CN110368374B

CN110368374B - 一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110368374B
Application number: CN201910780919.XA
Authority: CN
Inventors: 陈华兵; 邓益斌; 杨红; 柯亨特; 刘玲; 李厅; 杨涛; 王璐
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2019-08-22
Filing date: 2019-08-22
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2039-08-22
Also published as: CN110368374A

Abstract

本发明公开了一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法与应用。本发明首次采用两步制备方法，成功制备了铂类药物矿化蛋白纳米粒，制得的纳米粒在水溶液中分散均匀；纳米粒具有良好的肿瘤细胞毒作用，对人非小细胞肺癌细胞A549的IC₅₀为6.9μg/ml。本发明提供的铂类药物矿化蛋白纳米粒包括铂类药物与蛋白质，其显著的优势在于制备工艺简便、尺寸均一、粒径可控、生物相容性良好、水溶性好、血液中循环时间长、肿瘤靶向性高等特点，为高效的肿瘤治疗及耐药肿瘤治疗奠定了基础。

Description

一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药技术，具体涉及一种铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用。

背景技术

铂类药物是临床上常用的抗肿瘤化疗药物，具有广谱的抗肿瘤效果。铂类药物也存在很多不足，如疗效差、毒副作用大、靶向性差、易产生肿瘤耐药性等问题。纳米药物载体(如聚合物胶束、囊泡等) 可对此改善，然而，临床常用的铂类抗肿瘤药物（如顺铂及其衍生物）因水溶性、油溶性均较差，难以通过传统纳米载体包载，多采用化学偶联或前药修饰等方式实现其在载体中的负载，但这些纳米药物载体常存在难以有效包载、制备工艺复杂、使用非药用辅料等缺点，导致其临床应用受到明显限制（Chem Rev, 2016, 116, 3436-3486）。铂类药物的长期使用往往造成耐药性，其主要耐药机制包括多药耐药相关蛋白（MRP1）等介导药物外排、DNA自我修复、药物失活等。因此，如何解决铂类小分子化疗药物毒副作用大、靶向性差、耐药性强等问题，是提高铂类药物临床疗效的关键。

现有技术制备无机纳米晶蛋白质纳米粒的方法依赖于蛋白质分子中氨基酸残基与金属离子相互作用和无机沉淀的生成，难以直接用于铂类药物如顺铂的包载，缺乏肿瘤靶向性及逆转耐药的效应。另外，铂类药物都为非离子贵金属配合物，无法在蛋白质中反应合成纳米粒，难以被载体包载，所以都以配合物的形式应用。因此，在本领域，亟需开发一种具有临床应用前景、肿瘤靶向性的新型铂类药物蛋白纳米粒，以实现铂类药物的肿瘤靶向递送，并克服铂类药物易产生耐药性的问题，提高铂类药物的抗肿瘤效果。

发明内容

针对现有技术，本发明的目的在于提供一种铂类药物矿化蛋白纳米粒及其制备方法和应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒，所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒包括铂类药物与蛋白质。

本发明中，所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒由铂类药物与蛋白质组成；得到的抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的载药量为1%~50%，载药量是指纯化后样品中，铂类药物质量/（铂类药物质量+蛋白质质量）；本发明所述矿化是蛋白质参与的铂类药物的形成反应，纳米粒具有良好的细胞毒作用，人非小细胞肺癌细胞A549的IC₅₀为6.9 μg/mL。

本发明采用蛋白质作为分子反应器，首先制备铂类药物前体化合物，再与蛋白质混合进入内部空腔；进一步通过与铂类药物离去基团的配体交换反应，使铂类药物在蛋白质内腔中可控生长得到其矿化物，实现铂类药物在蛋白质中的矿化反应，从而制得铂类药物矿化蛋白纳米粒。本发明与传统纳米载体包载药物不同，并有效解决了现有技术认为铂类药物通常为非离子贵金属配合物，无法实现其在蛋白质水空腔中反应合成纳米粒的难题。本发明提供的铂类药物矿化蛋白纳米粒具有体内长循环和肿瘤靶向性特点，促进了铂类药物在肿瘤组织蓄积并进入肿瘤细胞，可逆转肿瘤耐药性。

本发明提供了上述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法，包括以下步骤：

（1）铂类药物与银盐在水中反应后除去沉淀，得到铂类药物前体化合物水溶液；然后将铂类药物前体化合物水溶液与蛋白质水溶液混合得到铂类药物前体化合物与蛋白质复合的混合液；

（2）调节所述铂类药物前体化合物与蛋白质复合的混合液的pH值至4~12后，加入配体水溶液，接着反应后纯化，得到铂类药物矿化蛋白纳米粒。

本发明的抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒可制成注射剂，并进一步制成各类半固体制剂、固体制剂等。

一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉，所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉的制备方法包括以下步骤：

（2）调节所述铂类药物前体化合物与蛋白质复合的混合液的pH值至4~12后，加入配体水溶液，接着反应后纯化，然后冻干得到铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉。

本发明中，步骤（1）中，采用离心分离除去沉淀，铂类药物与银盐反应为50~60 ℃下避光反应3小时后降温至室温，继续反应10~12小时；步骤（2）中，反应的温度为25~60 ℃，时间为0.5~24小时，优选为2~8小时，纯化为在超滤管中离心处理。优选的，离心分离为以8000~15000 rpm转速离心8~15分钟；离心处理的转速为1500~3000 rpm。

本发明中，铂类药物与银盐的摩尔比为（1~5）:1；铂类药物前体化合物与蛋白质的摩尔比为（20~200）:1；铂类药物前体化合物与配体的摩尔比为1:（1~16）；所述蛋白质水溶液的浓度为5~25mg/mL。优选的，铂类药物与银盐的摩尔比为（2~4）:1；铂类药物前体化合物与蛋白质的摩尔比为（50~150）:1，进一步优选（80~120）:1；铂类药物前体化合物与配体的摩尔比为1:（2~8）；所述蛋白质水溶液的浓度为10~20mg/mL。可以控制矿化物生长速度进而控制纳米粒尺寸。铂类药物前体化合物溶液的浓度为0.04~1.0 mol/L，优选0.08~0.6 mol/L。

本发明中，所述配体包括氯离子、溴离子、碘离子、1,1-环丁烷二羧酸根、乙醇酸根、草酸根、碳酸根或者碳酸氢根；银盐包括硝酸银、硫酸银。

本发明中，冻干时保护剂包括甘露醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖等的一种或几种。

本发明中，所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、低密度脂蛋白中的一种或几种；所述铂类药物包括顺铂、碘铂、溴铂、奥沙利铂、卡铂或者奈达铂。

本发明公开了上述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒或者抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉在制备肿瘤治疗药物中的应用。

本发明中，作为溶剂的水优选去离子水。

本发明中，可以采用化合物形式引入配体，比如加入碘化钾引入碘离子。

本发明中，用NaOH水溶液或HCl溶液调节混合液的pH值，优选NaOH水溶液或HCl溶液的浓度为0.2 M。

本发明的铂类药物矿化蛋白纳米粒可制成注射剂，用于静脉注射，还可进一步冷冻干燥制成冻干粉针。

本发明铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法可以举例表示为：

（1）铂类药物前体化合物与蛋白质复合的混合液的合成：铂类药物与硝酸银按一定比例混合后在水中于50~60 ℃下避光反应，反应2~5小时后降温至室温，继续反应6~12小时，然后将样品离心，除去氯化银沉淀，所得上清液即为铂类药物前体化合物溶液，取制得的铂类药物前体化合物溶液与白蛋白溶液充分混合得到混合液；

（2）铂类药物矿化蛋白纳米粒的合成：用0.2 M NaOH溶液或HCl溶液调节混合液的pH至4~12之间，然后加入配体溶液；在设定温度的水浴锅中加热，反应一定时间后，将反应液加入超滤管，离心处理除去游离铂类药物前体化合物等，即得铂类药物矿化蛋白纳米粒。

本发明提供了上述铂类药物矿化蛋白纳米粒在制备肿瘤治疗药物，尤其是耐药肿瘤治疗药物中的应用。

本发明首次采用两步制备方法，成功制备了铂类药物矿化蛋白纳米粒，制得的纳米粒在水溶液中分散均匀；纳米粒具有良好的肿瘤细胞毒作用，对人非小细胞肺癌细胞A549的IC₅₀为6.9 μg/ml。本发明将难溶性的铂类药物稳定的进入白蛋白水空腔作为前体配合物，再引入铂类药物离去基团发生配体交换反应，诱导铂类药物矿化物在蛋白质内腔中形成，从而制得纳米粒，解决了铂类药物溶解性差，难以有效包覆的问题；通过限定合成条件如投料比、反应时间等调控其粒径、释药行为等理化特性，获得具有可控释药特性和靶向性的铂类药物矿化蛋白纳米粒。与其他载铂类药物纳米粒相比，本发明提供的铂类药物矿化蛋白纳米粒，其显著的优势在于制备工艺简便、尺寸均一、粒径可控、生物相容性良好、水溶性好、血液中循环时间长、肿瘤靶向性高等特点，为高效的肿瘤治疗及耐药肿瘤治疗奠定了基础。

附图说明

图1为实施例一中碘铂蛋白纳米粒的电镜图；

图2为实施例二中碘铂蛋白纳米粒的电镜图；

图3为实施例三中碘铂蛋白纳米粒的电镜图；

图4为实施例九中顺铂蛋白纳米粒的电镜图；

图5为实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒的原子力显微镜图片；

图6为实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒的X-射线衍射图谱；

图7为实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒的圆二色谱图谱；

图8为本发明中实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒和游离顺铂细胞毒性对A549细胞株和A549/DDP顺铂耐药细胞株的细胞存活率图；

图9为本发明中实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒和游离顺铂细胞毒性对HepG-2细胞株的细胞存活率图；

图10为本发明中实施例九制备的顺铂蛋白纳米粒和游离顺铂细胞毒性对A549细胞株的细胞存活率图；

图11为本发明中实施例十五制备的碘铂转铁蛋白纳米粒和游离顺铂细胞毒性对A549细胞株的细胞存活率图；

图12 为本发明中实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒在荷瘤裸鼠体内的组织分布结果；

图13为碘铂蛋白纳米粒和顺铂的药物动力学结果，其中A为碘铂纳米粒的药物动力学曲线，B为游离顺铂的药物动力学曲线，C为药物动力学参数；

图14为本发明中实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒对肺肿瘤模型荷瘤裸鼠在25天内的抑瘤曲线图；

图15为本发明中实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒对肝肿瘤模型荷瘤裸鼠在25天内的抑瘤曲线图；

图16为本发明中实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒对乳腺癌模型荷瘤小鼠的抑瘤效果和体重变化；

图17为碘铂蛋白纳米粒对裸鼠体内肺原位肿瘤的抑瘤效果，其中A为生理盐水、游离顺铂、碘铂纳米粒在不同时间时的荧光成像图，B为肿瘤组织的荧光强度变化；

图18为碘铂蛋白纳米粒和顺铂治疗后血清中谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），碱性磷酸酶（ALP）以及尿素氮（Urea）含量，其中A和B分别为碘铂纳米粒和游离顺铂的实验结果；

图19为实施例一的碘铂蛋白纳米粒的水溶液照片，其中数字表示碘铂的浓度。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

现有技术蛋白质结合铂类药物比如顺铂或顺铂衍生物的数量非常有限，难以显著提高顺铂的水溶性和肿瘤靶向效果及疗效；本发明中，白蛋白、转铁蛋白等蛋白质是一类生物相容性良好的载体材料，将难溶性的铂类药物稳定的进入白蛋白水空腔作为前体配合物，再引入铂类药物离去基团发生配体交换反应，诱导铂类药物矿化物在蛋白质内腔中形成，解决了铂类药物溶解性差，难以有效包覆的问题。本发明铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法如下：

（1）铂类药物与银盐在水中反应后除去沉淀，得到铂类药物前体化合物水溶液；然后将铂类药物前体化合物水溶液与蛋白质水溶液混合得到混合液；

（2）调节上述混合液的pH值至4~12后，加入配体水溶液，反应后纯化，得到铂类药物矿化蛋白纳米粒。

实施例一

铂类药物矿化蛋白纳米粒制备，其具体步骤如下：

铂类药物前体化合物的合成：顺铂与硝酸银按1:2的摩尔比在水中混合后，在60℃下避光反应3小时，然后降温至室温，继续反应10小时，然后以12000 rpm转速将样品离心12分钟，除去氯化银沉淀，所得上清液即为铂类药物前体化合物水溶液。

取100 mM铂类药物前体化合物水溶液与13.3 mg/mL人血清白蛋白（HSA）水溶液按照体积比1:5充分混合，铂类药物前体化合物与人血清白蛋白的摩尔比为100:1，用0.2 MNaOH溶液调节混合的溶液pH至6.4，然后加入碘化钾（KI）水溶液引入配体离子碘离子得到混合液；铂类药物前体化合物（二水二氨合铂离子）与配体离子摩尔比为1:8；将混合液在55℃加热反应4小时，然后将所得混合液加入超滤管中，2000 rpm离心除去碘离子、钾离子等杂质，制得碘铂蛋白纳米粒，为铂类药物矿化蛋白纳米粒。

将上述碘铂蛋白纳米粒采用甘露醇作为保护剂冻干，得到碘铂蛋白纳米粒冻干粉，冻干的条件为：将样品置于-80 ℃预冻10小时，并迅速转移至冷阱温度降至-20 ℃的冻干机，真空度10 Pa，干燥12小时，然后逐步升温至30 ℃，继续干燥2小时。

对制备的碘铂蛋白纳米粒进行电镜拍摄，结果如图1所示，制得的纳米粒分散均匀、粒径均一，平均粒径（药物粒径）为7.0±0.8 nm，载药量为25%。

实施例二

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：铂类药物前体化合物与配体离子摩尔比为1:4，对制备的纳米粒进行电镜拍摄，结果如图2所示，制得的纳米粒平均粒径为4.1±0.3 nm。

实施例三

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：铂类药物前体化合物与配体离子摩尔比为1:2，对制备的纳米粒进行电镜拍摄，结果如图3所示，制得的纳米粒平均粒径为2.3±0.2 nm。

实施例四

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将混合液置于37 ℃加热反应4小时，制得的纳米粒平均粒径为1.8±0.4 nm。

实施例五

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将混合液在55 ℃加热反应30分钟，制得的纳米粒平均粒径为2.1±0.3 nm。

实施例六

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：将反应液在55 ℃加热反应2小时，对制备的纳米粒进行电镜拍摄，制得的纳米粒平均粒径为4.3±0.6 nm。

实施例七

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：人血清白蛋白（HSA）溶液的浓度为20mg/mL，对制备得到的纳米粒进行电镜拍摄，制得的纳米粒平均粒径为4.8±0.5 nm，载药量为19%。

实施例八

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：铂类药物前体化合物溶液的浓度为200 mM，对制备的纳米粒进行电镜拍摄，制得的纳米粒平均粒径为6.3±0.2 nm，载药量为48%。

实施例九

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：加入氯化钾（KCl）水溶液引入配体离子氯离子，制得顺铂蛋白纳米粒，对制备的纳米粒进行电镜拍摄，结果如图4所示（下方两个小图为高分辨电镜图），制得的纳米粒平均粒径为3.7±0.1 nm。

实施例十

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：加入溴化钾（KBr）引入配体离子溴离子，制得溴铂蛋白纳米粒，其平均粒径为4.7±0.2 nm。

实施例十一

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：加入1,1环丁烷二羧酸钠引入配体离子1,1环丁烷二羧酸根离子，制得卡铂蛋白纳米粒，其平均粒径为2.4±0.2 nm。

实施例十二

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：加入乙醇酸钠引入配体离子乙醇酸根离子，制得奈达铂蛋白纳米粒，其平均粒径为2.3±0.4 nm。

实施例十三

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：加入碳酸氢纳引入配体离子碳酸根离子，制得碳酸铂蛋白纳米粒，其平均粒径为6.5±0.5 nm。

实施例十四

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以牛血清白蛋白（BSA）溶液为蛋白溶液，制得BSA包载的碘铂蛋白纳米粒，其平均粒径为6.1±1.2 nm。

实施例十五

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以人转铁蛋白（Trf）溶液为蛋白溶液，制得碘铂转铁蛋白纳米粒，其平均粒径为5.5±0.9 nm。

实施例十六

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以奥沙利铂替换顺铂，制得碘铂蛋白纳米粒，其平均粒径为6.8±0.8 nm。

实施例十七

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以卡铂替换顺铂，制得碘铂蛋白纳米粒，其平均粒径为7.2±0.8 nm。

实施例十八

本实施例步骤与实施例一相同，其区别在于：以硫酸银替换硝酸银，制得碘铂蛋白纳米粒，其平均粒径为7.0±1.0 nm。

对比例

步骤与实施例一相同，其区别在于：铂类药物前体化合物与配体离子摩尔比为1:0.3，其余工艺不变，难以制得纳米粒。

步骤与实施例一相同，其区别在于：人血清白蛋白（HSA）溶液的浓度为2.0 mg/mL（铂类药物前体化合物与人血清白蛋白的摩尔比为100:1）；溶液产生黄色沉淀，难以制得纳米粒。

步骤与实施例一相同，其区别在于：人血清白蛋白（HSA）溶液的浓度不变，铂类药物前体化合物与人血清白蛋白的摩尔比为500:1；溶液产生黄色沉淀，难以制得纳米粒。

步骤与实施例一相同，其区别在于：分别取铂类药物（如顺铂、奥沙利铂、卡铂或者奈达铂）饱和水溶液与13.3 mg/mL人血清白蛋白（HSA）水溶液充分混合（铂类药物与人血清白蛋白的摩尔比为100:1），用0.2 M NaOH溶液调节混合的溶液pH至6.4，然后在55 ℃加热反应4小时，然后将所得混合液加入超滤管中，2000 rpm离心处理后都无法制得纳米粒。

对实施例制备的铂类药物矿化蛋白纳米粒进行性能测试，方法如下：

1、对实施例一中制备的碘铂蛋白纳米粒物理结构测试：具体步骤为：对制备的碘铂蛋白纳米粒进行原子力显微镜（AFM）拍摄、X射线衍射（XRD）、及圆二柱色谱（CD）分析。AFM图谱（图5）表明制得的蛋白纳米粒分散均匀、形态大小均一；XRD结果（图6）表明碘铂蛋白纳米粒中碘铂纳米晶与游离碘铂晶型一致，证明了碘铂纳米晶在蛋白质空腔中生长；CD结果（图7）显示，包载碘铂纳米晶的白蛋白，与对照组空白HSA曲线无明显差异，证明纳米粒制备过程中并未破坏白蛋白二级结构。

2、对实施例一中制备的碘铂蛋白纳米粒细胞毒性的测试：具体步骤为：取对数生长期的A549和及其顺铂耐药株A549/DDP细胞铺96孔板，接种密度为6×10³/mL，每孔100 μL，放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗1-2次，加入用培养基配好的碘铂蛋白纳米粒溶液，每孔100微升，纳米粒浓度梯度为1、5、10、15、20、25 μg/mL，每个浓度4个复孔，同时配制相同浓度的顺铂溶液作为对照组；放入培养箱培养24小时后，更换培养液，加10 µL浓度为5 mg/mL 的MTT的PBS溶液，4小时后弃去培养液，加入200 µL的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490 nm处测定吸光度值。结果（图8）表明，该纳米粒对A549细胞株和A549/DDP耐药株的IC₅₀值分别为6.9 μg/ml和6.8 μg/ml，而游离顺铂对耐药株细胞的细胞毒性较小，说明发明所述的蛋白纳米粒能有效克服A549/DDP的耐药。

3、对实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒对顺铂天然非敏感细胞株HepG-2的细胞毒性考察：取对数生长期的HepG2细胞接种于96孔板，接种密度为1×10⁵个/mL，每孔100 μL，其余步骤同上，结果见图9，可见该纳米粒对HepG-2细胞株IC₅₀为4.5 μg/ml，而游离顺铂IC₅₀为12.6 μg/ml，说明本发明的蛋白纳米粒对顺铂天然非敏感细胞株HepG-2同样具有很强的细胞毒作用。将实施例一的碘铂蛋白纳米粒冻干粉加水复溶后进行同样的测试，对HepG-2细胞株IC₅₀为4.6 μg/mL。

4、对实施例九中制备的顺铂蛋白纳米粒细胞毒性的测试：具体步骤为：取对数生长期的A549接种密度为6×10³个/mL，每孔100 μL，放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗1-2次，加入用培养基配好的顺铂蛋白纳米粒溶液，每孔100 μL，纳米粒浓度梯度为2、5、10、15、20、30 μg/ml，每个浓度4个复孔，同时配制相同浓度的顺铂溶液作为对照组；放入培养箱培养24小时后，更换培养液，加10 µL浓度为5 mg/mL的MTT的PBS溶液，4小时后弃去培养液，加入200 µL的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490 nm处测定吸光度值；图10结果表明，纳米粒组IC₅₀为顺铂组IC₅₀的一半左右。

5、对实施例十五中制备的碘铂转铁蛋白纳米粒细胞毒性的测试：具体步骤为：取对数生长期的A549接种密度为6×10³个/mL，每孔100 μL，放入细胞培养箱恒温培养12小时，确定细胞贴壁后，倒掉培养液，用磷酸盐缓冲液洗1-2次，加入用培养基配好的碘铂转铁蛋白纳米粒溶液，每孔100 μL，纳米粒浓度梯度为2、5、10、15、20、30 μg/mL，每个浓度4个复孔，同时配制相同浓度的顺铂溶液作为对照组；放入培养箱培养24小时后，更换培养液，加10 µL浓度为5 mg/mL 的MTT的PBS溶液，4小时后弃去培养液，加入200 µL的DMSO，振荡10分钟，酶标仪490 nm处测定吸光度值。图11结果表明，纳米粒组IC₅₀为顺铂组IC₅₀的三分之一左右。

将铂类药物矿化蛋白纳米粒加入生理盐水中，配置成肿瘤治疗药物，用于以下分析。

6、对实施例一中制备所得的纳米进行小鼠体内组织分布实验：具体实验步骤如下所述：

（1）肿瘤模型的建立：培养A549和A549/DDP肿瘤细胞，将其消化制备成1×10⁷个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在裸鼠腋下种瘤，每只小鼠皮下注射150 μL，每天观察肿瘤体积大小。肿瘤体积公式：肿瘤体积 = (长×宽²) /2；

（2）尾静脉注射上述实施例一中所得纳米粒至两组荷瘤裸鼠体内 (铂给药剂量为1 mg/kg)，注射24 h后分别取出三组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾和肿瘤，并用王水对组织进行高温消解，待组织消解完全之后定容至10.0 mL，用0.22微米微孔滤膜过滤之后用ICP-OES对各组织中的铂元素进行定量。通过上述测量方法得到裸鼠各组织中铂含量的分布结果（图12），由图可知本发明所述纳米粒对A549肿瘤模型和A549/DDP肿瘤模型均具有较好的肿瘤靶向性。

7、药动学测试：

对实施例一所述碘铂蛋白纳米粒进行小鼠血药浓度的考察：取适当数量小白鼠，分成七组，每组作为0、2、4、6、8、12、24、48小时各时间点血药样本，每组平行三只。每只小鼠的铂给药剂量为1 mg/kg，在给药时间到达上述时间点时，对小鼠进行摘眼球取血，血液样本分别溶解在王水及高氯酸溶液中高温灼烧，残存物溶解于5 mL水中经过0.22微米微孔滤膜处理，用ICP-OES对各组织中的铂元素进行定量，得到图13曲线，表明纳米粒具有非常好的长体循环效果。

8、对实施例一所述碘铂蛋白纳米粒进行裸鼠体内肺癌抑瘤效果的考察：如上建立的肿瘤模型的方法构建裸鼠荷瘤模型，待肿瘤体积至50-80 mm³时，按照以下设计给药：实施例一的碘铂蛋白纳米粒组（铂给药剂量为1 mg/kg），游离顺铂组（铂给药剂量为1 mg/kg），生理盐水组，每组5只，每5天给药一次。由图14裸鼠肿瘤的变化效果可知，注射生理盐水组，对A549肿瘤模型和A549/DDP肿瘤模型肿瘤的生长均无影响；而注射纳米粒组对两组肿瘤模型的生长都具有明显的抑制作用，且在观察期间裸鼠状态良好未出现死亡现象，说明本发明的蛋白纳米粒能有效抑制耐药肿瘤的生长；同时游离顺铂组对两组肿瘤模型也有一定的抑瘤效果，但在观察期间裸鼠状态较差且体重降低。

9、对实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒进行裸鼠体内肝肿瘤抑瘤效果的考察：肿瘤模型的建立：培养HepG2肿瘤细胞，将其消化制备成1×10⁷个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在裸鼠腋下种瘤，每只小鼠皮下注射150 μL，每天观察肿瘤体积大小。待肿瘤体积至50-80 mm³时，按照以下设计给药：碘铂蛋白纳米粒组（铂给药剂量为1 mg/kg），游离顺铂组（铂给药剂量为1 mg/kg），生理盐水组，每组5只，每5天给药一次。由图15裸鼠肿瘤的变化效果可知，注射生理盐水组，对HepG2肿瘤模型肿瘤的生长无影响；而注射纳米粒组对肿瘤模型的生长具有抑制作用，且在观察期间裸鼠状态良好未出现死亡现象，说明本发明所述的蛋白纳米粒也能有效抑制HepG2肿瘤的生长。

10、对实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒进行小鼠体内乳腺癌抑瘤效果的考察：肿瘤模型的建立：培养4T1肿瘤细胞，将其消化制备成1×10⁷个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在Balb/c雌性小鼠的右腿肌肉处皮下注射50 µL细胞悬液，每天观察肿瘤体积大小。待肿瘤体积至50-80 mm³时，按照以下设计给药：碘铂蛋白纳米粒组（铂给药剂量为1 mg/kg），游离顺铂组（铂给药剂量为1 mg/kg），生理盐水组，每组5只，每5天给药一次。由图16小鼠肿瘤的变化效果可知，注射生理盐水组，对4T1肿瘤模型肿瘤的生长无影响；而注射纳米粒组对肿瘤模型的生长具有抑制作用，且在观察期间裸鼠状态良好未出现死亡现象，说明本发明所述的蛋白纳米粒能有效抑制4T1肿瘤的生长。

11、对实施例一制备的碘铂蛋白纳米粒进行小鼠体内原位肺癌抑瘤效果的考察：肿瘤模型的建立：培养A549-luc肿瘤细胞，将其消化制备成1×10⁷个/mL细胞混悬液，保证细胞分散均匀，在裸鼠的肺内注射150 µL细胞悬液，接种3天后，腹腔注射荧光素钠盐（15mg/ml，200 μL），在小动物成像仪下观察肿瘤生长情况。待肺内肿瘤荧光强度达到50000 p/s/cm²/sr时，按照以下设计给药：碘铂蛋白纳米粒组（铂给药剂量为1 mg/kg），游离顺铂组（铂给药剂量为1 mg/kg），生理盐水组，每组5只，每5天给药一次。由图17小鼠肿瘤部位的荧光强度变化可知，注射生理盐水组的A549-luc原位肿瘤模型肿瘤的生长无影响；而注射碘铂蛋白纳米粒组的肿瘤生长受到明显抑制，且在观察期间裸鼠状态良好、未出现死亡现象，说明本发明所述的蛋白纳米粒能有效抑制A549-luc原位肿瘤的生长。

12、对实施例一所述碘铂蛋白纳米粒和游离顺铂进行小鼠体内血药浓度的考察：取正常雌性Balb/c小白鼠，分成（1）PBS组，注射药物后（2）7天组、（3）14天组、（4）21天组、（5）28天组，每组3只。每只小鼠尾静脉给药（1 mg/mL，每5天一次），待25天总共给药5次后，分别在给药后7、14、21、28天采用眼球取血法获取每只小鼠的血样0.5 mL，4 ℃放置过夜后1000 rpm离心5 min，取出上层澄清血清200 µL，用血生化仪检测样品中谷丙转氨酶（ALT），谷草转氨酶（AST），碱性磷酸酶（ALP）以及尿素氮（Urea）含量。结果如图18所示，完全注射药物7天后顺铂组尿素氮含量与对照组相比显示出明显差异，说明顺铂对小鼠具有一定肾损伤。

图19为实施例一的碘铂蛋白纳米粒的水溶液照片，其中数字表示碘铂的浓度；说明本发明得到的纳米粒水溶性很好。

Claims

1.一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒，其特征在于，所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒由铂类药物与蛋白质组成；所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、低密度脂蛋白中的一种或几种；所述铂类药物包括顺铂、碘铂、溴铂、奥沙利铂、卡铂或者奈达铂；所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法包括以下步骤：

（2）调节所述铂类药物前体化合物与蛋白质复合的混合液的pH值至4~12后，加入配体水溶液，接着反应后纯化，得到铂类药物矿化蛋白纳米粒；

铂类药物与银盐的摩尔比为（1~5）:1；铂类药物前体化合物与蛋白质的摩尔比为（20~200）:1；铂类药物前体化合物与配体的摩尔比为1:（1~16）；所述蛋白质水溶液的浓度为1~25mg/mL。

2.根据权利要求1所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒，其特征在于，所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的载药量为1%~50%。

3.一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、血红蛋白、低密度脂蛋白中的一种或几种；所述铂类药物包括顺铂、碘铂、溴铂、奥沙利铂、卡铂或者奈达铂；铂类药物与银盐的摩尔比为（1~5）:1；铂类药物前体化合物与蛋白质的摩尔比为（20~200）:1；铂类药物前体化合物与配体的摩尔比为1:（1~16）；所述蛋白质水溶液的浓度为1~25mg/mL。

4.根据权利要求3所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，采用离心分离除去沉淀，铂类药物与银盐反应为50~60 ℃下避光反应3小时后降温至室温，继续反应10~12小时；步骤（2）中，反应的温度为25~60 ℃，时间为0.5~24小时，纯化为在超滤管中离心处理。

5.根据权利要求3所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，铂类药物与银盐的摩尔比为（2~4）:1；铂类药物前体化合物与蛋白质的摩尔比为（50~150）:1；铂类药物前体化合物与配体的摩尔比为1:（4~12）；所述蛋白质水溶液的浓度为3~20mg/mL。

6.根据权利要求3所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，所述配体包括氯离子、溴离子、碘离子、1,1-环丁烷二羧酸根、乙醇酸根、草酸根、碳酸根或者碳酸氢根；所述银盐包括硝酸银、硫酸银。

7.一种抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉，其特征在于，所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉的制备方法包括以下步骤：

（2）调节所述铂类药物前体化合物与蛋白质复合的混合液的pH值至4~12后，加入配体水溶液，反应后纯化，然后冻干得到铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉；

8.权利要求1所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的应用。

9.权利要求7所述抗肿瘤铂类药物矿化蛋白纳米粒冻干粉在制备肿瘤治疗药物中的应用。