CN109528737B - 藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂与制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂与制备方法，具体质量组成为：藻酸双酯钠和聚乙烯吡咯烷酮质量比为2‒5:1；藻酸双酯钠的含量为15‒50%；盐酸阿霉素与塞来昔布含量40‒80%；其余是水；藻酸双酯钠的特性黏数为9.0‒14.0，有机硫含量为9.0‒13.0%；盐酸阿霉素与塞来昔布质量比1/10–1/2。本发明利用藻酸双酯钠的表面活性与抑晶性能，将其作为稳定剂用于制备疏水性或两亲性抗肿瘤药物的纳米制剂，以改善药物的溶解性，提高药物的生物利用度，增强药物疗效，降低药物毒副作用，进而更好地用于肿瘤治疗的临床应用。本发明能够显著抑制肿瘤的体内外生长与转移，为藻酸双酯钠在抗肿瘤药物新剂型等方面的用途开发提供了科学依据。

Description

藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂与制备方法
技术领域
本发明涉及一种藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂与制备方法，具体说是利用藻酸双酯钠的表面活性与抑晶性能，将其作为稳定剂用于制备疏水性或两亲性抗肿瘤药物的纳米制剂，以改善药物的溶解性，提高药物的生物利用度，增强药物疗效，降低药物毒副作用，进而更好地用于肿瘤治疗的临床应用。
背景技术
肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致其克隆性异常增生而形成的新生物。根据肿瘤对人体的危害程度，可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。其中，恶性肿瘤一直是危害人类健康的最危险的疾病之一，其生长呈浸润性、速度快，易发生出血、坏死、溃疡等症状，并常伴随远处转移，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等，最终造成患者死亡。目前用于治疗恶性肿瘤的方法包括手术治疗、化疗、放疗、激素、免疫和基因治疗，其中手术、化疗与放疗是临床肿瘤治疗的主要手段。手术和放疗属于局部治疗，只对治疗部位的肿瘤有效，对已经发生转移或潜在的转移病灶难以发挥疗效。化疗药物能够随着血液循环分布于大部分器官和组织，对具有全身播撒倾向及已发生转移的肿瘤具有一定疗效，因此化疗成为临床中晚期肿瘤患者的重要治疗手段。近年来，有研究表明化疗联合其他新型肿瘤治疗方法，如免疫治疗（Apetoh L, Ladoire S, Coukos G, Ghiringhelli F. Combining immunotherapyand anticancer agents: the right path to achieve cancer cure Annals ofOncology, 2015, 26(9): 1813–1823）与COX-2抑制治疗（Dai P, Li J, Ma XP et al.Efficacy and safety of COX-2 inhibitors for advanced non-small-cell lungcancer with chemotherapy: a meta-analysis. Onco Targets Ther, 2018, 11: 721–730）等，具有显著协同增效的抗肿瘤作用，因而受到肿瘤治疗领域的广泛关注。
临床常用的化疗药物大多存在水溶性差、生物利用度低、体内循环时间短、代谢快等局限，并且长期使用易产生耐药，进入体内后缺乏肿瘤靶向性，造成对正常组织细胞较大的毒副作用。例如，阿霉素长期用药可能导致不可逆的充血性心力衰竭；紫杉醇具有较大的骨髓抑制、神经毒性与肌肉毒性；依托泊甙可能造成机体过敏及强烈的胃肠道反应；斑蝥素具有肝肾毒性，可致急性肾衰竭，并且其有效剂量和毒性剂量较为接近。因此，提高化疗药物生物利用度、增强其疗效，并降低其毒副作用，一直是肿瘤治疗领域的重要研究课题。抗肿瘤药物纳米化为解决这些难题提供了可能。抗肿瘤纳米制剂是指粒径为10‒1000 nm的载药体系，包括纳米粒、纳米囊、脂质体、纳米胶束等，和普通抗肿瘤药物相比具有以下优势：（1）改善疏水药物的溶解性，提高其生物利用度；（2）减少药物与外界接触的机会，提高药物稳定性，延长药物血液循环时间；（3）具有纳米级尺寸，能够通过实体瘤的高通透性和滞留（EPR）效应实现药物的靶向递送，进而增强药物疗效，减轻或避免药物对正常组织器官的毒副作用；（4）通过表面配基或单克隆抗体的修饰获得对实体瘤的主动靶向性能，促进药物在肿瘤病灶的有效蓄积；（5）利用其结构和性质的多样性，纳制剂能够共载不同作用机制的抗肿瘤药物，进而模拟临床肿瘤治疗的联合用药模式，实现对肿瘤的协同增效的治疗作用。
目前，制备药物纳米制剂的方法主要包括纳米成球/成囊技术、脂质体技术、纳米乳化技术与纳米混悬技术等。其中，纳米混悬技术是20世纪末发展起来的一种新型制剂技术，是以表面活性剂为稳定剂，通过对“纯药物”进行粉碎或者控制其晶体析出而形成胶体分散体系的技术。该制备技术不需使用大量载体材料和/或表面活性剂，即可获得载药量高、给药体积小的纳米药物制剂。纳米混悬剂具有药物溶出度大、生物利用度高等优点，还能够通过提高药物稳定性以及减少附加剂的使用等来改善难溶性药物的成药性，为难溶性药物制剂的开发及其应用提供了新途径（Patel VR, Agrawal YK. Nanosuspension: anapproach to enhance solubility of drugs, J Adv Pharm Technol Res, 2011, 2(2):81–87）。物理稳定性问题是纳米混悬技术在药物制剂领域广泛应用的瓶颈，其影响因素主要包括剂型、分散介质、给药途径、生产技术和药物自身性质等。为了避免纳米混悬剂不稳定现象的发生，最常用的解决方法是制备过程中加入稳定剂（单独使用或组合使用的表面活性剂与抑晶剂等），然而发现并选择性质优良、参数匹配的稳定剂是一个艰辛且复杂的过程。
藻酸双酯钠（PSS）是一种硫酸化多糖类化合物，以褐藻（如海带）提取物褐藻酸为基本原料，首先经过降解得到低聚褐藻酸，再通过化学修饰的方法引入丙二醇酯基和硫酸酯基，以β-D-(1,4)-甘露糖醛酸（mannuronic acid, M）和α-L-(1,4)-古罗糖醛酸（guluronic acid, G）为基本糖链骨架组成的聚阴离子化合物，具有肝素样的结构特征和生理作用，但无肝素的毒副作用（管华诗. 新药藻酸双醋钠PSS 的研究. 医学研究通讯,1999, 28(9): 8）。藻酸双酯钠表现出强分散乳化性能,且不易受外界因子影响，可以用作表面活性剂；藻酸双酯钠具有阴离子聚电解质纤维结构的特点，沿链电荷集中，其分子内及分子间的电斥力能够抑制溶液中药物结晶的生成，因此还可以用作抑晶剂。因此，藻酸双酯钠有望成为一种性质优良的稳定剂用于制备纳米药物混悬剂。藻酸双酯钠PSS 作为海洋多糖类药物的代表，在抗凝血、抗血栓、降血脂和改善微循环等方面具有极其重要的应用。其抗凝血作用相当于肝素的1/3–1/2，能使凝血酶失活，阻止血小板对胶原蛋白的黏附，抑制由于血管内膜受损、腺苷二磷酸凝血酶激活、释放反应等所致的血小板活化与聚集，进而抑制血栓形成，缓解微动静脉痉挛，有效改善微循环（李春霞, 孙杨, 管华诗. 海洋药物藻酸双酯钠研究进展及启示. 生命科学, 2012, 24(9): 1019–1023）。研究还发现藻酸双酯钠具有抑制肿瘤血管新生和破坏脉管系统的药理活性，能够与抗肿瘤药物如阿霉素合用增强抗肿瘤作用（邱培菊, 管华诗. 藻酸双醋钠在制备治疗肿瘤的新血管生成抑制剂和血管破坏剂中的应用，中国发明专利CN102784164A）。因此，以藻酸双酯钠作为稳定剂制备抗肿瘤纳米制剂可能获得协同增效的抗肿瘤疗效。
发明内容
本发明旨在提供一种藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂与制备方法。利用藻酸双酯钠较强的表面活性和显著的抑晶性能，将其作为稳定剂用于制备疏水性或两亲性抗肿瘤药物的纳米制剂，包括纳米混悬剂与纳米粉针制剂，起到改善药物溶解性，提高药物生物利用度的目的。借助藻酸双酯钠对肿瘤血管新生的抑制作用及其对肿瘤脉管系统的破坏作用，以其为稳定剂制备的抗肿瘤药物纳米制剂能够显著抑制实体瘤的生长与转移。通过组合不同作用机制的治疗剂，制备获得的抗肿瘤纳米药物可有效联合不同的治疗方法，发挥对肿瘤协同增效的治疗作用。
本发明提供的一种藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂的质量组成为：
藻酸双酯钠和聚乙烯吡咯烷酮质量比为2‒5:1；藻酸双酯钠的含量为15‒50%；盐酸阿霉素与塞来昔布含量40‒80%；其余是水；藻酸双酯钠的特性黏数为9.0‒14.0，有机硫含量为9.0‒13.0%；盐酸阿霉素与塞来昔布质量比1/10–1/2。
制备方法为：按计量将藻酸双酯钠和聚乙烯吡咯烷酮（型号为PVPK15、PVPK25或PVPK30）溶于蒸馏水中充分搅拌，然后与盐酸阿霉素与塞来昔布的有机溶剂溶液混合，再采用透析法或挥发法除去有机溶剂，得到盐酸阿霉素与塞来昔布的抗肿瘤纳米药物的混悬液，或通过浓缩、高压均质处理，获得浓度适宜、性质稳定的抗肿瘤纳米混悬液。
所述的盐酸阿霉素与塞来昔布可使用表阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、依托泊甙、多西紫杉醇、喜树碱、斑蝥素、去甲斑蝥素、汉防己甲素、白藜芦醇、阿司匹林、咪喹莫特与瑞喹莫德中的一种或其组合替换。特别地，所述的盐酸阿霉素与塞来昔布使用去甲斑蝥素替换。
本发明提供的一种藻酸双酯钠抗肿瘤纳米制剂的制备方法具体包括的步骤：
1）按计量将藻酸双酯钠和聚乙烯吡咯烷酮溶于蒸馏水中，搅拌14-16小时。
2）将疏水性或两亲性抗肿瘤药物加至有机溶剂或含有三乙胺的有机溶剂中，搅拌均匀使其充分溶解；
所述的有机溶剂为二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、甲醇、乙醇、四氢呋喃与丙酮中的一种或其混合溶液；含有三乙胺的有机溶剂中三乙胺的用量为两亲性抗肿瘤药物的2‒3个摩尔当量。
3）将步骤2）得到的药物溶液缓慢加至步骤1）得到的藻酸双酯钠水溶液中，经过搅拌或超声处理以及去除有机溶剂，即可获得抗肿瘤纳米药物的混悬液。
所述有机溶剂去除方法包括透析法或挥发法。对于沸点较高的有机溶剂如二甲基亚砜与二甲基甲酰胺可以采用透析法除去，透析过程在蒸馏水或磷酸盐缓冲液中进行，且采用截留分子量为1000的透析膜；对于低沸点的有机溶剂如甲醇、乙醇、四氢呋喃与丙酮可以采用在常温或加温条件下搅拌或旋蒸挥发除去。
4）将步骤3）得到的浓度较低的抗肿瘤纳米药物混悬液进行浓缩、高压均质处理，获得浓度适宜、性质稳定的纳米混悬液。
5）将步骤3）或4）得到的抗肿瘤纳米药物混悬液进行冷冻干燥处理，必要时加入冻干保护剂，即可获得抗肿瘤纳米药物的注射粉末，所述冻干保护剂包括D-海藻糖、葡萄糖、半乳糖或甘露糖，所述的冻干保护剂优选D-海藻糖，加入量为疏水性抗肿瘤药物质量的5%。冻干粉针复能够复溶于生理盐水或葡萄糖注射液，动态激光散射法检测纳米颗粒的平均粒径小于500 nm。
本发明提供的实施例中，以疏水性抗肿瘤药物去甲斑蝥素为例，制备其藻酸双酯钠纳米混悬剂：去甲斑蝥素是由我国首先研制的去除斑蝥素两个甲基的衍生物，分子结构式（I）。与斑蝥素相比，去甲斑蝥素明显减轻了对泌尿系统的刺激作用，能够升高白细胞数、调节免疫，并且无骨髓抑制作用，因而受到关注。去甲斑蝥素在临床上用于治疗多种癌症，是原发性肝癌的理想用药。虽然明显减轻了斑蝥素的毒性，但去甲斑蝥素仍然具有较大毒性，临床上对其使用时的最大剂量具有严格限制，因此其新剂型的开发是抗肿瘤药物递送领域的重要研究课题。以藻酸双酯钠为稳定剂，聚乙烯比咯烷酮为辅助增溶与抑晶剂，丙酮为有机溶剂，制备得到的去甲斑蝥素纳米混悬液粒径分布均匀、体外性质稳定。和游离药物比较，去甲斑蝥素纳米混悬剂灌胃给药后能够减小肝癌模型小鼠的用药剂量，降低药物毒副作用。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
本发明提供的实施例中，以两亲性抗肿瘤药物盐酸表阿霉素为例，制备其藻酸双酯钠粉针剂：表阿霉素属于抗生素类抗肿瘤药物，为阿霉素的同分异构体，分子结构如式（II）。表阿霉素的作用机制是直接嵌入DNA核碱对之间，干扰转录过程，阻止mRNA的形成，进而抑制DNA和RNA的合成；其对拓朴异构酶Ⅱ也有一定的抑制作用。虽然表阿霉素比阿霉素的心脏毒性小，但也有心脏毒性剂量限制，所引起的心脏毒性表现为心肌病以及不可逆性的损害，因此开发表阿霉素的新剂型具有较为重要的理论意义及潜在的临床应用价值。以藻酸双酯钠为稳定剂、含有三乙胺的二甲基亚砜为有机溶剂，制备得到的表阿霉素纳米混悬液粒径分布均匀、性质稳定，冷冻干燥后为红褐色粉末，能够很好地复溶于5% 葡萄糖或0.9% 氯化钠溶液中。
Figure 612133DEST_PATH_IMAGE002
本发明提供的实施例中，以阿霉素与塞来昔布两种抗肿瘤药物组合为例，制备阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂：阿霉素具有两亲性分子结构如式（III），是目前多种癌症的一线临床用药。阿霉素具有较强的骨髓抑制和心脏毒性，长期使用容易产生耐药，还缺乏肿瘤靶向性，因而极大影响了其临床药效的发挥。近年来，大量研究显示环氧化酶-2（COX-2）本身及其催化生成的炎性介质在多种癌症的发生、发展及转移过程中发挥着关键作用，主要机制包括：促进癌细胞的增殖，抑制其凋亡；促进肿瘤血管新生；抑制免疫应答，使肿瘤细胞“逃脱”免疫监视；促进癌细胞上皮-间充质转化，增强其迁移和运动能力，进而导致癌症的转移。近期的研究还发现 COX-2与肿瘤多药耐药的产生密切相关，如COX-2能够显著上调人乳腺癌MDA-MB-231细胞多药耐药基因1（MDR1）及其产物P-糖蛋白的表达水平。塞来昔布为COX-2选择性抑制剂，具有对结肠、乳腺、肺、前列腺及肝肿瘤生长与转移的抑制作用，能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，克服肿瘤耐药，因此将其与化疗药物联用具有协同增效的治疗作用。塞来昔布为疏水药物，分子结构如式（IV），溶解性差、生物利用度低。以藻酸双酯钠为稳定剂、含有三乙胺的二甲基亚砜为有机溶剂，制备获得的共载阿霉素与塞来昔布的纳米混悬液粒径分布均匀、性质稳定，具有良好的肿瘤靶向性，能携载阿霉素有效蓄积于小鼠体内的乳癌组织，并且大大降低了阿霉素的心脏毒性，对塞来昔布起到了显著的增溶作用，能够有效抑制小鼠体内乳癌的原位生长与远处转移。
Figure DEST_PATH_IMAGE003
总之，与现有技术比较，本发明具有的显著优点是：
1）藻酸双酯钠具有良好的生物学性质（生物相容、可生物降解、无毒），独特的理化性质（成胶性、易化学改性）和具有强分散乳化性与显著的抑晶性能，且不易受外界因素影响，是用于纳米混悬技术的性质优良的稳定剂。
2）藻酸双酯钠具有抗凝血、抗血管新生及抗肿瘤等生理活性，临床应用时可以通过口服或静脉注射给药，以其为稳定剂制备获得的抗肿瘤纳米制剂具有较高的生物安全性，并且具有协同增效的抗肿瘤作用。
3）以藻酸双酯钠为稳定剂，采用纳米混悬技术制备抗肿瘤纳米制剂的工艺简单、条件温和、且成本低廉，适于工业化大量生产。
4）以藻酸双酯钠为稳定剂制备得到的抗肿瘤纳米制剂中药物含量高达40‒80%，克服了其它制剂中载药量较低的缺陷。
5）本发明中的抗肿瘤纳米制剂大大增加了疏水药物的溶解性，提高了其体内外的稳定性，细胞实验数据表明纳米制剂具有与游离药物同等的细胞增殖抑制活性。
6）本发明通过两亲性与疏水性抗肿瘤药物的组合，可制备获得共载两种不同作用机制的抗肿瘤药物，并联合藻酸双酯钠实现对肿瘤显著的协同治疗作用。所述两亲性与疏水抗肿瘤药物包括表阿霉素、阿霉素、柔红霉素、阿克拉霉素、依托泊甙、多西紫杉醇、喜树碱、斑蝥素、去甲斑蝥素、塞来昔布、阿司匹林、汉防己甲素、白藜芦醇、咪喹莫特与瑞喹莫德中的一种或其组合替换。
7）本发明中阿霉素与塞来昔布的藻酸双酯钠纳米制剂具有良好的肿瘤靶向性，显著的细胞杀伤作用，能够高效地抑制乳腺肿瘤的体内生长与转移，为临床乳腺癌治疗中的复发转移、化疗抵抗以及肿瘤相关血小板过度活化等诸多问题提供了新策略。
因此，本发明以藻酸双酯钠为稳定剂的抗肿瘤纳米制剂的制备方法适用性强，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的透射电镜照片。
图2是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的粒径分布柱状图。
图3是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂中两种药物的体外释放曲线。
图4是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂与小鼠乳腺癌4T1细胞共孵育后的激光共聚焦照片。
图5是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂对4T1细胞体外生长的抑制曲线。
图6是实施例1中游离塞来昔布对4T1细胞的体外毒性考察。
图7是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂对4T1细胞体外迁移的抑制数据。
图8是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂经尾静脉注射给药后在4T1荷瘤小鼠体内的组织分布数据。
图9是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂经尾静脉注射给药后对4T1荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制曲线。
图10是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂经尾静脉注射给药治疗后4T1荷瘤小鼠体内肿瘤转移的荧光观察成像照片。
图11是实施例1中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂经尾静脉注射给药治疗后对4T1荷瘤小鼠体内肿瘤肺转移的荧光强度检测数据。
图12是实施例1中4T1荷瘤小鼠经阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂治疗后对肿瘤血管染色的免疫组化照片。
图13是实施例1中4T1荷瘤小鼠经阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂治疗后肿瘤部位的微血管密度检测数据。
图14是实施例2中阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米粉针剂的粒径分布柱状图。
图15是实施例3中去甲斑蝥素的藻酸双酯钠纳米混悬剂的透射电镜照片。
图16是实施例3中去甲斑蝥素的藻酸双酯钠纳米混悬剂的粒径分布柱状图。
图17是实施例4中表阿霉素的藻酸双酯钠纳米药物粉针剂复溶于蒸馏水后的透射电镜照片。
图18是实施例4中表阿霉素的藻酸双酯钠纳米药物粉针剂复溶于蒸馏水后的粒径分布柱状图。
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进行具体描述，它们只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整，均属本发明保护范围。
实施例中未注明的具体使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，或本领域的普通技术人员用熟知的方法得到。所涉及的具体实验方法、操作条件，通常按照常规工艺条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：
1．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的制备
称取25 mg藻酸双酯钠（中国海洋大学医药学院）与5 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30，购于Sigma-Aldrich），溶于15 mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶解。将盐酸阿霉素（购于大连美仑生物生物技术有限公司）以8 mg/mL的浓度溶于二甲基亚砜中，并加入3倍摩尔当量的三乙胺，以600 rpm的转速在室温下避光搅拌12 h，进行脱盐处理；将塞来昔布（大连美仑生物生物技术有限公司）以80 mg/mL的浓度溶于二甲基亚砜中；将阿霉素与塞来昔布溶液等体积进行混合，并在避光条件下搅拌24 h。随后将2 mL药物溶液缓慢滴加至上述藻酸双酯钠溶液中，室温下持续搅拌30 min，控制转速为600‒800 rpm，得到红褐色乳状混悬液。将该纳米混悬液转移至透析袋（截留分子量为1000）中，而后于250 mL蒸馏水中透析纯化，每6 h换水1次至混悬液中的二甲基亚砜完全除去，并用蒸馏水稀释至25 mL，即得阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂。
2．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂中药物含量的测定
采用高效液相法检测纳米混悬剂中阿霉素与塞来昔布的含量。阿霉素的高效液相色谱检测条件：Waters C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为乙腈/0.05 mol/L磷酸二氢钾（35/65, v/v, pH 3.0）；激发波长480 nm；发射波长580 nm；流速1.0 mL/min；柱温25℃；进样量20 μL。用流动相配置系列浓度的阿霉素标准溶液，进样后检测峰面积，绘制阿霉素浓度相对于峰面积的标准曲线，求回归方程。塞来昔布的高效液相色谱检测条件：WatersC18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相为甲醇/水（85:15，v/v）；检测波长254 nm；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样量20 μL。用甲醇配置系列浓度的塞来昔布标准溶液，进样后检测峰面积，绘制塞来昔布浓度相对于峰面积的标准曲线，求回归方程。样品的处理方法及药物含量的测定：检测阿霉素含量时，取纳米混悬剂适量，用0.1 mol/L的盐酸溶液稀释，过滤后进样，按照上述高效液相条件测定其中阿霉素的浓度，并计算纳米混悬剂中阿霉素的含量为0.305±0.018 mg/mL；检测塞来昔布含量时，取共载阿霉素/塞来昔布纳米混悬剂适量，用甲醇溶液提取，过滤后进样，按照上述高效液相条件测定其中塞来昔布的浓度，并计算纳米混悬剂中塞来昔布的含量为2.95±0.16 mg/mL。
3．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的表征
将所制备的纳米混悬剂用蒸馏水稀释10倍，涡旋使其充分分散后滴于铜网碳支持膜上，然后在透射电镜下观察纳米粒子的形态。透射电镜照片如图1，纳米粒呈现较为规则的球状形貌，具有明显的“核-壳”结构。采用动态激光散射法检测混悬液中纳米粒子的粒径及其分布，结果如图2。纳米粒的平均粒径为146.8±18.9 nm，分散系数为0.145。利用Zeta电位测定仪检测纳米混悬液的Zeta电位为-40.3±5.2 mV，说明藻酸双酯钠分布于纳米粒表面，荷负电。将纳米混悬剂稀释于pH 7.4磷酸盐缓冲液与含有10%胎牛血清的磷酸盐缓冲溶液中，随后均置于4℃条件下保存，连续7天并且每天测定其粒径变化，考察该纳米体系的粒径稳定性。检测结果显示该纳米混悬剂具有较好的稳定性，储存过程中粒径无显著变化，分散系数有所增大。
4．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的体外药物释放情况
采用动态透析考察纳米混悬剂中阿霉素与塞来昔布的体外释药情况。首先将截留分子量为1000的透析袋在沸水中活化10 min，而后将3 mL纳米混悬剂转移至透析袋中，两端用夹子夹紧后放入加有50 mL pH 7.4的磷酸盐（释放介质）中，并让透析袋完全浸没，置于37℃恒温避光振荡。按预设时间点，更换释放介质，采用上述高效液相条件测定各时间点释放介质中阿霉素与塞来昔布的浓度，并根据以下公式计算药物释放百分率，绘制药物累积释放曲线。
释放百分率% =（药物释放量/药物总含量）× 100%
阿霉素和塞来昔布的体外释放曲线如图3所示，前12 h两种药物均呈现较快的释放速率，而后释放缓慢，72 h阿霉素与塞来昔布的释放率分别为54.2%与47.8%，说明两种药物能够从纳米混悬剂中释放发挥抗肿瘤作用。
5．乳腺癌4T1细胞对阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的摄取能力
将置于完全培养液中的小鼠乳腺癌4T1细胞常规消化、离心、重悬、计数，随后分别以6×104个/孔的细胞密度接种于12孔板中，放入37 °C，5% CO2培养箱中孵育24 h，弃去培养基，更换分别含有游离阿霉素与纳米混悬剂的完全培养基，阿霉素的浓度均为1 μg/mL，并继续孵育0.5 h，6 h及12 h。随后，弃去培养液，用冰磷酸盐缓冲液洗3次，4%多聚甲醛固定10 min，再用4', 6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色10 min，利用阿霉素的自发红色荧光于激光共聚焦显微镜下观察4T1细胞对游离阿霉素以及纳米混悬剂中所携载阿霉素的摄取能力。
激光共聚焦照片如图4所示，4T1细胞能够有效摄取纳米混悬剂中的纳米粒，其摄取量随着孵育时间的延长而增加，并且共孵育12 h后阿霉素的红色荧光主要分布于细胞核，说明阿霉素通过纳米混悬剂的携载能够有效进入4T1细胞并在细胞中成功释放进入胞核发挥抗肿瘤作用。
6．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂对乳腺癌4T1细胞的毒性作用
将处于对数生长期的4T1细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板之中，放入37℃，5% CO2培养箱中孵育12 h至细胞贴壁，吸去培养基，分别加入含有游离阿霉素、阿霉素/塞来昔布混合物以及纳米混悬剂的培养基，并继续孵育48 h。随后，向每孔加入20 μL（5mg/mL）的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液，继续放入孵箱中培养4 h，弃去培养液和MTT试剂，每孔加入150 μL二甲基亚砜，并置于摇床上以100 rpm的转速震荡10 min，最后用酶标仪于490 nm处检测每孔的吸光度值即OD值，设置不加药组为空白对照，按照以下公式计算细胞存活率：
存活率 =（实验孔OD值/对照孔OD值）×100%
乳腺癌4T1细胞经过不同药物处理后的细胞生存曲线如图5所示，计算游离阿霉素、阿霉素/塞来昔布混合物与纳米混悬剂给药组中半数致死量（IC50）分别为2.12、1.30和0.82 μg/mL阿霉素。阿霉素/塞来昔布混合物具有比游离阿霉素更强的细胞毒性，而塞来昔布在使用范围内没有明显的细胞毒性（图6），说明塞来昔布能够显著增强4T1细胞对阿霉素的敏感性。纳米混悬剂表现出比阿霉素/塞来昔布混合物更强的细胞生长抑制作用，说明纳米混悬剂能够有效联合阿霉素与塞来昔布这两种不同作用机制的抗肿瘤药物，进而发挥协同增效的抗肿瘤作用。
7．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂对乳腺癌4T1细胞迁移的抑制作用
将处于对数生长期的4T1细胞以7×105个/皿的密度接种于背面标记划线的6 mm细胞培养皿之中，放入37 °C，5% CO2培养箱中孵育12 h至细胞贴壁。按照以下分组加入含药培养基：游离阿霉素、游离塞来昔布、阿霉素/塞来昔布混合物、纳米混悬剂，使药物与细胞共孵育24 h，而后吸去培养基，用枪在皿中央画一条垂直于标记线的痕迹，磷酸盐缓冲液清洗2次。再按照上述分组加入含药培养基，使药物与细胞继续共孵育24 h，期间每隔3 h于显微镜下观察痕迹宽度，并于0 h和24 h拍照记录。
实验数据如图7所示。和对照组相比，所有治疗组均表现出一定程度上的细胞迁移抑制作用，但阿霉素/塞来昔布混合物与纳米混悬剂具有比游离阿霉素与游离塞来昔布更强的的抑制效率，进一步说明两种药物具有协同抑制乳腺癌细胞运动的能力。众所周知，肿瘤细胞的运动性与肿瘤发生转移密切相关，因此纳米混悬剂对4T1细胞迁移的显著抑制作用证明其具有抑制乳腺癌转移的能力。
8．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂在乳腺癌4T1荷瘤小鼠体内的分布
利用阿霉素的自发有荧光作为示踪，考察阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂在乳腺癌4T1荷瘤小鼠体内的组织分布。首先建立乳腺癌原位小鼠模型，如下：将培养至对数生长期的荧光素酶标记的4T1-Luc细胞常规消化、离心、弃去上清液，以磷酸盐缓冲液洗涤2 次后悬浮于无血清DMEM培养液中，制备细胞悬液，并进行细胞计数；随后在BALB/c健康小鼠的左侧乳房垫皮下以5×105个细胞/只小鼠进行细胞接种，建立原位乳腺癌小鼠模型。待小鼠体内瘤块体积生长约为1 cm3时，通过尾静脉分别注射200 μL无菌生理盐水（对照）、游离阿霉素与纳米混悬剂，控制阿霉素的剂量为8 mg/kg。利用小动物活体成像仪分别在给药后6 h与24 h观察阿霉素在小鼠体内的分布情况；最后处死小鼠，收集主要脏器和肿瘤组织，半定量观察阿霉素荧光信号在小鼠各脏器和肿瘤组织中的分布。
荧光照片如图8所示，游离阿霉素给药后6 h主要分布于肝脏与肾脏，说明其在小鼠体内代谢清除迅速，并且24 h后在肿瘤中的蓄积有限；阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂改变了阿霉素的组织分布，6 h时即表现出在肿瘤中的显著分布，24 h后仍能有效蓄积于肿瘤组织，以上结果说明纳米混悬剂可以通过EPR效应被动靶向递送阿霉素与塞来昔布至肿瘤病灶发挥抗肿瘤效应。
9．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的体内抗肿瘤作用评价
将原位瘤块大小生长至体积约为1 cm3的小鼠随机分为4组（每组10只小鼠），按照以下分组进行治疗：生理盐水对照组、游离阿霉素、游离塞来昔布、阿霉素/塞来昔布混合物与纳米混悬剂治疗组。通过尾静脉注射生理盐水与各种治疗剂200 μL，其中阿霉素剂量为3mg/kg，塞来昔布剂量为30 mg/kg，藻酸双酯钠剂量为1 mg/kg；每2 d给药1次，合计给药6次。治疗期间，每2 d用游标卡尺测量瘤块的长径a和宽径b，并按照公式V＝(ab2)/2计算肿瘤的体积V，绘制肿瘤生长曲线，并同时对小鼠的体重进行称量。
实验结果如图9所示。与对照组比较，游离阿霉素、阿霉素/塞来昔布混合物与纳米混悬剂治疗对小鼠体内肿瘤的生长均表现出显著的抑制作用（**: P<0.01）。与游离阿霉素相比，阿霉素/塞来昔布混合治疗16 d后小鼠体内肿瘤的生长明显减缓，说明塞来昔布具有增效阿霉素的抗肿瘤作用。与阿霉素/塞来昔布混合治疗比较，纳米混悬剂对肿瘤的体内生长表现出更为显著的抑制效应（##: P<0.01），治疗8 d后肿瘤的生长几乎被完全抑制，说明该纳米混悬剂能够有效联合化疗与COX-2抑制剂用于乳腺癌的治疗。这种对体内肿瘤生长显著的抑制效应是由于纳米制剂能够靶向递送阿霉素与塞来昔布至肿瘤病灶，进而有利于发挥两种抗肿瘤药物的协同治疗作用。此外，治疗过程中各治疗组小鼠的体重无显著变化，包括低剂量下的游离阿霉素组，说明这些治疗方法的体内毒性低，具有一定的生物安全性。
10．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的体内抗肿瘤转移作用评价
由于4T1-Luc细胞在荧光素酶底物的作用下能够发射荧光，因此可以通过观察荧光的组织分布以及检测组织内的荧光强度来考察乳腺肿瘤在小鼠体内的转移情况。治疗结束后，从各组随机选取3只小鼠，腹腔注射荧光素酶底物，6 min后断颈处死并收集重要脏器，30 min内于小动物活体成像仪的生物发光模式下观察癌细胞的脏器转移情况，并通过检测组织荧光强度来半定量考察乳腺肿瘤的体内转移情况。
如图10所示，小鼠体内乳腺癌4T1肿瘤的转移主要发生在肺部，游离阿霉素、游离塞来昔布及其混合物治疗组小鼠肺部也出现了转移灶，而纳米混悬剂治疗几乎完全抑制了小鼠体内乳腺肿瘤的肺转移。小鼠肺脏荧光强度的比较如图11，各种治疗均表现出对乳腺肿瘤肺转移的显著抑制效应（**: P<0.01）；相比之下，阿霉素/塞来昔布纳米混悬剂治疗组的小鼠肺脏荧光强度显著低于其他治疗组（##: P<0.01），说明该纳米制剂能够靶向肿瘤递送阿霉素与塞来昔布，进而有效发挥两种抗肿瘤药物的协同作用，抵抗原位乳腺肿瘤的远处转移。
11．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的抗肿瘤转移作用机制初探
已有参考文献报道塞来昔布能够通过抑制肿瘤血管新生来抑制肿瘤的原位生长与远处转移（Klenke FM, Gebhard MM, Ewerbeck V, Abdollahi A, Huber PE, SckellA, The selective Cox-2 inhibitor celecoxib suppresses angiogenesis and growthof secondary bone tumors: an intravital microscopy study in mice, BMC Cancer,2006, 6: 9），加之藻酸双酯钠作为一种硫酸化多糖也具有抑制肿瘤血管新生和破坏脉管系统的药理活性（邱培菊, 管华诗. 藻酸双醋钠在制备治疗肿瘤的新血管生成抑制剂和血管破坏剂中的应用，中国发明专利CN102784164A）。综上，我们认为对肿瘤血管生成的抑制作用可能是阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂抑制乳腺癌转移的主要机制之一，因此我们继续考察了治疗后小鼠肿瘤组织中的血管生成情况。实验方法如下：治疗结束后，将小鼠拉颈处死，收集肿瘤并制成石蜡组织切片；对石蜡切片进行脱蜡、水化处理，20 mL3% 过氧化氢常温避光作用15 min，蒸馏水冲洗孵育以消除内源性过氧化物酶活性，高压枸橼酸钠抗原修复液进行抗原修复，山羊血清封闭1 h后相继进行一抗（anti-CD31兔多克隆抗体，ab28364，Abcam）、二抗（HRP标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司）处理，以及二氨基联苯胺和苏木精染色，之后进行组织脱水和透明封片处理，加盖玻片于显微镜下观察。100 倍镜下，每张切片中选择6个血管密度最高的区域，然后在400 倍镜下统计每个区域的血管数目，计算平均值即为平均血管密度。
肿瘤组织微血管的免疫组化照片如图12，与对照组比较，各治疗组小鼠肿瘤组织中的血管生成均受到一定程度的抑制，特别是游离塞来昔布、阿霉素/塞来昔布混合物及其纳米混悬剂治疗组，肿瘤组织中几乎观察不到大血管的生成。肿瘤微血管密度的检测数据见图13，游离塞来昔布与阿霉素/塞来昔布混合物显著抑制了4T1荷瘤小鼠体内肿瘤血管的生成（*: P<0.05），是由于塞来昔布能够通过抑制COX-2的活性下调血管内皮生长因子（VEGF）表达的原因；阿霉素/塞来昔布纳米混悬剂表现出更为显著的肿瘤血管生成抑制作用（**: P<0.01），并且与其他治疗组相比也具有非常显著的血管生成抑制效应（##: P<0.01）。以上数据进一步说明我们制备的阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂能够通过抑制肿瘤血管的生成有效抑制乳腺癌的肺转移。
实施例2：
1．阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米粉针剂的制备
将实施例1中制备得到的阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂中加入约2%的甘露糖，而后进行冷冻干燥处理得红褐色絮状粉末，即为其纳米粉针剂。
2. 阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米粉针剂中药物含量的测定
采用与实施例1中相同的高效液相法检测纳米粉针剂中阿霉素与塞来昔布的含量。样品处理与药物含量测定：检测阿霉素含量时，精密称取纳米粉针剂5 mg分散于0.1mol/L的盐酸溶液5 mL中，涡旋振荡3 h后过滤处理，滤液稀释适当倍数后按照实施例1中高效液相色谱条件进样测定阿霉素的浓度，并计算纳米粉针剂中阿霉素的含量为6.0%；检测塞来昔布含量时，精密称取纳米粉针剂5 mg分散于1 mL蒸馏水中，而后滴加至10 mL甲醇溶液中，振荡3 h后过滤处理，滤液稀释适当倍数后按照实施例1中高效液相色谱条件进样测定塞来昔布的浓度，并计算纳米粉针剂中塞来昔布的含量为56.4%。
3. 阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米粉针剂的表征
将上述制备的纳米粉针剂用蒸馏水分散至浓度约为0.5 mg/mL，涡旋并行短时超声处理，使其充分分散后滴于铜网碳支持膜上，然后在透射电镜下观察纳米粒子的形态。纳米粉针剂中的纳米粒子呈现与实施例1纳米混悬剂中类似的球状形貌，具有明显的“核-壳”结构。采用动态激光散射法检测混悬液中纳米粒子的粒径及其分布，结果如图14，纳米粉针剂中纳米粒子的平均粒径为225.3±16.8 nm，分散系数为0.198。可见，阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米粉针剂的粒径明显大于实施例1纳米混悬剂，但仍然位于肿瘤被动靶向EPR效应的粒径范围。利用Zeta电位测定仪检测纳米混悬液的Zeta电位为-36.5±4.8 mV，说明藻酸双酯钠分布于纳米粒表面，荷负电。
实施例2中的阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米粉针剂的体外释药情况、肿瘤细胞对其的摄取能力、细胞毒性、体外抑制肿瘤细胞迁移的能力、体内肿瘤靶向性及其抑瘤效果与实施例1中数据相仿，在此不重复叙述。
实施例3：
1．去甲斑蝥素纳米混悬剂的制备
称取25 mg藻酸双酯钠与5 mg聚乙烯吡咯烷酮，溶于15 mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶解；称取30 mg去甲斑蝥素（购于大连美仑生物生物技术有限公司）溶于1.5 mL丙酮中，缓慢滴加至上述藻酸双酯钠溶液，室温下持续搅拌30 min，控制转速为600‒800 rpm，得到白色乳状混悬液，而后室温下旋蒸除去丙酮，即制得去甲斑蝥素纳米混悬剂。
2．去甲斑蝥素纳米混悬剂中药物含量的测定
采用高效液相色谱法（HPLC）检测纳米混悬液中去甲斑蝥素的药物含量。色谱条件如下：Waters C18色谱柱（4.6×250 mm，5 μm）；流动相pH 3.1磷酸水溶液-甲醇（70/30, v/v）；流速1.0 mL/min；柱温25℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。标准溶液样品的配置及标准曲线的绘制：精密称取干燥至恒重的去甲斑蝥素对照品5 mg，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，并通过定量稀释配置浓度为0、5、10、25、50、75和100 μg/mL的标准溶液，按上述色谱条件检测，记录峰面积，绘制标准曲线，求回归方程，相关系数r为0.9985。样品的处理方法及药物含量的测定：取纳米混悬液溶液2 mL置于 25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，充分摇匀，滤过，取续滤液为供试品。将供试品溶液用甲醇稀释后按上述色谱条件进样测得峰面积，代入回归方程计算即可得到的药物含量为1.94±0.08 mg/mL。
3．去甲斑蝥素纳米混悬剂的表征
将去甲斑蝥素纳米混悬液用蒸馏水稀释10倍后滴于铜网碳支持膜上，然后在透射电镜下观察纳米粒子的形态。透射电镜照片如图15，纳米粒呈现类球状形貌，分布均匀。采用动态激光散射法检测混悬液中纳米粒的粒径及其分布，结果如图16。纳米粒的平均粒径为258.2±31.6 nm，分散系数为0.218。利用Zeta电位测定仪检测纳米混悬液的Zeta电位为-34.5±5.6 mV，说明藻酸双酯钠分布于纳米粒表面。
4．去甲斑蝥素纳米混悬剂对小鼠体内肝癌生长的抑制作用
人肝癌 HepG2细胞小鼠荷瘤模型的建立：将对数生长期的HepG2细胞（购于美国模式培养物集存库 ATCC）常规消化，离心，吸取上清液，磷酸盐缓冲（PBS）溶液重悬，离心，弃去上清液，重复2次，除去培养液中的血清。随后进行细胞计数，调整细胞浓度至5×107个/mL，悬浮于无血清DMEM培养液中，制成细胞悬液。用注射器抽取细胞悬液200 μL，接种于裸鼠皮下，每只小鼠接种5×105个细胞，瘤块体积生长约为1 cm3时，进行以下治疗实验。
将HepG2荷瘤小鼠随机分为6组（6只小鼠/组），分别为空白对照组（生理盐水）、藻酸双酯钠给药组、游离去甲基斑蝥给药组、纳米混悬液低、中、高剂量给药组，治疗方案如下：每日灌胃给药1次，连续给药8 d；藻酸双酯钠给药剂量为4 mg/kg；游离去甲基斑蝥分散于羧甲基纤维素钠溶液中，给药剂量为2 mg/kg；纳米混悬液给药低、中、高剂量分别为1、2与4 mg/kg；记录各组小鼠体重变化，8 d 后处死各组小鼠，完整剥离肿瘤，称重，计算抑瘤率＝(1 – 实验组平均瘤重/空白对照组平均瘤重)×100％，以抑瘤率大小判断对肿瘤的抑制作用。各组小鼠的体重和抑瘤率比较见表1。与空白对照组比较，各治疗组小鼠的瘤重均明显减轻（P<0.05或P<0.01）说明这些治疗能够抑制小鼠体内肝癌的生长；与游离药物组比较，纳米药物治疗的中、高剂量给药组的抑瘤率明显升高（P<0.05或P<0.01），并且相同给药剂量（2 mg/kg）下，纳米药物组表现出显著高于游离药物组的抑瘤率，说明去甲斑蝥素制备成纳米混悬液后的抗肝癌疗效明显增强。与空白对照组相比，游离药物组的小鼠平均体重显著降低，而相同剂量下纳米药物组小鼠体重无明显变化，说明去甲斑蝥素制备成纳米混悬液后的体内毒性减小；此外，纳米药物高剂量组（剂量4 mg/kg）小鼠不仅平均体重显著降低，而且在治疗过程中1只小鼠死亡，说明去甲斑蝥素纳米混悬液高剂量时也存在一定的毒性。
表1. 各组小鼠的体重和抑瘤率比较
Figure 732536DEST_PATH_IMAGE004
与空白对照组比较：* P<0.05，** P<0.01；与游离给药组相比：# P<0.05，## P<0.01
实施例4：
1．表阿霉素纳米药物粉针剂的制备
称取25 mg藻酸双酯钠与5 mg聚乙烯吡咯烷酮，溶于15 mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶解；将盐酸表阿霉素50 mg加至含有三乙胺30 μL的二甲基亚砜2 mL中，搅拌均匀使其充分溶解，而后缓慢滴加至上述藻酸双酯钠溶液，室温下持续搅拌30 min，控制转速为600‒800 rpm，得到红褐色乳状混悬液。将该纳米混悬液转移至透析袋（截留分子量为1000）中，而后于250 mL蒸馏水中透析纯化，每6 h换水1次至混悬液中的二甲基亚砜完全除去；收集透析液并加入约2%的甘露糖，进行冷冻干燥处理得红褐色絮状粉末，即为表阿霉素纳米粉针剂。
2．表阿霉素纳米药物粉针剂中药物含量的测定
采用紫外分光光度法检测纳米药物粉针剂中表阿霉素的药物含量。标准溶液样品的配置及标准曲线的绘制：精密称取盐酸表阿霉素对照品5 mg，置于100 mL容量瓶中，蒸馏水充分溶解并定容，用0.1 mol/L盐酸溶液定量稀释配置浓度为0、0.5、1.0、5.0、10、25和50μg/mL的标准溶液，利用紫外分光光度计在480 nm处检测标准溶液的吸光度，绘制标准曲线，求回归方程。样品的处理方法及药物含量的测定：精密称取纳米药物粉末5 mg，置于100mL量瓶中，用0.1 mol/L的盐酸溶液溶解并稀释至刻度，充分摇匀，滤过，取续滤液为供试品；利用紫外-可见分光光度计在480 nm处检测供试品的吸光度，并根据表阿霉素盐酸盐标准曲线计算表阿霉素纳米药物粉针剂中药物含量为57.9±2.5%。
3．表阿霉素纳米药物粉针剂的表征
将表阿霉素纳米药物粉针剂约2 mg混悬于蒸馏水5 mL中，涡旋使其充分分散后滴于铜网碳支持膜上，然后在透射电镜下观察纳米粒子的形态。透射电镜照片如图17，纳米粒呈现较为规则的球状形貌，能够观察到其内部表阿霉素纳晶的分布。采用动态激光散射法检测表阿霉素纳米粒的粒径及其分布，结果如图18。纳米粒的平均粒径为178.5±23.8 nm，分散系数为0.156。利用Zeta电位测定仪检测纳米混悬液的Zeta电位为-38.6±4.8 mV，说明藻酸双酯钠分布于纳米粒表面，荷负电。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (3)

1.一种阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂的制备方法，其特征在于经过如下的步骤：
1）称取25 mg藻酸双酯钠与5 mg聚乙烯吡咯烷酮（PVPK30），溶于15 mL蒸馏水中，搅拌使其充分溶解；
2）将盐酸阿霉素以8 mg/mL的浓度溶于二甲基亚砜中，并加入3倍摩尔当量的三乙胺，以600 rpm的转速在室温下避光搅拌12 h，进行脱盐处理；
3）将塞来昔布以80 mg/mL的浓度溶于二甲基亚砜中；将阿霉素与塞来昔布溶液等体积进行混合，并在避光条件下搅拌24 h；
4）随后将2 mL药物溶液缓慢滴加至上述藻酸双酯钠溶液中，室温下持续搅拌30 min，控制转速为600‒800 rpm，得到红褐色乳状混悬液；
5）将该纳米混悬液转移至截留分子量为1000的透析袋中，而后于250 mL蒸馏水中透析纯化，每6 h换水1次至混悬液中的二甲基亚砜完全除去，并用蒸馏水稀释至25 mL，即得阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂。
2.权利要求1所述的制备方法得到的阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂。
3.权利要求2所述的阿霉素/塞来昔布的藻酸双酯钠纳米混悬剂在制备抗肿瘤纳米药物中的应用。
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