CN113249377B - 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用 - Google Patents

一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113249377B
CN113249377B CN202110723186.3A CN202110723186A CN113249377B CN 113249377 B CN113249377 B CN 113249377B CN 202110723186 A CN202110723186 A CN 202110723186A CN 113249377 B CN113249377 B CN 113249377B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleic acid
nanoflower
double
stranded
concentration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110723186.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113249377A (zh
Inventor
许文涛
田晶晶
贺晓云
朱龙佼
朱丽叶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN202110974159.3A priority Critical patent/CN115537413A/zh
Priority to CN202110723186.3A priority patent/CN113249377B/zh
Publication of CN113249377A publication Critical patent/CN113249377A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113249377B publication Critical patent/CN113249377B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y15/00—Nanotechnology for interacting, sensing or actuating, e.g. quantum dots as markers in protein assays or molecular motors
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。利用oxyethyleneglycol bridge修饰引物通过PCR扩增获得的5’端带有粘性末端的扩增子，以此为模板实现双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%‑98%；进而通过调节双链功能核酸纯化子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控。此外，利用功能核酸纳米花优良的比表面积和核酸特异性，实现了功能核酸纳米花高效捕获单链核酸靶标。本发明调控核酸纳米材料形貌的方法简单、成本低廉，非常适用于单链核酸靶标的检测与生物医学应用。

Description

一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
技术领域
本发明属于生物纳米材料领域，具体涉及一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。
背景技术
核酸特有的沃森-克里克碱基配对特性，使其可作为构建各种纳米结构的元件。相比于传统纳米材料，核酸纳米材料具有序列可编程性、自动控制合成、稳定性高以及其本身的功能，从而广泛用于生物医疗、生物技术和纳米电化学中。
常见的核酸纳米结构如多面体、核酸纳米粒子、核酸纳米管、DNA折纸等，这些构建核酸纳米结构的方法均依赖于短的核酸链之间的沃森-克里克碱基配对，然而，这些方法也存在一些缺点，如需要对核酸链进行复杂的设计，需制备大量的核酸链，核酸链间的空间位阻导致其结构不紧密，切口的存在使其易被核酸酶降解，变性等条件会导致其结构的解离从而破坏纳米结构的完整性。因此，需要一种不依赖于沃森-克里克碱基配对作用，只需少量的不含有切口的核酸链来构建堆积紧密、多功能化的核酸纳米结构。
DNA纳米花是一种紧密堆积的非典型的层级的自组装结构，不依赖于沃森-克里克碱基配对，在无机焦磷酸镁的存在下，利用DNA链与焦磷酸镁之间的相互作用，通过DNA液体结晶化、各向异性的有序组装而形成高浓度的多聚体。紧密堆积的DNA纳米花可用于装载各种功能基团，如药物和成像物质等，纳米花的形貌大小对于其应用具有重要作用。因此，对于纳米花形貌的调控的研究十分重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用。
为了实现本发明的目的，利用oxyethyleneglycol bridge修饰引物通过PCR扩增获得的5’端带有粘性末端的扩增子，以此为模板实现双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%；进而通过调节双链功能核酸扩增子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控。此外，利用功能核酸纳米花优良的比表面积和核酸特异性，实现了功能核酸纳米花高效捕获单链核酸靶标。
第一方面，本发明提供一种双链功能核酸纳米花的组装方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，对所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板进行双链功能核酸纳米花的组装；
所述的化学修饰的核酸引物为上游引物1 SEQ ID NO:1（序列中n代表oxyethyleneglycol bridge）和下游引物1 SEQ ID NO:2（序列中n代表oxyethyleneglycolbridge）；
具体的，上游引物SEQ ID NO:1：
5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTT-oxyethyleneglycol bridge-TTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’；
具体的，下游引物SEQ ID NO:2：
5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTT-oxyethyleneglycol bridge-TTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’；
所述的化学修饰为oxyethyleneglycol bridge，具体结构为：
Figure 353357DEST_PATH_IMAGE001
所述纯化方法为去除PCR扩增体系中的蛋白质、盐等非PCR产物；
优选地，纯化方法采用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(DP204-02)对扩增产物进行纯化；
所述纯化子孵育是在30℃的金属浴中孵育18 h进行高效组装，其中孵育体系是159 μL ddH2O, 20 μL 10×PCR Buffer (Mg2+ plus)，17 μL Mg2+ (100 mM), 2 μL PPi(100 mM)，2 μL PCR纯化子。
随后，使用冷冻离心机于4℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清；加入20 μL去离子水充分洗涤，于4℃下12000 rpm/min离心30min，弃上清，用去离子水以上述方法洗涤两次后晾干过夜，通过扫描电镜观察双链功能核酸纳米花的形貌。
第二方面，本发明利用双链功能核酸纳米花对Tris-HCl buffer (pH 5.0)不耐受，将制备好的纳米花样品使用Tris-HCl buffer (pH 5.0)中进行溶解，建立双链功能核酸纳米花的核酸定量分析方法；
所述定量分析方法，首先使用10倍梯度稀释的纯化PCR扩增子(浓度为95.218 ng/μL)为扩增模板，进行real time PCR的定量分析, SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(FP205 天根生化科技(北京)有限公司)，PCR过程选用了25 μL的PCR扩增体系，组分如下：
Figure 252043DEST_PATH_IMAGE002
其中，使用的上游引物2 SEQ ID NO:3与下游引物2 SEQ ID NO:4的序列分别为：
上游引物SEQ ID NO:3：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’
下游引物SEQ ID NO:4：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’
实验得到的real time PCR的扩增曲线，并依据其Ct值与扩增模板的浓度之间的线性关系绘制出标准曲线：y = -4.553x + 16.507。
标准曲线绘制完毕后，即可定量分析纳米花对双链核酸的装载率。该过程使用双链功能核酸纳米花的Tris-HCl buffer (0.05 mM, pH 5.0)溶解物的10倍梯度稀释产物作为real time PCR的扩增模板，使用上游引物SEQ ID NO:3与下游引物SEQ ID NO:4作为real time PCR的扩增引物(PCR扩增体系同上)，进行real time PCR。通过测定的Ct值，带入上述标准曲线，计算得到双链功能核酸的浓度，进而计算得到纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。
第三方面，本发明提供一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，用所述PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过调控纯化子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控；
所述纯化子的浓度范围在1.00 pg/L~200 μg/L；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的纯化子浓度为：95.218 pg/L~95.218 μg/L；
所述Mg2+浓度范围在0.10~ 20mM；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的Mg2+浓度为：2.5~10 mM；
所述焦磷酸根浓度范围在0.01~5.00 mM；具体地，能够显著调控双链功能核酸纳米花的形貌的焦磷酸根浓度为：0.25~1.0 mM。
第四方面，本发明提供一种双链功能核酸纳米花的应用，将预先合成的双链功能核酸纳米花喷涂在硝酸纤维素膜上，然后通过侧流层析作用捕获特定的单链核酸；
所述单链核酸通过羧氨反应偶联标记在磁珠上；具体的，氨基修饰的核酸序列，其序列如SEQ ID NO:5所示，具体为：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGGGTGGTGGGTTTT-NH2-3’。
所述捕获方法是通过观察硝酸纤维素膜上是否有棕色的条带，判断功能核酸纳米花捕获磁珠偶联的单链核酸。
另一方面，本发明的双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法在纳米材料合成中的应用以及相应的双链功能核酸纳米花在核酸检测中的应用。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明利用oxyethyleneglycol bridge修饰的功能核酸引物进行PCR扩增，扩增后利用带有oxyethyleneglycol bridge修饰的PCR纯化子进行双链功能核酸纳米花的组装，且通过核酸定量分析方法，计算发现纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%；通过双链PCR纯化子浓度、金属离子浓度、焦磷酸根浓度，实现了双链功能核酸纳米花的形貌转换，为核酸纳米材料在检测领域的应用提供了借鉴。
1．本发明利用oxyethyleneglycol bridge修饰的功能核酸引物进行PCR扩增，其PCR纯化子可以实现双链功能核酸纳米花的组装。
2．本发明公开了一种双链功能核酸纳米花的高效定量组装方法，纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。
3．本发明通过调节双链PCR纯化子的浓度，有效调控了双链功能核酸纳米花可控组装的花瓣密集程度；且纯化子的浓度与纳米花的组装密集程度呈现负相关性。
4．本发明通过调节金属镁离子的浓度，有效调控了双链功能核酸纳米花的花状骨架结构；且镁离子的浓度与纳米花的花状骨架的清晰度呈现正相关性。
5．本发明通过调节焦磷酸根的浓度，有效调控了双链功能核酸纳米花的密集组装程度；且焦磷酸根的浓度与纳米花的密集组装程度呈现正相关性。
6．本发明将组装密集程度适中，形貌良好的功能核酸纳米花喷涂在侧流层析纸基上，证明纳米花能够有效捕获磁珠偶联的单链核酸靶标，为核酸纳米材料在检测领域的应用提供了借鉴。
附图说明
图1为双链功能核酸纳米花的扫描电镜图。(加速电压为10 kV；工作距离为9.6mm；利用SE2探测器探测；放大倍数为10980倍)。
图2为溶解后的双链功能核酸纳米花的扫描电镜图。(加速电压为10 kV；工作距离为7.8 mm；利用InLens探测器探测；放大倍数为10700倍)。
图3为PCR扩增子的real time PCR的扩增曲线。
图4为PCR扩增子的real time PCR的标准曲线。
图5为带有oxyethyleneglycol bridge化学修饰的双链PCR纯化子的浓度对双链功能核酸纳米花的形貌调控的电子显微镜观察结果。
图6为金属镁离子的浓度对双链功能核酸纳米花的形貌调控的电子显微镜观察结果。
图7为焦磷酸根的浓度对双链功能核酸纳米花的形貌调控的电子显微镜观察结果。
图8 为功能核酸纳米花喷涂在试纸上捕获磁性单链核酸的显色结果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1 双链功能核酸纳米花的可控组装
dNTPs、rTaq DNA聚合酶、10×PCR buffer购自TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒DP204-02购自天根生化科技（北京）有限公司, MgCl2·6H2O、K4P2O7溶液级别为分析纯。
培养沙门氏菌后，使用试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)对 细菌基因组DNA进行基因组提取，以沙门氏菌基因组作为扩增模板，上游引物SEQ ID NO:1与下游引物SEQID NO:2对基因组进行扩增。
其中，上游引物1 SEQ ID NO:1与下游引物1 SEQ ID NO:2的序列分别为：
上游引物1 SEQ ID NO:1：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTT-oxyethyleneglycolbridge-TTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’
下游引物1 SEQ ID NO:2：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGTT-oxyethyleneglycolbridge-TTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’；
且隔断引物中隔断物为oxyethyleneglycol bridge，其结构为：
Figure 667237DEST_PATH_IMAGE003
Figure 207940DEST_PATH_IMAGE004
扩增程序为：98℃ 5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，72℃10min，4℃降温。
双链PCR扩增子的产物纯化过程使用了50 μL的PCR扩增体系，使用天根生化科技(北京)有限公司试剂盒(DP204-02)对扩增产物进行纯化，随后使用nanodrop分析得到PCR纯化子的浓度为95.218 ng/μL。
双链功能核酸纳米花于30℃的金属浴中孵育18 h进行高效组装，体系组分如下：
Figure 320253DEST_PATH_IMAGE005
随后将样品置于4℃预冷的冷冻离心机中，12000 rpm离心30 min。仔细观察微量沉淀，缓慢、小心地吸净上清，保留沉淀，然后滴加40 μL ddH2O，涡旋振荡，再次于4℃预冷的冷冻离心机离心，12000 rpm离心30 min。以上洗涤过程重复两次，将样品置于30℃金属浴中过夜晾干。利用扫描电镜观察到纳米花的形貌，发现纳米如图1所示。
实施例2 双链功能核酸纳米花的核酸定量分析
由于双链功能核酸纳米花对Tris-HCl buffer (pH 5.0)不耐受，因此实验对双链功能核酸纳米花的溶解过程进行了形貌验证。将制备好的纳米花样品使用0.05 mM的Tris-HCl buffer (pH 5.0)在37℃的细胞培养箱中孵育24 h后，利用扫描电镜观察到纳米花的形貌，发现纳米花几乎消失，扫描电镜图见图2。即可以获得功能核酸纳米花的双链核酸。
接下来建立标准曲线。使用10倍梯度稀释的纯化PCR扩增子(浓度为95.218 ng/μL)为扩增模板，进行real time PCR的定量分析(天根生化科技(北京)有限公司,SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)(FP205))，PCR过程选用了25 μL的PCR扩增体系，组分如下：
Figure 124261DEST_PATH_IMAGE006
其中，使用的上游引物2 SEQ ID NO:3与下游引物2 SEQ ID NO:4的序列分别为：
上游引物2 SEQ ID NO:3：5’-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’
下游引物2 SEQ ID NO:4：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’
实验得到的real time PCR的扩增曲线见图3，并依据其Ct值与扩增模板的浓度之间的线性关系绘制出标准曲线：y = -4.553x + 16.507 (图4)。标准曲线绘制完毕后，即可定量分析纳米花对双链核酸的装载率。该过程使用双链功能核酸纳米花的Tris-HClbuffer (0.05 mM, pH 5.0)溶解物的10倍梯度稀释产物作为real time PCR的扩增模板，使用上游引物SEQ ID NO:3与下游引物SEQ ID NO:4作为real time PCR的扩增引物(PCR扩增体系同上)，进行real time PCR。通过测定的Ct值，带入上述标准曲线，计算得到双链功能核酸的浓度，进而计算得到纳米花对双链核酸的装载率高达86%-98%。
实施例3 双链功能核酸纳米花的形貌调控
首先用带有oxyethyleneglycol bridge化学修饰的双链PCR纯化子的浓度对核酸纳米花形貌调控的验证，即核酸纯化子的终浓度依次为95.218 μg/L，95.218 ng/L，95.218pg/L，然后与10 mM Mg2+，终浓度为1.0 mM的K4P2O7在30℃金属浴中孵育18h后，离心水洗，过夜晾干，使用Gemini SEM 300电镜进行拍照观察核酸纳米花的形貌。
具体的孵育体系如下：
Figure 322024DEST_PATH_IMAGE007
实验结果表明，在焦磷酸根浓度、金属离子种类和浓度一定时，随着核酸浓度的减小，核酸纳米花的粒径逐渐增大，且花瓣数随之增加（图5）。
其次，验证Mg2+浓度对核酸纳米花形貌的调控。固定K4P2O7的终浓度为1.0 mM，核酸纯化子的终浓度为原核酸纯化子稀释1000倍，即95.218 μg/L，改变金属离子的浓度：Mg2+浓度分别选取 2.5 mM，5mM，10 mM，分别于30℃金属浴孵育18h后，离心水洗，过夜晾干，使用Gemini SEM 300电镜进行拍照观察核酸纳米花的形貌。
具体的Mg2+孵育体系如下：
Figure 869680DEST_PATH_IMAGE008
实验结果表明，当Mg2+浓度为2.5 mM时，核酸纳米花的形状为海绵状球体，当Mg2+浓度依次为5mM，10 mM，核酸纳米花的形状为球体，10 mM时花状骨架更加明显（图6）。
最后，研究焦磷酸根浓度对核酸纳米花形貌的调控。
固定金属离子为Mg2+，终浓度为10 mM，核酸终浓度为95.218 μg/L，焦磷酸根浓度依次为0.25 mM、0.50 mM、1.0 mM，分别于30℃金属浴孵育18h后，离心水洗，过夜晾干，使用Gemini SEM 300电镜进行拍照观察核酸纳米花的形貌。
具体的焦磷酸孵育体系如下：
Figure 836499DEST_PATH_IMAGE009
实验结果表明，在金属离子种类和浓度、核酸浓度一定时，随着焦磷酸根浓度的增加，核酸纳米花的组装逐渐密集，花瓣数逐渐增加（图7）。
实施例4双链功能核酸纳米花用于捕获单链核酸
1. 单链核酸的磁珠偶联标记
（1）试剂配制：分别称取50mg的EDC与50mg的NHS，使用25mM的MES (2-(N-吗啉)乙磺酸，pH6.0) buffer溶解成终浓度为50 mg/mL的溶液，4℃避光储存，备用。
（2）磁珠洗涤：取50 μL的羧基修饰磁珠(10 mg/mL)，分别使用500 μL的25mM MESbuffer洗涤3次后，使用180 μL的MES buffer(25 mM)重悬；
（3）磁珠活化：200 μL活化体系，于37℃的金属浴中震荡活化1h；
Figure 76987DEST_PATH_IMAGE010
（4）磁珠洗涤：磁分离去除上清，分别使用500 μL的25mM MES buffer洗涤3次后，使用198 μL的MES buffer(25 mM)重悬,然后加入2 μL的氨基修饰核酸(100 μM)。其中，氨基修饰核酸的序列SEQ ID NO:5为：5’-GGGGGGAAGAGGGAAGGGGTGGTGGGTTTT-NH2-3’
（5）磁珠偶联：200 μL偶联体系，于室温下翻转震荡偶联3h以上；
（6）磁珠洗涤：磁分离去除上清，分别使用500mL的25mM MES buffer洗涤3次后，磁分离去除上清；
（7）磁珠重悬：使用50 μL的复溶液(20 nM Na3PO4·12H2O，5%BSA，0.25% Tween-20,10%蔗糖)将修饰后的磁珠重悬为10 mg/mL，4℃贮存一周后备用；
2. 纳米花的制备：
dNTPs、rTaq DNA聚合酶、10×PCR buffer购自TaKaRa公司，DNA纯化试剂盒DP204-02购自天根生化科技（北京）有限公司, MgCl2·6H2O、K4P2O7溶液为分析纯。
培养沙门氏菌后，使用细菌基因组DNA提取试剂盒进行基因组提取，以沙门氏菌基因组作为扩增模板，上游引物SEQ ID NO:6与下游引物SEQ ID NO:7对基因组进行扩增。
其中，上游引物3 SEQ ID NO:6（序列中n代表oxyethyleneglycol）与下游引物3SEQ ID NO:7（序列中n代表oxyethyleneglycol）的序列分别为：
上游引物3 SEQ ID NO:6：5’-ACCCACCACCCCTTCCCTCTTCCCCCCTT-oxyethyleneglycol bridge-TTGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’,
下游引物3 SEQ ID NO:7：5’-ACCCACCACCCCTTCCCTCTTCCCCCCTT-oxyethyleneglycol bridge-TTTCATCGCACCGTCAAAGGAACC-3’；
且隔断引物中隔断物为oxyethyleneglycol bridge，其结构为：
Figure 729423DEST_PATH_IMAGE011
双链PCR扩增子的产物纯化过程使用了50 μL的PCR扩增体系，使用普通DNA产物纯化试剂盒(DP204-02)对扩增产物进行纯化，随后使用nanodrop分析得到PCR纯化子的浓度为95.218 ng/μL。
双链功能核酸纳米花于30℃的金属浴中孵育18 h进行高效组装，体系组分如下：
Figure 80770DEST_PATH_IMAGE012
扩增程序为：98℃ 5min，95℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1min，40个循环，72℃10min，4℃降温。
随后将样品置于提前4℃预冷的冷冻离心机中，12000 rpm离心30 min。
蒸馏水洗涤：仔细观察微量沉淀，缓慢、小心地吸净上清，保留沉淀，滴加40 μLddH2O，涡旋振荡，再次于提前4℃预冷的冷冻离心机，12000 rpm离心30 min。洗涤后仔细观察微量沉淀，小心吸取上清，保留沉淀。以上洗涤过程重复两次后，将样品置于30℃金属浴中过夜晾干。
3. 双链功能核酸纳米花用于捕获单链核酸的验证
(1) 切纸器处理：将样品垫用切纸器切成20 mm×20 cm规格、将结合垫切成5 mm×20 cm规格，将吸水纸切成20 mm×20 cm规格作为吸收垫。
(2)结合垫的预处理：将结合垫浸于垫处理液（300mL的 50 mM的Borate BufferpH 8.0）中30 min，继而置于室温干燥过夜后存放于干燥环境中。
(3)划线机划线：将每份隔断纳米花样品溶解于20 μL的PBS buffer中(添加有0.25%浓度的海藻糖)，用试纸条划线仪以1 μL/cm的速度喷涂在硝酸纤维素膜（25 mm×30cm）上，将喷涂完检测线的硝酸纤维素膜于37℃的烘箱中干燥3 h，之后将其储存于4℃的冰箱中。
(4) PVC 底板组装：将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫均按照一定的叠加顺序组装于一个PVC背板（60 mm×30 cm）上，每部分之间留出2 mm的重叠宽度来保证溶液能够在层析试纸上流通顺畅。
(5) 切条机切条：用可编程切条器将组装好的核酸侧流层析传感器切成3 mm宽度的成品。
(6) 双链功能核酸纳米花用于捕获单链核酸的验证：将磁珠偶联的单链核酸滴加试纸条的结合垫上，将试纸条的样品垫竖直浸在running buffer（4×SSC+2% BSA+0.05%Tween-20）中，观察NC膜上是否有棕色的条带出现。
结果如图8所示，可以发现检测线出现棕色条带，这表明纳米花成功捕获了磁珠偶联的单链核酸。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
<130> S010210617028Y
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggggaaga gggaaggttn ttgtgaaatt atcgccacgt tcgggcaa 48
<210> 2
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggggggaaga gggaaggttn tttcatcgca ccgtcaaagg aacc 44
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaaattat cgccacgttc gggcaa 26
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatcgcacc gtcaaaggaa cc 22
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggggaaga gggaaggggt ggtgggtttt 30
<210> 6
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acccaccacc ccttccctct tccccccttn ttgtgaaatt atcgccacgt tcgggcaa 58
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acccaccacc ccttccctct tccccccttn tttcatcgca ccgtcaaagg aacc 54

Claims (4)

1.一种双链功能核酸纳米花的形貌调控方法，其特征在于，用化学修饰的核酸引物对基因组进行PCR扩增获得扩增子，将PCR扩增子进行纯化，获得纯化子，以所述纯化子为模板通过调控纯化子浓度、Mg2+浓度、焦磷酸根浓度，实现功能核酸纳米花的形貌调控；
所述纯化子的浓度范围在95.218 pg/L~95.218 μg/L；
所述Mg2+浓度范围在2.5~1.0 mM；
所述焦磷酸根浓度范围在0.25~1.0 mM；
所述基因组为沙门氏菌基因组；所述的化学修饰的核酸引物为上游引物SEQ ID NO:1和下游引物SEQ ID NO:2；
所述的化学修饰为oxyethyleneglycol bridge，具体结构为：
Figure 387184DEST_PATH_IMAGE001
。
2.如权利要求1所述的形貌调控方法，其特征在于，所述焦磷酸根为K4P2O7。
3.如权利要求1或2所述的形貌调控方法在纳米材料合成中的应用。
4.如权利要求1或2所述的形貌调控方法在核酸纳米材料形貌控制中的应用。
CN202110723186.3A 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用 Active CN113249377B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110974159.3A CN115537413A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
CN202110723186.3A CN113249377B (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110723186.3A CN113249377B (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110974159.3A Division CN115537413A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113249377A CN113249377A (zh) 2021-08-13
CN113249377B true CN113249377B (zh) 2021-09-24

Family

ID=77190001

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110723186.3A Active CN113249377B (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
CN202110974159.3A Pending CN115537413A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110974159.3A Pending CN115537413A (zh) 2021-06-29 2021-06-29 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN113249377B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114767660B (zh) * 2022-06-22 2022-09-02 中国农业大学 一种靶向协同降脂的纳米双药制备及应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105821132B (zh) * 2016-04-29 2019-04-16 江南大学 一种基于核酸外切酶和核酸探针的电化学检测特定单链dna浓度的方法
GB201620450D0 (en) * 2016-12-01 2017-01-18 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
KR101990503B1 (ko) * 2017-05-02 2019-06-18 한국과학기술원 핵산분해효소 저항성 dna-무기 복합 나노꽃의 제조방법
CN110507818B (zh) * 2018-05-21 2022-11-29 国家纳米科学中心 一种dna纳米花形复合结构及其制备方法和应用
CN111235234B (zh) * 2020-02-14 2022-11-25 江西师范大学 一种基于酶催化产物裂解二氧化锰纳米花@硫化镉核壳结构的光电化学检测马拉硫磷的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN115537413A (zh) 2022-12-30
CN113249377A (zh) 2021-08-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104313130B (zh) 一种高效富集微生物的功能化磁性纳米粒子及制备与应用
Lee et al. Repeated use of stable magnetic flocculant for efficient harvest of oleaginous Chlorella sp.
Xu et al. Transformation of the matrix structure of shrimp shells during bacterial deproteination and demineralization
CN107267369B (zh) 微生物浓集方法和装置
EP2414809B1 (en) Microorganism concentration process and device
CN113249377B (zh) 一种双链功能核酸纳米花的组装和形貌调控方法及其应用
CN102634068A (zh) 一种制备功能纳米颗粒/细菌纤维素复合膜的方法及其装置
He et al. Effect of pyrite, elemental sulfur and ferrous ions on EPS production by metal sulfide bioleaching microbes
CN103506093B (zh) 一种磁性双模板蛋白质分子印迹纳米粒子及其制备方法
EP2516984B1 (en) Microorganism concentration process and concentration agent for use therein
Ekelhof et al. Microalgal cultivation in porous substrate bioreactor for extracellular polysaccharide production
He et al. Biomineralization of iron phosphate nanoparticles in yeast cells
JP2013517768A (ja) 急速な病原体検出技術および装置
CN104209087B (zh) 一种用于样本快速前处理的单分散纳米磁珠及其制备方法
CN104857858A (zh) 一种抗污染膜材料的制备方法
CN106994333B (zh) 吸附重金属镉离子的胱胺改性生物炭的制备方法
JP2000014380A (ja) 菌体濃縮方法及び菌体濃縮試薬
CN104193012B (zh) 利用银纳米颗粒促进黄孢原毛平革菌去除重金属镉的方法
CN103907600B (zh) 一种氧化石墨烯复合龙脑的抗菌材料
JP6405013B1 (ja) 微生物を抑制するメンブレンフィルターの製造方法
CN107699511B (zh) 一株喜温酸硫杆状菌及其培养基和培养方法
CN115521895B (zh) 水溶性蛋白作为外泌体提取增强剂的应用及外泌体提取试剂
CN114717118B (zh) 一种载银硅藻材料及其制备方法和应用
CN113567206B (zh) 基于金属有机骨架纳米材料的膜蛋白及膜相关蛋白提取方法
WO2024073128A1 (en) Microfiltration device, method of preparing the same, method of separating biological material and a kit

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant