(图5)，验证避免π-π堆叠的Hemin催化H₂O₂消除GSH的活性更高。Hemin@Gd-NCPs通过避免其自身的π-π堆叠猝灭而明显增强了Hemin的过氧化物酶样活性。这些结果表明Hemin@Gd-NCPs在放射治疗中的双重敏化机制，预示它们在抑制肿瘤细胞增殖方面具有出色的治疗作用。

实施例5纳米级配位聚合物对CT 26结直肠癌细胞的体外药效

Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs对肿瘤细胞的毒性作用使用CCK-8试剂盒进行测定。96孔板上接种2×10⁵个CT26结直肠癌细胞，37℃培养24h后，用PBS将Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs按Gd³⁺浓度稀释为200,100,50,25,12.5μM 5个梯度，并设PBS为对照组，分别取100μL加入对应的孔中。放射剂量为X-ray 8Gy，吸去培养基，加入CCK-8试剂。孵育两小时后，用酶标仪对96孔板进行检测。波长设定为450nm读取OD值，计算细胞存活率；暗毒性实验中不加X-ray辐照步骤，其余操作步骤与放射毒性实验相同。

图6A所示，在没有X-ray辐照时，各个浓度的Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs的细胞存活率都在100％左右，证明了Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs是没有毒性的，其生物安全性很高。在图6B中，当X-ray辐照后，Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs的放疗敏化作用就显现出来，并且双重增敏放疗的Hemin@Gd-NCPs其细胞毒性明显强于单重增敏的Gd-NCPs，但它们抑制肿瘤的效果均强于单独放疗；当浓度进一步增大时，Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs呈现出明显的浓度依赖型细胞毒性，说明Gd-NCPs和Hemin@Gd-NCPs可以有效的增敏放疗杀伤肿瘤细胞，并且双重增敏的纳米药物Hemin@Gd-NCPs具有更加优异的肿瘤杀伤能力。

实施例6纳米级配位聚合物对CT26荷瘤小鼠的治疗

取CT26肿瘤细胞，离心，无菌生理盐水重悬后，制备成含有5×10⁶个细胞的悬液。在Balb/c小鼠右侧腋下处接种50μL，正常喂养。等待小鼠的肿瘤长至80mm³-100 mm³左右后，将荷瘤小鼠随机按照Saline、Gd-NCPs、Hemin@Gd-NCPs、Saline+RT、Gd-NCPs+RT、Hemin@Gd-NCPs+RT分为6个组，(给药剂量为([Gd³⁺]＝30mg/kg,[Hemin]＝12.5mg/kg)，每组小鼠8只。向小鼠尾静脉内注射药物后6h后，给予5Gy的辐照剂量。每天测量小鼠的肿瘤体积和体重，未放疗实验组监测2周，放疗实验组监测3周。参照上述分组，收集完数据后，处死小鼠。取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织，4％甲醛固定并石蜡包埋切片。进行H&E染色后，用显微镜进行观察肿瘤组织的结构变化。

在CT26荷瘤小鼠模型上给予药物治疗之后，记录小鼠的肿瘤体积变化，如图7所示，未放疗实验组在监测的14天里，肿瘤迅速生长，各组之间并没有显著差异，说明Gd-NCPs、Hemin@Gd-NCPs在未放疗时对肿瘤无抑制作用。而经Gd-NCPs+RT、Hemin@Gd-NCPs+RT治疗过后相对于单独放疗，小鼠肿瘤体积的增长受到非常显著的抑制，尤其是Hemin@Gd-NCPs+RT，历经21天的治疗周期结束后肿瘤体积基本没有生长，说明Hemin@Gd-NCPs纳米药物可以有效地增敏放疗，显著地抑制肿瘤细胞的生长。

随后，对治疗后的小鼠的心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织进行H&E染色切片分析，从小鼠的心、肝、脾、肺、肾H&E切片结果中可以看到(图8)，Gd-NCPs、Hemin@Gd-NCPs生物安全性较高，基本上没有毒性。肿瘤组织H&E切片结果相比较其他各组，Hemin@Gd-NCPs+RT组的肿瘤组织切片组织间隙变大，核缩小，有明显的病变现象，说明Hemin@Gd-NCPs纳米药物能够有效地抑制肿瘤细胞的生长。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种放疗增敏用纳米级配位聚合物，其特征在于：所述配位聚合物包括含有过氧化物酶活性的氯化血红素(Hemin)、钆离子(Gd³⁺)和5'-鸟苷酸(5'-GMP)。

2.根据权利要求1所述一种放疗增敏用纳米级配位聚合物，其特征在于：所述Hemin、Gd^{3 +}和5'-GMP按化学物质的量比为(1～5)：(15～30)：(20～45)。

3.根据权利要求2所述一种放疗增敏用纳米级配位聚合物，其特征在于：所述Hemin、Gd^{3 +}和5'-GMP按化学物质的量比为2：20：30。

4.根据权利要求1-3任意一项所述一种放疗增敏用纳米级配位聚合物，其特征在于：所述纳米级配位聚合物的粒径为50～150nm。

5.一种放疗增敏用纳米级配位聚合物的制备方法，其特征在于：Hemin、Gd³⁺和5'-GMP利用超分子自组装技术制备而成，其超分子自组装结构式如下：

6.根据权利要求5所述一种放疗增敏用纳米级配位聚合物的制备方法，其特征在于：所述超分子自组装技术包括以下步骤：将Hemin以及5'-GMP溶入缓冲液中，混合均匀后，再向其中加入含钆离子的溶液，搅拌后，经离心、洗涤、再离心以及超声分散即得到纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs。

7.根据权利要求6所述一种放疗增敏用纳米级配位聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤的详细制备过程包括：将Hemin以及5'-GMP溶入HEPES缓冲液中，搅拌5～30分钟，混合均匀后，再向其中加入含钆离子的溶液，搅拌10～50分钟后，经8000～12000rpm×10min条件下离心得到纳米级粗产物，再经去离子水洗涤1～5次、每次去离子水用量为1～7mL，去除游离分子单体；再次离心得到纳米级纯净固体；最后将纳米级纯净固体溶入生理盐水中进行超声分散即得到纳米级配位聚合物Hemin@Gd-NCPs。

8.放疗增敏用纳米级配位聚合物的用途，其特征在于：所述纳米级配位聚合物用于放射治疗恶性肿瘤。

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