CN110507818B - 一种dna纳米花形复合结构及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种DNA纳米花形复合结构及其制备方法和应用,所述DNA纳米花形复合结构包括由单链DNA模板扩增形成的DNA纳米花形结构和与DNA纳米花形结构杂交的免疫刺激核酸片段;本发明通过巧妙地设计引物和模板序列,采用滚环复制的方法将模板DNA扩增形成纳米花形,并创造性地将pH响应的i‑motif基序融入杂交位点来实现免疫刺激核酸序列的杂交与酸响应释放,优化反应条件,最终成功制备该复合结构;本发明提供的复合结构能够作为载体,装载免疫刺激核酸片段高效运输至免疫细胞内部,通过响应性释放免疫刺激核酸片段,激活免疫细胞,为肿瘤免疫治疗提供一种强有力的新型佐剂材料,具有广阔的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及纳米药物技术领域,尤其涉及一种DNA纳米花形复合结构及其制备方法和应用。
背景技术
对于恶性肿瘤的发生和转移,现在普遍认为与机体免疫耐受机制有关。尽管机体存在多种免疫监视机制,恶性细胞由于具有逃逸免疫监视的能力,则有可能发生并持续发展形成肿瘤。肿瘤免疫治疗则是通过刺激病人免疫系统,用以攻击自身肿瘤细胞的一种疗法。对比与传统高损伤的手术治疗和放化疗,肿瘤免疫治疗效果较为明显,副作用很小,目前已在临床上作为恶性肿瘤的辅助治疗手段。
在众多免疫疗法所使用的药物中,具有代表性的是一类核酸类免疫激动剂,如双链RNA序列(dsRNA),聚肌苷酸多聚胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,poly I:C),胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸的脱氧寡核苷酸(CpG ODN)等,通常在免疫治疗临床试验研究中作为疫苗佐剂激活免疫系统。其中CpG序列是一段特定单链DNA序列,通常存在于细菌内,在动物体内非常罕见。CpG核酸序列利用了动物体防御细菌入侵的一种机制,可以在体内引起强烈的免疫反应。哺乳动物免疫细胞内体表面具有Toll样受体9(Toll-like receptor9,TLR9),能够识别并结合非甲基化的CpG序列,从而激活TLR9介导的先天免疫(Innateimmunity)信号通路,引起一系列细胞因子(如白介素6,白介素12等)的释放。尽管CpG序列作为免疫治疗佐剂具有相当的应用潜力,但仍面临着诸多挑战。其中最大的问题是单链CpG序列由于其分子量较小且带有负电荷,很难直接穿越细胞膜到达细胞内体,且在体内会被DNA酶迅速降解。选择一种良好的纳米载体进行CpG序列的高效可控运输仍是现在免疫治疗面临的瓶颈问题之一。
结构DNA纳米技术自上世纪八十年代提出以来,已经过几十年的蓬勃发展,目前研究者已经可以应用多种DNA自组装技术构建多种形貌可控、生物相容性好、易于功能化修饰的纳米结构,作为多种生物应用的平台。其中利用DNA纳米结构作为药物运输载体的工作已有报道,其中滚环复制(Rolling circle amplification,RCA)是一类高效的等温扩增过程,在相应的聚合酶与引物序列作用下,可扩增环状模板序列得到长片段的核酸产物并用于多种功能结构自组装。这些超分子的纳米结构可用于核酸、蛋白质和药物小分子等功能成分的装载,实现其对靶器官、靶细胞的安全、高效输送。
CN104689325A提供了一种负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒,由壳聚糖和寡聚脱氧核苷酸组成,所述壳聚糖和寡聚脱氧核苷酸的质量比为(10-30):1,所述寡聚脱氧核苷酸为未甲基化的DNA序列,所述DNA序列包括一个5’-ATCGAT-3’基序,一个5’-GGCGTT-3’基序,两个5’-GTCGTC-3’基序,两个5’-AACGTT-3’基序。该负载寡聚脱氧核苷酸的壳聚糖纳米粒不仅能刺激机体产生较强的免疫效应,还能提高CpG-ODN在体内的稳定性,延长CpG-ODN在体内的半衰期。CN102309457A涉及一种包裹药理活性物质的核酸纳米粒的制备方法,该发明利用DNA滚环复制原理制备具有大量重复序列的核酸球形或者类球形结构,然后将药理活性物质包入,形成纳米粒,用于体内递送。CN200410040209.7提供了一段能刺激动物免疫细胞增殖活性的CpG寡聚核苷酸序列,并提供了利用壳聚糖包装此段CpG寡聚核苷酸以制备抗感染DNA纳米颗粒制剂的方法,公开了该CpG纳米颗粒作为新型抗感染分子免疫增强剂的应用技术。该方法包括壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸,将此制备DNA纳米颗粒制剂以肌肉注射或口服的方式单独或协同疫苗免疫实验动物,检测实验动物的细胞和体液免疫指标,提供了壳聚糖纳米颗粒包装CpG寡聚核苷酸作为新型动物抗感染分子免疫增强剂的应用技术。CN106824107A涉及一种核酸自组装复合纳米花颗粒材料及其制备方法和应用,所述自组装复合材料为收缩后的核酸与Mg2P2O7共结晶形成的纳米花颗粒,所述颗粒的粒径小于500nm;该发明的自组装复合材料为具有高比表面积的纳米花结构,该DNA纳米花自组装复合材料的产率接近100%,颗粒在500nm以下,利于后期的利用。但上述现有技术的制备工艺繁琐,得到的材料不易进行修饰,相容性和安全性都不高,有待进一步优化。
因此,将结构DNA纳米技术与免疫刺激核酸序列相结合,构建一种高效安全的新型复合材料,具有巨大的生物应用潜力。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求,本发明提供一种DNA纳米花形复合结构及其制备方法和应用,所述复合结构为装载有免疫刺激核酸片段的DNA纳米花形结构,具有良好的生物相容性和安全性,尺寸形貌稳定可控,易于进行各种功能化修饰,利用具有pH响应功能DNA“锁钥”结构,在微酸性环境下发生变构从而打开,释放出CpG序列与内体膜上TLR9受体结合,引起多种细胞因子分泌,免疫刺激效率高,具有巨大的生物应用潜力。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供一种DNA纳米花形复合结构,所述DNA纳米花形复合结构包括由单链DNA模板形成的DNA纳米花形结构和与DNA纳米花形结构杂交的免疫刺激核酸片段。
本发明中,发明人在长期科研实践过程中,深入研究DNA纳米结构和生物免疫治疗之间的关系,为探索高效便捷的肿瘤免疫治疗药物,将DNA纳米结构与免疫刺激核酸片段相结合,发挥纳米花形结构的良好生物相容性和安全性的优点,优化制备工艺,经过复杂的探索和实验验证,最终得到所述DNA纳米花形复合结构。设计制备复合结构时,用i-motif及其互补链构成的“锁”可以装载目的片段,在靶点(免疫细胞溶酶体的微酸环境)内,这个双链的“锁”打开,目的片段就脱落下来行使功能。DNA纳米花形复合结构在进入巨噬细胞后,在富含Toll样受体的酸性细胞器中响应性释放免疫刺激核酸片段,直接与免疫刺激片段相应的受体结合,有效活化免疫细胞,引起一系列细胞因子表达,有效激活免疫系统功能,可作为纳米免疫佐剂用于肿瘤治疗中。
优选地,所述免疫刺激核酸片段的结构包括CpG核酸序列片段、粘性末端的双链RNA序列或具有核酸序列修饰的免疫刺激小分子药物中的任意一种或至少两种的组合。
优选地,所述单链DNA模板为5’端磷酸化修饰的单链DNA。
优选地,所述单链DNA模板的长度为90-200nt,例如可以是90nt、98nt、100nt、120nt、140nt、160nt、180nt或200nt,所述单链DNA模板经过预先设计并环化后,经滚环复制扩增获得长单链,具有杂交装载免疫刺激序列的位点;环状模板在滚环复制形成长单链过程中,加入免疫刺激核酸片段在滚环复制同时进行杂交组装,形成带有免疫刺激核酸片段的DNA纳米花形复合结构。
例如模板1的核苷酸序列为SEQ ID NO.1:
例如模板2的核苷酸序列为SEQ ID NO.2:
具体如下:
优选地,所述单链DNA模板具有与引物杂交的部分,能够与引物杂交形成环状,在T4连接酶作用下闭合磷酸骨架,形成没有缺口的环状DNA模板;环状DNA模板与引物的杂交体在phi29DNA聚合酶作用下经过等温扩增,能够形成长DNA单链产物,该DNA单链产物序列完全与模板链互补,具有与免疫刺激核酸片段的杂交位点互补序列。
优选地,所述单链DNA模板链包含具有酸响应效果序列的互补序列,经phi29酶扩增后得到的长单链则具有酸响应效果序列,能够与所述免疫刺激核酸片段的杂交位点包括具有微酸响应的DNA基序。
优选地,所述具有微酸响应的DNA基序为i-motif,所述i-motif的核苷酸序列为SEQ ID NO.3,具体序列如下:
CCCTAACCCTAACCCTAACCC.
i-motif序列是一段含有许多的C碱基的特定DNA序列,中性环境下,能够与互补链杂交形成双链,在微酸环境下(pH<6.5),C碱基被H+稳定,形成四连体结构。
即单链DNA模板链包含有其互补序列GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG(即前述模板1中加粗部分标记序列),经phi29酶扩增后得到的长单链含有多个i-motif基序。
优选地,所述免疫刺激核酸片段的结构,包括CpG核酸序列片段、粘性末端的双链RNA序列或具有核酸序列修饰的免疫刺激小分子药物中的任意一种或至少两种的组合。
所述具有pH响应性释放的免疫功能核酸序列片段例如可以是SEQ ID NO.4,具体序列如下:
SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5加粗序列为杂交部分,Angew.Chem.Int.Edit.2003,42,5734-5736.首次报道,黑色未加粗序列为具有免疫刺激功能的CpG序列,本发明首次将这个设计用于构建具有免疫刺激效果的DNA复合纳米花并用来控制释放;选用与长单链产物互补的杂交序列,还可用类似方法装载其他免疫刺激功能片段,如其他种类的CpG片段、OVA多肽、双链RNA序列等,还可进行荧光团标记;OVA也是一种免疫刺激剂,OVA多肽偶联DNA,以此代替CpG核酸片段,这样可根据需要构建多种DNA复合纳米花免疫药物。
单链DNA模板在phi29酶作用下形成单链产物,能与一段设计序列杂交,这个设计序列分为两个部分,一部分是起到免疫刺激功能核酸片段CpG,一段是与扩增产物杂交的部分,这部分基本与扩增产物互补,有两个碱基的错配(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5加下划线部分),微酸环境更容易释放下来。
优选地,所述杂交位点形成pH响应性锁匙结构。
所述锁钥结构在中性pH值时和微酸性pH值时响应型变构,具体地,在中性pH值时免疫核酸片段可稳定杂交;在免疫核酸片段起效的微酸性细胞器内,则发生变构释放出免疫核酸片段,激活下游信号通路。
其中pH响应性释放的免疫功能核酸序列片段的加粗部分与phi29酶扩增后得到的长单链中i-motif基序基本互补配对,加下划线部分为两个错配位点,在pH 7.5的phi29酶扩增反应缓冲液中,核酸序列片段能够与扩增的长DNA单链产物杂交,共组装形成DNA纳米花复合结构,并在生理环境中保持稳定;当该纳米颗粒运输至免疫细胞内体时,在微酸性细胞器中pH<6.5,DNA纳米花结构中的i-motif基序变为四连体构象,“锁钥”结构在微酸性环境下发生变构从而打开,释放出的CpG序列与内体膜上TLR9受体结合,引起多种细胞因子分泌,激活下游信号通路。
优选地,所述DNA纳米花形复合结构的直径为550-1500nm,例如可以是550nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm。
优选地,所述DNA纳米花形复合结构呈球形颗粒外观,内部具有层叠花瓣形片层。
第二方面,本发明提供一种制备如第一方面所述的DNA纳米花形复合结构的方法,包括如下步骤:
(1)设计单链DNA模板和引物,进行反应使模板链闭合成环状链;
(2)以步骤(1)得到的环状链作为模板,进行滚环复制,实现长单链等温扩增,形成纳米花形结构;
(3)在步骤(2)所述环状链形成长单链的过程中,加入免疫刺激核酸片段进行杂交,形成所述的DNA纳米花形复合结构。
优选地,步骤(1)所述反应的酶为DNA连接酶,优选为T4DNA连接酶。
具体地,加入引物链与5’端磷酸化的模板互补,使其环化,利用T4DNA连接酶修复其磷酸骨架缺口,是模板链最终闭合成完整的环。
优选地,步骤(2)所述滚环复制的酶为DNA聚合酶,优选为phi29DNA聚合酶。
优选地,步骤(2)所述等温扩增的时间为2-24h,例如可以是2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h或24h,温度为25-35℃,例如可以是25℃、27℃、29℃、30℃、31℃、33℃或35℃。
所述引物的核苷酸序列为SEQ ID NO.6;具体如下:
TCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAG.
作为优选技术方案,一种制备如第一方面所述的DNA纳米复合机结构,具体包括如下步骤:
(1)设计单链DNA模板和引物,加入T4DNA连接酶进行反应使模板链闭合成环状链;
(2)以步骤(1)得到的环状链作为模板,在引物和phi29DNA聚合酶作用下进行滚环复制,实现长单链25-35℃等温扩增2-24h,形成纳米花形结构;
(3)在步骤(2)所述环状链形成长单链25-35℃等温扩增2-24h的过程中,加入免疫刺激核酸片段进行杂交,之后65℃10min变性使DNA聚合酶失活,之后缓慢退火降温至4℃,形成所述的DNA纳米花形复合结构。
本发明中,所述制备方法具体为将预先设计的90-200碱基的单链DNA模板环化,在聚合酶作用下等温复制扩增,杂交单链免疫刺激核酸序列,将其包裹组装进入DNA纳米结构内部,形成带有免疫刺激核酸序列修饰的DNA纳米花型自组装药物;同时通过序列设计,纳米花型结构与免疫刺激核酸片段的杂交是一种响应性的锁钥结构,在中性pH值时可形成稳定双链,从而杂交免疫刺激核酸片段;在免疫核酸片段起效的微酸性细胞器内,则发生变构释放出免疫核酸片段,有效增加细胞对于免疫刺激核酸片段的摄取,激活下游信号通路;DNA纳米花形复合结构在进入巨噬细胞后,在富含Toll样受体的酸性细胞器中响应性释放免疫刺激核酸片段,直接与免疫刺激片段相应的受体结合,有效活化免疫细胞,引起一系列细胞因子表达,有效激活免疫系统功能,可作为纳米免疫佐剂用于肿瘤治疗中。
第三方面,本发明提供一种如第一方面所述的DNA纳米花形复合结构用于制备肿瘤免疫佐剂的用途,所述肿瘤并不限于乳腺癌肿瘤和黑色素瘤,抗肿瘤类型具有广谱性。
该DNA纳米花形复合结构能够作为一种纳米容器,将其中装载的免疫刺激核酸片段高效运输至免疫细胞内部,在位点特定信号诱导下,免疫刺激核酸片段释放,高效激活免疫细胞,并引起下游细胞因子表达,为肿瘤免疫治疗提供了一种强有力的新型佐剂材料。
本发明的技术方案简述如下:本发明将一条长度为90-200碱基、5’端磷酸化的DNA单链(模板链)与一条长度为20-50碱基的引物互补杂交,DNA长单链在引物作用下形成有缺口的环,在T4DNA连接酶作用下将环的缺口封闭,形成闭合的DNA环状模板与引物杂交的复合体;在phi29DNA聚合酶作用下进行等温DNA扩增,扩增产生的DNA长单链产物与加入的免疫刺激核酸片段杂交,在2-24h滚环扩增反应之后形成装载免疫刺激核酸片段(如CpG序列)的DNA纳米花形复合结构;其中通过DNA模板链与免疫刺激核酸片段杂交部分的序列设计,可将具有微酸响应的DNA基序i-motif融入其中,使得反应缓冲条件(pH7.5)和生理环境(pH7.2-7.4)时,免疫核酸片段稳定装载于DNA纳米花形结构,在免疫细胞酸性细胞器(pH<6.5)则响应性脱落,与其受体结合而引起下游免疫应答。利用透射电镜、共聚焦荧光显微镜对于自组装DNA纳米花形复合结构进行表征;在细胞水平,研究携带免疫刺激片段的DNA纳米花形结构的细胞摄入和定位;在功能检测方面,研究该纳米药物对于免疫信号通路的激活,细胞因子分泌等。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明提供的DNA纳米花形复合结构作为载体,通过DNA模板自组装为纳米框架,DNA分子易于化学修饰,由其作为基元构建得到的纳米结构具有良好的生物相容性和安全性,尺寸形貌稳定可控,易于进行各种功能化修饰,具有巨大的生物应用潜力;利用DNA滚环复制的方法合成花形纳米结构,可以实现结构的可控、可预测性、可响应性,实现目标分子在纳米结构中的大量装载、可控定位及响应性释放;装载免疫刺激片段的DNA纳米花形结构有望作为一种免疫佐剂用于临床肿瘤免疫治疗,具有良好的药物开发潜力。
附图说明
图1是DNA复合纳米花形结构的构建及pH响应性释放示意图;
图2是本发明提供经反应8h、10h、12h DNA纳米花形复合结构的透射电镜形貌观察图,其中,图2(A)为反应8h的观察图,图2(B)为反应10h的观察图,图2(C)为反应12h的观察图,比例尺为500nm,嵌入图比例尺为100nm;
图3是本发明提供的DNA纳米花形复合结构在微酸环境下对装载的免疫刺激核酸片段的响应性释放的结果图,图3(A)为不同pH条件缓冲液孵育0h样品照片,图3(B)为24h孵育照片,图3(C)为两种pH条件下带有荧光修饰的CpG核酸链从DNA纳米花型自组装药物释放曲线图;
图4是本发明提供的DNA纳米花型自组装药物在活细胞内的运输图,图4(A)为游离CpG序列和DNA纳米花形自组装药物孵育Raw264.7细胞4h后的流式细胞分析图,图4(B)为游离CpG序列和DNA纳米花形自组装药物孵育Raw264.7细胞4h后的共聚焦荧光显微镜分析图;
图5是本发明提供的DNA纳米花型自组装药物对于巨噬细胞Raw264.7细胞的免疫刺激作用,图5(A)为肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放结果图,图5(B)为干扰素γ(IFN-γ)释放结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案,但本发明并非局限在实施例范围内。对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂厂商购买得到的。下述实施例中的定量实验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
本发明所用仪器和材料如下:
器材:Mastercycler Pro梯度PCR仪(Eppendorf,德国),5810R小型高速离心机(Eppendorf,德国),UV-2450紫外-可见分光光度计(岛津,日本),全波长酶标仪(TECAN,瑞士),共聚焦荧光显微镜(ZEISS,德国)。
原料:短链核苷酸序列(引物链、模板链、释放链等)购自生工生物工程(上海)有限公司,T4DNA连接酶、phi 29DNA聚合酶及相应配套试剂购自New England Biolabs公司。
试剂:实验中所用的缓冲溶液有TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)和PBS缓冲溶液(pH7.4),其中,1×TAE/Mg2+缓冲溶液(pH 8.3)的组分为:4×10-2mol L-1Tris,2×10-2mol L-1乙酸,2.0×10-3mol L-1EDTA和1.25×10-2mol L-1醋酸镁;1×PBS缓冲溶液(pH 7.4)的组成为:136.9×10-3mol L-1(8.00g L-1)的NaCl,2.68×10-3mol L-1(0.20g L-1)的KCl,9.75×10-3mol L-1(1.56g L-1)的Na2HPO4·H2O和1.47×10-3mol L-1(0.20g L-1)的KH2PO4;
这些缓冲溶液所用的试剂均为分析纯,购自Sigma-Aldrich公司,细胞因子分泌实验所使用的试剂盒购自ebioscience公司。
细胞:Raw264.7小鼠巨噬细胞系购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。
培养基:R1640培养基,添加10%胎牛血清,细胞接种于100mm2培养皿中,置于5%CO2培养箱,37℃培养,当细胞生长至融合度80%左右时传代;所用培养基和胎牛血清购自ThermoFisher Scientific公司。
实施例1 DNA纳米花形复合结构的制备
本实施例中所用到的DNA序列如下:
1、模板与引物的杂交,模板的环化
等比例5’端磷酸化修饰DNA模板链1与引物链(各10μM,2.8μL)、10×T4Buffer(4μL)、去离子水29.4μL,混合构成40μL的溶液体系,置于程序降温仪中变性(95℃加热5min)后,从95℃缓慢退火降温至4℃,每1℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为1min;
上述步骤退火过程结束后,在40μL的溶液体系中加入T4DNA连接酶(400,000units/ml,1μL)环化模板链,条件为24℃连接12h,之后65℃10min酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
2、等温复制与药物序列杂交
环化模板-引物(25.8μL,697nM),10×Phi29Buffer(6μL),dNTP(2.5mM,12μL),100×BSA(1.2μL),Phi29DNA聚合酶(10000units/ml,5μL),CpG序列(100μM,6μL),去离子水4μL混合构成60μL的溶液体系;将溶液体系震荡混匀后30℃10h等温扩增同时杂交药物序列,之后65℃10min变性使DNA聚合酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
实施例2 DNA纳米花形复合结构的制备
本实施例中所用到的DNA序列如下:
1、模板与引物的杂交,模板的环化
等比例5’端磷酸化修饰DNA模板链1与引物链(10μM,2.8μL)、10×T4Buffer(4μL)、去离子水29.4μL,混合构成40μL的溶液体系,置于程序降温仪中变性(95℃加热5min)后,从95℃缓慢退火降温至4℃,每1℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为1min;上述步骤退火过程结束后,在40μL的溶液体系中加入1μL(20000units 50μL)的T4DNA连接酶环化模板链,条件为24℃连接12h,之后65℃10min酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
2、等温复制与药物序列杂交
环化模板-引物(25.8μL,697nM),10×Phi29Buffer(6μL),dNTP(2.5mM,12μL),100×BSA(1.2μL),Phi29DNA聚合酶(10,000units/ml,5μL),荧光修饰的CpG序列(100μM,6μL),去离子水4μL混合构成60μL的溶液体系;将溶液体系震荡混匀后30℃10h等温扩增同时杂交药物序列,之后65℃10min变性使DNA聚合酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
实施例3 DNA纳米花形复合结构的制备
本实施例中所用到的DNA序列如下:
1、模板与引物的杂交,模板的环化
等比例5’端磷酸化修饰DNA模板链2与引物链(10μM,2.8μL)、10×T4Buffer(4μL)、去离子水29.4μL,混合构成40μL的溶液体系,置于程序降温仪中变性(95℃加热5min)后,从95℃缓慢退火降温至4℃,每1℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为1min;
上述步骤退火过程结束后,在40μL的溶液体系中加入1μL(20000units 50μL)的T4DNA连接酶环化模板链,条件为24℃连接12h,之后65℃10min酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
2、等温复制与药物序列杂交
环化模板-引物(25.8μL,697nM),10×Phi29Buffer(6μL),dNTP(2.5mM,12μL),100×BSA(1.2μL),Phi29DNA聚合酶(10,000units/ml,5μL),荧光修饰的CpG序列(100μM,6μL),去离子水4μL混合构成60μL的溶液体系。将溶液体系震荡混匀后30℃10h等温扩增同时杂交药物序列,之后65℃10min变性使DNA聚合酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
实施例4 DNA纳米花形复合结构的制备
本实施例中所用到的DNA序列如下:
1、模板与引物的杂交,模板的环化
等比例5’端磷酸化修饰DNA模板链2与引物链(10μM,2.8μL)、10×T4Buffer(4μL)、去离子水29.4μL,混合构成40μL的溶液体系,置于程序降温仪中变性(95℃加热5min)后,从95℃缓慢退火降温至4℃,每1℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为1min;上述步骤退火过程结束后,在40μL的溶液体系中加入1μL(20000units 50μL)的T4DNA连接酶环化模板链,条件为24℃连接12h,之后65℃10min酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min。
2、等温复制与药物序列杂交
环化模板-引物(25.8μL,697nM),10×Phi29Buffer(6μL),dNTP(2.5mM,12μL),100×BSA(1.2μL),Phi29DNA聚合酶(10,000units/ml,5μL),荧光修饰的CpG序列(100μM,6μL),OVA多肽-DNA序列(100μM,4μL),混合构成60μL的溶液体系;将溶液体系震荡混匀后30℃10h等温扩增同时杂交药物序列,之后65℃10min变性使DNA聚合酶失活,之后缓慢退火降温至4℃;每2℃为一个梯度,每个梯度停留时间均为2min,OVA多肽序列SIINFEKL可杂交在模板扩增后长链AAAAAAAAAAAAAAA碱基序列处,OVA多肽连接的碱基序列为SED ID NO.7,具体如下:
GCATCTCAGGATAGCTTTTTTTTTTTTTTT.
实施例5 DNA纳米花形复合结构形貌表征
将实施例2制备的DNA纳米花形复合结构加入200μL的磷酸盐缓冲液,震荡混匀,离心吸弃上清,清洗2次;最后将离心产物使用60μL的磷酸盐缓冲液重悬混匀,超声30s,使离心管里沉淀全部溶解分散后制样;之后取样品10μL,滴加到铜网上,沉积10min,将铜网上的多余液体吸弃,利用透射电子显微镜观察DNA纳米花型自组装药物的形貌,结果见图2(A)-图2(C)所示;
由图2(A)-图2(C)可知:根据前述实验方法,能够稳定形成DNA复合纳米花形结构,随着反应时间的不同,可以得到不同的尺寸。
后续实施例均采用实施例2制备得到的DNA纳米花形复合结构。
实施例6 DNA纳米花形复合结构酸响应释放
将等量(300nM,60μL)实施例2制备的DNA纳米花形复合结构(CpG片段使用荧光标记)经过离心重悬步骤将缓冲液置换,分别置于100μL pH5和pH7的磷酸盐缓冲液中,每个样品准备三个重复;将样品充分震荡分散后,37℃孵育,分别于0h,3h,8h,12h,24h,48h数个时间点离心后测定上清液荧光值,结果如图3(A)-图3(C)所示;
由图3(A)-图3(C)可知,新鲜制备的DNA纳米花形复合结构由于装载了带有Cy5荧光修饰的CpG序列,离心清洗后,外观呈蓝色沉淀;在微酸性环境孵育则导致DNA复合纳米花结构中i-motif形成四连体结构,“锁钥”控制部分被发生变构,带有Cy5染料荧光修饰的CpG核酸序列被释放下来;随着孵育时间延长,上清液中的荧光值增加,而离心得到的DNA复合纳米花结构沉淀则逐渐变为白色。
实施例7 DNA纳米花形复合结构细胞摄入
将小鼠巨噬细胞RAW264.7悬液浓度调整为5×104个/孔,接种6孔板;将6孔板放入37℃培养箱培养过夜,待细胞贴壁后,吸出培养基,分别加入含药培养基:其中含药培养基分别为终浓度(50nM)CpG的DNA纳米花形复合结构和等量未加载体的CpG单链(CpG单链为Cy5荧光修饰),每个实验组设置3个复孔,另外设置一组仅完全培养基孵育细胞的空白对照。将加入药物结构处理的RAW264.7细胞继续孵育4h;之后,吸出含有药物的培养基,对细胞进行消化重悬,用磷酸盐缓冲液清洗3次,清洗去掉游离荧光CpG链及培养基;利用流式细胞仪检测RAW264.7细胞的荧光强度。
将小鼠巨噬细胞RAW264.7按照细胞悬液浓度为5×104个/mL接种于共聚焦小皿(35mm2)中,过夜培养后,待细胞贴壁后,吸出培养基,分别加入含药培养基:其中含药培养基分别为终浓度50nM CpG的DNA纳米花形复合结构和等量未加载体的CpG单链(CpG单链为Cy5荧光修饰),每个实验组设置3个重复,另外设置一组仅完全培养基孵育细胞的空白对照;将加入药物结构处理的RAW264.7细胞继续孵育4h;将共聚焦小皿取出,使用细胞核染料(Hochest33342,2μL)染色5min,溶酶体标记物(Lysotracker green,1μM,4μL)染色40min使用共聚焦显微镜进行观察负载有CpG的DNA纳米花形复合结构和未加载体的CpG单链细胞内分布情况,结果如图4(A)-图4(B)所示;
由图4(A)-图4(B)可知,该DNA纳米花形复合结构能够作为一种纳米容器,将其中装载的CpG序列高效运输至免疫细胞内部;图3(A)所示流式结果展示,DNA纳米花形复合结构能够明显增加CpG序列在巨噬细胞中的内化;同时图3(B)则显示CpG信号与溶酶体探针信号共定位,显示了DNA纳米花形复合结构能够将CpG片段运输至巨噬细胞酸性细胞器中。
实施例8 DNA纳米花形复合结构激活免疫细胞
将RAW264.7小鼠巨噬细胞的细胞悬液浓度调整为5×104个/mL,接种于96孔板,每孔100μL细胞悬液;将96孔板放入37℃细胞培养箱培养过夜,吸弃培养基,分别加入负载有(100nM,10μL)CpG的DNA纳米花形复合结构和等量未加载体的CpG单链,每个实验组设置复孔3个,另外设置一组仅完全培养基孵育细胞的空白对照;将加入药物结构处理的RAW264.7细胞96孔板,继续37℃孵育12h(检测TNF-α)或24h(检测IFN-γ),具体步骤如下:
(一)酶联免疫吸附反应(ELISA)的细胞免疫因子检测方法:细胞坏死因子-α(TNF-α)。
实验试剂的准备:
(1)1×包被缓冲液的配制:使用超纯水将10×包被缓冲液稀释至1×,震荡混匀;
(2)捕获抗体的配制:抗小鼠TNF-α(250×);计算每个96孔板,将48μL的捕获抗体加到12mL的1×包被缓冲液中;
(3)1×ELISA/ELIPOT稀释液的配制:将5×ELISA/ELIPOT稀释震荡混匀,得到1×ELISA/ELIPOT稀释液;
(4)标准品的配制:取1mL超纯水到溶解TNF-α标准品,室温放置15min并轻轻搅拌使其充分溶解,得到浓度为15ng/mL的TNF-α标准品溶液;使用1×ELISA/ELIPOT稀释液,配制得到标准曲线中的最高浓度(1000pg/mL),用倍比稀释法获得浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.63和7.81pg/mL捕获抗体;
(5)检测抗体的配制:抗小鼠TNF-α生物素(250×)的检测抗体。每个96孔板,将48μL的检测抗体取出,加到盛有12mL的1×ELISA/ELIPOT的15mL离心管中;
(6)酶的配制:抗生物素蛋白辣根过氧化物酶(Avidin-HRP,250×)。每个96孔板,将48μL的捕获抗体加到容有12mL的1×ELISA/ELIPOT的15mL离心管中;
(7)底物显色液:1×四甲基联苯胺(TMB);
(8)冲洗液的配制:配制1000mL的磷酸盐缓冲液,加入0.05%体积的吐温20,即500μL,充分混匀,待用;
(9)终止液的配制:取36mL的超纯水置于50mL离心管中,用移液枪小心的吸取18M的硫酸4mL,慢慢的加入到超纯水中,混匀待用。
实验步骤:
(1)向96孔板(Corning 9018)中加入稀释好的捕获抗体,每孔100μL,用封口膜密封板子,2-8℃孵育过夜;
(2)次日,将96孔板中的捕获抗体液倒掉,用配置好的冲洗液,每孔多于250μL,清洗三遍;每次清洗将96孔板中的残余液体用吸水纸吸干;
(3)用1×ELISA/ELIPOT封闭96孔板,每孔加入200μL,室温孵育1h;
(4)封闭完成后,将96孔板中的1×ELISA/ELIPOT倒掉,拍干板子,用冲洗液清洗一次;
(5)在96孔板的每孔中加入100μL梯度稀释的标准品溶液,每孔设3个复孔,用来做含有8个点的标准曲线;之后将前一天培养的加过药的96孔板从细胞培养中取出,将上清液吸出加入到含有捕获抗体的96孔板中,每孔加100μL,每组设置3个复孔;用封口膜密封96孔板,室温孵育2h;
(6)将96孔板中的液体倒掉拍干,用冲洗液清洗3-5次,按照步骤2操作;
(7)加入用1×ELISA/ELIPOT稀释液稀释好的检测抗体,每孔加100μL;之后用封口膜封闭板子,室温孵育1h;
(8)将96孔板中的液体倒掉,用冲洗液清洗3-5次,按照步骤2操作;
(9)加入稀释好的抗生物素蛋白辣根过氧化物酶(Avidin-HRP),每孔100μL。封闭板子,室温孵育30min;
(10)倒掉板子中的液体,用冲洗液清洗5-7次,在倒掉之前允许清洗液沉浸1-2min,按照步骤(2)操作;
(11)加入1×TMB溶液,每孔加100μL;封闭板子,室温孵育15min;
(12)加入终止液,每孔加入50μL;
(13)用酶标仪读取450nm时的吸光度值。
(二)酶联免疫吸附反应(ELISA)的检测方法:干扰素-γ(IFN-γ)。
实验试剂的准备:
(1)1×包被缓冲液的配制:使用超纯水将10×包被缓冲液稀释至1×,震荡混匀;
(2)捕获抗体的配制:抗小鼠IFN-γ;计算每个96孔板,将12μL的捕获抗体加到12mL的1×包被缓冲液中;
(3)1×ELISA/ELIPOT稀释液的配制:将5×ELISA/ELIPOT稀释液稀释从Elisa试剂盒中取出,用移液枪移取5mL的5×ELISA/ELIPOT稀释液到50mL离心管中,之后用洗耳球和移液管移取20mL超纯水到50mL离心管中,震荡混匀,得到1×ELISA/ELIPOT稀释液;
(4)标准品的配制:将10μL的标准品加入到5mL的1×ELISA/ELIPOT稀释液中,得到标准曲线的最高浓度(2000pg/mL);使用1×ELISA/ELIPOT稀释液,配制得到标准曲线中的最高浓度(1000pg/mL),用倍比稀释法获得浓度为500、250、125、62.5、31.25、15.63和7.81pg/mL捕获抗体;
(5)检测抗体的配制:抗小鼠IFN-γ生物素的检测抗体。每个96孔板,将12μL的检测抗体取出,加到盛有12mL的1×ELISA/ELIPOT的15mL离心管中;
(6)酶的配制:抗生物素蛋白辣根过氧化物酶(Avidin-HRP,250×);每个96孔板,将48μL的捕获抗体加到容有12mL的1×ELISA/ELIPOT的15mL离心管中;
(7)底物显色液:1×四甲基联苯胺(TMB);
(8)冲洗液的配制:配制1000mL的磷酸盐缓冲液,加入0.05%体积的吐温20,即500μL,充分混匀,待用;
(9)终止液的配制:取36mL的超纯水置于50mL离心管中,用移液枪小心的吸取18M的硫酸4mL,慢慢的加入到超纯水中,混匀待用。
实验步骤:
(1)向96孔板(Corning 9018)中加入稀释好的捕获抗体,每孔100μL,用封口膜密封板子,2-8℃孵育过夜;
(2)次日,将96孔板中的捕获抗体液倒掉,用配置好的冲洗液,每孔多于250μL,清洗三遍;每次清洗将96孔板中的残余液体用吸水纸吸干;
(3)用1×ELISA/ELIPOT封闭96孔板,每孔加入200μL;室温孵育1h;
(4)封闭完成后,将96孔板中的1×ELISA/ELIPOT倒掉,拍干板子,用冲洗液清洗至少一次;
5)在96孔板的每孔中加入100μL梯度稀释的标准品溶液,每孔设3个复孔,用来做含有8个点的标准曲线;之后将前一天培养的加过药的96孔板从细胞培养中取出,将上清液吸出加入到含有捕获抗体的96孔板中,每孔加100μL,每组设置3个复孔;用封口膜密封96孔板,室温孵育2h;
(6)将96孔板中的液体倒掉拍干,用冲洗液清洗3-5次,按照步骤2操作;
(7)加入用1×ELISA/ELIPOT稀释液稀释好的检测抗体,每孔加100μL;之后用封口膜封闭板子,室温孵育1h;
(8)将96孔板中的液体倒掉,用冲洗液清洗3-5次,按照步骤2操作;
(9)加入稀释好的抗生物素蛋白辣根过氧化物酶(Avidin-HRP),每孔100μL。封闭板子,室温孵育30min;
(10)倒掉板子中的液体,用冲洗液清洗5-7次,在倒掉之前允许清洗液沉浸1-2min,按照步骤(2)操作;
(11)加入1×TMB溶液,每孔加100μL;封闭板子,室温孵育15min;
(12)加入终止液,每孔加入50μL;
(13)用酶标仪读取450nm时的吸光度值。
结果见图5(A)-图5(B)所示;
由图5(A)和图5(B)可知,DNA纳米花形复合结构在进入巨噬细胞后,将在富含Toll样受体的酸性细胞器中响应性释放免疫刺激核酸片段,导致一系列细胞因子表达;比较游离CpG片段和DNA纳米花空载体,带有CpG核酸片段的DNA纳米花形复合结构明显刺激巨噬细胞TNF-α和IFN-γ的表达。
综上所述,本发明提供的DNA纳米花形复合结构通过巧妙设计引物和模板,融入pH响应的DNA基序,优化反应条件,最终制备得到性能优良的自组装结构,实现结构的可控、可预测性、可响应性,实现目标分子在纳米结构中的大量装载、可控定位及响应性释放,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 国家纳米科学中心
<120> 一种DNA纳米花形复合结构及其制备方法和应用
<130> 2018年
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
ttcccggcgg cgcagcagtt agattttttt ttttttttgg gttagggtta gggttagggt 60
tttttttttt tttttttttt ttctaaccgt acagtatt 98
<210> 2
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ttcccggcgg cgcagcagtt agattttggg ttagggttag ggttagggtt tttttttttt 60
tgggttaggg ttagggttag ggctaaccgt acagtatt 98
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
ccctaaccct aaccctaacc c 21
<210> 4
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
gttagtgtta gtgttagttt gcaagctgtt gggttaccac cttcattgga aaacgttctt 60
cggggcgttc ttaggtggta acc 83
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gttagtgtta gtgttagtt 19
<210> 6
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tctaactgct gcgccgccgg gaaaatactg tacggttag 39
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gcatctcagg atagcttttt tttttttttt 30
Claims (11)
1.一种肿瘤免疫佐剂,其特征在于,所述肿瘤免疫佐剂为具有刺激响应的DNA纳米花形复合结构;
所述DNA纳米花形复合结构包括由单链DNA模板扩增形成的DNA纳米花形结构和与DNA纳米花形结构杂交的免疫刺激核酸片段;
所述单链DNA模板的扩增产物包括具有pH为4.5-6.5微酸响应的DNA基序;所述具有微酸响应的DNA基序为i-motif,所述i-motif的核苷酸序列为SEQ ID NO.3;
所述免疫刺激核酸片段与单链DNA模板杂交部分的核苷酸序列为SEQ ID NO.5;所述杂交位点形成pH响应性锁匙结构;
所述DNA纳米花形复合结构的直径为550-1500nm;
所述DNA纳米花形复合结构采用如下方法进行制备,具体包括以下步骤:
(1)设计单链DNA模板和引物,进行反应使模板链闭合成环状链;
(2)以步骤(1)得到的环状链作为模板,进行滚环复制,实现长单链等温扩增,形成纳米花形结构;
(3)在步骤(2)所述环状链形成长单链的过程中,加入免疫刺激核酸片段进行杂交,形成所述的DNA纳米花形复合结构;
步骤(1)所述单链DNA模板的核苷酸序列为SEQ ID NO.1;所述引物的核苷酸序列为SEQID NO.6。
2.根据权利要求1所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,所述免疫刺激核酸片段的结构包括CpG核酸序列片段、粘性末端的双链RNA序列或具有核酸序列修饰的免疫刺激小分子药物中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,所述单链DNA模板的5’端磷酸化。
4.根据权利要求1或2所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,所述单链DNA模板的长度为90-200nt。
5.根据权利要求1或2所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,所述DNA纳米花形复合结构呈球形颗粒外观,内部具有层叠花瓣形片层。
6.根据权利要求1所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,步骤(1)所述反应的酶为DNA连接酶。
7.根据权利要求6所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,步骤(1)所述反应的酶为T4 DNA连接酶。
8.根据权利要求1所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,步骤(2)所述滚环复制的酶为DNA聚合酶。
9.根据权利要求1所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,步骤(2)所述滚环复制的酶为phi29 DNA聚合酶。
10.根据权利要求1所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,步骤(2)所述等温扩增的时间为2-24h,温度为25-35℃。
11.根据权利要求1所述的肿瘤免疫佐剂,其特征在于,所述DNA纳米花形复合结构的制备方法具体包括如下步骤:
(1)设计单链DNA模板和引物,加入T4DNA连接酶进行反应使模板链闭合成环状链;
(2)以步骤(1)得到的环状链作为模板,加入phi29 DNA聚合酶进行滚环复制,实现长单链25-35℃等温扩增2-24h,形成纳米花形结构;
(3)在步骤(2)所述环状链形成长单链25-35℃等温扩增2-24h的过程中,加入免疫刺激核酸片段进行杂交,之后65℃ 10min变性使DNA聚合酶失活,之后缓慢退火降温至4℃,形成所述的DNA纳米花形复合结构。
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DNA自组装纳米花的设计制备与载药及成像应用研究;梅蕾;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》;20170315(第2017年03期);文章号E072-106 * |
Enhanced immunostimulatory activity of oligodeoxynucleotides by Y-shape formation Introduction;Makiya Nishikawa等;《Immunology》;20071231;第124卷;第247-255页 * |
I-motif-based nano-flares for sensing pH changes in live cells;Jin Huang等;《Chem. Commun.》;20141028;第50卷;第15768-15771页 * |
Self-Assembled DNA Dendrimer Nanoparticle for Efficient Delivery of Immunostimulatory CpG Motifs;Yijiao Qu等;《ACS Appl. Mater. Interfaces》;20170701;第9卷;第20324-20329页 * |
功能化荧光核酸探针用于腺苷和pH的检测;何咏;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)工程科技I辑》;20150415(第2015年04期);文章号B014-289 * |
梅蕾.DNA自组装纳米花的设计制备与载药及成像应用研究.《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)医药卫生科技辑》.2017,(第2017年03期), * |
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Publication number | Publication date |
---|---|
CN110507818A (zh) | 2019-11-29 |
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