CN115887672B - 包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒及其制备方法与应用,该纳米粒包括碳酸铜矿化纳米粒和生物大分子药物,碳酸铜矿化纳米粒在矿化过程中稳定包载所述生物大分子药物,碳酸铜矿化纳米粒由铜离子与碳酸根离子矿化制得,生物大分子药物包括核酸类药物和蛋白质类药物,碳酸铜矿化纳米粒对生物大分子药物的载药量为0~60%。本发明通过铜离子与生物大分子药物间的强作用力稳定结合,在其矿化过程将生物大分子进一步稳定装载于矿化纳米粒中,矿化纳米粒携带生物大分子药物实现跨细胞转运;该矿化纳米粒可以响应溶酶体微酸性环境,快速降解释放生物大分子药物,与降解后释放的铜离子协同作用杀伤肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料和纳米生物医药领域,具体涉及一种包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒及其制备方法与应用。
背景技术
在过去的20年中,大分子药物的开发取得了重大进展。与小分子药物相比,以核酸和蛋白质结构为主体的生物大分子药物具有极高的特异性和亲和力、复杂的生物功能等独特优势,为目前难治性疾病的治疗提供了新的希望。然而,这类药物的结构复杂性为药物的成药性开发带来了共性挑战。例如,未经化学修饰的大分子在体循环中不稳定,容易被蛋白酶水解(对于蛋白质)和核酸酶(对于核酸)的生物降解。此外,生物大分子体积大,不能自由地穿透生物屏障和细胞膜。因此,需开发特定的给药载体来实现生物大分子药物的递送。
目前,基于聚合物和脂质的大分子药物纳米递送载体已取得巨大突破,如递送siRNA的阳离子聚合物和递送mRNA疫苗的脂质纳米颗粒。但这些传递系统存在一些内在的局限性,包括材料合成繁琐,制备过程复杂,载体具有潜在的毒性。此外,药物结构复杂、体积大,难以有效包封,通常通过静电相互作用实现载药,但在体内循环过程中存在过早泄漏的风险,影响最终疗效。因此,开发简单高效的生物大分子药物递送载体依然是领域内的重大挑战。
相比于有机载体,通过生物矿化作用形成的无机纳米平台是一种递送生物大分子的替代选择。生物矿化的基本过程是无机离子(主要是金属)与生物大分子相互作用形成坚硬的生物材料。与有机载体相比,生物矿化纳米颗粒具有制备简单、成本低、生理稳定性好、生物相容性好等优点。金属离子可以通过不同的作用力与大分子相互作用,如静电吸引、配位和氢键(通过水合金属离子),从而具有更高的包载效率和包载稳定性。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提出了包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒及其制备方法与应用,其目的是通过生物矿化作用形成稳定的无机纳米载体,以稳定包载生物大分子药物,实现生物大分子药物跨细胞高效转运,同时该矿化纳米粒可以响应溶酶体微酸性环境,快速降解释放生物大分子药物,以对肿瘤细胞进行杀伤。
为了实现上述目的,本发明首先提供了一种包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒,包括碳酸铜矿化纳米粒和生物大分子药物,所述碳酸铜矿化纳米粒在矿化过程中稳定包载所述生物大分子药物,所述碳酸铜矿化纳米粒由铜离子与碳酸根离子矿化制得,所述生物大分子药物包括核酸类药物和蛋白质类药物,所述碳酸铜矿化纳米粒对生物大分子药物的载药量为0~60%。
作为优选,所述铜离子与所述碳酸根离子的摩尔比为1:1。
作为优选,所述核酸类药物为DNA酶、microRNA、siRNA和反义核苷酸中的一种或多种,所述蛋白质类药物为蛋白酶、抗体和细胞因子中的一种或多种。
作为优选,所述核酸类药物为DNA酶,所述蛋白质类药物为葡萄糖氧化酶。
作为优选,所述铜离子为氯化铜,所述碳酸根离子为碳酸钠。
基于一个总的发明构思,本发明还提供了一种包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒的制备方法,包括以下步骤:
S1、将生物大分子药物与铜离子溶液混合孵育;
S2、将碳酸根离子快速加入至步骤S1中配置的混合液中混合均匀,超声后离心收集沉淀,即得包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒。
作为优选,所述铜离子与所述碳酸根离子的浓度均为0.5~10mM。
作为优选,所述步骤S1中混合孵育时间为10~30min。
作为优选,所述步骤S2中超声时间为5~10min。
基于一个总的发明构思,本发明还提供一种包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
1、本发明提供的包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒,利用无机矿化的方式制备生物大分子药物的纳米递送载体,通过铜离子与生物大分子药物间的强作用力先稳定结合,然后加入碳酸根后与结合了生物大分子药物的铜离子进行无机矿化,在其矿化过程将生物大分子进一步稳定装载于矿化纳米粒中;同时,由于生物大分子药物的界面稳定作用,最终矿化形成粒径均匀的球形纳米粒,粒径为100~200nm;
2、该碳酸铜矿化纳米粒可高效包载生物大分子药物,整体包载率高达60%,该无机矿化纳米粒在正常人体环境中可以稳定包载,不会过早泄露,因此该矿化纳米粒可以携带生物大分子药物实现跨细胞转运,高效递送至目标肿瘤微环境中;同时,该矿化纳米粒在溶酶体微酸性环境能快速降解,抵达肿瘤细胞后的矿化纳米粒能够被快速降解的释放出包载的生物大分子药物,对肿瘤细胞进行作用杀伤;
3、该矿化纳米制剂在降解后释放的铜离子还能产生类芬顿效应,可以协同增效生物大分子药物的治疗活性,提高对于肿瘤细胞的作用效果;
4、该碳酸铜矿化纳米制剂会使其包载的生物大分子药物暂时性失活,进一步提高包载大分子药物纳米粒的生物安全性;当该矿化纳米粒在溶酶体微酸环境中降解后,生物大分子药物能恢复活性,不影响生物大分子药物的功能;
5、本发明提供的生物大分子包载策略无需有机合成过程,通过生物大分子的稳定化作用,生物矿化碳酸铜形成纳米粒,制备方法简单,绿色经济高效,且整体包载率远远高于现有的有机载体,为生物大分子的递送提供了一种简单高效的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1碳酸铜矿化形成过程表征图,其中图1A为碳酸铜矿化形成过程表征图,图1B为沉淀定量结果;
图2为本发明实施例2碳酸铜矿化对核酸的包载结果图,其中图2A为上清液PAGE电泳图,固定碳酸根浓度,图2B为核酸包封率趋势图;
图3为本发明实施例2碳酸铜矿化对蛋白的包载结果图;
图4为本发明实施例3碳酸铜在矿化包载生物大分子的前后对比图;
图5为本发明实施例3碳酸铜矿化纳米粒的粒径、电位表征图,其中图5A为碳酸铜矿化纳米粒的粒径图,图5B为碳酸铜矿化纳米粒电位表征图;
图6.本发明实施例3碳酸铜矿化纳米粒的形态与元素分布图,其中图6A为碳酸铜矿化纳米粒的形态,图6B为碳酸铜矿化纳米粒的元素分布图;
图7为本发明实施例4碳酸铜矿化纳米粒的酸敏响应崩解;
图8为本发明实施例4碳酸铜矿化纳米粒的药物释放图,其中图8A为碳酸铜矿化纳米粒中的药物GOx释放图,图8B为大分子药物DZ的释放图;
图9为本发明实施例5所述包载于碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)结构中的生物大分子活性考察结果,其中图9A为包载于碳酸铜纳米粒结构中的生物大分子活性GOx活性考察,图9B为DZ活性考察;
图10为本发明实施例6碳酸铜矿化纳米粒中铜离子释放后产生的类芬顿效应表征结果;
图11为本发明实施例7碳酸铜矿化纳米粒介导生物大分子的跨细胞转运标记成像结果;
图12为本发明实施例7碳酸铜矿化纳米粒对于肿瘤细胞毒性结果;
图13为本发明实施例7碳酸铜矿化纳米粒对ATP生成的抑制作用结果;
图14为本发明实施例7碳酸铜矿化纳米粒对靶基因HIF-1α的沉默作用结果图;
图15为本发明实施例7碳酸铜矿化纳米粒通过芬顿效应胞内产生自由基的能力;
图16为本发明实施例8碳酸铜矿化纳米粒的体内抗肿瘤疗效结果图,其中图16A为注射碳酸铜矿化纳米粒和生理盐水后肿瘤生长曲线图,图16B为两组对照治疗后的肿瘤实物图;
图17为本发明实施例8碳酸铜矿化纳米粒抗肿瘤效应的病理观察图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。
若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段;若未特别指明,实施例中所用试剂均为市售。
实施例1
碳酸铜的生物矿化
100μL浓度为1M的氯化铜溶液与不同体积的(1,2,5,10,50,100μL)浓度为1M的碳酸钠混合,随后加入水使总体积到达1mL。涡旋混合后,10,000rpm离心10分钟,拍照后收集沉淀,冷冻干燥并称重,结果如图1所示。
图1A为碳酸铜矿化形成过程表征图:固定铜离子的总量,随着碳酸根离子添加量的增加,沉淀逐渐增加,表明生物矿化的形成;图1B为沉淀定量结果,沉淀的重量随着碳酸钠的量的增加呈现线性增长。
实施例2
碳酸铜矿化对生物大分子的包载
10μL不同浓度的氯化铜溶液(0,1,2,3,4,5,8,10mM)与10μL浓度为10μM核酸或10μL浓度为2mg/mL的蛋白进行混合孵育,随后快速加入10μL浓度为10mM的碳酸钠和70μL的水,进行超声混合5分钟。离心取上清,分别通过PAGE胶和考马斯亮蓝测定未包载的核酸及蛋白质浓度,结果如图2所示和图3所示。
图2为碳酸铜矿化对核酸的包载效果图,其中图2A为上清液PAGE电泳图:当固定碳酸根总量,通过增加铜离子浓度实现生物矿化,在生物过程中核酸被包载进入矿化纳米粒中,使得上清液中剩余的核酸逐渐减少;图2B为核酸包封率趋势图,固定碳酸根总量,随着铜离子总量的增加,包封率逐渐提高。
图3碳酸铜矿化对蛋白的包载效果图,当固定碳酸根浓度,通过增加铜离子浓度实现生物矿化及蛋白的煲仔率提升,证实了碳酸铜矿化过程对于蛋白有效包载。
实施例3
包载生物大分子药物的碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)制备及表征
将氯化铜、葡萄糖氧化酶(GOx)以及DNA酶(DZ)在1mM水中充分混合并孵育30min,随后加入碳酸钠溶液,超声5分钟,经离心分离即得碳酸铜矿化纳米粒,碳酸铜在矿化包载生物大分子的前后对比如图4所示;通过马尔文粒径仪测定纳米粒的粒径以及电位,结果如图5所示;通过透射电镜表征纳米粒的形貌及元素分布,结果如图6所示。
由图4可知,碳酸铜矿化纳米粒的对生物大分子药物实现有效包载,以葡萄糖氧化酶(GOx)及DNA酶(DZ)为药物,通过生物大分子的稳定化作用,生物矿化碳酸铜形成均匀分布的纳米粒。
图5A为碳酸铜矿化纳米粒的粒径图,该纳米粒平均粒径为100~200nm,其粒径分布较为均匀;图5B为碳酸铜矿化纳米粒电位表征图,其电位为-12mV。
图6A为碳酸铜矿化纳米粒的形态,该纳米粒形态为球形;图6B为碳酸铜矿化纳米粒的元素分布图,结构中含有硫元素与磷元素,分别为蛋白质与核酸的特征元素,证明生物大分子药物的有效包载。
实施例4
碳酸铜矿化纳米的pH响应性能。
将实施例3制备的碳酸铜矿化纳米粒分别置于pH7.4及pH5.5缓冲液中孵育30min后,离心收集沉淀观察,结果如图7所示,将该碳酸铜矿化纳米粒在酸性条件下孵育后,离心发现沉淀消失,证明了矿化纳米粒的崩解。
为考察纳米粒的酸敏响应药物释放,将该碳酸铜矿化纳米粒置于不同的缓冲液中(pH 7.4或5.5),在不同时间点离心去上清液,根据实施例2的方法测定释放的蛋白质及核酸浓度,结果如图8所示。图8A为碳酸铜矿化纳米粒中的药物GOx释放图,图8B为大分子药物DZ的释放图。由图8结果可知,在生理pH条件下,碳酸铜矿化纳米粒中包载的生物大分子药物释放缓慢;当pH降低至5.5时,药物释放显著增加,证明了纳米粒酸敏响应崩解并释放药物的特性。
实施例5
生物大分子活性考察。
将实施例3制得的碳酸铜矿化纳米粒别至于不同pH条件的缓冲溶液中处理2h,然后按下述方法分别测定GOx及DZ的活性:
GOx的活性:在溶液中加入10mM葡萄糖,然后通过溶氧仪测定溶液中氧气含量的变化。
DZ的活性测定:在溶液中加入2μM底物以及1mM镁离子,于37℃条件下反应1h,然后通过PAGE胶测定底物的切割率。
结果如图9所示:图9A为包载于碳酸铜纳米粒结构中的生物大分子活性GOx活性考察,图9B为DZ活性考察。GOx催化氧化底物葡萄糖(Glu)过程中需要消耗氧气,因此GOx的活性可通过氧气的浓度降低来反映,由图9A可知,在中性条件下,GOx稳定包载与矿化纳米结构中,其活性丧失;当pH降低后,GOx释放出来,活性恢复。DZ的活性可通过其对底物的切割来表征,由图9B可知,DZ仅在酸性条件下表现出切割活性。由此证明了碳酸铜矿化纳米粒可使生物大分子药物失活,并响应酸性pH,快速崩解释放生物大分子药物,恢复药物的活性。
实施例6
类芬顿效应检测
将实施例3制得的碳酸铜矿化纳米粒分别至于不同pH条件(pH7.4或者5.5)的缓冲溶液中处理2h,对照组为pH 7.4的空白缓冲溶液(未加纳米粒),然后在溶液中加入NaHCO3/5%CO2(25mM)缓冲液(含10μg/mL亚甲基蓝、8mM过氧化氢),于37℃条件下反应2h,然后扫描溶液400~800nm波长范围的紫外图谱,结果如图10所示。
由图10可知,在pH5.5处理后,该碳酸铜矿化纳米粒可降低亚甲基蓝的紫外吸收,表现出pH敏感的类芬顿效应,也证明了该碳酸铜矿化纳米粒的微酸环境快速响应降解,降解后产生的铜离子释放后产生的类芬顿效应,降低亚甲基蓝的紫外吸收。
实施例7
生物矿化纳米粒的细胞行为学研究
1.介导生物大分子的胞内转运:将MDA-MB-231细胞以1×105个细胞/cm2接种在35mm玻璃底培养皿中,与碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)或游离DZ孵育6小时后,用PBS洗涤细胞两次。然后,用Hoechst33342(1μg/mL)标记细胞核。使用共聚焦荧光显微镜(德国蔡司LSM780 NLO)对细胞进行成像,结果图11所示。
由图11结果可知,相比于游离的DZ,在GOx/DZ@Cu NPs的介导下,细胞内的DZ信号明显增强,证明了碳酸铜矿化纳米粒介导DZ的胞内转运。
2.细胞毒性研究:将MDA-MB-231细胞(5×103个细胞/孔)接种在96孔板中进行粘附。用含有系列浓度的碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)混合培养24小时。然后,加入20μLMTT溶液(5mg/mL)孵育4小时,弃去溶液,加入150μL DMSO溶解甲赞晶体。最后,测量490nm处的吸光度,计算细胞活力,结果图图12所示。
由图12可知,以GOx浓度计,碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)对具有浓度依赖性的MDA-MB-231细胞肿瘤细胞杀伤作用。
3.胞内ATP的测定:将MDA-MB-231细胞以每孔2×105个细胞的密度接种在12孔板中,孵育12小时。然后,将细胞与碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)孵育24小时。之后,收集细胞并使用ATP裂解缓冲液裂解,并通过ATP测定试剂盒测量ATP浓度,结果如图13所示。
由图13可知,碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)对于ATP的生成具有明显的抑制作用。
4.胞内基因沉默的能力:免疫印迹法检测靶基因HIF-1α的表达。将MDA-MB-231细胞(1×106细胞/孔)加入六孔板中24小时,然后与碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)孵育24小时。然后,用RIPA缓冲液溶解总蛋白,并用BCA蛋白检测试剂盒定量。接下来,在十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上对具有等量总蛋白上样分析60min,然后转移到PVDF膜上,用封闭缓冲液(5%脱脂乳,10mM PBST)封闭膜,并在4℃下与抗HIF-1α的单克隆抗体孵育。在室温下用HRP与二级抗体孵育后,用western印迹检测系统检测印迹,结果如图14所示。
由图14结果可知,碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)对靶基因HIF-1α具有较好的沉默作用,从而改善肿瘤细胞环境乏氧情况。
5.胞内自由基的测定:DCFH-DA检测细胞内ROS的生成。将MDA-MB-231细胞接种在24孔培养板中(2×105个细胞/孔)。细胞与碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)孵育6小时。PBS洗涤三次,加入DCFH-DA(10μM)继续培养30分钟。用无血清培养基洗涤三次后,用荧光成像系统观察细胞内的荧光,结果如图15所示:该碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)通过芬顿效应提高了胞内产生自由基的能力。
实施例7
生物矿化纳米粒的体内抗肿瘤作用研究。
将肿瘤体积约为100mm3的M231荷瘤小鼠随机分为实验组与对照组(每组6只)。在第0天、第3天、第6天和第9天,向小鼠注射生理盐水对照或碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@CuNPs),同时每2天记录一次肿瘤大小和体重。肿瘤体积计算如下:体积=(长×宽2)/2。第14天,处死所有小鼠,收集主要器官(心、肝、脾、肺和肾)和所有肿瘤,然后用PBS清洗并用福尔马林固定。主要脏器HE染色。所有肿瘤均经苏木精-伊红(HE)染色、TUNEL染色、免疫荧光(ki-67,HIF-1α)染色。从不同组的肿瘤组织中检测HIF-1α的Western blotting分析。为了进行生化指标分析,处死所有小鼠,采集血液,用标准试剂盒分析天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶、血尿素氮(BUN)和肌酐(Cre)水平。结果如图16~17所示。
图16A为注射碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)和生理盐水后肿瘤生长曲线,图16B为两组治疗后的肿瘤实物图,从图可知碳酸铜矿化纳米粒对肿瘤生长具有明显抑制作用。
图17为注射碳酸铜矿化纳米粒(GOx/DZ@Cu NPs)和生理盐肿瘤效应的病理观察图。经碳酸铜矿化纳米粒处理后HIF-1α荧光显著降低,证明了DZ的体内激活及其对HIF-1α的沉默;H&E染色、TUNEL染色、以及Ki-67染色分别证明了纳米粒体内促进肿瘤细胞的坏死、凋亡、以及细胞增殖抑制活性。
以上所述是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明所述原理的前提下,还可以作出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒,其特征在于,包括碳酸铜矿化纳米粒和生物大分子药物,所述生物大分子药物为葡萄糖氧化酶和DNA酶;
所述包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒的制备方法包括以下步骤:将氯化铜、葡萄糖氧化酶、DNA酶在1mM水中充分混合并孵育30min,随后加入碳酸钠溶液超声5min,经离心分离即得碳酸铜矿化纳米粒。
2.一种权利要求1所述的包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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