KR101990503B1 - 핵산분해효소 저항성 dna-무기 복합 나노꽃의 제조방법 - Google Patents

핵산분해효소 저항성 dna-무기 복합 나노꽃의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자가 금속이온과 복합체를 형성하는 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법에 관한 것으로, 핵산을 이용하여 간단한 방식으로, 유해한 화학물질 없이 친환경적 조건에서 유, 무기 복합 나노꽃 구조물을 합성할 수 있으며, 이와 같이 제조된 핵산-무기 복합 나노꽃 구조물은 DNA 담지 효율이 우수하고, 핵산분해효소에 저항성이 있으며 크게 향상된 과산화효소 활성을 보이는 특성을 가지고 있기 때문에, 유전자 치료용 전달체 및 바이오 센싱 기술에 널리 활용될 수 있다.

Description

핵산분해효소 저항성 DNA-무기 복합 나노꽃의 제조방법{Method of Preparing Nuclease-Resistant DNA-Inorganic Hybrid Nanoflowers}
본 발명은 핵산분해효소 저항성 DNA-무기 복합 나노꽃의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자가 금속이온과 복합체를 형성하는 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법에 관한 것이다.
나노꽃(nanoflowers) 이라 불리는 꽃 모양의 나노 물질은 표면이 거칠고 넓은 표면적을 가지는 특성을 바탕으로 촉매, 전자 기술, 및 분석 화학을 비롯한 다양한 분야에서 주목을 받고 있다(A. Mohanty et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 5, 4962; J. Xie et al., ACS Nano 2008, 23, 2473; Z. Lin, Y et al., RSC Adv., 2014, 4, 13888). 최근, Zare 연구팀은 다양한 효소 및 단백질을 이용하여 상온 조건에서 유, 무기 복합 나노꽃을 합성하는데 성공하였으며, 이 복합 물질에 담지된 효소는 수용액에 녹아 있는 일반적인 효소와 비교하여 높은 활성, 안정성 및 내구성을 지닌다는 것을 발견하였다(J. Ge et al., Nanotechnol., 2012, 7, 428). 이러한 상승된 효소 활성은, 다양한 물질을 매우 민감하고 안정적으로 분석하는 시스템에 적용할 수 있으며, 현재까지 페놀, 과산화수소, 포도당의 검출을 위한 바이오센서 시스템이 개발되었다(L. Zhu et al., Chem. Asian. J., 2013, 8, 2358; Z. Lin et al., ACS. Appl. Mater. Inter., 2014, 6, 10775; J. Sun et al., Nanoscale, 2014, 6, 225).
나노꽃 구조를 형성하는 단백질은, 아마이드 결합 및 아민 그룹에 다양한 질소 원자를 포함하고 있으며, 이 부분이 구리 이온과의 배위 상호 작용(coordination interaction)을 통하여 복합체를 형성하여, 일차적인 나노입자의 합성을 유도하고 결과적으로 나노꽃 구조를 형성한다는 원리가 제안되었다(J. Ge, et al., Nat. Nanotechnol., 2012, 7, 428). 예로서, 소혈청 알부민(bovine serum albumin), 알파-락트알부민(α-lactalbumin), 라카아제(laccase), 탄산무수화효소(carbonic anhydrase), 리파아제(lipase)와 같은 다양한 단백질을 이용하여 유, 무기 복합 나노꽃을 합성할 수 있다는 것이 확인되었다(B.S. Batule et al., J. Nanomedicine, 2015, 10, 137). 상기 기술은 단백질을 활용한 새로운 나노꽃 구조 합성기술이라는 의미가 있으나, 다른 유기 생체 분자로의 확장은 발표되지 않았다.
이에, 본 발명자는 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산-무기 복합 나노꽃을 제조할 경우, 핵산을 이용하여 매우 간단하게 상온의 친환경적 조건에서 유, 무기 복합 나노꽃 구조물의 합성이 가능하며, 이와 같이 제조된 핵산-무기 복합 나노꽃이 낮은 세포독성을 지니며, 기존의 DNA 담지 기술과 비교하여 상당히 향상된 담지 효율(loading capacities)을 나타내고, 핵산분해효소(nuclease)에 높은 저항성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 유해한 환원제 등과 같은 화학물질을 첨가하지 않는 상온의 친환경적 조건에서 매우 간단하게 핵산-무기 복합 나노꽃 구조물을 합성하는 DNA-무기 복합 나노꽃의 제조방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 낮은 세포독성을 지니며, 높은 DNA 담지 효율(loading capacities)을 나타내고, 핵산분해효소(nuclease)에 대하여 높은 저항성을 지니는 핵산-무기 복합 나노꽃을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자가 금속이온과 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 핵산분해효소에 대해 저항성을 가지는 핵산-무기 복합 나노꽃을 제공한다.
본 발명은 상기 핵산-무기 복합 나노꽃을 포함하는 유전자 치료용 전달체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 핵산-무기 복합 나노꽃을 포함하는 바이오센서를 제공한다.
본 발명에 따른 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법은 핵산을 이용하여 유해한 환원제 등의 화학물질을 첨가하지 않고 상온의 친환경적 조건에서 매우 간단하게 핵산-무기 복합 나노꽃 구조물을 합성할 수 있는 효과가 있다. 이와 같이 제조된 핵산-무기 복합 나노꽃은 낮은 세포독성을 지니며, 기존의 DNA 담지 기술과 비교하여 상당히 향상된 95% 이상의 담지 효율(loading capacities)을 나타내고, 핵산분해효소(nuclease)에 높은 저항성을 지니는 효과가 있어, 유전자 치료용 전달체 및 표적 생체 물질을 고감도로 검출하기 위한 바이오 센서로의 활용가치가 높다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 DNA를 이용한 유, 무기 복합 나노꽃 구조물의 합성 과정(a) 및 시간에 따른 나노꽃 구조물의 형성 과정을 보여주는 SEM 사진(b)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 나노꽃 구조물 형성에 미치는 DNA의 농도에 따른 영향을 확인하는 SEM 사진이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 나노꽃 구조물의 형성에 미치는 DNA 염기서열 및 길이의 영향을 확인하는 SEM 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 핵산분해효소인 DNase I (A) 및 엑소뉴클리아제(exonuclease)　III 효소(B)를 이용하여 나노꽃 구조물에 담지된 DNA가 분해되는지를 확인한 전기영동 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 DNA-나노꽃 구조물의 세포 독성 실험결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 DNA-나노꽃 구조물의 과산화효소 활성을 확인한 결과 그래프이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자와 금속이온과 복합체를 형성함으로써 핵산분해효소에 대해 저항성을 가지고 24시간의 충분한 효소 반응 후에도 나노 구조물에 담지된 DNA가 안전하게 구조를 유지하는 핵산-무기 복합 나노꽃이 제조될 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자와 금속이온과 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하는 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서 상기 방법에 의해 제조된 핵산분해효소에 대해 저항성을 가지는 핵산-무기 복합 나노꽃에 관한 것이다.
본 발명은 단백질 기반의 나노꽃 구조물의 합성 원리를 바탕으로 또 다른 생체 고분자 물질인 핵산 역시 많은 아마이드 결합 및 아민 그룹을 포함하고 있다는 사실에 주목하였고, 단백질과 유사하게 꽃 모양의 나노 구조물의 합성을 유도할 것을 예상하였다. 이러한 예상을 바탕으로 실험을 진행한 결과, 핵산을 이용하여 매우 간단하게 상온의 친환경적 조건에서 유, 무기 복합 나노꽃 구조물의 합성이 가능하다는 것을 처음으로 발견하였다(K.S. Park, B.S. Batule, K.S. Kang, T.J. Park, M.I. Kim and H.G. Park, J. Mater. Chem. B, 2017, 5, 2231).
본 발명은 DNA를 단순히 연결고리로 사용하여 나노물질 합성의 형판으로만 활용하는 기존의 방식(D. Nykypanchuk et al., Nature, 2008, 451, 553)과 비교하여 다음과 같은 장점들을 가지고 있다: 1) 유해한 환원제 화학물질 없이 친환경에서 나노꽃 구조물의 합성이 가능하다; 2) 합성된 DNA 기반 나노꽃 구조물은 낮은 세포독성을 지닌다; 3) 꽃 구조물에 담지된 DNA는 기존의 DNA 담지 기술(K.E. Shopsowitz et al., Small, 2014, 10, 1623)과 비교하여 상당히 향상된 95%의 담지 효율(loading capacities)을 보인다; 4) 나노꽃 구조물에 담지된 DNA는 핵산분해효소(nuclease)에 높은 저항성을 지닌다.
본원발명에 의한 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 핵산-무기 복합 나노꽃에 관하여 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 상기 금속은 구리(Cu), 아연(Zn), 칼슘(Ca) 및 망간(Mn)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 구리이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 금속이온함유 화합물은 황산구리(CuSO4), 아세트산아연(Zn(CH3COO)2), 염화칼슘(CaCl2) 및 황산망간(MnSO4)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 황산구리를 사용하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원발명에 의한 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법에 있어서, 상온에서 60 내지 80시간 동안 반응시키고, 상기 핵산의 농도는 그 염기서열의 길이에 따라, 10pM 내지 100μM, 바람직하게는 10pM 내지 1μM일 수 있으며, 상기 핵산의 농도에 따라 핵산-무기 복합 나노꽃의 크기가 결정될 수 있다.
또한 본 발명에서는 상기 핵산-무기 복합 나노꽃이 표적 생체 물질을 고감도로 검출하기 위한 바이오 센싱 기술에 활용할 수 있을 뿐만 아니라, 세포 독성이 전혀 없어 유전자 치료용 전달체로도 활용될 수 있는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 또 다른 관점에서 상기 핵산-무기 복합 나노꽃을 포함하는 유전자 치료용 전달체 또는 바이오센서에 관한 것이다.
본 발명에 의하여 제조된 DNA-나노꽃 구조물은 전혀 세포 독성이 없으며(cell viability: 100%), 향후 유전자 치료용 전달체로 활용될 수 있다. 또한, DNA-나노꽃 구조물은 특유의 넓은 표면적으로 인해서 높은 과산화효소 활성을 나타내며, 더구나 DNA-나노꽃 구조물의 과산화효소 활성은 기존의 단백질 기반 나노꽃 구조물의 과산화효소 활성보다도 더 높은 활성을 가진다. 따라서, 본 발명에 의해서 합성되는 DNA 나노꽃 구조물은 향후 표적 생체 물질을 고감도로 검출하기 위한 바이오 센싱 기술에 널리 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1: 핵산분해효소 저항성 DNA-무기 복합 나노꽃의 제조
다양한 염기서열 및 길이를 가지는 DNA를 황산구리(copper sulfate)와 상온에서 3일간 반응시켜 DNA-무기 복합 나노꽃 구조물을 제조하였다.
도 1(a)은 DNA를 이용한 유, 무기 복합 나노꽃 구조물의 합성 과정을 보여준다. 다양한 염기서열 및 길이를 가지는 DNA를 황산구리(copper sulfate)와 상온에서 3일간 반응시키면 넓은 표면적을 지니는 나노꽃 구조물이 얻어진다. 합성 원리는 단백질과 유사하게 핵산에 존재하는 아마이드 결합 및 아민 그룹에서 질소 원자가 구리 이온과 복합체를 형성하고, 이를 통해 꽃 모양의 구조물이 합성된다. 도 1(b)는 시간에 따른 나노꽃 구조물의 형성 과정을 보여주는 SEM(scanning electron microscope) 사진이다. 도 1(b)에 나타낸 바와 같이, 반응 초기(2시간)에는 작은 꽃눈 모양을 형성하다가 시간이 지남(18시간)에 따라 꽃 모양이 형성되고 최종적으로 3일 후에는 넓은 표면적 비율(surface-to-volume ratio)을 가지는 완성된 꽃 모양의 구조물이 합성됨을 확인할 수 있었다. 이러한 DNA 기반 나노꽃 구조물 형성 과정은 단백질을 이용한 나노꽃 형성 과정과 유사하다(J. Ge et al., Nanotechnol., 2012, 7, 428).
실시예 2: DNA의 농도에 따른 DNA-무기 복합 나노꽃의 제조
DNA-무기 복합 나노꽃의 제조에 있어서, DNA 농도의 영향을 확인하였다. 도 2는 DNA의 농도(A: 0.05μM, B: 0.1μM, C: 0.25μM, D: 0.5μM, E: 1μM, F: 0μM)가 나노꽃 구조물 형성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험의 결과를 나타내는 SEM 사진이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, DNA 농도가 낮을 경우에는 평균 30μm 정도의 상대적으로 크기가 큰 꽃 구조물이 형성됨을 확인할 수 있었다(도 2의 A, B, C). 반면, DNA 농도가 높을 경우에는 평균 5μm 정도의 상대적으로 크기가 작은 나노꽃 구조물이 형성됨을 확인할 수 있었다(도 2의 D, E). 또한, 이러한 꽃 구조물은 DNA가 존재하는 경우에만 형성됨을 확인할 수 있었다(도 2의 F).
실시예 3: DNA 염기서열 및 길이에 따른 DNA-무기 복합 나노꽃의 제조
DNA-무기 복합 나노꽃의 제조에 있어서, DNA 염기서열 및 길이의 영향을 확인하였다. 도 3은 DNA 염기서열 및 길이가 나노꽃 구조물의 형성에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험의 결과를 나타내는 SEM 사진이다. 실험에 사용된 DNA 염기서열을 포함한 정보는 표 1에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 모든 DNA(A: dNTPs, B: Adenine-rich single-stranded (ss) DNA, C: Thymine-rich ssDNA, D: Guanine-rich ssDNA, E: Cytosine-rich ssDNA, F: 51-bp Adenine-Thymine double-stranded (ds) DNA, G: 51-bp Guanine-cytosine dsDNA, H: 200-bp PCR amplicon, I: 5420-bp plasmid DNA, J: 4857-kbp genomic DNA)는 평균 20-50㎛ 정도의 꽃 구조물을 형성함을 확인할 수 있었으며, 제작된 꽃 구조물의 DNA 담지 효율은 95% 이상임을 확인할 수 있었다(표 2). 여기서 DNA 담지 효율(encapsulation yield)은 초반에 넣어준 DNA 양 대비 나노꽃 구조물에 담지된 DNA의 비율로 정의된다. 또한, 담지된 DNA가 전체 나노꽃 구조물에서 차지하는 무게의 비율(weight percentage)은 7~13%로 기존의 단백질 기반 꽃 구조물과 유사한 값을 나타냄을 확인할 수 있었다(표 2, Lin, Y. Xiao et al., ACS. Appl. Mater. Inter., 2014, 6, 10775).
Figure 112017042776536-pat00001
Figure 112017042776536-pat00002
실시예 4: DNA-무기 복합 나노꽃의 응용 가능성 확인
도 4는 DNA-나노꽃 구조물의 응용 가능성을 확인하기 위하여 진행된 실험으로 제작된 DNA-나노꽃 구조물이 핵산분해효소에 대해 저항성을 가진다는 것을 보여주는 결과이다. 대표적인 핵산분해효소인 DNase I(A) 및 엑소뉴클레아제(exonuclease)　III 효소(B)를 이용하여 나노꽃 구조물에 담지된 DNA가 분해되는지를 확인해보았으며, 그 결과는 전기영동방법을 통하여 확인하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 자유롭게 존재하는 DNA는 핵산분해효소에 의해 완전히 분해됨을 확인할 수 있었다(lane 5: 반응 전 DNA, lane 6: DNAse I (A) 혹은 Exonuclease III (B) 효소와 30분간 반응한 DNA). 반면, 나노꽃 구조물에 담지된 DNA의 경우 두 종류의 핵산분해효소 모두에 저항성을 가지며 24시간의 충분한 효소 반응 후에도 나노 구조물에 담지된 DNA는 안전하게 구조를 유지함을 확인할 수 있었다(lane 1: 반응 전 DNA-나노꽃 구조물, lane 2: DNAse I (A) 혹은 Exonuclease III (B) 효소와 30분간 반응한 DNA-나노꽃 구조물, lane 3: DNAse I (A) 혹은 Exonuclease III (B) 효소와 6시간 동안 반응한 DNA-나노꽃 구조물, lane 4: DNAse I (A) 혹은 Exonuclease III (B) 효소와 24시간 동안 반응한 DNA-나노꽃 구조물).
다양한 농도의 DNA-나노꽃 구조물을 세포에 주입하고, 24시간 동안 배양 후에 세포에 미치는 독성을 확인하여 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, DNA-나노꽃 구조물은 전혀 세포 독성이 없다는 것(Cell viability: 100%)을 확인할 수 있었다. 이러한 우수한 특성을 바탕으로 본 DNA-나노꽃 구조물은 향후 유전자 치료용 전달체로 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
또한, 합성된 DNA-나노꽃 구조물의 과산화효소 활성을 확인하여 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, DNA가 없는 경우에는 황산구리 염으로부터 형성된 침전물이 매우 낮은 과산화효소 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6의 B). 반면, DNA와 황산구리 염의 반응을 통해 합성된 나노꽃 구조물은 특유의 넓은 표면적으로 인해서 높은 과산화효소 활성을 나타냄을 확인할 수 있었다(도 6의 A). 또한, DNA-나노꽃 구조물의 과산화효소 활성은, 기존의 단백질 기반 나노꽃 구조물(도 6의 C)의 과산화효소 활성보다도 더 높은 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 의해서 합성되는 DNA 나노꽃 구조물은 향후 표적 생체 물질을 고감도로 검출하기 위한 바이오 센싱 기술에 널리 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 핵산과 금속이온함유 화합물이 용해된 용액을 상온에서 반응시켜 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자와 금속이온이 20~50㎛의 크기를 갖는 복합체를 형성하고, 상기 복합체에서 핵산의 무게 비율이 7~13%이며, 상기 핵산의 농도에 반비례하여 상기 복합체의 크기가 결정되는 것을 특징으로 하는 핵산분해효소 저항성 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 DNA 또는 RNA인 것을 특징으로 하는 핵산분해효소 저항성 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 금속은 구리(Cu), 아연(Zn), 칼슘(Ca) 및 망간(Mn)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산분해효소 저항성 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 금속이온함유 화합물은 황산구리(CuSO4), 아세트산아연(Zn(CH3COO)2), 염화칼슘(CaCl2) 및 황산망간(MnSO4)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 핵산분해효소 저항성 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상온에서 60 내지 80시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 핵산분해효소 저항성 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 핵산의 농도는 그 염기서열의 길이에 따라 10pM 내지 1μM인 것을 특징으로 하는 핵산분해효소 저항성 핵산-무기 복합 나노꽃의 제조방법.
  7. 삭제
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조되고, 핵산에 존재하는 아마이드 결합 또는 아민 그룹 중의 질소원자와 금속이온이 형성한 20~50㎛의 크기를 갖는 복합체이며, 전체 나노꽃에서 핵산의 무게 비율이 7~13%인 것을 특징으로 하는 핵산분해효소에 대해 저항성을 가지는 핵산-무기 복합 나노꽃.
  9. 삭제
  10. 제8항의 핵산-무기 복합 나노꽃을 포함하는 유전자 치료용 전달체.
  11. 제8항의 핵산-무기 복합 나노꽃을 포함하는 바이오센서.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210078156A (ko) * 2019-12-18 2021-06-28 가천대학교 산학협력단 라케이즈 모사 활성을 지닌 dna-무기 나노 꽃을 이용한 페놀류 화합물 검출방법

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210138574A1 (en) 2019-11-08 2021-05-13 Lincoln Global, Inc. Plasma torch cutting system
CN113106137A (zh) * 2021-03-05 2021-07-13 华南理工大学 一种蛋白质-无机杂化纳米花及其制备方法
CN113249377B (zh) * 2021-06-29 2021-09-24 中国农业大学 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
CN115887672B (zh) * 2022-10-12 2024-02-02 湖南省肿瘤医院 包载生物大分子的碳酸铜矿化纳米粒及其制备方法与应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101029329B1 (ko) * 2008-11-26 2011-04-15 고려대학교 산학협력단 산화구리 나노플라워를 이용한 과산화수소 검출 센서
CN105602926A (zh) * 2016-01-27 2016-05-25 尹小英 一种拓朴异构酶ⅱ杂化纳米花的制备方法及应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Angew. Chem. Int. Ed. Vol. 53, Pages 5821-5826(공개일: 2014.)*
Journal of Nanobiotechnology, Vol. 13, Pages 54(공개일: 2015.)*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210078156A (ko) * 2019-12-18 2021-06-28 가천대학교 산학협력단 라케이즈 모사 활성을 지닌 dna-무기 나노 꽃을 이용한 페놀류 화합물 검출방법
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